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M.C.
ELABORARON:
M.C. Amanda Dvila Lezama
M.A.I.A. Marnie Gonzlez Estvez
M.C.Marisela Martnez Gamboa
FIRMA:
FIRMA:
FECHA
FIRMA:
FECHA
NDICE
INTRODUCCIN
OBJETIVO GENERAL
PRCTICA No. 1
PRCTICA No. 2
PRCTICA No. 3
PRCTICA No. 4
PRCTICA No. 5
PRCTICA No. 6
PRCTICA No. 7
PRCTICA No. 8
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ANEXOS
A1: EVALUACIN DEL LABORATORIO
A2: INFORMACIN COMPLEMETARIA PRCTICA No. 1
A3: INFORMACIN COMPLEMENTARIA PRCTICA No. 2
A4: INFORMACIN COMPLEMENTARIA PRCTICA No. 4 y 6
A5: INFORMACIN COMPLEMETARIA PRCTICA No. 6 y 7
A6: INFORMACIN COMPLEMETARIA PRCTICA No. 8
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INTRODUCCIN
OBJETIVO GENERAL
El objetivo general que persigue el presente Manual de Laboratorio como herramienta de
trabajo es que el alumno tenga a su alcance la informacin necesaria referente a la
reglamentacin del uso y permanencia de laboratorio, as como la temtica de cada una de las
prcticas permitiendo as avanzar favorablemente en la prctica.
Las ilustraciones y ejemplos que contienen las prcticas aqu propuestas respaldan y
demuestran los resultados de las sesiones, de sta manera, el alumno podr apoyarse en las
mismas para elaborar un informe de laboratorio completo y al nivel de trabajo que la materia y la
sesin prctica exija.
Este reglamento es de observancia obligatoria para cualquier persona que ingrese o visite los
laboratorios de la Escuela de Ciencias de la Salud (ECISALUD).
1. Usar bata blanca de laboratorio con manga larga, abotonada, traje quirrgico
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mesas de trabajo, usar joyera y/o alhajas grandes que pudieran ocasionar accidentes,
lesin o interferencia en el trabajo, usar celulares o sistemas de comunicacin mvil.
Mantener sus pertenencias fuera del rea de trabajo o en los espacios asignados por el
docente de laboratorio.
Lavarse las manos antes y despus de trabajar en cada sesin.
No se podrn realizar prcticas sin la supervisin de un responsable del laboratorio.
Mantener limpia, ordenada y/o saneada su rea de trabajo, antes y despus de realizar
la actividad.
Usar equipo de proteccin personal (guantes de ltex, lentes de seguridad, mascarilla,
etc.) durante la permanencia dentro del laboratorio, de acuerdo a la actividad a realizar.
No distraer a sus compaeros durante la manipulacin de material, equipo y sustancias
qumicas.
No presentarse bajo el influjo de bebidas alcohlicas o cualquier otra droga.
Respetar horarios de actividades y en caso de no terminar la actividad en su horario,
solicitar acceso al responsable.
No mover, sustraer, manipular o hacer uso indebido de equipo sin autorizacin, as como
sistemas de cmputo y/o transmisin de datos.
Reportar incidentes o accidentes por leve que sean con o sin lesin, condiciones
inseguras y equipo daado al docente de laboratorio o al responsable del laboratorio.
No trate de atender un accidente o contingencia para lo cual no ha sido capacitado.
En simulacros o contingencias obedecer las disposiciones de seguridad indicadas por el
docente, coordinador o responsable del evento.
Disponer los residuos generados en la prctica en los contenedores correspondientes
bajo supervisin del tcnico acadmico, docente, responsable del laboratorio o por
personal capacitado para ello. Es responsabilidad del docente de laboratorio proporcionar
la informacin pertinente para la correcta disposicin de los residuos.
Prohibido verter slidos o sustancias qumicas peligrosas en los lavabos.
Mantener las puertas y ventanas cerradas en caso de que la actividad a realizar as lo
requiera.
Prohibido visitas no autorizadas. (Los responsables del laboratorio o direccin son los
que autorizan las visitas y debern de advertir a los visitantes sobre los riesgos y medidas
de seguridad del laboratorio).
21. El usuario deber de contar con material de limpieza de acuerdo a las actividades
realizadas.
22. Los alumnos que tengan asignada gaveta o rea, mantenerla limpia, en buenas
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docente, investigador o responsable del laboratorio tenga una gaveta exclusiva para ello.
Respetar las condiciones de seguridad y funcionalidad del laboratorio.
En caso de ruptura o dao del material o equipo de laboratorio, ste deber ser repuesto
o reparado en un lapso no mayor a 15 das.
El responsable de la sesin o actividad, deber anotar, las cantidades de reactivos
utilizados en las prcticas, investigaciones o servicios externos; en la bitcora de
consumo de reactivos.
Al terminar la sesin de laboratorio, verificar que los servicios de agua, gas, vaco, aire a
presin y/o energa elctrica no se desperdicien.
Prohibido introducir mascotas al laboratorio.
Se deber notificar al Coordinador o Responsable de laboratorio acerca de las prcticas
que requieran muestras biolgicas. En caso de ser externas, se llenar y firmar el
formato de consentimiento informado. Las muestras slo pueden ser utilizadas con fines
de docencia.
No se podrn tomar muestras biolgicas sin la autorizacin y supervisin de un
responsable de laboratorio.
Por lo cual, en caso de incumplimiento parcial o total a estos lineamientos, se harn acreedores
a las sanciones correspondientes indicadas en la reglamentacin universitaria o estipulada en el
contrato colectivo de trabajo segn corresponda.
Los alumnos (as) que no aporten el material que les sea solicitado para
alguna de las prcticas no podrn permanecer en el laboratorio.
En caso de que el material consumible se agote, el alumno ser
6. Para las prcticas que involucren el uso del microscopio, queda prohibido el uso de
maquillaje de ojos.
7. Los alumnos debern limpiar con solucin desinfectante el rea de trabajo ANTES de
empezar y al TERMINAR la prctica.
8. Los alumnos se harn cargo de la limpieza e integridad del material y equipo
proporcionado por el instructor al inicio de la prctica. Antes finalizar la sesin, debern
entregar el material proporcionado por el instructor, limpio y seco. De igual manera, el
equipo deber cumplir las condiciones de limpieza.
9. Los alumnos (as) son responsables de que las llaves de agua, gas y vaco, de sus mesas
de trabajo queden debidamente cerradas al finalizar cada prctica.
10. El rea de trabajo deber estar libre de cualquier material que no sea requerido para la
realizacin de prcticas (ej. ropa, bolsas, mochilas, libros, etc.).
11. La calificacin obtenida en cada prctica de laboratorio estar basada parcialmente en
los requisitos que marca la rbrica de evaluacin de bitcora (Anexo 1), la cual precisa
los puntos a seguir para elaborar la bitcora de laboratorio completa.
12. La evaluacin del alumno en sesin de laboratorio incluye, adems de la realizacin de
la bitcora de prctica, mantener una buena conducta, demostrar destreza en el
desarrollo de los experimentos, tener una actitud de compaerismo, trabajo y respeto
basado en valores. Estos aspectos sern considerados para su evaluacin final y se
encuentran detallados en la rbrica de evaluacin (Anexo 1).
Resultados e interpretacin.
Realizar lo que indica la prctica para esa seccin con una descripcin detallada.
Cuestionario.
Resolver las preguntas que se les presente en su manual.
Conclusiones.
Concluir en base a los resultados obtenidos y al cumplimiento de competencias. Media
cuartilla de extensin.
PRCTICA No. 1
MANEJO DE RESIDUOS PELIGROSOS BIOLGICO-INFECCIOSOS (R.P.B.I.)
TEMA TERICO AL QUE APOYA: Introduccin al curso de Biologa celular y bases qumicas
de la biologa.
FUNDAMENTO DE LA PRCTICA:
La Ley General del Equilibrio Ecolgico y la Proteccin al Ambiente, define como residuos
peligrosos a todos aquellos residuos que por sus caractersticas corrosivas, reactivas, explosivas,
txicas, inflamables y biolgico-infecciosas, que representan un peligro para el equilibrio
ecolgico o el ambiente (LEGEEPA, 2010).
La manipulacin de Residuos Peligrosos Biolgico Infecciosos implica un riesgo para la
salud de las personas directamente relacionadas con los residuos pero tambin puede significar
un riesgo potencial para la poblacin en general y el medio ambiente. Por tales motivos, las
personas y empresas que generan y manejan dichos residuos estn obligadas a seguir la
normatividad vigente elaborada con el fin de minimizar riesgos y eficientizar su uso y disposicin.
La normatividad para el manejo de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos responde
a estrictas regulaciones ambientales, las cuales, es necesario actualizar tomando en
consideracin las experiencias y competencias de los sectores involucrados en su cumplimiento,
con el fin de que sus disposiciones sean operativas y adecuadas para proteger el medio ambiente
y la salud de la poblacin en general (Diario Oficial de la Federacin, 2003).
As pues, siguiendo la labor de informacin, se hizo una actualizacin de la Norma Oficial
Mexicana NOM-087-ECOL-1995, resultando la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, publicada
en el Diario Oficial de la Federacin. (Diario Oficial de la Federacin, 2003).
Las empresas que manejan y generan R.P.B.I tiene la responsabilidad de consultar la
Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 para reglamentar cada una de los
procedimientos que se relacionan con estos residuos, as como tener a la mano un plan de
contingencia en caso de que suceda el derrame de algn residuo considerado peligroso (Diario
Oficial de la Federacin, 2003).
Para la identificacin de las reas, recipientes, materiales o procedimientos que impliquen
un riesgo biolgico se utiliza un smbolo universal, el cual se muestra en la imagen de la derecha.
MARCO TERICO:
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MATERIALES Y EQUIPO
METODOLOGA
1. El instructor explicar las condiciones de generacin, disposicin y
manejo de los
basura normal):
Cmara de jeringa.
Hisopo con saliva.
Aguja.
Torunda de algodn.
Tubo vacutainer con muestra de sangre.
Gasa.
Portaobjetos.
Cubreobjetos.
Cubreobjetos con muestra.
Gasa con sangre.
Empaque de la jeringa.
Algodn con sangre.
Guantes.
Cmara de jeringa con sangre.
Algodn impregnado y tirando sangre.
Hisopos.
Sangre.
Portaobjetos con muestra de eritrocitos.
Papel.
Tubos rotos.
Abatelenguas con saliva.
Guantes con sangre o fludos.
Puntas de pipeta contaminadas.
Hoja de bistur contaminada.
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DIAGRAMA DE FLUJO:
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RESULTADOS E INTERPRETACIN
A. Organiza tus resultados en un mapa mental tomando en cuenta la normatividad para la
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CUESTIONARIO
1. Por qu es importante el buen manejo de los R.P.B.I. dentro y fuera del laboratorio?
CONCLUSIONES:
Concluye en base a la utilidad de la prctica de laboratorio y la disposicin de estos materiales
para su confinamiento.
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PRCTICA No. 2
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MARCO TERICO:
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MATERIALES Y EQUIPO:
Microscopio ptico
Laminillas con diferentes muestras
Aceite de inmersin
Papel seda (Kimwipes)
Lquido para limpiar oculares y lentes
METODOLOGA:
1. Designar dos integrantes de cada equipo como responsables de llevar el microscopio a
su mesa de trabajo, anotarse en la bitcora de uso y esperar las indicaciones del
instructor.
2. Seguir la explicacin del instructor(a) sobre el manejo y los componentes del microscopio
ptico.
3. Observar al microscopio laminillas con diferentes tipos celulares bajo el siguiente
procedimiento:
a. Colocar la laminilla en el centro de la platina, deslizando los clips sujetadores.
b. Verificar que el objetivo que est colocado para la visualizacin sea el de menor
aumento.
c. Colocar mediante el movimiento de la platina la muestra de estudio en el centro del
microscopio.
d. Acercar la platina al objetivo hasta alcanzar una distancia aproximadamente de 2 mm,
entre el cubreobjetos y el objetivo, mediante el ajuste macromtrico, y bajo la
observacin directa de la platina con los oculares.
e. Enfocar la muestra a observar, viendo a travs del ocular y usando el ajuste
micromtrico. Regule el diafragma para mejorar la iluminacin.
f. Al observar las caractersticas de la muestra con el lente objetivo de menor aumento,
cambiar el lente objetivo por el siguiente de mayor aumento. Enfocar la imagen con
el ajuste micromtrico y observar la diferencia.
g. Barrer la muestra a travs de movimientos de la platina, de arriba hacia abajo en
forma de ondas.
h. Cambiar nuevamente el objetivo hacia el de mayor aumento. Ajustar la imagen con el
ajuste micromtrico y regular el diafragma para mejor iluminacin.
i. Al llegar al objetivo de 40X y pasar al 100X es necesario que agregar una gota de
aceite de inmersin en la muestra y solo entonces colocar el objetivo mayor.
4. Elaborar dibujos de lo observado en las laminillas.
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DIAGRAMA DE FLUJO:
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RESULTADOS:
En los siguientes espacios dibuja lo observado en cada uno de los objetivos utilizados.
Laminilla 1: ______________________________
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Laminilla 2: _______________________________
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CUESTIONARIO:
1. Indica el nombre de cada una de las partes del microscopio:
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2. Indica las ventajas y desventajas del uso y del manejo del microscopio ptico.
Ventajas
Desventajas
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CONCLUSIONES:
Concluye en base a tu experiencia en la sesin utilizando el microscopio ptico, acerca de su
manipulacin, enfoque y mantenimiento; as como la utilidad que tiene en el estudio de las clulas
y su comparacin con otras tcnicas de microscopa.
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PRCTICA No. 3
FROTIS BUCAL
TEMA TERICO AL QUE APOYA: Generalidades de la organizacin y estructura celular.
COMPETENCIA: El alumno aprender a elaborar preparaciones de muestras biolgicas que le
permitirn observar y reconocer clulas eucariotas y procariotas al microscopio, as como, sus
principales estructuras.
FUNDAMENTOS DE LA PRCTICA:
La clula es la unidad bsica funcional y estructural ms pequea que forma a los organismos
vivos. En su estado natural, son casi invisibles al microscopio convencional, una manera de
hacerlas visibles es realizar preparaciones donde se tian con colorantes orgnicos selectivos,
los cuales, se comportan como compuestos cidos o bsicos y tienen la tendencia de formar
uniones electrostticas con los radicales ionizables de los tejidos.
Las preparaciones pueden ser temporales, frescas y permanentes. Una preparacin temporal es
aquella que es utilizada en el momento de la observacin, ya que requiere que el medio de
montaje no se evapore tan rpidamente y que sea posible que el material biolgico se conserve
por un tiempo en condiciones de ser observado. Las preparaciones permanentes son aquellas
que permanecen intactas por siempre, por lo que se debe hacerse con un material especial
para que el cubreobjetos permanezca perfectamente adherido al portaobjetos durante aos y
muestra no se deteriore.
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MARCO TERICO:
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Portaobjetos.
Cubreobjetos.
Gotero.
Papel de seda (Kimwipes)
Hisopos estriles.
Abatelenguas.
Vaso de precipitados.
Azul de metileno.
Agua destilada.
Violeta de genciana.
Lugol.
Safranina.
Alcohol acetona.
Aceite de inmersin.
Microscopio ptico.
MUESTRA BIOLGICA:
Clulas de la mucosa bucal.
METODOLOGA:
CLULAS EUCARIOTAS:
1. Colocarse los guantes.
2. Tomar un portaobjetos y un cubreobjetos bien limpios y secos.
3. Para obtener la muestra, tirar del labio inferior hacia fuera y raspar de forma circular, la
parte interna del mismo con un hisopo estril.
4. Colocar la muestra en el portaobjetos frotando el hisopo en sobre el centro del mismo.
5. Depositar una gota de agua sobre la muestra, en el centro del portaobjetos.
6. Con el extremo contrario del hisopo, extender la mucosa extrada y disprsarla en la gota
de agua.
7. Teir las preparaciones agregando una gota de azul de metileno sobre la muestra.
8. Colocar el cubreobjetos cuidando de no hacer burbujas.
9. Observar al microscopio, enfocando progresivamente con los objetivos de menor a mayor
aumento.
CLULAS PROCARIOTAS:
Preparacin de la muestra:
1. Sujeta la lengua del paciente con el abatelenguas y frota con firmeza la pared
posterior de la garganta con el hisopo de algodn seco y estril (Fig. 1). NOTA:
Se debe tener cuidado de no tocar la epiglotis para no provocar el vmito en el
paciente.
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DIAGRAMA DE FLUJO:
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RESULTADOS:
CLULAS EUCARIOTAS (Objetivo 4x)
Descripcin
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CUESTIONARIO:
1. Se observa algn orgnulo citoplasmtico? Cul?
3. Cules colorantes se utilizan para teir clulas eucariotas, adems del azul de metileno?
CONCLUSIONES:
El alumno indicar el aprendizaje obtenido a partir de la realizacin de la prctica, as como su
comentario final al respecto de las observaciones.
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PRCTICA No. 4
FRAGILIDAD OSMTICA DEL ERITROCITO
TEMA TERICO AL QUE APOYA: Transporte a travs de membrana y smosis
FUNDAMENTOS DE LA PRCTICA:
La membrana de eritrocito es la ms sencilla de las membranas celulares. Esta consta
de una doble capa lipdica y un esqueleto proteico en su cara citoplasmtica. La morfologa del
eritrocito depende de la osmolaridad del medio en que se encuentra. En condiciones fisiolgicas
(osmolaridad de ~290 mOsm/Kg), el eritrocito tiene forma de disco bicncavo.
En sta prctica se visualizarn al microscopio los cambios morfolgicos del eritrocito en
medios hipertnico, isotnico e hipotnico.
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MARCO TERICO:
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Jeringa.
Torniquete.
Torundas de algodn.
Alcohol etlico.
Tubo vacutainer con anticoagulante (EDTA).
Microtubos o tubos de ensaye.
Soluciones de NaCl al 1.8%, 0.9% y 0.45%
Solucin de sodio-dodecil-sulfato (SDS) al 0.1%
Agua destilada.
Pipetas semiautmaticas y puntas desechables.
Portaobjetos.
Cubreobjetos.
Microscopio ptico.
Papel de seda y lquido para limpieza de lentes de microscopio.
Recipientes para R.P.B.I.
METODOLOGA:
1. Obtener sangre fresca (aprox. 3 ml) de uno de los alumnos del subgrupo, utilizando la
Rotular los 4 tubos de ensaye de acuerdo a la solucin que van a contener (1.8%, 0.9%,
0.45% y SDS 0.1% respectivamente).
a. En el tubo # 1, colocar 1.5 ml de solucin NaCl al 0.45 %
b. En el tubo # 2, colocar 1.5 ml de solucin NaCl al 0.9 %.
c. En el tubo # 3, colocar 1.5 ml de solucin NaCl al 1.8 %.
d. En el tubo # 4, colocar 1.5 ml de solucin NaCl 0.9%, agrega 1 gota de SDS al
0.1%.
Aadir 1 gota de sangre a cada uno de los 4 tubos de ensaye.
Mezclar con cuidado.
Rotular 4 portaobjetos limpios de la misma forma que los tubos de ensaye.
Realizar 4 preparaciones temporales, colocando 1 gota de cada una de las suspensiones
obtenidas en el portaobjetos correspondiente y cubrir cuidadosamente con un
cubreobjetos.
Visualizar la morfologa eritrocitaria al microscopio en el objetivo 40X.
4.
5.
6.
7.
8.
38
DIAGRAMA DE FLUJO:
39
RESULTADOS:
Describir en su bitcora la morfologa observada en cada tipo de solucin de NaCl y con el SDS.
Eritrocitos en solucin NaCl 0.45%
Dibujo
Descripcin
Dibujo
Descripcin
40
Dibujo
Descripcin
Dibujo
Descripcin
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CUESTIONARIO:
A qu se le denomina fantasma de eritrocito?
CONCLUSIONES:
Anotar las conclusiones relativas a la fragilidad osmtica del eritrocito.
LITERATURA CITADA:
Karp, G. 2001. Biologa Celular y Molecular. ISBN: 9701016440
Alberts et al. 2006. Essential Cell Biology, An Introduction to the Molecular Biology of the Cell.
Garland Publishing, Inc. ISBN 0-8153-2045-0
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2
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PRCTICA No. 5
FRACCIONAMIENTO CELULAR Y TINCIN DE MITOCONDRIAS
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MARCO TERICO:
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45
DIAGRAMA DE FLUJO:
46
Dibujo
Descripcin
OBJETIVO 100x
Dibujo
Descripcin
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CUESTIONARIO:
1. Qu otras tcnicas existen para la separacin de organelos celulares?
3. Cules son las ventajas y las desventajas de trabajar con clulas enteras o fraccionadas?
CONCLUSIONES:
Definir los aciertos, errores y anotaciones pertinentes para una buena prctica, finalizando con
una conclusin que aporte acerca de la importancia de sta tcnica en la prctica clnica.
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LITERATURA CITADA:
1. Callen J. 2003. Biologa celular: de las molculas a los organismos. Mxico, D.F. Segunda
edicin. Editorial Continental. Pgs. 122-125.
2. Cooper, G. 2002. La clula. Segunda edicin. Editorial Marbn. Pgs. 17-24, 81.
3. Coutio, R. y Fernandez, S. 1997. Biologa celular. Manual de laboratorio experimental. Textos
universitarios. Primera edicin. Pgs. 21-22.
4. Curtis, H. 2004. Biologa. Mxico D.F. Sexta edicin. Editorial Panamericana. Pgs. 100-112,
82.
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PRCTICA 6
EXTRACCIN DE ADN
50
MARCO TERICO:
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MATERIALES Y EQUIPO:
Muestra de sangre.
Microtubos.
Pipeta semiautomtica.
Puntas para pipeta.
Gradilla.
Agua destilada.
Tris-HCl 10mM y 20 mM (pH 7.6)
Isopropanol.
EDTA 1mM.
SDS 0.1% p/v.
Acetato de potasio 5M.
cido actico glacial.
Buffer TE.
Etanol absoluto.
MIcrocentrfuga.
METODOLOGA:
(Para la preparacin de reactivos consultar el Anexo 4)
Preparacin de la muestra:
1. Tomar una muestra de sangre de acuerdo a la tcnica de venopuncin (Consultar Anexo
6) y colocarla en un tubo vacutainer con EDTA como anticoagulante (tapn morado).
2. Transferir alcuotas de 300 uL de sangre completa a 2 microtubos.
3. Adicionar 900 uL de buffer de lisis de clulas rojas a cada tubo.
4. Mezclar por inversin.
5. Incubar la solucin a temperatura ambiente por 10 minutos, mezclando ocasionalmente
por inversin.
6. Centrifugar los tubos a velocidad mxima por 20 segundos a temperatura ambiente.
7. Descartar el sobrenadante hasta que queden aproximadamente 20 uL del mismo.
8. Resuspender los pellets celulares en el sobrenadante remanente. Combine el contenido de
ambos tubos en uno solo.
Extraccin de ADN:
52
de DNA.
5. Retirar el sobrenadante por aspiracin y adicionar 600uL de etanol al 70%. Mezclar por
inversin. Centrifugar a mxima velocidad por 1 minuto a temperatura ambiente.
7. Disuelva el pellet de DNA en 100uL de buffer TE (pH 7.6). NOTA: La solubilizacion del
pellet de DNA genmico puede ser facilitado por la incubacin de la muestra por 16
horas a temperatura ambiente o 1 hora a 65 C.
53
DIAGRAMA DE FLUJO:
54
RESULTADOS:
Anota tus observaciones de toda la prctica.
Cul era la apariencia del ADN?
En qu momento se empez a observar la formacin de ADN?
OBSERVACIONES
CUESTIONARIO:
Explique la importancia de la extraccin y purificacin de DNA en la investigacin biomdica y
prctica clnica.
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CONCLUSIONES:
Enriquece y finaliza tus observaciones concluyendo acerca del proceso de extraccin y el
resultado esperado.
4.
Kulg et al. Conceptos de gentica. Ed. Prentice Hall. 5 ed. Madrid 1999. pp. 43-45.
5.
Curtis, H. 2004. Biologa. Mxico D.F. Sexta edicin. Editorial Panamericana. Pp 249-261.
56
PRCTICA No. 7
ELECTROFORESIS DEL ADN
TEMA TERICO AL QUE APOYA: Estructura del ADN.
COMPETENCIA: El alumno al finalizar la prctica conocer el procedimiento para realizar un gel
de agarosa y separar los fragmentos de ADN de su muestra.
FUNDAMENTOS DE LA PRCTICA:
La concentracin e integridad del ADN extrado, as como el tamao de distintos
fragmentos de ADN (por ejemplo, productos de PCR) pueden ser verificadas mediante
electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La electroforesis consiste en la separacin
de molculas (protenas, isoenzimas, cidos nucleicos) a travs de una matriz tamponada
(agarosa, acrilamida, almidn). La matriz funciona como un filtro, separando las molculas en un
campo elctrico, de acuerdo al tamao y la carga neta que poseen. En el caso de los cidos
nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH
neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (nodo) durante la
electroforesis (Posso y Ghneim 2008).
La resolucin y velocidad de separacin de fragmentos de ADN por electroforesis son
reguladas a travs de la concentracin de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje aplicado
durante la electroforesis. La agarosa funciona como un filtro en el que los fragmentos de menor
tamao migran ms rpidamente hacia el nodo que aquellos de mayor tamao. Al aumentar la
concentracin de agarosa se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo largo del gel,
permitiendo obtener una mayor resolucin en los fragmentos de menor longitud. El incremento
del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migracin de los fragmentos en el gel
(Posso y Ghneim op cit.).
Los cidos nucledos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante
tincin con colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su
concentracin mediante un anlisis comparativo con patrones de concentracin conocida. Los
colorantes fluorescentes actan mediante insercin entre las pares de bases que conforman el
cido nucleco. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la visualizacin de ADN y
ARN. Sin embargo, ste es un reactivo altamente txico, con propiedades mutagnicas, por lo
que debe ser manejado con extremo cuidado en el laboratorio. En la actualidad existen
colorantes fluorescentes alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green
y Syto60, desarrollados especficamente para reducir los riesgos potenciales de mutagnesis.
La tcnica para la cuantificacin de ADN consiste simplemente en la utilizacin de una
secuencia de concentraciones de solucin patrn de ADN con la que se comparan muestras de
ADN de concentracin desconocida. El clculo de las concentraciones se hace bajo la luz
ultravioleta segn la fluorescencia. Debe evitarse la exposicin prolongada a la luz ultravioleta,
incluso con mscara de proteccin. La estimacin de las concentraciones de ADN puede
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realizarse sobre una fotografa digital del gel tomada bajo luz ultravioleta si se cuenta con un
analizador de imgenes (Posso y Ghneim op cit.).
La concentracin de agarosa y el voltaje con los que se debe trabajar depende del tamao
del segmento de ADN que se quiera visualizar. Los segmentos de gran tamao, el ADN total
(proveniente de una extraccin de ADN), deben trabajarse con concentraciones del 0.8% y a
voltajes de 60V para evitar la fragmentacin del mismo. Los segmentos de 1500pb en adelante
con geles al 1%, los segmentos de 500pb a 1500pb en geles 1,5% o 2% y los pequeos
segmentos de 100pb a 500pb (los microsatlites por ejemplo) en geles al 4% o 6%. Para estos
el voltaje puede variar de 20V a 120V de pendiendo de la velocidad a la que quiera que migre el
ADN, a voltajes elevados ms rpido corren las muestras.
La pureza de la agarosa y de la solucin tampn (TAE o TBE) puede variar segn la
finalidad del ensayo. Es posible reutilizar una solucin de agarosa para fines de una simple
visualizacin de algn producto de PCR. No se debe reutilizar cuando con se va a cuantificar
ADN ni a extraer bandas a partir del gel. Para reutilizar la solucin de agarosa se recomienda
guardar el gel en un envase con tapa, esto evita la evaporacin y la entrada de polvo. En caso
dado de que se evapore algo de la solucin se puede completar el volumen con solucin tampn
limpia.
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MARCO TERICO:
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Pipetas semiautomticas.
Puntas para pipeta.
Probeta.
Matraz Erlenmeyer.
Cmara de electroforesis horizontal con peine y bandeja.
Fuente de poder.
Guantes.
Sybr Green.
Agarosa grado molecular.
Tris base
cido Brico
EDTA
Azul de bromotimol
Glicerol
SDS
Agua Destilada.
METODOLOGIA:
1. Prepara 1 L de buffer TBE 10X (Anexo 4)
2. Prepara la bandeja sellando los bordes por presin.
3. Prepara el gel de agarosa al 1% siguiendo estos pasos:
a. Pesa 1 g de agarosa.
b. Coloca la agarosa dentro de un envase de vidrio que contenga 100 mL de buffer TBE
0,5X y calienta en el microondas o en el bao de Mara hasta su completa disolucin.
c. Cuando la solucin de agarosa haya alcanzado una temperatura soportable por la mano,
agrega 5 uL de SYBR Green I.
d. Mezcla bien, agitando el recipiente en forma circular, evitando que se formen burbujas en
la solucin.
e. Sirve la solucin en la bandeja de corrida vertindola lentamente por uno de los extremos
de la bandeja y retire las burbujas que queden sobre el rea de corrida de las muestras,
con una puntilla de pipeta limpia.
f. Coloca el peine y espera a que polimerice el gel (aproximadamente 30 minutos). Una vez
polimerizado, retira el peine.
4. En un microtubo, mezcla 2 uL de buffer de carga con 10 uL de muestra de ADN. Repetir
este paso para cada muestra.
5. Deposita la muestra en cada pozo del gel de agarosa. Utilizando el primer pozo para el
marcador de peso molecular.
60
61
DIAGRAMA DE FLUJO:
62
RESULTADOS:
Anotar las observaciones de todo el procedimiento.
Observar el bandeo en el gel y anotar el nmero de bandas observadas.
CUESTIONARIO:
1. Mencionar que otros tipos de electroforesis existen y los tipos de geles que se utilizan en
ellos.
63
CONCLUSIONES:
Concluir acerca del procedimiento para la observacin y la presencia de la banda de ADN en la
electroforesis.
64
PRCTICA No. 8
ANLISIS DE CARIOTIPO
TEMA TERICO AL QUE APOYA: Cromosomas.
COMPETENCIA: El alumno tiene la capacidad de identificar y distinguir a partir de una imagen
de cromosomas metafsicos el cariotipo de un ser humano con o sin aberraciones
cromosmicas.
INTRODUCCIN:
El cariotipo humano es la imagen del arreglo de sus 46 cromosomas que se hacen visibles
durante la metafase de la mitosis. En las ltimas tres dcadas las tcnicas de tincin han
permitido resolver ambigedades de la identificacin individual de los cromosomas e identificar
dentro de ellos regiones especficas dnde se localizan los genes. El anlisis de los cromosomas
metafsicos con las tcnicas de tincin ha permitido distinguir alrededor de 2000 regiones ricas
en adeninas y timinas (A y T) que facilitan la localizacin de genes especficos (Alberts y
colaboradores, 1994). Cada cromosoma posee un estrechamiento denominado centrmero, de
gran relevancia para los movimientos de los cromosomas durante divisin celular. De acuerdo a
la posicin del centrmero los cromosomas se clasifican en telocntricos, acrocntricos,
submetacntricos y metacntricos. En organismos diploides, como nosotros, las clulas a
excepcin de las gamticas poseen un doble juego de cromosomas (cromosomas homlogos)
que se indica con los caracteres 2n, mientras que las clulas con una sola especie (clulas
haploides) con la letra n (Junqueira y Carneiro, 1997).
Las variaciones en el nmero normal de cromosomas de una especie se conocen como
aberraciones cromosmicas. Adems del nmero, pueden varan en la forma, lo que se conoce
como aberraciones estructurales. Cuando no son letales, en ocasiones pueden transmitirse a la
progenie y producir malformaciones y o enfermedades congnitas, por lo cual estudiar el cariotipo
resulta ser una actividad importante. Este tipo de anlisis suele ser utilizado para evaluar a
parejas con antecedentes de abortos espontneos o examinar infantes con rasgos inusuales o
retrasos en el desarrollo. Los anlisis de cariotipo pueden realizarse prcticamente a partir de
cualquier tejido, incluyendo lquido amnitico, sangre, mdula sea, etc (MedlinePlus).
65
MARCO TERICO:
66
MATERIALES Y EQUIPOS:
METODOLOGA:
1. Cuente y recorte individualmente los cromosomas de la imagen del cariotipo desordenado
que se le proporciona en el Anexo 5.
2. Ordnelos por tamao.
3. Identifique, por su patrn de bandas, los pares cromosmicos. (Para averiguar de qu
cromosoma se trata, comprelos con el patrn de bandas mostrado por el idiograma en el
Anexo 5).
4. Llene la tabla I de la seccin resultados.
5. Una vez ordenados los cromosomas, sujtelos con cinta adhesiva o goma.
6. Indique en la imagen de la seccin de resultados qu cromosomas son metacntricos, cuales
submetacntricos y cuales acrocntricos.
7. Indique segn el nmero de cromosomas a qu organismo pertenece?, si ste presenta
anomalas numricas y si existe dimorfismo sexual en los cromosomas a que sexo
corresponde el grupo de cromosomas analizado.
8. Discuta los resultados obtenidos con los de otros equipos y concluya a partir de su discusin
el cuerpo de conocimientos obtenido.
67
DIAGRAMA DE FLUJO:
68
RESULTADOS:
Entregar el cariotipo organizado y clasificado segn lo requerido en la metodologa.
1. Clasificacin y conteo de los cromosomas por la posicin del centrmero y el tamao.
Nmero
Por tamao
B
X
Nmero
69
2. Organizacin del cariotipo: Imagen obtenida del ordenamiento del grupo de cromosomas
proporcionado.
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
70
CUESTIONARIO:
1. Qu caractersticas permiten diferenciar, en general, unos cromosomas de otros?
2. Cules son las diferencias que podran encontrarse en un cariotipo de una persona
Down?
71
CONCLUSIONES:
Detallar las conclusiones a las cuales llegaron al finalizar su cariotipo. Perteneca a una
persona sana? Enferma? Hombre? Mujer?
72
ANEXOS
73
Anexo 1
EVALUACIN.
RBRICA PARA EVALUAR BITCORA DE LABORATORIO
RUBRO
9-10
7-8
- La bitcora no est
bien organizada, la
limpieza y cuidado
estan ausentes en la
mayora de sus partes.
No hay secuencia
lgica de la
presentacin de cada
rubro a evaluar.
MARCO TERICO
20%
El marco terico
contiene informacin
necesaria y concreta
sobre el tema. Hay
antecedentes del
mismo y se lleva a cabo
una justificacin para
abordar el tema a tratar.
Redactada con
formalidad.
El marco terico
contiene informacin
necesaria y concreta
sobre el tema. Hay
antecedentes del
mismo.
Redactada con
formalidad.
El marco terico
contiene informacin
necesaria y concreta
sobre el tema.
Redactada con poca
formalidad.
El marco terico
contiene informacin
necesaria sobre el
tema.
Redactada de manera
totalmente informal.
La bitcora describe
concretamente los
resultados.
Se establece una
relacin entre lo
observado y los
resultados. Algunas
descripciones no
corresponden con los
resultados.
La bitcora describe
concretamente los
resultados.
Se sigue una secuencia
lgica.
La bitcora describe
errneamente los
resultados.
RESULTADOS E
INTERPRETACIN
35%
La bitcora describe
clara, correcta y
concretamente los
resultados
Se sigue una secuencia
lgica.
Se establece una
relacin entre lo
observado (descripcin)
y los resultados.
Todas las preguntas
estn resueltas
correctamente y de
manera concisa.
Alguna pregunta no se
resolvi o est resuelta
incorrectamente.
La mayora de las
preguntas estn sin
resolver o la respuesta
no es congruente con lo
que se le pide.
No se resolvi el
cuestionario.
Todas las preguntas
estn resueltas
incorrectamente.
- Define de manera
clara el cuerpo de
conocimientos obtenido.
-Emerge de manera
indiscutible de los
resultados obtenidos.
- Define el cuerpo de
conocimientos obtenido.
-Emerge de los
resultados obtenidos.
- No define el
conocimiento generado
-Es incongruente con
los resultados.
La bitcora contiene
mnimo 5 referencias
bibliogrficas: 3 libros, 1
artculo de investigacin
y 1 electrnica fuente
confiable.
La bitcora contiene
mnimo 4 referencias
bibliogrficas:
2
libros, 1 artculo de
investigacin y 1
electrnica de fuente
confiable.
La bitcora contiene
mnimo 2 referencias
bibliogrfica: 1 libro y 1
artculo de investigacin
PRESENTACIN
10%
CUESTIONARIO
10%
CONCLUSIN
15%
REFERENCIAS
CITADAS
5%
4-6
0-3
La mayora de las
descripciones no
corresponden con los
resultados.
.
La bitcora contiene
mnimo 1 referencia
bibliogrfica: 1 artculo
de investigacin.
La bitcora solo
contiene citas de
paginas web.
74
ORTOGRAFA,
GRAMTICA Y
SINTAXIS
5%
No comete errores.
-Errores (1-5) en todo el
reporte.
Errores de frecuencia
moderada: 1-3 por
pgina.
-Errores frecuentes en
todos los rubros:
Ortografa, gramtica y
sintaxis.
75
Conocen la
competencia de
la prctica y
todos los pasos
del
procedimiento
de la prctica a
realizar
(9-10 ptos.)
Conocen la
competencia y
algunos pasos del
procedimiento de
la prctica a
realizar.
(7-8 ptos.)
Conocen
solamente los
pasos del
procedimiento de
la prctica a
realizar pero no
conoce la
competencia
(5-6 ptos.)
Conocen la
No conocen la
competencia
competencia
pero no los
ni los pasos
pasos del
del
procedimiento procedimiento
de la prctica a de la prctica a
realizar
realizar.
(3-4 ptos.)
(0-2 ptos.)
MANEJO DE
MATERIALES,
EQUIPO E
INSTALACIONES
(5 ptos.)
Conocen los
nombres y
funcionamiento
de todo el
material y el
equipo de
laboratorio.
(5 ptos.)
Conocen el
funcionamiento y
nombre de
algunos
materiales y algn
equipo de
laboratorio.
(3-4 ptos.)
Conocen los
nombres pero no
el funcionamiento
del material y
equipo de
laboratorio.
(2 ptos.)
Conocen
No conocen el
algunos
material ni su
nombres y
funcionamient
poco sobre el o as tampoco
funcionamient el equipo de
o del material
laboratorio.
y equipo de
(0 ptos.)
laboratorio.
(1 pto.)
COLABORACION
EN EQUIPO (10
ptos.)
Promueven
notablemente
todo el tiempo
el trabajo
colaborativo o
en equipo
Participa
activamente en
la realizacin de
toda la prctica.
(9-10 ptos.)
Promueven la
mayora del
tiempo durante el
desarrollo de la
prctica el
trabajo
colaborativo o en
equipo
Participa
activamente en la
mayora de los
momentos de la
prctica.
(7-8 ptos.)
Promueven
algunas veces el
trabajo
colaborativo o en
equipo
Participa
activamente en
algunas etapas del
desarrollo de la
prctica
(5-6 ptos.)
Promueven
No promueven
muy poco el
el trabajo
trabajo
colaborativo o
colaborativo o
en equipo
en equipo
No participa
Participa poco
en ninguna
en las etapas
etapa del
del desarrollo desarrollo de
de la prctica.
la prctica.
(3-4 ptos.)
(0-2 ptos.)
COMPORTAMIEN
TO
Y
ORGANIZACION
DEL AREA DE
TRABAJO (15
ptos.)
Su
comportamiento
va de acuerdo al
reglamento del
laboratorio todo
el tiempo a
partir de que
ingresa al
mismo.
(13-15 ptos.)
Su
comportamiento
va de acuerdo al
reglamento del
laboratorio la
mayora del
tiempo desde su
ingreso al mismo.
(10-12 ptos.)
Su
comportamiento
va de acuerdo al
reglamento del
laboratorio
algunas veces
desde su ingreso
al mismo.
(7-9 ptos.)
Su
Su
comportamien comportamien
to va de
to no va de
acuerdo al
acuerdo al
reglamento
reglamento
del laboratorio del laboratorio
pocas veces
en ningn
desde su
momento
ingreso al
desde su
mismo.
ingreso al
(4-6 ptos.)
mismo.
(0-3 ptos.)
Concluyeron la
N/A
Concluyeron
PRCTICA
N/A
No
76
CONCLUIDA (10
ptos.)
prctica.
(10 ptos.)
parcialmente la
prctica
(5 ptos.)
concluyeron la
prctica
(0 ptos.)
77
78
Anexo 2
INFORMACIN COMPLEMETARIA PRCTICA No. 1
Tabla No. 1: Identificacin y clasificacin de los R.P.B.I.
Denominacin
Estado fsico
Descripcin
Cultivos y cepas
Lquido / slido
Patolgicos
Slido / lquido
No anatmicos
Slido
Punzocortantes
Slido
79
Estado
fsico
Envasado
Color
Sangre
Lquidos
Recipientes hermticos
Rojo
Cultivos y cepas de
agentes infecciosos
Slidos
Bolsas de polietileno
Rojo
Patolgicos
Slidos
Bolsas de polietileno
Amarillo
Lquidos
Recipientes hermticos
Amarillo
Slidos
Bolsas de polietileno
Rojo
Lquidos
Recipientes hermticos
Rojo
Slidos
Recipientes rgidos
polipropileno
Rojo
Residuos no anatmicos
Objetos punzocortantes
80
Anexo 3
INFORMACIN COMPLEMENTARIA PRCTICA No. 2
81
Anexo 4
INFORMACIN COMPLEMENTARIA PRCTICA No. 4 y 6
EXTRACCIN SANGUINEA
Cuando se extrae sangre del cuerpo y se deja reposar en un recipiente de vidrio por algunos
minutos, sta se coagula, el cual se debe a la precipitacin de una protena plasmtica llamada fibringeno,
que forma hebras de fibrina insoluble. Las clulas de la sangre son atrapadas en una red de fibrina que
gradualmente se contrae y libera un lquido llamado suero. El suero no contiene fibringeno ni algunos
factores de la coagulacin, ya que estos se han consumido durante la formacin del coagulo. El plasma a
diferencia del suero, si contiene factores de coagulacin y se obtiene si el tubo donde se recolecta la
sangre tiene un anticoagulante.
Si se requiere una pequea cantidad de sangre sta puede obtenerse por puncin capilar
(puncionando la piel del dedo o el lbulo de la oreja con un instrumento cortante), para obtenerla primero
se limpia la piel con alcohol y se deja secar. Se inserta una lanceta o aguja estril en la piel a profundidad
de 1 o 2 mm. La primera gota de sangre que sale de la herida se limpia con torunda de algodn. Las gotas
subsecuentes se recogen con un portaobjetos para frotis, o con una pipeta o con algn otro recipiente para
pruebas diversas.
Si se requiere un volumen mayor de 0.5 ml entonces se debe realizar la tcnica de ven puncin o
flebotoma. Esta tcnica consiste en la puncin de la barrera protectora exterior (piel) por va extracutnea;
con un objeto punzocortante (cnula o aguja) para la obtencin de una muestra sangunea que puede ser
perifrica, arterial o venosa. Por lo general se prefiere sangre venosa para la mayor parte de exmenes y
se procurara obtener una mayor cantidad por si fuese necesario verificar alguna prueba. La flebotoma se
puede realizar por dos mtodos diferentes: utilizando tubos al vaco (sistema Vacutainer) y utilizando aguja
y jeringa convencional. El mtodo de utilizar tubos al vaco es ms rpido, pero se prefiere utilizar aguja y
jeringa cuando se trabaja en venas pequeas y frgiles, para evitar que estas colapsen.
Comnmente se emplea una vena del brazo (fosa antecubital) ya que stas son de fcil acceso,
relativamente largas y fciles de localizar. Se utiliza un torniquete para bloquear la circulacin venosa, se
selecciona alguna vena adecuada por su calibre y prominencia y se limpia la piel con alcohol (utilizando
tcnicas de asepsia y antisepsia ya estandarizadas). Una vez que el alcohol se ha evaporado se introduce
una aguja afilada adaptada a una jeringa de tamao adecuado y estril; enseguida se tira del embolo de
la jeringa para que la sangre penetre en sta. Tan pronto como se haya obtenido una cantidad adecuada
se libera la presin ejercida sobre el brazo y se extrae la aguja. Se aplica una torunda de algodn estril
en el sitio de la puncin y se ejerce presin firme durante medio minuto para evitar escurrimiento de la
sangre en los tejidos circunvecinos. Debe quitarse la aguja de la jeringa antes de distribuir la sangre en los
tubos de ensayo (no as cuando se depositar dentro de un tubo al vaco vacutainer).
Si se requiere suero, la sangre puede ser vertida en el interior de un tubo de ensayo (esterilizado). Si
se necesita sangre total o plasma, deber utilizarse algn anticoagulante, el ms comn para la mayor
parte de anlisis es el cido etilen-diamino-tetra-actico (EDTA). El citrato de sodio al 3% tambin es un
anticoagulante. La heparina es un anticoagulante antitrombnico que se usa en pruebas donde no se desea
la eliminacin de iones calcio. Los tubos del sistema Vacutainer (figura 1) vienen con tapones de diferentes
colores que indican los anticoagulantes o aditivos que contienen:
Tapn rojo: el tubo no contiene anticoagulante y el interior del tubo es estril, la sangre coagular
y liberar suero despus de la centrifugacin. Se utiliza para analizar la qumica del suero.
Tapn rojo y gris/negro: tambin llamado tubo de separador de suero, este tubo contiene un gel
82
83
Contraindicaciones relativas:
1. Zonas de flexin.
2. Venas muy pequeas
84
85
86
Anexo 5
INFORMACIN COMPLEMETARIA PRCTICAS No. 6 y 7
A. Buffer de lisis celular:
REACTIVO
CANTIDADES
Tris base
109g
cido brico
55g
EDTA
4.65g
87
F. Buffer TE (1L):
G.
Agregar 60.57 g de Tris base a 0.5L de agua, ajustar pH a 7.5 utilizando HCl
88
Anexo 6
INFORMACIN COMPLEMETARIA PRCTICA No. 8
Clasificacin de los cromosomas para la elaboracin de un cariotipo humano
Los grupos que comprende el cariotipo humano son los siguientes:
- Cromosomas grandes
* Grupo A, (cromosomas 1, 2 y 3), meta y submetacntricos
* Grupo B, (cromosomas 4 y 5), submetacntricos
- Cromosomas medianos
* Grupo C, (cromosomas 7, 8, 9, 10, 11, 12 y adems los cromosomas X),
submetacntricos
* Grupo D, (cromosomas 13, 14 y 15) acrocntricos
- Cromosomas pequeos
* Grupo E, (cromosomas 16, 17 y 18) submetacntricos
* Grupo F, (cromosomas 19 y 20) metacntricos
* Grupo G, (cromosomas 21 y 22) acrocntricos
Patrn de bandeo
89
Idiograma
Un idiograma es la representacin esquemtica del tamao, forma y patrn de bandas de
todo el complemento cromosmico, los cromosomas se sitan alineados por el centrmero, y
con el brazo largo siempre hacia abajo. Los cromosomas sexuales X e Y se separan de sus
grupos correspondientes y se ponen juntos aparte al final del cariotipo.
90
91
Anexo 6
92