RECUPERACIÓN PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LIPASAS PRODUCIDAS POR Candida Rugosa

Universitat Autnoma de Barcelona
ESCOLA TCNICA SUPERIOR D'ENGINYERIA
DEPARTAMENT D'ENGINYERIA QUMICA
RECUPERACIN, PURIFICACIN Y CARACTERIZACIN

DE LIPASAS PRODUCIDAS POR Candida rugosa.
APLICACIN A LA RESOLUCIN DE COMPUESTOS
QUIRALES Y DISEO DEL REACTOR ENZIMTICO.
Programa de Doctorado:
BIOTECNOLOGA
Memoria que para optar al grado de Doctor en Ingeniera Qumica presenta:
ANTONIO SNCHEZ FERRER

FRANCISCO VALERO BARRANCO, Profesor titular del Departament
d'Enginyeria Qumica de la Universitat Autnoma de Barcelona y
FCO. JAVIER LAFUENTE SANCHO, Profesor titular del Departament
d'Enginyeria Qumica de la Universitat Autnoma de Barcelona
CERTIFICAN:
Que el licenciado Antonio Snchez Ferrer ha realizado, bajo
nuestra direccin, el trabajo que, con ttulo "Recuperacin,
purificacin y caracterizacin de lipasas producidas por
Candida rugosa. Aplicacin a la resolucin de
compuestos quirales y diseo del reactor enzimtico",
presenta en esta memoria, la cual constituye su Tesis para
optar al Grado de Doctor en Ingeniera Qumica.
Y para que conste a los efectos que corresponda,

presentamos a la Escola Tcnica Superior d'Enginyeria de la
Universitat Autnoma de Barcelona el trabajo citado,
firmando el presente certificado en Bellaterra, a 1 de
Setiembre de 1998.
.V
Francisco Valero Barranco Feo. Javier Lafuente Sancho

A mis padres
Agradecimientos
A lo largo de los 3 aos y medio que me ha ocupado la realizacin de este trabajo, muchas han sido las
personas que con su ayuda, atencin, saber escuchar o simple compaa se han hecho merecedoras de
aparecer en este apartado. Sin embargo, todas las tesis, corno las personas, nunca son por definicin
completas o perfectas, como estoy seguro que no lo ser la lista de gente incluida aqu en este momento.
En primer lugar, quera dedicar este trabajo a mis padres, las personas que han hecho que yo estudiara y
que siempre han procurado, dentro de sus posibilidades, que yo tuviera lo mejor.
Tambin quiero dedicar este trabajo a Laura, la que ha sido mi compaera durante todos estos aos,
recordndole la deuda que tengo con ella por todo el tiempo que este trabajo nos ha robado.
A mis amigos, Alex, Joan, Julin, Javi, Ramn, Jos Ramn y los que ahora no recuerdo, por formar parte
de mi vida y haber compartido tantas cosas conmigo, convirtindose en una parte fundamental de mi vida.
Quiero agradecer a mis directores de tesis, Paco y Javier, adems de formarme como cientfico, el haber
sabido convertirse en mis amigos, tanto que se me haga difcil llamarles ms "jefes" o "directores". A
ellos, que siempre han estado a mi lado, querra recordarles que mi compromiso personal con ellos va ms
all de estos 3 aos y medio.
Quiero dejar constancia aqu tambin de la suerte que he tenido de trabajar en un grupo de investigacin
como el de lipasas. Los conocimientos tanto cientficos como humanos que he obtenido del trabajo en este
grupo no se pueden explicar en cuatro lneas, pero me gustara citar aqu a Alberto Sanz, que ha
compartido tantas y tantas cosas y horas conmigo, Pau Ferrer y Jos Lus Montesinos, que me han
inculcado el rigor como norma de trabajo, y a Caries Casas, cuya experiencia y sentido comn han sido
uno de los pilares de mi formacin.
Mencin aparte querra hacer de Alicia, que para m ha sido como un soplo de aire fresco en momentos
crticos de mi trabajo. Su simpata, compaa y ayuda quedarn siempre en mi memoria.
A Oriol, me gustara desearle toda la suerte del mundo en su tesis.
Me gustara hacer extensivo este agradecimiento a toda la gente del Departament d'Enginyeria Qumica,
por crear el entorno de trabajo adecuado en el que ha sido posible desarrollar este trabajo.
En particular, me gustara agradecer a todos aquellos que me han demostrado que ser Doctor es algo ms
que comparecer ante un tribunal durante unos minutos y redactar un manuscrito, entre ellos a Pau Ferrer,
Jos Lus Montesinos, Montse Sarr, Joan Albiol, Jos Lus del Ro, Eugenio Ferreira, Fel Vzquez,
Nuria Adroer, Caries Campmaj y sobretodo, Goyo Alvaro, cuya colaboracin fue clave en ciertos
momentos de esta tesis.
Tambin me gustara dar las gracias a aquella gente que me ha ayudado en un momento u otro en el
laboratorio, en particular a Silvia Romero y Merc Fit.
A Juan Baeza y David Gabriel, por compartir tantos conocimientos, experiencias y otras cosillas.
A la gente del grupo de Pptidos, por el inters que demostraron y por sus aportaciones a este trabajo, en
especial, a Gloria Caminal.
A dos personas para m muy especiales que compartieron conmigo algo ms que sus horas de trabajo,
Rosi Tello y Manuel Plaza, que adems pueden sentirse coautores de este trabajo.
A la gente de la Escuela de Mollet, en particular Xavi y Ma Angels, por haber confiado en m, y a los que
espero corresponder en los prximos aos.
A Caries Sol, por sus clases.
A Manel Poch, por haberse interesado siempre en m y en mi trabajo.
A la gente de Purac Bioqumica, por los ocho meses que pas all aprendiendo a ver las cosas desde otro
punto de vista.
A Nacho, por todos los momentos que hemos compartido "en las ondas" y a toda la gente annima que he
conocido virtualmente.
A la tropa que nos reunimos a comer en la Merc, Joan, Jos Lus, Alberto, Femando, Oriol, etc. por los
ratos que hemos pasado juntos.
A las seoras de la limpieza de la UAB, por haber sido mi nica compaa en muchas horas de la
realizacin de este trabajo.
A la Generalitat de Catalunya, que me financi con una beca durante la realizacin del trabajo y a la
Universitat Autnoma de Barcelona, que me permiti la realizacin de este trabajo.
A los programas BIO-4-96-0005 (European Program on Biotechnology), QFN94-4627-C02-1 (Programa

de Qumica Fina, Plan Nacional de R+D. CIRTT, Generalitat de Catalunya) y CICYT-QUI97-0506-C03
(Programa Espaol en Tecnologas de Procesos Qumicos) que financiaron nuestro proyecto de
investigacin durante estos aos.
A toda la gente que particip en dichos proyectos y con la que he tenido la suerte de trabajar, A Marisa
Ra y su equipo de la Universidad de Vigo, a Jos Manuel Guisan y su equipo del Instituto de Catlisis y
Petroleoqumica de Madrid y a Jos Mara Snchez-Montero, Chami, Isidoro, Andrs, Jos Vicente y
compaa del Departamento de Qumica Orgnica y Farmacutica de la Facultad de Farmacia de Madrid
por su acogida cuando estuve all. Tambin me gustara acordarme de Ernst Wehtje (you really saved my
life!).
A toda la fauna del Koko, y a los buenos ratos de mi vida que han pasado all.
A los hroes (definidos por Alexis Mquina), a SK o RB, a los hermanos Gallagher y a la lluvia
ndice
NDICE
0. Resumen 1
1. Introduccin 3
1.1. El papel de las lipasas en la Biotecnologa 3
1.1.1. Enzimas. Definicin de lipasas: actividad lipoltica y estersica 3
1.1.2. Fuentes de obtencin de lipasas. Especificidad 5
1.1.3. Reacciones catalizadas por lipasas 6
1.1.4. Aplicaciones biotecnolgicas de las lipasas 8
1.2. Precedentes en la produccin de lipasas 11
1.3. Mtodos de purificacin y caracterizacin de protenas 12
1.3.1. Mtodos de concentracin de protena 12
1.3.2. Mtodos de precipitacin 14
1.3.3. Cromatografa 16
1.3.3.1. Cromatografa de intercambio inico 17
1.3.3.2. Cromatografa de filtracin en gel 17
1.3.3.3. Cromatografa hidrofbica 19
1.3.3.4. Cromatografa de afinidad 21
1.3.3.5. Cromatoenfoque 22
1.3.4. Electroforesis 22
1.3.5. Electroforesis capilar 23
1.4. Lipasas de Candida rugosa 26
1.4.1. Estructuray mecanismo de reaccin 26
1.4.2. Isoformas presentes 27
1.4.3. Purificacin de las isoformas presentes en Candida rugosa 29
1.4.4. Diferencias entre reactividad entre las isoformas 32
1.4.5. Obtencin de una lipasa de propiedades catalticas reproducibles ..33
1.5. Utilizacin de enzimas en medio orgnico 35
1.5.1. Introduccin. Ventajas y desventajas 35
1.5.2. Eleccin del disolvente. Influencia del agua 36
1.5.3. Inmovilizacin de enzimas 37
ndice II
1.5.3.1. Introduccin 37
1.5.3.2. Tcnicas de inmovilizacin de enzimas 38
1.5.3.3. Seleccin de la tcnica de inmovilizacin 41
1.6. Bioreactores enzimticos 43
1.6.1. Reactores ideales. Distribucin de tiempo de residencia (DTR) 43
1.6.2. Modelos de flujo 46
1.6.2.1. Modelo de dispersin axial 46
1.6.2.2. Modelo de tanques en serie 47
1.6.2.3. Modelos compartimentados 47
1.6.3. Tipos de reactores enzimticos 48
1.6.4. Procesos industriales enzimticos 51
1.7. Utilizacin de lipasas 53
1.7.1. Inmovilizacin de lipasas 53
1.7.2. Cinticas enzimticas para lipasas 58
1.7.3. Bioreactores con lipasas 61
1.7.4. Formas de expresar y calcular la enantioselectividad 64
1.7.5. Resolucin de cidos 2-aril propinicos con lipasas 66
1.7.5.1. Precedentes 66
1.7.5.2. Factores que afectan a este tipo de reacciones 68
1.7.6. Resolucin de rans-2-fenil-ciclohexanol con lipasas 80
1.8. Valoracin econmica de procesos 81
1.8.1. Estimacin de las partidas necesarias 81
1.8.2. Clculo de Net Cash Flow (NCF) y Rent Discounted Cash
Flow(RDCF) 83
2. Objetivos 85
3. Materiales y mtodos 87
3.1. Metodologa experimental 87
3.1.1. Fermentacin 87
3.1.1.1. Montaje experimental de la fermentacin 87
3.1.1.2. Medio y reactivos de la fermentacin 88
3.1.1.3. Mantenimiento de la levadura y sistema de inculos 89
3.1.2. Separacin 90
ndice i.J.1
3.1.3. Cromatografa en FPLC 91

3.1.3.2. Cromatografa de gel filtracin 92
3.1.3.3. Cromatografa de interaccin hidrofbica 93
3.1.4. Electroforesis 93
3.1.5. Reacciones no quirales 94
3.1.5.1. Reacciones de hidrlisis 94
3.1.5.2. Reacciones de sntesis 94
3.1.6. Inmovilizacin 94
3.1.6.1. Inmovilizacin sobre Celita y Poliamida 94
3.1.6.2. Inmovilizacin sobre Duolite 95
3.1.6.3. Inmovilizacin sobre EP100 95
3.1.7. Reacciones quirales 95
3.1.8. Diseo de experimentos 97
3.1.9. Montaje de las reacciones en continuo 97
3.2. Mtodos de anlisis 98
3.2.1. Fermentacin y purificacin 98
3.2.1.1. Determinacin de la biomasa por peso seco 98
3.2.1.2. Test de actividad lipoltica por mtodo turbidimtrico 98
3.2.1.3. Anlisis colorimtrico de la actividad estersica 99
3.2.1.4. Anlisis de protena total por el mtodo de Lowry 99
3.2.1.5. Anlisis de protena total por el mtodo de Bradford 100
3.2.1.6. Determinacin de los polisacridos totales por el
mtodo de la Antrona 101
3.2.2. Reacciones con lipasas 102
3.2.2.1. Anlisis de cido propinico por Cromatografa de
Gases 102
3.2.2.2. Anlisis de propionato de n-butilo por Cromatografa
de Gases 103
3.2.2.3. Anlisis de hexanol por Cromatografa de Gases 104
3.2.2.4. Anlisis de butanol por HPLC 105
3.2.2.5. Anlisis de enantimeros de ibuprofeno por HPLC 106
ndice IV
3.2.2.6. Anlisis de enantimeros del cido 2-fenil-propinico

porHPLC 107
3.2.2.7. Anlisis de enantimeros de /raAw-2-fenil-l-ciclohexanol
porHPLC 108
4. Resultados y discusin 109

4.1. Produccin de la lipasaUAB 109
4.1.1. Estrategia de fermentacin 109
4.1.2. Determinacin de la ley de adsorcin de lipasas sobre
el cido oleico 111
4.1.3. Conclusiones 120
4.2. Separacin de la lipasa UAB 121
4.2.1. Obtencin de un concentrado lquido de lipasas UAB 121
4.2.2. Obtencin de una lipasa UAB slida 124
4.2.2.1. Precipitacin con etanol 124
4.2.2.2. Precipitacin con sulfato amnico 125
4.2.2.3. Liofilizacin directa 127
4.3. Estimacin econmica del proceso de produccin de lipasas UAB 131
4.3.1. Partidas que componen la estimacin econmica 131
4.3.1.1. Ventas (V) 131
4.3.1.2. Inmovilizado (I) , 131
4.3.1.3. Costes 133
4.3.1.4. Amortizacin 136
4.3.1.5. Capital circulante 136
4.3.2 Clculo de la rentabilidad 137
4.4. Caracterizacin de la lipasa UAB y comparacin con lipasas
comerciales de Sigma 1754-tipo VII 139
4.4.1. Determinacin de las protenas presentes en la lipasa UAB 139
4.4.2. Separacin de las distintas protenas presentes 144
ndice v
4.4.3.2. Cromatografa de gel filtracin. Relacin lipasa-
polisacrido 147
4.4.3.3. Cromatografa de interaccin hidrofbica: separacin
de bandas 3 y 4 149
4.5. Utilizacin de la lipasa UAB libre en reacciones de sntesis no quirales... 157
4.5.1. Esterificacin del cido propinico con alcoholes lineales 157
4.6. Inmovilizacin de la lipasa UAB 163
4.6.1. Necesidad de inmovilizarla lipasa UAB 163
4.6.2. Inmovilizacin por adsorcin 163
4.6.2.1. Inmovilizacin sobre celita y poliamida 164
4.6.2.2. Inmovilizacin sobre Duolite... 167
4.6.2.3. Inmovilizacin sobre EP100 170
4.6.3. Inmovilizacin por unin covalente 172
4.7. Utilizacin de la lipasa UAB inmovilizada en reacciones de sntesis
quirales 175
4.7.1. Eleccin de las reacciones 175
4.7.2. Condiciones de reaccin. Eleccin de la enzima 177
4.7.3. Comparacin entre lipasa UAB y Lipozyme IM20 178
4.8. Estudio de la esterifcacin enantioselectiva de ibuprofeno mediante
Lipozyme EVI20 185
4.8.1. Metodologa general 185
4.8.2. Determinacin de los factores que influyen en la reaccin 186
4.8.3. Diseo de experimentos 188
4.8.4. Determinacin de la cintica de reaccin 199
4.8.5. Seleccin de tipo de reactor en continuo: RCFP o RCTA 205
4.8.6. Estudios en un RCFP 207
4.8.7. Comportamiento del agua en el sistema 212
4.8.8. Estudio hidrodinmico del RCFP: DTR 215
ndice VI

4.9. Estudio de la esterificacin enantioselectiva de fras-2-fenil-l-
ciclohexanol conlipasaUAB 225
4.9.1. Optimizacin de las condiciones de reaccin 225
4.9.2. Determinacin de la cintica en el ptimo 232
4.9.3. Eleccin del tipo de reactor 234
4.9.4. Funcionamiento del RCFP 235
5. Conclusiones 239
6. Nomenclatura 241
7. Bibliografa 243
7.1. Referencias 243
7.2. Bibliografa electrnica 262
8. Apndices 263
8.1. Calibrado de la actividad lipoltica 263
8.2. Calibrado de actividad estersica 264
8.3. Calibrado de protena total por el mtodo deLowry 265
8.4. Calibrado de protena total por el mtodo de Bradford 266
8.5. Calibrado de polisacridos por el mtodo de la Antrona 267
8.6. Calibrado de cido propinico por cromatografa de gases 268
8.7. Calibrado de propionato de n-butilo por cromatografa de gases 269
8.8. Calibrado de hexanol por cromatografa de gases 270
8.9. Calibrado de butanol por HPLC 271
8.10. Anlisis de ibuprofeno por columna de HPLC quiral 272
8.11. Anlisis de cido 2-fenil propinico por columna de HPLC quiral 273
8.12. Anlisis de ra5-2-fenil-l-ciclohexanol por columna de HPLC quiral ..274
8.13. Cromatografa en FPLC 275
8.14. Diseo de experimentos 276
8.15. Programa de control de la microbureta 280
Resumen
0. RESUMEN
En esta memoria se presentan los resultados obtenidos en el estudio de la aplicacin de

las lipasas producidas por Candida rugosa mediante fermentacin en la resolucin de
compuestos quirales de inters farmacutico por medio de reacciones de esterificacin en
medio orgnico.
En el presente trabajo se ha iniciado la separacin de lipasas producidas por

fermentacin de Candida rugosa creciendo sobre cido oleico en un proceso fed-batch a
escala planta piloto, consiguindose una lipasa claramente superior en trminos de actividad
lipoltica a los preparados comerciales proporcionados por Sigma y Amano. La recuperacin
de un preparado slido conteniendo estas lipasas (denominado lipasa UAB) se realiz por
mtodos sencillos y fcilmente escalables como centrifugacin, filtracin, ultrafiltracin y
liofilizacin, que originaron recuperaciones de actividad superiores al 90 %. Al mismo
tiempo, se presenta una evaluacin econmica preliminar del proceso.
Se ha conseguido la caracterizacin de las protenas presentes en el preparado slido

final, describindose la presencia de dos isoenzimas correspondientes a dos genes de lipasa de
Candida rugosa. Tambin se ha descrito la presencia de al menos dos protenas de naturaleza
estersica, que se han conseguido purificar mediante la implementacin de un sistema de
purificacin por cromatografa hidrofbica y de intercambio inico utilizando la tecnologa
FPLC.
Se ha comprobado la potencialidad del uso de la lipasa UAB en reacciones de sntesis

con substratos de naturaleza no quiral, originando resultados similares a los de las lipasas
comerciales de Candida rugosa de Sigma y Amano.
Se ha estudiado la inmovilizacin de la lipasa UAB sobre distintos soportes: celita,

poliamida, duolite, toyopearl y EP100, resultando el mejor soporte el EP100, con el que se
obtiene un biocatalizador de actividad comparable al producto Lipozyme EVI20 de Novo
Resumen
Nordisk (que corresponde a lipasa deMucor tniehei inmovilizada sobre duolite) en reacciones
de sntesis no quiral.
Se ha estudiado la utilizacin de la lipasa UAB inmovilizada sobre EP100 en la

resolucin de substratos de naturaleza quiral de inters farmacutico (antiinflamatorios no
esteroidales) como el cido 2-fenil propinico y el ibuprofeno mediante esterifcacin con
butanol en isooctano. En ambos casos la lipasa UAB origin resultados superiores en
enantioselectividad pero inferiores en velocidad de sntesis cuando se compar a Lipozyme
IM20. Tambin se ha estudiado la resolucin de /r<ms'-2-fenil-ciclohexanol (intermediario
para la produccin de otros compuestos quirales) con cido propinico en isooctano, en cuyo
caso slo con la lipasa UAB se obtuvo una resolucin satisfactoria.
Se ha desarrollado un sistema en continuo para la resolucin altamente

enantioselectiva de ibuprofeno utilizando Lipozyme IM20. La determinacin de las
condiciones ptimas de reaccin se realiz mediante un diseo de experimentos factorial. El
sistema en continuo propuesto consiste en un reactor de lecho fijo con flujo pistn que mostr
un funcionamiento ptimo durante 100 horas de operacin. Mediante tcnicas de distribucin
de tiempo de residencia se estudi el comportamiento hidrodinmico del reactor demostrando
estar prximo a un flujo pistn ideal.
El sistema en continuo tambin se utiliz con xito en la resolucin altamente

enantioselectiva de r<ms-2-fenil-ciclohexanol utilizando lipasa UAB inmovilizada sobre
EP100. La determinacin de las condiciones ptimas de reaccin se realiz de nuevo
mediante un diseo de experimentos factorial.
Introduccin
1. INTRODUCCIN
1.1. El papel de las lipasas en la Biotecnologa
1.1.1. Enzimas. Definicin de lipasas: actividad lipoltica y estersica
Una de las aplicaciones ms comunes de la Biotecnologa es la produccin y

utilizacin de enzimas. Las enzimas son substancias de naturaleza proteica y como
biocatalizadores presentan grandes ventajas sobre los catalizadores qumicos ms comunes
como son su mayor especificidad y selectividad, principalmente debido al hecho de que son
catalizadores pticamente selectivos, adems de trabajar en condiciones de reaccin cercanas
a las que se encuentran en medios fisiolgicos, al contrario de la mayora de reacciones
qumicas convencionales. Este hecho implica, adems, la ausencia de productos secundarios
con la consiguiente simplificacin, a priori, de las etapas de separacin y purificacin.
Por el contrario, las enzimas presentan una serie de inconvenientes como son su
elevado coste y su poca estabilidad en medios y condiciones alejadas de las fisiolgicamente
habituales, en particular, es marcada la dependencia de la actividad de una enzima con
factores ambientales como temperatura, presin o pH y operacionales como agitacin,
aireacin, etc. Por otro lado, la presencia de inhibiciones que modifican la actividad
enzimtica, obliga a trabajar habitualmente a concentraciones de substratos y productos bajas,
lo que muchas veces provoca un encarecimiento de la etapa de purificacin del producto de
inters.
Las lipasas (triacilglicerol ster hidrolasas: EC. 3.1.1.3) pertenecen a un grupo de

enzimas hidrolticos cuya funcin biolgica es catalizar la hidrlisis de triglicridos para
obtener como productos finales cidos grasos libres y glicerol o productos intermedios como
mono o diglicridos. En la figura 1.1 se puede observar cual sera la reaccin natural de las
lipasas en medio acuoso.
Introduccin
CH,OH
O-R
3H,O CHOH + 3RCOOH
-O R
HC' CHiOH
O-R
Trigcrido Glioerol Acido graso
Fig. 1.1.: Accin tpica de las lipasas hidrolizando un triglicrido.
En la naturaleza, las lipasas actan en la interfase orgnico-acuosa, y su modelo

cintico normalmente no se ajusta a cinticas del tipo Michaelis-Menten siendo generalmente
mucho ms complejo (Verger et al, 1990). De hecho, la caracterstica claramente
diferenciada de las lipasas con respecto a otros enzimas que tambin pueden hidrolizar esteres
como las esterasas es la necesidad de una interfase orgnico-acuosa para realizar dicha
funcin cataltica.
Los substratos propios de las lipasas son esteres insolubles y cuando la enzima acta
en esta interfase orgnico-acuosa se habla de actividad lipoltica y su cintica no puede ser
descrita por el modelo clsico de Michaelis-Menten. En el caso de la actividad lipoltica
normalmente se produce un fenmeno de adsorcin inicial sobre la fase orgnica, al que sigue
la reaccin propiamente dicha sobre la interfase, con la formacin de complejo enzima-
substrato y posterior liberacin de los productos a la fase acuosa con la posterior regeneracin
de la enzima (Jaeger et al, 1994).
En el caso de la actividad estersica la situacin es completamente diferente puesto

que las esterasas catalizan hidrlisis de esteres solubles, trabajando sin interfase y pudiendo
describirse su cintica mediante modelos de Michaelis-Menten. En este punto, es necesario
sealar que la mayora de lipasas son tambin esterasas, sin embargo, no ocurre lo mismo con
las esterasas, que no suelen catalizar reacciones con substratos insolubles, precisamente por la
necesidad de trabajar en la interfase.
Introduccin
1.1.2. Fuentes de obtencin de lipasas. Especificidad
Si bien la primera fuente de obtencin de las lipasas fue a partir de pncreas de

mamferos (cerdos generalmente) en la actualidad se obtienen va fermentativa a partir de una
amplia variedad de microorganismos entre los que se encuentran bacterias (Jaeger et al,
1994), levaduras y hongos (Rapp y Backhaus, 1992). En particular, las lipasas producidas por
bacterias, como las producidas por las especies Pseudomonas, las producidas por hongos que
pertenecen a las especies Penicillium, Rhizopus, Rhizomucor, Geotrichum y las de levaduras
como distintas especies de Candida son las ms destacadas en cuanto a produccin industrial.
La produccin de lipasas a partir de cada uno de los microorganismos depende en gran

medida de factores ambientales, como temperatura o pH, composicin del medio de
fermentacin: fuentes de carbono, nitrgeno, concentracin de sales inorgnicas, as como
porcentaje de oxgeno disuelto, pudiendo estos factores alterar la estructura de la enzima y la
relacin lipasa extracelular/intracelular. Las condiciones habitualmente utilizadas son:
temperatura alrededor de los 30C, pH en zona neutra y condiciones aerobias. Como fuente de
carbono se suele utilizar una fuente mixta compuesta por un glcido y un lpido, actuando este
ltimo como inductor para la produccin de lipasas. Como fuente de nitrgeno se suele
utilizar urea o sales inorgnicas de amonio.
En el Departament d'Enginyeria Qumica de la Universitat Autnoma de Barcelona se

han estudiado los diversos factores que afectan a la fermentacin de Candida rugosa para la
produccin de lipasas. Se estudiaron fuentes de carbono mixtas (Valero et al., 1991)
destacando un crecimiento ptimo en aceite de oliva y constatndose el efecto inhibitorio de
la glucosa sobre la produccin de lipasas. Posteriormente se estudi el efecto de introducir los
componentes del aceite de oliva, glicerol y cido oleico, por separado (Del Ro et al., 1990)
observndose que se produca un crecimiento diauxico en el cual primero se consuma el
glicerol y despus el cido oleico, en cuya fase se produca la produccin de la enzima.
Finalmente se eligi el cido oleico como substrato de entre los distintos cidos grasos
probados (Obradors et al, 1993). Actualmente se trabaja con cido oleico como nica fuente
de carbono y se ha desarrollado un modelo matemtico estructural para describir el
crecimiento de Candida rugosa y la produccin de lipasas (Montesinos et al, 1995).
Introduccin
Recientemente se ha constatado el efecto que sobre la produccin de lipasas tiene el tamao

de la gota de cido oleico (Dalmau et al, 1998) y su importancia como criterio de escalado en
operaciones de produccin de lipasas a escala piloto.
Por otro lado, la especificidad de las lipasas est directamente relacionada con el
microorganismo productor de las mismas. De acuerdo con esto, existen lipasas no
especficas, es decir, aqullas que hidrolizan el triglicrido en cualquiera de sus posiciones,
obtenindose como productos intermedios (1,2)(2,3)(1,3) diglicridos y monoglicridos. A
este grupo pertenece la lipasa de Candida rugosa y la de Candida crvala (Rose y Harrison,
1989). Por lo que se refiere a lipasas especficas, dicha especificidad puede ser de dos tipos:
1) Posicional: cuando se hidrolizan preferentemente ciertas posiciones del triglicrido,

normalmente las posiciones 1 y 3 que son las ms accesibles, por ejemplo, pertenecen a
este tipo las lipasas producidas por Yarrowia lipolytica, Candida deformans, Aspergillus
niger, Rhizopus arrhizus, Rhizopus japonicus y Rhizopus delemar (Macrae, 1983; Macrae
y Hammond, 1985; Rose y Harrison, 1989).
2) De cido graso: cuando se cataliza la hidrlisis de un determinado tipo de cido graso
particular de un triglicrido. Ejemplos de este tipo son las lipasas de Penicillium
cyclopium, Aspergillus niger, Rhizopus delemar, y Geotrichum candidum (Borgstrm y
Brockman, 1984; Sidebottom etal., 1991).
1.1.3. Reacciones catalizadas por lipasas
El inters de algunos tipos de lipasa es consecuencia de su accin especfica sobre

unos enlaces qumicos determinados. Esto permite una amplia serie de aplicaciones como la
resolucin de compuestos quirales y la obtencin, con un alto rendimiento, de cidos grasos
de elevada pureza a partir de aceites y grasas. En general, las lipasas tambin catalizan otras
reacciones no necesariamente lipolticas, lo que hace que esta enzima tenga una amplia
utilizacin en reacciones muy diversas.
Otras aplicaciones muy interesantes vienen dadas por la capacidad de estos enzimas de
Introduccin
catalizar la reaccin inversa lo que permite la sntesis de esteres, la transesterifcacin y la

interesterifcacin (Jaeger et al, 1994). En estos ltimos casos citados la concentracin del
agua en el medio ser un parmetro clave para desplazar el equilibrio hacia la sntesis de los
productos de inters, siendo muy comunes los sistemas de eliminacin continua del agua
formada durante la reaccin (Kwon et al, 1995).
La transesterificacin se define como una reaccin de sntesis en la cual el acil

donador es un ster, y se distinguen dos tipos de transesterificaciones, glicerlisis y
alcohlisis, segn sea el glicerol o un alcohol el acil receptor. En la figura 1.2 se puede
observar el mecanismo de la transesterifcacin.
O
II Lipasa
T " i
Alcohlisis R,COR2 R3OH -^ R3COR, ROH
O
O un UUJ
II Lipasa
Glicerlisis R,COR, un Url
/-XTT
R2OH
OH OH
Fig. 1.2.: Tipos de transesterificaciones con lipasas.
Por otro lado, la interesterificacin es un proceso til para cambiar la composicin de

cidos grasos en un enlace ster, en el cual el grupo acil se intercambia entre un ster y un
cido graso (acidlisis) o entre dos esteres como se presenta en la figura 1.3.
Lipasa ^ O O
i? II II
R3COH R,COH R3COR2
O Acidlisis
u
R,COR2
O O O
II Lipasa II II
R3COR4 R,COR4 R3COR2
Fig. I.3.: Tipos de intersesterificaciones con lipasas.

Introduccin
1.1.4. Aplicaciones biotecnolgicas de las lipasas
Las aplicaciones biotecnolgicas clsicas con inters industrial de las lipasas estn
ntimamente ligadas a los distintos tipos de reacciones que son capaces de llevar a cabo, as
pues, se tienen distintas posibilidades:
a) Reacciones de hidrlisis:
Hidrlisis de aceites vegetales en la industria oleoqumica (Piazza, 1991).
- Produccin de aromas y sabores para la industria alimentaria,
- Inclusin en detergentes para la eliminacin de manchas de grasas.
- Finalidades analticas para la determinacin de la estructura de triglicridos.
- Resolucin de mezclas quirales (Ushio et al., 1992).
b) Reacciones de sntesis:
Sntesis de triglicridos (Ergan y Irani, 1991).
Sntesis de precursores de pptidos (Matos et al, 1987).
- Produccin de esteroides para la industria farmacutica.
- Resolucin de mezclas racmicas de alcoholes en la industria farmacutica (Hedstrm et
al, 1993).
Sntesis de alcoholes terpnicos como saborizantes (Nishio et al, 1987).
Sntesis de esteres glucdicos para la industria cosmtica (Seino et al, 1984).
c) Reacciones de interesterificacin:
- Variacin de la composicin de cidos grasos en mezclas de triglicridos (Wisdom et al,
1987).
- Eliminacin de cidos grasos responsables de causar la inestabilidad en el sabor de ciertos
aceites y mantequillas (Kaimal y Saroja, 1988).
d) Reacciones de transesterificacin:
- Preparacin de compuestos enantiomricamente puros (Santaniello et al, 1993).
- Transesterificaciones enantioselectivas dobles (Theil y Bjorkling, 1993).
Introduccin
Actualmente, el estudio de las lipasas se encamina a una serie de aplicaciones de

qumica fina de inters fundamentalmente farmacutico, bsicamente en el campo de la
resolucin de compuestos quirales. Las normativas de legislacin en las que se tiende a exigir
productos pticamente puros en lugar de mezclas racmicas estn provocando un gran
esfuerzo de investigacin en el campo de las lipasas como biocatalizadores
enantiomricamente activos. Algunos de los trabajos en los que se est haciendo particular
hincapi son:
- Preparacin de cicloalcanoles enantiomricamente puros como intermediarios de

reacciones de inters farmacolgico (Taylor et al, 1997).
Sntesis enantioselectiva de a-Amino-{3-hidroxi cidos como productos para elucidar
estructuras tridimensionales de protenas y pptidos (Sutherland y Willis, 1997).
Preparacin de anlogos de hormonas enantiomricamente puros (Nishizawa et al,
1997).
Preparacin de enantimeros puros del cido 2-ariI-propinico, como ibuprofeno,
naproxeno, ketoprofeno, etc. de utilidad farmacolgica como antiinflamatorios (Botta et
al, 1997; ChangyTsai, 1997).
Sntesis altamente diestereoselectiva de p-Lactonas como intermediarios para la
produccin de compuestos quirales (Yang et al, 1997).
- Produccin de agentes antipsicticos como derivados de butiro fenonas
enantiomricamnete puros (Gil et al, 1997).
Sntesis de piranonas pticamente puras, tiles en ciertas reacciones quirales como
adiciones cclicas (Van den Heuvel et al, 1997).
Resolucin cintica de alcoholes secundarios (Legros et al, 1997'; Ljubovic and Sunjic,
1997).
Preparacin de quinonas diterpenoides tiles en el tratamiento de la artritis (Yamamura et
al, 1997).
- Produccin de biosurfactantes como cido araquidnico de aplicacin en la industria de
la alimentacin, cosmtica y farmacutica (Ward et al, 1997).
- Preparacin de etanolaminas pticamente activas de inters fisiolgico en medicina
(Furutaniea/., 1997).
10 Introduccin
Bioconversin de triglicridos con cidos grasos poliinsaturados a hidroperxidos de alta

reactividad en la industria alimentaria (Gargouri y Legoy, 1997).
Sntesis de productos antitumorales como acetomicina (Kinderman y Feringa, 1998).
Sntesis de amidas quirales a partir de mezclas racmicas de esteres de amidas (De Castro
y Gago, 1998).
Sntesis de antioxidantes derivados de la vitamina E (benzofuraniles) para el tratamiento
de ciertas enfermedades (Ayers et a/., 1997).
Transesterificacin de 1,3-propanodioles para la construccin de 3-acetoxipropanoles
usados en la sntesis de alcaloides (Fadel y Arzel, 1997).
Sntesis de compuestos fluoroorgnicos de inters en medicina y biologa en sntesis de
biomolculas (Goj etal, 1997).
Preparacin de cianocicloalcanoles para la posterior produccin de 1,3-heterociclos
(Forro et al, 1997).
Construccin de biosensores, por ejemplo, para la determinacin de cidos grasos en
alimentos (Schoemaker et al, 1997).
Produccin de peroxi cidos importantes en sntesis orgnica y en la industria qumica
(Klaas y Warwel, 1997).
Resolucin de antibiticos como nitroimidazoles (Skupin et al, 1997).
Introduccin ^ ______ 11
1.2. Precedentes en la produccin lipasas
Hace aproximadamente 12 aos que en el Departament d'Enginyeria Qumica de la

Universitat Autnoma de Barcelona se comenz una nueva lnea de investigacin con el ttulo
general de monitorizacin y control de biorreactores. Uno de los procesos escogidos para la
monitorizacin y el control del mismo fue la produccin de lipasas por Candida rugosa.
A lo largo de estos aos se han realizado avances importantes en la produccin de la

enzima, siempre trabajando con la cepa de coleccin sin alterarla genticamente, a base de
optimizar las condiciones ambientales del medio de fermentacin (fuentes de carbono y
nitrgeno, condiciones de aireacin) y utilizando diferentes estrategias de operacin. Todo
este trabajo ha permitido el aumento de la produccin de la enzima en un factor entre 50 y 75
veces. La monitorizacin prcticamente completa de la fermentacin, consiste en el
seguimiento en lnea de la actividad enzimtica y las velocidades de consumo de oxgeno
(OUR) y de produccin de C2 (CER) mediante espectrometra de masas. A partir de esta
ltima medida y mediante la utilizacin de "software sensors" se han estimado otros
parmetros clave de la fermentacin como la biomasa, velocidad especfica de crecimiento y
substrato consumido (Montesinos et al, 1993a; Montesinos et al., 1994).
Toda esta informacin obtenida a travs de experimentos en discontinuo y continuo ha

desembocado en la elaboracin de un modelo matemtico estructurado que describe
correctamente el proceso (Montesinos et al., 1995) y que ha permitido, mediante
simulaciones, establecer diferentes estrategias de operacin en fed-batch (caudal de adicin
constante, velocidad especfica de crecimiento constante, relacin substrato/biomasa
constante) como las ms rentables desde el punto de vista de productividad, expectativas que
han sido comprobadas experimentalmente (Gordillo et al., 1998). Informacin exhaustiva del
desarrollo de estos sistemas se encuentra en los trabajos de Valero (1990), Del Ro (1991),
Montesinos (1993b), Gordillo (1996) y Sanz (1998).
Es en este punto, en el que se tiene un gran conocimiento del sistema y una gran
monitorizacin del mismo, en el que se plantea la recuperacin de la enzima de nuestros
propios caldos de cultivos y su utilizacin en reacciones de qumica fina,
12 Introduccin
1.3. Mtodos de purificacin y caracterizacin de protenas
1.3.1. Mtodos de concentracin de protena
Normalmente, la concentracin de protena resultante al final de una fermentacin es

del orden de unos pocos gramos por litro, pudiendo llegar a ser del orden de miligramos por
litro. Esto impulsa a la investigacin de mtodos de concentracin de la protena a partir del
caldo de cultivo, adems de perseguir la eliminacin de ciertos componentes como son la
biomasa (para protenas extracelulares, como es el caso de la lipasa de Candida rugosa) y la
reduccin de la elevada concentracin de sales inorgnicas que suelen tener los medios de
fermentacin.
Un proceso tipo para la obtencin de un producto obtenido por va biotecnolgica

suele constar de las siguientes etapas (Belter et a/., 1988):
1. Eliminacin de insolubles: bsicamente filtracin y centrifugacin como operaciones

unitarias, producen poca concentracin y mejora de la calidad del producto.
2. Aislamiento de productos: etapa en la que se eliminan materiales de propiedades muy
distintas al producto de inters, y donde suele ocurrir una apreciable concentracin y
mejora de la calidad del producto.
3. Purificacin: donde mediante tcnicas altamente selectivas se separa el producto de
inters de productos de caractersticas fsico-qumicas similares.
4. Cristalizacin: etapa final para la obtencin de un slido de alta pureza.
En casos reales, como operaciones de separacin de la biomasa se pueden destacar:
1. Centrifugacin: operacin unitaria slido-lquido en la que un slido y un lquido se

separan por diferencias de densidad al aplicarles una fuerza centrfuga. La separacin del
slido y el lquido puede ser tipo sedimentacin al campo centrfugo o tipo filtracin con
filtros centrfugos.
Introduccin 13
2. Filtracin: operacin bsica en la que se separan slidos en suspensin en un lquido

haciendo pasar la mezcla por un poro que es capaz de retener el slido.
3. Decantacin: con el mismo principio que la centrifugacin pero los slidos son
separados por diferencia de densidad con respecto al lquido sometidos nicamente a la
accin de la fuerza de la gravedad.
Una vez se dispone de una corriente libre de biomasa, se impone la tarea de reducir de
forma considerable el volumen del caldo y concentrar, por tanto, el producto de inters. En
esta fase, se requerir tambin una disminucin de la concentracin de las sales u otros
complementos del medio. En este campo, existen diversas operaciones de uso muy general
(Deutscher, 1988):
1. Dilisis: usada para la eliminacin de componentes de bajo peso molecular, normalmente

sales inorgnicas, se basa en las propiedades de una membrana semipermeable que
permite el paso a molculas de un determinado corte molecular, siendo el transporte
consecuencia de una diferencia de concentracin a ambos lados de la membrana.
2. Ultrafiltracin: tambin basada en el uso de una membrana semipermeable con un rango
definido de corte molecular, aunque a diferencia de la dilisis implica el uso de fuerza
para favorecer el paso del lquido a travs de la membrana, ya sea con presin, vaco o por
fuerza gravitacional. Es una tcnica verstil cuyo uso es aplicable desde escala de
laboratorio a industrial. Las membranas de ultrafiltracin deben ser estructuras slidas,
rgidas y estables a la presin de trabajo y adems tener el corte apropiado para la
concentracin de la protena de inters, es decir, lo ms cercano posible al peso de la
protena pero asegurando la completa recuperacin. Una tendencia conocida de las
membranas de ultrafiltracin es su capacidad de adsorber protena en la superficie,
especialmente las de celulosa, siendo recomendable el uso de membranas de polisulfona
cuya afinidad qumica por las protenas es mucho menor. Otro efecto conocido en la
ultrafiltracin es la disminucin del flujo a travs de la membrana con el paso del tiempo,
fenmeno causado por la polarizacin de la membrana y que normalmente implica el
lavado de las membranas con soluciones limpiadoras de carcter alcalino, o tener
agitacin cerca de la membrana.
14 Introduccin
3. Liofilizacin: se trata de la evaporacin por sublimacin de la solucin congelada

conteniendo la protena de inters. El sistema se compone de un recipiente adecuado, una
trampa fra de condensacin y una bomba de vaco de elevada capacidad. Normalmente,
se recomienda una rpida congelacin para favorecer la estabilidad de la protena, adems
de intentar aumentar la relacin superficie/volumen expuesto al vaco para aumentar la
velocidad de sublimacin. El gran inconveniente de esta tcnica es que no implica ningn
tipo de separacin excepto por lo que se refiere a compuestos voltiles, por lo que las sales
y otros componentes no voltiles permanecern en el slido y su concentracin aumentar
junto con la del producto de inters.
1.3.2. Mtodos de precipitacin
Estos mtodos suelen ser un paso previo a un mtodo especfico de separacin de la

protena de inters, y con ellos se suele conseguir la precipitacin no selectiva de una
conjunto de protenas. Las protenas pueden ser precipitadas causando perturbaciones en el
disolvente que afecten al pH, a la fuerza inica y a la temperatura; normalmente debido a la
adicin de elevadas concentraciones de ciertas sales o disolventes orgnicos miscibles.
En el caso de la adicin de alguna sal inorgnica esto se asocia a que el cambio de

condiciones en el disolvente provoca cambios de conformacin en la protena, bsicamente la
estructura de puentes de hidrgeno, con lo que se produce una neutralizacin de las cargas
externas de la protena por parte de la sal, originando as su precipitacin. Normalmente, el
aumento en la fuerza inica del medio provoca la agregacin de las protenas. Adems cada
sal tendr una fuerza inica diferente, pudindose clasificar de modo cualitativo ciertos iones
tpicos:
Aniones: PO43" > SO42" > CH3COO" > Cl" > Br" > NO3" > C1O3" > I" > SCN"
mayor efecto "salting-out"
Cationes: NH4+ < Rb+ < K+ < Na+ < Cs+ < Li+ < Mg2+ < Ba2+
mayor efecto caotrpico - >
Introduccin 15
Aumentando el efecto de "salting-out" se favorecen las interacciones hidrofbicas, mientras

que el efecto caotrpico las debilita.
La adicin de disolventes orgnicos suele producir cambios ms importantes, ya que

se produce una interaccin entre los grupos hidrofbicos del disolvente y los de la protena
provocando un cambio en la capa de hidratacin de sta pudiendo tener efectos ms
importantes sobre la actividad biolgica de la protena.
Como agentes precipitantes ms importantes se pueden destacar:
1) Sales inorgnicas:
- Cloruros: de sodio, potasio y calcio.

- Fosfatos: de sodio y potasio.
Sulfates: de magnesio y amonio.
Entre ellos, el sulfato amnico es, sin duda, el agente precipitante de protenas ms utilizado
(Jernejc y Legisa, 1996; Schaefer et a/., 1997) puesto que tiene una serie de caractersticas
que lo convierten en ptimo:
Su elevada solubilidad implica la precipitacin de la mayora de protenas.

Su bajo calor de disolucin, que no implica cambios en la temperatura.
Su baja densidad a elevada concentracin, lo cual no interfiere en la posterior
centrifugacin.
De hecho, incluso se han desarrollado diversas tcnicas de precipitacin fraccionada con

sulfato amnico variando la concentracin de ste (Knepper et al., 1998).
2) Disolventes orgnicos:
- Etanol (Adhirai y Selvam, 1998)

- Metanol (Kim et al., 1997)
_16 Introduccin
- Acetona (Minagawa et al., 1997)

- Acetonitrilo (Ducharme y Farinotti, 1997)
El tratamiento con disolventes orgnicos debe realizarse con extremo cuidado en las
operaciones de precipitacin de protena para obtener buenos rendimientos (Ra et al., 1993)
Por ejemplo, en el caso del etanol, se requiere:
- Temperatura siempre por debajo de los 0C.

- Agitacin adecuada durante la adicin del etanol.
- Etanol previamente enfriado a baja temperatura.
- Bao fro para absorber la transferencia de calor.
- Adicin lenta del etanol para disminuir efectos de alta concentracin local de etanol.
- Periodos de equilibracin tras cada adicin de etanol manteniendo la temperatura.
1.3.3. Cromatografa
La cromatografa es una tcnica ampliamente desarrollada en la separacin de

protenas y normalmente se usa para separar la protena de inters del resto de protenas o de
otras substancias que interaccionen fuertemente con la protena como pueden ser
polisacridos u otras macromolculas.
La cromatografa no debe de ser considerada una operacin bsica de separacin sino

un conjunto de tcnicas basadas en distintos principios que permiten aislar o separar protenas
de otras molculas de parecidas caractersticas. De acuerdo con esto, existirn diferentes
cromatografas aplicables a la purificacin de protenas. La aplicacin de la cromatografa
para protenas implica normalmente la utilizacin de instrumentacin tipo FPLC ("Fast
Protein Liquid Chromatography") o FIPLC ("High Performance Liquid Chromatography"), de
carcter normalmente analtico, aunque ambos sistemas pueden ser desarrollados a escala
preparativa.
Introduccin 17
1.3.3.1. Cromatografa de intercambio inico
El fundamento de la separacin es el punto isoelctrico (pl) de la protena e implica

dos pasos sucesivos, la unin de la protena a una serie de cargas fijas, y la posterior elucin
de la protena de dichas cargas por adicin de una solucin que vuelve a desplazar la protena.
La fase slida suele incluir rellenos de celulosa, dextranos, agarosa y poliestireno, mientras
que grupos funcionales tpicos son DEAE (dietilaminoetil), CM (carboximetil) y PE
(polietilenimina). Los eluyentes pueden ser muy variados, pero normalmente se trata de sales
tamponadas a un pH que estabilice la protena, pudindose establecer gradientes de
concentracin del eluyente para favorecer la separacin de las distintas protenas (tecnologa
FPLC).
Los rellenos de columna utilizados pueden ser de intercambio amnico (relleno con
carga positiva) o catinico (relleno con carga negativa) y la eleccin de un relleno ser
funcin del valor de los puntos isoelctricos de las protenas que contenga la mezcla. En
concreto, para protenas que se hallen a un pH superior a su pl, la carga ser negativa, con lo
que tendrn que utilizarse rellenos de intercambio aninico, y al contrario para pH inferiores
alp.
Esta tcnica est ampliamente desarrollada para la separacin de un gran rango de

protenas y es de carcter general (Breccia et al, 1998; Alfonzo et al, 1997; Cai et al, 1998),
de hecho, se ha aplicado con xito en el campo de las lipasas (Shaw y Chang, 1989; Ra et
al, 1993; Linko y Wu, 1996).
1.3.3.2. Cromatografa de filtracin en gel
El fundamento de esta cromatografa es el tamao relativo de las protenas, pero al

contrario de la cromatografa de intercambio inico, ninguna de las protenas es retenida en el
gel de filtracin de la columna. Como soporte de la columna cromatogrfca se usa un lecho
poroso, con un volumen interno y uno externo. Las molculas grandes no penetran en el
volumen interno y eluyen rpidamente, mientras que las pequeas son capaces de pasar al
18 Introduccin
volumen interno y eluyen ms lentamente. Este comportamiento se ilustra en la figura 1.4.
+ Peso Molecular -
42
o
Tiempo
Fig. 1.4: Salida tpica de una columna de filtracin en gel.
De nuevo, la eleccin del gel a utilizar depender del tamao de las protenas que se
quieran separar. Una buena indicacin del tamao molecular la da el peso molecular, aunque
en ocasiones no sea directamente proporcional al tamao ya que ste depende de otros
factores como conformacin tridimensional, estado de agregacin, asociacin con otras
macromolculas, etc. Sin embargo, y como orientacin, el valor del peso molecular es el que
se necesita a la hora de elegir un relleno, por ejemplo, la empresa Pharmacia Biotech tiene
rangos de trabajo que van desde pptidos a protenas de 8000 kDa, como se observa en la
tabla 1.1.
La determinacin del peso molecular es, por otro lado, poco compleja mediante
Introduccin 19
tcnicas de electroforesis, con lo cual ser un primer paso imprescindible antes de elegir esta
cromatografa como posible mtodo de separacin.
Relleno Rango de separacin (kDa)

Superdex Peptide 0.1-7
Superdex 30 <10
Superdex 75 3-70
Superdex 200 10-600
Superse 6 5-5000
Superse 12 1-300
Sephacryl S-100 1-100
Sephacryl S-400 20-8000
Tabla 1.1.: Rangos de separacin para algunos de los rellenos de Pharmacia Biotech.
Los materiales ms habituales en los que se construyen estos geles suelen ser
altamente porosos, destacando matrices de agarosa, dextranos o acrilamida con distintas
posibilidades por lo que se refiere a recuperacin, especificidad y estabilidad.
Esta tcnica es de amplia utilizacin en la separacin de muchas protenas que

provienen de caldos de cultivo tanto a nivel de caracterizacin (Magnuson y Crawford, 1997;
Andersson et al, 1998) como a escala industrial, donde ha sido una de las tcnicas
cromatogrflcas ms empleadas en la separacin de protenas (Scandella y Pettersson, 1991;
Kittelbergerea/., 1998).
1.3.3.3. Cromatografahidrofbica
Como su nombre indica, esta tcnica se basa en las interacciones de los grupos
hidrofbicos de la protena con un soporte de naturaleza tambin hidrofbica. En este caso, la
forma de operar es la opuesta al caso de la cromatografa de intercambio inico. La columna
se carga con la protena disuelta en una disolucin de fuerza inica elevada, favoreciendo as
su interaccin con el soporte hidrofbico. Posteriormente, la fuerza inica se va disminuyendo
de manera que las protenas van eluyndose en funcin de su hidrofobicidad creciente, como
se ilustra en la figura 1.5.
20 Introduccin
Los materiales utilizados para esta cromatografa suelen ser matrices de agarosa o
derivados con ligandos tipo isopropil, butil, octil o fenil que son los que unen a los grupos
hidrofbicos que contienen ciertos aminocidos que componen las protenas. Por lo que se
refiere a eluyentes, los ms ampliamente usados son los basados en sales de elevada fuerza
inica, siendo el ms habitual el sulfato amnico en concentraciones superiores a 1 M.
- Hidrofobicidad de las protenas +
O
ctf 'c
O -
3
N
Tiempo
Fig. 1.5: Salida tpica de una columna de interaccin hidrofbica.
Si bien esta tcnica ser slo aplicable a casos en que se tenga un conocimiento de que
la protena de inters tenga un carcter hidrofbico, hay bastantes ejemplos de aplicacin de
esta cromatografa en distintas protenas (Chen et al., 1997a; Scott et al., 1997), habiendo sido
aplicada tambin a la resolucin de lipasas (Ra y Ballesteros, 1994).
Introduccin 21
1.3.3.4. Cromatografa de afinidad
Se trata de la cromatografa ms selectiva ya que se produce una interaccin especfica

entre el soporte cromatogrfco y la protena de inters, siendo una tcnica bioespecfica,
puesto que se produce un "reconocimiento" del soporte hacia algn punto de la protena,
quedando as ligada al soporte. Esta tcnica ha sido muy desarrollada en los ltimos aos y se
presenta como la herramienta ms poderosa para la purificacin de protenas, habiendo
infinidad de trabajos de purificacin mediante el uso de estas cromatografas de afinidad
(Olczak et al, 1997; Deane et a/., 1998).
Algunas de las cromatografas de afinidad ms habituales se detallan en la siguiente lista:
1) Afinidad por ciertos grupos funcionales, como -NKfe, -OH, -SH, -COOH, -CHO de
especial uso en la separacin de pptidos.
2) Afinidad por protenas de fusin: donde los ligandos pueden ser nquel, IgG para
protenas especficas que interaccionen con estos grupos.
3) Afinidad por anticuerpos monoclonales y policlonales: para la purificacin de
anticuerpos monoclonales y policlonales IgG, donde los grupos utilizados son Protena A
o G nativa o recombinante.
4) Afinidad por glicoprotenas: bsicamente para glicoprotenas que contienen cc-D-
manosas y a-D-glucosas donde se usan como ligandos Concavalina A y diversos tipos de
lectinas.
5) Afinidad por enzimas: el grupo ms amplio donde existen ligandos especficos para
ATPasas, desoxiribonucleasas, exonucleasas, lipasas, enzimas dependientes de NAD+ y
NADP+, fosfodiesterarsas, proteasas y endonucleasas entre otras.
6) Afinidad por otras protenas: como albmina e interferon especficamente u otros
grupos de protenas como lipoprotenas, protenas de membrana, neurotransmisores,
factores de coagulacin, factores de crecimiento, etc.
Esta tcnica tambin se puede utilizar para la separacin de otros tipos de macromolculas
como ADN o clulas (cromatografa de afinidad celular).
22 Introduccin
1.3.3.5. Cromatoenfoque
Basado en la carga superficial de la protena, en este mtodo se aplica un gradiente de

pH, de manera que la carga de las molculas est continuamente cambiando a medida que
vara el pH, provocando la elucin de las protenas desde la resina a medida que alcanzan su
punto isoelctrico, es decir, el pH que neutraliza su carga superficial. Este mtodo suele ser
muy especfico pero presenta el problema de que se tiene que trabajar a un pH
correspondiente al pl de cada una de las protenas que contiene al mezcla a tratar, y esto
puede afectar mucho a protenas que sean sensibles a variaciones importantes del pH.
Los rellenos utilizados son similares al caso de la cromatografa de intercambio

amnico. El proceso implica empezar con un pH elevado superior al pl de las protenas de la
mezcla para posteriormente ir disminuyendo este pH y eluir las protenas cuando se alcance
cada punto isoelctrico. Este mtodo es aplicable para mezclas de protenas de caractersticas
conocidas (Lee et al., 1997; Alfonzo e al., 1997).
1.3.4. Electroforesis
La electroforesis se define como la migracin de macromolculas cargadas bajo la

influencia de un campo elctrico, y suele emplearse casi siempre a escala de laboratorio con
fines analticos o de caracterizacin. Normalmente, se usa una solucin de elevada fuerza
inica para concentrar e inmovilizar las protenas, y se aplica una diferencia de potencial al
gel que contiene las protenas que migraran en funcin de su carga o de su peso molecular si
previamente han sido igualadas las cargas.
El mtodo ms popular de electroforesis de una dimensin es el conocido por SDS-

PAGE ("Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis") usado para la
determinacin de pesos moleculares de macromolculas como las protenas, que una vez
dotadas de una carga equivalente, migran bajo la accin de un campo elctrico sobre un gel en
funcin de su tamao molecular. Los pesos moleculares de las protenas se determinan por
comparacin de sus movilidades con algunos marcadores de peso molecular conocido.
Introduccin 23
Otro mtodo utilizado frecuentemente es el denominado Isoelectroenfoque, en esta

tcnica, cuando una protena es introducida en un medio de pH variable bajo la influencia de
un campo elctrico, se mueve hacia el polo opuesto a su carga, pero en su migracin a travs
del gradiente de pH, la protena puede ganar o perder protones, de manera que su carga
disminuir y perder movilidad, llegando hasta el punto en que el pH iguale su punto
isoelctrico. Sus aplicaciones en el campo de la caracterizacin de protenas en todas sus
variedades y posibilidades son muy numerosas (Deutscher, 1988; Riguetti, 1990).
1.3.5. Electroforesis capilar
La electroforesis capilar (CE) se define como una tcnica de alta resolucin para la
separacin de una amplia gama de molculas de inters biolgico como metabolitos,
aminocidos, cidos nucleicos, glcidos, protenas y pptidos, aunque su mayor aplicacin
actualmente est en el campo del anlisis de cationes y aniones (Fung y Lau, 1998a; Fung et
al, 1998b).
Al igual que en el caso de la electroforesis en gel, las separaciones en CE se basan en

la relacin carga-masa. La CE emplea columnas capilares de slice que pueden ser o no
derivatizadas por donde las protenas se mueven en solucin. Esta tcnica puede utilizarse a
modo de electroforesis en gel para determinar los pesos moleculares de las protenas o bien,
para conocer los puntos isoelctricos de dichas protenas. En este ltimo caso, conocido como
isoelectroenfoque, la protena se desplaza cuando se crea un gradiente de pH en la columna
hasta pararse en el punto en el que en pH es igual al pl. Tras esto, la muestra se moviliza
rompiendo el gradiente de pH o hidrodinmicamente, obtenindose picos parecidos a los
obtenidos mediante las tcnicas cromatogrfcas tipo FPLC y HPLC.
En su forma ms simple, la separacin mediante CE se consigue pasando un voltaje

entre dos recipientes llenos de algn tampn que estn unidos por un capilar tambin lleno de
lquido (Fig. 1.6). Esto produce la generacin de lo que se conoce por flujo electroosmtico,
que permite a las molculas de inters pasar de un extremo del capilar al otro. En el caso del
isoelectroenfoque, la forma ms comn de operar es situar en cada extremo del capilar una
solucin de pH cido y bsico respectivamente, aplicar potencial para crear un gradiente de
24 Introduccin
pH a lo largo del capilar que permita a las molculas, en este caso protenas, moverse hasta
alcanzar el pH correspondiente a su punto isoelctrico, en el que dejarn de moverse. En este
punto, se iguala el pH de ctodo y nodo situando el mismo compuesto (cido o base) en cada
extremo de la columna, de manera que se rompe el gradiente de pH, y las protenas salen de la
columna consecutivamente por su pl de acuerdo a como se hayan distribuido en la primera
fase (Coligan et al., 1995).
Los capilares utilizados tienen generalmente de 30 a 50 cm de largo con 50-75 \im de

dimetro interno, lo que supone volmenes del orden de microlitros. Los capilares tienen un
grosor muy pequeo, lo que permite una efectiva eliminacin del calor generado por los
voltajes que normalmente alcanzan los 30 kV, necesarios para este tipo de separaciones. Los
capilares pueden estar vacos (normalmente en el caso del anlisis de iones) pero para
protenas se recomienda el uso de capilares rellenos de los cuales en el mercado se encuentran
distintos tipos cuyas diferencias suelen ser de hidrofobicidad.
r*^ ~*$S
(~* S
W
Capilar /ililllllll
\
Detector
Voltaje
Tampn/muestra Tampn
Fig. I.6.: Esquema de una CE.

Introduccin 25
Aunque la CE ha sido aplicada con xito en la resolucin de algunas protenas (Jin et

al, 1997; Park et al, 1997; Magnuson y Crawford, 1997; Xu et a/., 1997), el hecho de que
esta tcnica sea una de ms difciles de optimizar para tener buenas separaciones en mezclas
complejas como las que provienen habitualmente de caldos de fermentacin, ha provocado
que no sea todava un sistema de separacin comn en biotecnologa, aunque sin embargo, es
una herramienta til en la determinacin cuantitativa rpida de la pureza de ciertas muestras.
26 _^ Introduccin
1.4. Lipasas de Candida rugosa
1.4.1. Estructura v mecanismo de reaccin
Una de las caractersticas ms importantes de las lipasas y que las diferencia de otras
enzimas es la propiedad que tienen de adsorberse sobre superficies hidrofbicas, provocando
normalmente un aumento de su actividad cataltica. Este hecho, conocido como activacin
interfacial se explica mediante la estructura tridimensional de la enzima. Los anlisis por
difraccin de rayos X revelan la existencia de una estructura en hlice alfa que recubre el
centro activo de la enzima, y que se activa por desplazamiento de esta estructura en forma de
tapa, cuyo movimiento crea una estructura apolar exponiendo los grupos catalticos de la
protena, mientras que la superficie hidrofbica estabiliza el contacto entre la enzima y la
interfase lipdica (Brzozowski et al, 1991).
Recientemente, se ha determinado la estructura de una lipasa de Candida rugosa en

sus conformaciones cerradas y abierta (Fig. 1.7). La comparacin entre ambas estructuras
indica que la activacin requiere el movimiento y replegamiento de un solo bucle, de manera
que comporta la aparicin de una superficie hidrofbica alrededor del centro activo que
permite la interaccin con la interfase lipdica. Este movimiento se asocia a una isomerizacin
de cis a trans del enlace peptdico del residuo prolina. Esta isomerizacin es un mecanismo de
cierre en una u otra conformacin, afectando a la velocidad de reorientacin de la protena en
este movimiento de cierre y apertura (Grochulski et al, 1993; Grochulski et al, 1994).
Por lo que se refiere a la catlisis en s, durante la reaccin se forma un intermediario

tetradrico que se transforma en un complejo acil-enzima, para que posteriormente la lipasa
en forma libre se regenere por la reaccin hidroltica con una molcula de agua. El
mecanismo por el cual la lipasa hidroliza un enlace ster se inicia con un ataque nuclefilo
por parte del oxgeno de la cadena lateral de la serina hacia el tomo de carbono del grupo
carbonilo del enlace ster dando lugar a la formacin de un complejo intermediario
tetradrico. La histidina incrementa el carcter nuclefilo del grupo hidroxilo de la serina, ya
que su anillo imidazol se protona adquiriendo carga positiva, estabilizada gracias a la carga
negativa del residuo cido. El intermediario tetradrico se estabiliza por puentes de hidrgeno
Introduccin 27
con los enlaces amina de los residuos que pertenecen a la cavidad de oxianin. Finalmente se
libera el alcohol, quedando el complejo acil-enzima, y mediante el ataque nuclefilo de un ion
hdroxilo se libera el cido graso y se regenera la enzima (Grochulski et al, 1993; Grochulski
etal., 1994).
73 73
2 cis-trans cis-trans
Fig. I.7.: Conformaciones y posiciones de las dos tapas abierta (a) y cerrada (b) para lipasa de
Candida rugosa (Grochulski et al, 1994).
1.4.2. Isoformas presentes
Una de las caractersticas ms importantes que hay que tener en cuenta al estudiar las
lipasas de Candida rugosa es el hecho de que aparezcan mltiples isoformas de lipasas en los
preparados comerciales de esta enzima. Al menos 7 genes distintos de lipasas, nombrados de
Lipl a Lip7 han sido descritos en Candida rugosa, aunque slo 5 de ellos (Lipl-Lip5) han
sido completamente caracterizados (Lotti y Alberghina, 1996). De estos 5 genes, slo se han
identificado 3 productos (los correspondientes a Lipl, Lip2 y Lip3) en los preparados
comerciales de esta enzima.
28 Introduccin
A partir de estas secuencias de genes, se ha elaborado la secuencia amoniacdica

terica de las diferentes isoenzimas, as como otras caractersticas como peso molecular,
puntos de glicosilacin tericos y punto isoelctrico. En la tabla 1.2 se recoge la secuencia de
aminocidos comenzando por el N-terminal de los distintos genes de lipasa de Candida
rugosa, marcando aquellos puntos donde no coinciden, mientras que en la tabla 1.3 se
incluyen las previsiones tericas obtenidas a partir de las secuencias de la tabla 1.2.
5 19 22 30 35 40 45-46 49
Lipl APTA T LANGDTITGLNAI I NE A FLGIPFA E PPVG N LRFK D PVPY SG SL D G
Lip2 APTA T LANGDTITGLNAI V NE K FLGIPFA E PPVG T LRFK P PVPY SA SL N G
Lip3 APTA K LANGDTITGLNAI I NE A FLGIPFA E PPVG N LRFK D PVPY SG SL N G
Lip4 APTA T LANGDTITGLNAI I NE A FLGIPFA Q PPVG N LRFK P PVPY SA SL N G
Lip5 APTA T LANGDTITGLNAI I NE A FLGJPFA E PPVG N LRFK D PVPY RG SL N G
Tabla I.2.: Secuencia de aminocidos para los distintos genes de lipasa de Candida rugosa.
Protena PM Pl Puntos de glicosilacin

Lipl 57223 4.5 3
Lip2 57744 4.9 1
Lip3 57291 5.1 3
Lip4 57051 5.7 1
Lip5 56957 5.5 3
Tabla 1.3.: Prediccin terica para las distintas isoformas de lipasas de Candida rugosa.
Las distintas secuencias descritas en la tabla 1.2 presenta hasta un 84 % de similitud,

con zonas altamente conservadas que intervienen en el plegamiento y funcin cataltica y
otras ms variables cuyas diferencias marcan la especificidad de la enzima (Lotti et al, 1994).
Introduccin ___ 29
1.4.3. Purificacin de las isoformas presentes en Candida rugosa
Aunque en la bibliografa se encuentran numerosos trabajos de purificacin y

caracterizacin de las distintas isoformas de lipasas, as como de otras protenas asociadas
generalmente de naturaleza estersica, presentes en los preparados comerciales de lipasas de
Candida rugosa, existen muy pocos trabajos de purificacin referidos a la influencia de las
condiciones de cultivo y fisiologa de Candida rugosa y su perfil lipsico/estersico secretado
por el microorganismo (Lotti et al, 1998).
La mayora de tcnicas que se han utilizado para la separacin de dichas isoformas

incluyen operaciones de cromatografa de distintos tipos. Previamente a su utilizacin se
realiza un pretratamiento o semipurificacin de la muestra, mediante operaciones de
centrifugacin, precipitacin o dilisis, para eliminar gran parte de las impurezas insolubles y
solubles que contienen los preparados comerciales. Hay que destacar que en muchos de los
trabajos se encuentran fracciones de protenas que difieren en alguna caracterstica, pero rara
vez existe una identificacin con las distintas isoformas previstas por las secuencias
presentadas en la tabla 1.2.
Esto es debido a que la heterogeneidad de isoformas de lipasas encontradas en

preparados comerciales puede ser debida no tanto a variaciones en la secuencia de
aminocidos sino a diferencias en la glicosilacin de las protenas, as como a asociaciones de
naturaleza no covalente entre las lipasas e impurezas presentes en los caldos de fermentacin,
como polisacridos de elevado peso molecular, que son habitualmente producidos por
microorganismos productores de lipasas (Cirigliano y Carman, 1984; Cirigliano y Carman
1985).
En la tabla 1.4 se detalla una recopilacin de los distintos trabajos realizados por
distintos autores en la purificacin de las distintas isoformas presentes en preparados
comerciales. En la tabla tambin se indica si existe una correlacin entre las fracciones
obtenidas y alguna de las secuencias determinadas por Lotti et al. (1996) de la tabla 1.2. Esta
analoga se realiza normalmente por determinacin del N-terminal hasta el aminocido
distintivo de cada isoforma.
30 Introduccin
Autor Procedencia Fracciones Caracterisitcas Cromatografa utilizada

Veeraragavan y Gibbs (1989) Sigma 2 d y II) PM=58,pI=5.6,5.8 I. inico
Shaw y Chang (1989) Sigma 3 (A, B y C) PM=62 I. inico
Brahimi-Hom etal. (1990) Sigma 2 (I y II) PM=60, pl=4.3, 4.7 I. inico + 1. hidrofob.
Allenmark y Ohlsson (1992) Sigma 2 (I y II) - I inico + G. filtracin
Ra etal, (1993) Sigma 2(AyB)(1) PM=60,pI=5.5,4.8 I. inico + Afinidad
Chang efa/., (1994) Sigma 2 - -
Amano 3 - -
Meito Sangyo 1 - -
Ra y Ballesteros ( 1 994) Sigma 2(AyB) w - I. hidrofob.+ G. filtracin
Gordilloefa/. (1995) Fermentacin 2(ly2) PM=60 I. inico
w
LinkoyWu(1996) Biocatalyst 2 (1 y 2) PM=57,60 I. hidrofob.+ G. filtracin
Diczfalusy efa/. (1997) Sigma 3(CELl,2y3) w " I. hidrofob.+ G. filtracin
+ 1. inico
Lundell etal. (1998) Sigma 2(AyB)CT PM=60 I. inico
(1)
La lipasa A corresponde a Lip3 con un grado de glicosilacin del 6.7 %, mientras que la
lipasa B, mayoritaria, puede corresponder a Lip 1,2,4 o 5, con un grado de glicosilacin del
2.7 %.
(2)
Variacin del mtodo propuesto para separar las isoenzimas A y B del punto(1).
(3)
Siguiendo el protocolo descrito por Ra y Ballesteros (1994).
(4)
CEL-1 y CEL-3 se identifican con Lipl y CEL-2 es el producto del gen Lip2, de nuevo
Lipl aparece como mayoritaria, sin embargo, contrariamente a lo descrito por Ra et al.
(1993), no aparece Lip3. En este trabajo han sido identificadas protenas de naturaleza
estersica en preparados de Sigma tipo VII (Diczfalusy y Alexson, 1996; Diczfalusy et al,
1997) por medio de cromatografa hidrofbica. Concretamente se trata de acil-CoA
tioesterasas/carboxilesterasas presentes en pequeas cantidades en el liofilizado comercial.
(5)
Siguiendo el protocolo descrito por Ra et al. (1993).
Tabla 1.4.: Resumen de los trabajos de purificacin realizados con lipasas de Candida
rugosa.
Como se puede observar en la tabla 1.4, los resultados obtenidos son muy diversos y
siguiendo diferentes tcnicas de purificacin o incluso cambiando de proveedor o de lote se
obtienen distintas proporciones e incluso se identifican distintas isoenzimas. Adems, en
Introduccin 31
muchas ocasiones las lipasas se presentan en forma de agregados o asociadas a otras

molculas (Shaw y Chang, 1989). Este hecho, unido a que las lipasas presentan una
importante heterogeneidad en la glicosilacin (Tabla 1.5), provoca que los intentos de
identificar los picos obtenidos cromatogrflcamente con protenas puras sean extremadamente
difciles. En la tabla 1.5 se presentan a modo de resumen aquellas purificaciones que han
llegado a este tipo de identificacin para la lipasa comercial de Sigma.
.Protena PM (kDa) pl % Glicosilacin Autor

Lipl/B 62 4.8 3.6% Raetal. (1993)
Lip3/A 64 5.5 8.0% Ra et al (1993)
Lipl 60 - - Grochulski et al (1993)
Lipl 60 - 5.0% Diczfalusye/a/. (1997)
Lip2 58 - 1.5% Diczfalusy et al. (1997)
Tabla 1.5.: Resumen de los trabajos de purificacin realizados con lipasas de Candida rugosa
en los que se llega a una identificacin de un gen descrito por Lotti et al. (1996).
Otro factor a tener en cuenta es que en este tipo de cromatografas normalmente los
rendimientos obtenidos son muy bajos, contabilizando la actividad que se recupera en las
fracciones con respecto a la de partida. Esto normalmente viene compensado por unos
elevados factores de purificacin que reflejan el aumento producido en la actividad especfica.
Por ejemplo, la tabla 1.6 proporcionada por Ra et al. (1993) muestra claramente la
disminucin del rendimiento al mismo tiempo que el aumento del factor de purificacin:
Purificacin Protena total Act. esp. (U/mg) Factor de Rendimiento

(mg) (Tributirina) purificacin (%)
Crudo 1100 65 1.0 100
Prec. etanol 500 120 1.8 84
DEAE
Lip A 80 134 2.0 15
Lip B 154 230 3.5 49
Sephacryl
Lip A 4.5 750 11.5 5
Lip B 20 744 11.3 21
Tabla 1.6.: Rendimientos y factores de purificacin para la purificacin de isoformas de

Candida rugosa segn Ra et al, 1993.
32 Introduccin
Otros datos proporcionados por Veeraragavan y Gibbs (1989) hablan de

recuperaciones del orden del 20 % y factores de purificacin cercanos a 6, mientras que datos
de Diczfalusy y Alexson (1996) obtienen rendimientos inferiores al 20 % con factores de
purificacin cercanos a 20 para el mejor de los casos.
No obstante, tomando como referencia la lipasa de Sigma, se pueden postular una

serie de conclusiones:
- Existe la presencia de dos isoformas, de las cuales la mayoritaria corresponde al gen Lipl.
- Esta forma mayoritaria correspondiente al gen Lipl es la denominada LipB por Ra et al,
(1993).
- En cuanto a la otra isoforma, la mayora de autores sealan que se trata de la
correspondiente al gen Lip3, mientras que Diczfalusy et al. (1997) identifican el gen Lip2.
Los pesos moleculares y puntos isoelctricos determinados experimentalmente difieren de
los previstos tericamente.
Hay una cierta heterogeneidad en el grado de glicosilacin que parece depender incluso
del lote estudiado.
- Se ha constatado por parte de Diczfalusy y Alexson (1996) la presencia de al menos dos
esterasas en el preparado de Sigma.
- La presencia de contaminantes en la muestra, la posibilidad de agregacin de las lipasas y
la asociacin a otras macromolculas dificulta la purificacin de esta lipasa.
1.4.4. Diferencias de reactividad entre las isoformas
Existen pocos estudios donde se haya determinado distinta reactividad entre las dos
isoformas mayoritarias presentes en las lipasas comerciales de Candida rugosa. De todas
formas, los primeros estudios realizados por Shaw y Chang (1989) sugeran que haba
diferencias en la actividad enzimtica de las distintas fracciones separadas al variar la longitud
de la cadena del grupo acilo del ster que se hidrolizaba. Estos resultados fueron confirmados
por Brahimi-Horn et al. (1989) cuando se compar la actividad estersica de ambas fracciones
y por Ra et al. (1993), ya que cuando separaron las lipasas A y B (que por primera vez
Introduccin 33
correspondan a dos genes identificados para Candida rugosa), se lleg a la conclusin de

que la lipasa B presentaba menor afinidad por substratos solubles (/?-nitrofenil butirato,
actividad estersica) y por triglicridos de cadena corta (tributirina) que por substratos de
naturaleza lipdica como triolena, y que, en cambio, la lipasa A tena ms afinidad por
substratos estersicos, adems de otras diferencias importantes de tipo bioqumico como pH y
temperatura ptimos, influencia de disolventes orgnicos, etc. que haban sido constatados en
trabajos anteriores.
Sin embargo, Allenmark y Ohlsson (1992) fueron los primeros en probar distintas
fracciones de lipasas en substratos de naturaleza quiral, observando como los excesos
enantiomricos obtenidos variaban en funcin de la fraccin utilizada. Otros estudios
posteriores apuntan a que en reacciones de transesterificacin la lipasa B origin unos
resultados mucho mejores en selectividad y conversin que la lipasa A (Linko y Wu, 1996).
Sin embargo, estudios recientes (Lundell et al, 1998) no determinaron distintas
enantioselectividades para las lipasa A y B en la resolucin de alcoholes secundarios, aunque
s se detectaron diferencias en la resolucin de derivados del cido 2-fenil propinico como
ibuprofeno (Herniz et al., 1997) donde la lipasa B se mostr mucho ms enantioselectiva,
hecho que haba sido constatado previamente con este tipo de compuestos y con /?-nitrofenil
esteres (Herniz et al., 1995).
1.4.5. Obtencin de una lipasa de propiedades catalticas reproducibles
A la vista de lo explicado en este captulo, las rutas para conseguir una lipasa de
Candida rugosa que sea reproducible en su actividad cataltica son esencialmente las tres
siguientes:
1. Trabajar con isoformas puras: sin embargo, esto presenta los problemas que se han
descrito anteriormente, como son la dificultad de obtener estas isoformas y los bajos
rendimientos que se originan en este tipo de procesos.
34 Introduccin
2. Expresin en otros microorganismos: otra posibilidad es clonar y expresar uno de los

genes que codifican la produccin de alguna de las isoformas de Candida rugosa en algn
otro microorganismo husped. Sin embargo, Candida rugosa no utiliza el cdigo gentico
universal comn a la mayora de organismos (Kawaguchi et al., 1989), cambiando el
codn universal para leucina, CUG, por serina. Como consecuencia, la expresin del gen
seleccionado en microorganismos como Sacharomyces cerevisiae origina lipasas inactivas
(Fusseti et al, 1996). Este problema ha sido recientemente solucionado por tres vas
distintas para el gen Lip 1:
Expresin del gen en un microorganismo que codifique igual que Candida rugosa
como es Candida maltosa (Mileto et al, 1998).
Mutagnesis del gen natural de Lipl y expresin en S. cerevisiae (Brocea et al.,
1998).
Sntesis qumico-enzimtica del gen y expresin de ste en S. cerevisiae y Pichia
Pastoris (Brocea et al, 1998).
3. Control preciso de las condiciones de fermentacin: demostrado que las condiciones de

fermentacin afectan a la proporcin de los isoenzimas obtenidos (Gordillo et al, 1998) es
evidente que mediante un control de las condiciones de fermentacin se obtiene un
producto repetitivo. Sin embargo, el proceso de downstream y las condiciones de
almacenamiento tambin han de estar perfectamente definidas, ya que se ha constatado
con lipasas comerciales que no slo al cambiar de lote, sino al variar el tiempo de
almacenamiento, las propiedades del catalizador son variables (Tsai y Dordick, 1996b).
Introduccin 35_
1.5. Utilizacin de enzimas en medio orgnico
1.5.1. Introduccin. Ventajas v desventajas
El uso de las enzimas en medio orgnico ha tenido un gran desarrollo en los ltimos
aos debido a que muchas de las reacciones de inters slo pueden llevarse a cabo en este tipo
de medios. Si bien es cierto que algunas propiedades de las enzimas tienden a mejorar en este
tipo de medios, en general se puede postular que la actividad enzimtica es menor en
disolventes orgnicos que en medio acuoso.
A modo de resumen, entre las ventajas de trabajar en medio orgnico se pueden citar
(Godtfredsenea/., 1985; Dordick, 1991; Kvittingen, 1994):
- Aumentar la solubilidad de substratos apelares.

Favorecer la reaccin de sntesis frente a la hidrlisis desplazando el equilibrio
termodinmico.
- Eliminacin de las reacciones laterales que dependan del agua.
Alteracin en substratos y especificidad.
Ausencia de necesidad de inmovilizacin, ya que las enzimas no son solubles en medios
orgnicos.
- Las enzimas son fcilmente recuperables por filtracin o centrifugacin ya que
constituyen una fase diferente del medio.
Al tratarse de medios orgnicos, normalmente la separacin del producto es ms simple,
debido a que los productos tienen bajo punto de ebullicin.
- Mejora de la termoestabilidad.
- Eliminacin de contaminacin microbiana.
- Potencial uso de las enzimas para ser utilizadas directamente en un nuevo o ya existente
proceso qumico.
- La gran variedad de reacciones que son capaces de catalizar las enzimas en medios
orgnicos.
_36 Introduccin
- La posibilidad de las enzimas de actuar enantioselectivamente sobre substratos orgnicos

de naturaleza quiral.
- Las enzimas trabajan habitualmente en condiciones suaves cercanas a las fisiolgicas.
- La alta selectividad con respecto al substrato.
- Las enzimas pueden ser obtenidas por fermentacin.
De la misma manera, sin embargo, el empleo de enzimas en medio orgnico presenta

una serie de inconvenientes, entre los que podemos destacar (Godtfredsen et al., 1985):
- Las enzimas se inactivan fuertemente por muchos disolventes orgnicos.

- Las enzimas se inactivan cuando no trabajan en zonas cercanas al pH ptimo, y en
disolventes orgnicos este factor es difcil de controlar.
- Las enzimas presentan inhibicin por muchos de los productos y substratos hidroflicos
que aparezcan en la reaccin.
- La mayora de disolventes orgnicos no son aceptables desde el punto de vista medio
ambiental.
- Complejidad elevada del sistema de reaccin.
Mucho menor conocimiento terico de los mecanismos de reaccin en medio orgnico, as
como de los factores que afectan al diseo del reactor y modelizacin del proceso.
Coste adicional del disolvente.
As pues, la eleccin de un proceso enzimtico en un disolvente orgnico vendr

determinada al tener en cuenta todas estas consideraciones, de entre las cuales la ms
importante es la actividad que presente la enzima en el disolvente utilizado.
1.5.2. Eleccin del disolvente. Influencia del agua
La actividad cataltica de las enzimas en medio orgnico depende en gran medida de

que en estos disolventes mantengan la estructura proteica, que viene condicionada por
multitud de puentes de hidrgeno que se forman entre la protena el medio que la rodea. De
hecho, una enzima presentar su actividad ptima para una conformacin definida que vendr
determinada por un conjunto de interacciones de tipo puente de hidrgeno, inicas, covalentes
Introduccin 37
e hidrofbicas (Lehninger, 1982). Para preservar esta conformacin es necesaria la presencia

de lo que se denomina una capa de hidratacin, cuya prdida supone normalmente un fuerte
descenso en la actividad cataltica.
Las enzimas necesitan esta capa de hidratacin para realizar su actividad cataltica, sin
embargo, depender de cada caso la cantidad de agua necesaria para preservar la capa de
hidratacin y en este aspecto tendr mucha importancia el tipo de disolvente utilizado y sus
caractersticas.
1.5.3. Inmovilizacin de enzimas
1.5.3.1. Introduccin
La inmovilizacin de una enzima o, en general, de un biocatalizador consiste en su

localizacin en una regin definida de espacio manteniendo alguna actividad cataltica
deseada. En los sistemas de inmovilizacin la difusin es el mecanismo predominante para el
transporte de materia, es decir, donde la agitacin no juega ningn papel en el transporte
convectivo.
Las principales ventajas de utilizar enzimas inmovilizados son:
Se pueden reutilizar y utilizar de forma continua.

Permiten aumentar la concentracin de enzima en el medio de reaccin.
Se facilita su separacin del medio de reaccin.
Se suele producir un aumento de la estabilidad de la enzima.
- Todos estos factores suelen generar un aumento de la productividad, lo que suele
desembocar en un sistema econmicamente rentable.
Como desventajas principales se pueden sealar las siguientes:
- Se aade una nueva etapa en la preparacin de la enzima.

38 Introduccin
- La actividad cataltica puede quedar afectada negativamente.

- Los fenmenos de difusin pueden limitar la velocidad de reaccin.
En resumen, la necesidad de inmovilizar una enzima vendr condicionada por el

sistema de reaccin que se requiera emplear y sobre todo, del tipo de bioreactor que se desee
utilizar. En trminos generales, para procesos en batch no ser necesaria la inmovilizacin, as
como para procesos en tanque agitado en continuo, en los que la agitacin suele tener un
efecto negativo en la integridad de las partculas. Sin embargo, para procesos en continuo tipo
flujo pistn ser prcticamente siempre necesario el uso de algn sistema de inmovilizacin.
Entre estos ltimos destacan sistemas en lecho fijo, lecho fluidizado o fibras huecas
(Zaborsky, 1973; Bailey y Ollis, 1986;Mosbach, 1987).
1.5.3.2. Tcnicas de inmovilizacin de enzimas
Los principales protocolos de inmovilizacin se pueden dividir en funcin del

mecanismo en que se basan, tal como se esquematiza en la Fig. 1.8.
Adsorcin
Esta es la tcnica ms simple y la ms comn y consiste en poner en contacto una

disolucin de la enzima en sus condiciones ptimas con un adsorbente activo. Tras un cierto
tiempo, se limpia la partcula para eliminar la enzima no inmovilizada. Las fuerzas que
favorecen esta interaccin suelen ser de tipo inico o hdrofbico y en general de carcter
dbil.
El problema principal de la inmovilizacin por adsorcin es la reversibilidad del

proceso, dado que se trata de un proceso en equilibrio, y que el cambio en condiciones como
pH y temperatura pueden provocar el desplazamiento de la enzima hacia la fase soluble. En
procesos donde se trabaje con disolventes orgnicos, es el mtodo ms aconsejable puesto que
no existe dicha reversibilidad.
Introduccin 39
Adsorcin Enlace covalente
"Crosslinking" Inclusin
Fig. I.8.: principales mtodos de inmovilizacin de enzimas.
Este mtodo se ha aplicado ampliamente para enzimas de todo tipo y en concreto para
lipasas (Murray et a/., 1997; Knezevic et al, 1998), en particular mediante el empleo de
soportes que favorecen las interacciones hidrofbicas (Bastida et al, 1998).
Algunos de los soportes utilizados ms comnmente para realizar este tipo de

inmovilizacin son: almina, celulosa, agarosa, concavalina A, silica gel, vidrio poroso,
resinas de intercambio inico, celitas y diversos tipos de polmeros.
40 Introduccin
Enlace covalente
En este caso, la unin enzima-soporte se realiza mediante un enlace de naturaleza

covalente. Existe una gran variedad de mtodos en funcin de la naturaleza del soporte y su
grupo funcional, el grupo funcional de la enzima que interacciona con el soporte, la activacin
previa de los soportes y los agentes enlazantes utilizados (Zaborsky, 1973; Mosbach, 1987).
En la tabla 1.7 se recogen algunos de los mtodos ms habituales de inmovilizacin por
enlace covalente, as como algunos de los soportes ms habituales que se utilizan.
Grupo funcional Ejemplos de soporte Agente acoplador Grupo reactivo de la

del soporte protena
Hidroxilo Dextranos, celulosas Bromuro de Amino
ciangeno
Carboxilo Poliacrilamidas Carbodii midas Amino
Amino Cermicas Glutaraldehdo Amino
modificadas Nitrito sdico
Aldehido Aldehidos Reaccin directa Amino y otros
polimricos
Imidosteres Derivados de niln Reaccin directa Amino
Tiol Polisacridos Reaccin directa Cis-tiol
modificados
Tabla 1.7: Algunos mtodos comunes de formacin de enlace covalente entre enzima y
soporte.
Uno de los problemas ms importantes que presenta este tipo de protocolo es que las
prdidas de actividad suelen ser mayores que en el caso de la adsorcin, debido a que se
producen modificaciones qumicas en algn aminocido de la enzima.
Este sistema de inmovilizacin es muy habitual para distintos tipos de enzimas

implicando normalmente prdidas de actividad pero mejoras en la estabilidad frente a factores
como pH y temperatura (Chellapandian, 1998; Spagna et al, 1998), aunque su aplicacin en
lipasas ha sido mucho ms reducida (Moreno et a/., 1997).
Introduccin 41
"Crosslin king"
Mediante la formacin de enlaces cruzados entre enzimas, se forman agregados

insolubles mediante un agente multifuncional que se enlaza covalentemente a la enzima.
Normalmente los agentes usados son los mismos que para la inmovilizacin por enlace
covalente. Este mtodo es de uso ms restringido y suele tener una aplicacin analtica en el
desarrollo de biosensores (Guerrieri et al, 1998).
Inclusin
Este mtodo se basa en la formacin de una matriz tridimensional en presencia del

biocatalizador, que queda atrapado dentro de su estructura. La matriz ha de permitir la
retencin de la enzima al mismo tiempo que la difusin de substratos y productos y las ms
utilizadas son polmeros sintticos o geles de origen natural.
Este sistema ha sido ampliamente utilizado para la inmovilizacin de clulas, y su

aplicacin para enzimas es bastante reducida debido a un aumento importante de los
problemas de difusin y que la retencin de la enzima es muy pobre. No obstante, se ha
aplicado en la construccin de electrodos enzimticos, por ejemplo, glucosa oxidasa y
hexokinasa para la determinacin de ATP (Compagnone y Guilbault, 1997), alcohol
deshidrogenasa para la determinacin de etanol (Cai et al, 1997) o diamina oxidasa para la
determinacin de diamina (Bouvrette et al, 1997).
1.5.3.3. Seleccin de la tcnica de inmovilizacin
En la tabla 1.8 se recogen algunas de las principales caractersticas que definen los
mtodos de inmovilizacin existentes para enzimas, sin embargo, la eleccin siempre vendr
marcada por la enzima particular y sus caractersticas particulares en cada caso (Zaborsky,
1973; Mosbach, 1987).
42 Introduccin
Caracterstica Adsorcin Enlace inico Enlace "Crosslinking" Inclusin

fsica covalente
Preparacin Fcil Fcil Difcil Difcil Difcil
Actividad Baja Alta Alta Moderada Alta
enzimtica
Especificidad No No Modificable Modificable No
de substrato modificable modificable modificable
Fuerza de Dbil Moderada Fuerte Fuerte Fuerte
enlace
Regeneracin Posible Posible Imposible Imposible Imposible
Aplicabilidad Baja Moderada Moderada Baja Alta
Coste Bajo Bajo Alto Moderado Bajo
Tabla 1.8: Comparacin entre mtodos de inmovilizacin de enzimas.

Introduccin
1.6. Bioreactores enzimticos
1.6.1. Reactores ideales. Distribucin de tiempo de residencia (DTR)
En el estudio de los modelos de flujo que describen el comportamiento de los

reactores, se hace referencia a dos modelos ideales, el de flujo pistn y el de tanque agitado o
de mezcla perfecta, que representan los dos extremos en el diseo y funcionamiento de un
reactor (Levenspiel, 1979). La ventaja de utilizar estos sistemas es su simplicidad y en que
uno de los dos origina normalmente el funcionamiento ptimo. No obstante, la mayora de
reactores reales tienen un comportamiento intermedio entre estos dos extremos. En los
reactores reales muchas veces aparecen zonas muertas, canales preferenciales, retromezcla y
otras distorsiones del modelo de flujo ideal.
En el caso de los reactores reales, la distribucin de tiempo de residencia (DTR) del

material a travs del reactor es el factor que determinar en que punto entre los dos
comportamientos ideales se sita el flujo de un bioreactor. La tcnica utilizada para
determinar el modelo de flujo de un reactor es la denominada estmulo-respuesta, basada en la
inyeccin de un trazador inerte y siguiendo la respuesta del sistema analizando la evolucin
de la concentracin del trazador a la salida.
La eleccin del trazador es de vital importancia para obtener una informacin precisa
acerca del comportamiento del fluido dentro del bioreactor. Los requisitos que debe cumplir
el trazador son los siguientes:
- Miscible y de propiedades similares a las del fluido que se est investigando.

- Inerte, sin interaccionar con el biocatalizador ni con los substratos y productos de la
reaccin.
Fcilmente analizable, y detectable en concentraciones bajas.
- En sistemas multifsicos (por ejemplo, enzimas inmovilizados), no ha de ser transportado
entre fases.
44 Introduccin
La introduccin del trazador en el alimento al reactor puede seguir diversas

estrategias, siendo los ms habituales los de pulso y escaln. En la tcnica de pulso, se
introduce de forma instantnea una cantidad M del trazador a la corriente de alimento que
entra en el reactor, y su concentracin de salida se registra a lo largo del tiempo. En la fig. 1.9
se presenta un ejemplo de esta tcnica.
C"
V
Entrada
Salida ideal
QL
flujo pistn
tanque agitado
Fig. I.9.: Respuesta de sistemas ideales para un pulso de trazador.
A partir de la curva se puede calcular el tiempo de residencia real del reactor que viene dado
por la ecuacin (1):
f 'tCdt
T = * (1)
t'Cdt
JO
y compararlo con el tiempo de residencia ideal que vendr dado por:
T= V
(2)
OL '
Adems, el clculo de la integral de la concentracin de trazador con respecto al tiempo ha de

resultar la cantidad total de trazador introducida en el sistema, que por otro lado se conoce.
Este ser el test de consistencia del experimento.
Introduccin 45
Muchas veces la curva C frente a t se representa de forma adimensional como una

curva de E vs 9 en la que E representa la concentracin adimensional calculada como V-C/M
y donde 0 es el tiempo adimensional calculado como t/i.
En el caso de que el trazador se introduzca en forma de escaln, con un caudal m, la

variacin de la concentracin a la salida del bioreactor ser de la forma que indica la fig. 1.10.
V
Entrada \,
Salida ideal
~ flujo pistn
tanque agitado
Fig. 1.10: Respuesta de sistemas ideales para un escaln de trazador.
En este caso, de la aplicacin del balance de materia para el sistema se deduce el test
de consistencia, que viene dado por la ecuacin (3):
Cmaxl=mV/QL2 (3)
La curva normalizada para los experimentos en escaln se conoce como curva F que
se calcula como Qi/C/m, mientras que el tiempo de residencia real se calcula segn la
ecuacin (4):
46 Introduccin
mm
f_!
' ~~ fCme,
c
f
Las funciones E y F estn relacionadas entre s, ya que la primera es la derivada de la
segunda, y la segunda la integral de la primera. Por tanto, independientemente de como se
haga la introduccin del trazador, el tratamiento posterior de los datos puede hacerse de
ambas formas. Una vez obtenida la distribucin de tiempo de residencia se puede pasar a
estudiar cual es el tipo de flujo en el reactor.
1.6.2. Modelos de flujo
Una vez conocidos los datos de distribucin de tiempo de residencia para un sistema
determinado, las caractersticas de flujo han de ser evaluadas cuantitativamente mediante el
uso de ajuste de modelos matemticos. Los modelos de flujo no ideal pueden dividirse en tres
grupos:
Modelos de dispersin: correspondientes a pequeas variaciones del modelo de flujo en
pistn.
- Modelos de recirculacin: correspondientes a pequeas variaciones del modelo de
mezcla completa.
Modelos compartim en tados: para el resto de situaciones intermedias.
1.6.2.1. Modelo de dispersin axial
Consiste en una variacin del modelo de flujo en pistn ideal, en el que se considera
un proceso de dispersin axial al mismo tiempo que el flujo convectivo. La introduccin de
este trmino origina que la concentracin adimensional en funcin del tiempo viene dada por
la ecuacin (5):
(5)
donde Pe es el nmero de Peclet que se define como:

Introduccin 47
'. = (6)
D,
donde:
L es la longitud del reactor
u es la velocidad del fluido en el reactor
Dz es el coeficiente de dispersin axial.
y expresa el grado de mezcla del reactor, es decir, un Pe = O significa un sistema de tanque
agitado perfecto, mientras que Pe = oo indica un flujo pistn ideal.
Para variaciones pequeas del flujo pistn, las curvas que predice el modelo son
simtricas, mientras que para desviaciones ms considerables la forma de la curva no es
simtrica, y esto ocurre para valores inferiores de 100 del nmero de Peclet.
1.6.2.2. Modelo tanques en serie
El reactor se representa por una serie de tanques perfectamente agitados y del mismo
volumen, conectados en serie. El grado de mezcla del reactor global viene dado por el nmero
de tanques N. As, cuanto ms elevado es el nmero de tanques, el reactor se acerca ms a un
flujo pistn. En este caso, a partir del balance de materia se puede deducir la expresin para la
curva E que se presenta en la ecuacin (7):
exp(-W) (7)
(N-)\
Con esta ecuacin se puede generar una familia de curvas dando distintos valores a N.
1.6.2.3. Modelos compartimentados
Los modelos anteriores basados en desviaciones de un modelo ideal no son capaces de

explicar todas las desviaciones respecto al flujo ideal. Para describir los reactores que
presentan regiones poco agitadas, canalizacin o recirculacin importante de fluido entre otras
48 Introduccin
posibles disfunciones se necesitan modelos multiparamtricos, en los cuales el volumen del

reactor se divide en tres diferentes fracciones:
- regin de flujo pistn
- regin de flujo agitado
- zonas muertas
mientras que el flujo en su interior se compone de:
- flujo activo
- flujo de by-pass
flujo de recirculacin
Comparando la curva real de DTR y las curvas tericas para diferentes combinaciones
de compartimentos y flujos, se puede determinar que modelo se ajusta mejor al reactor real.
Levenspiel (1979) realiza una descripcin detallada de algunos de los modelos
compartimentados tpicos que describen algunas situaciones reales.
1.6.3. Tipos de bioreactores enzimticos
Cuando se utilizan biocatalizadores inmovilizados, existen dos posibles

configuraciones de reactor de acuerdo con la movilidad de las partculas de catalizador:
partculas en movimiento o fijas. Los sistemas en que las partculas no estn fijas son
bsicamente tres:
- reactor de tanque agitado
- reactor de lecho fluidizado
- reactor "air-lift"
mientras que los sistemas con partculas fijas se conocen como reactores de lecho fijo (Brink
et al, 1988) e incluyen los reactores de membranas.
El reactor de tanque agitado es el ms simple de diseo y uno de los ms utilizados,

aunque su uso no es recomendable para enzimas inmovilizadas debido a la poca resistencia de
las partculas al esfuerzo cortante de las palas del agitador, o en casos donde exista inhibicin
Introduccin 49
por producto, ya que trabaja a las condiciones de salida. No obstante, existen algunos trabajos
utilizando enzimas libres (Margot etal, 1998).
El reactor de lecho fluidizado se caracteriza por que las partculas del biocatalizador
se mantienen en suspensin en el reactor mediante el caudal de alimentacin, la recirculacin
del lquido o el gas producido y/o aportado al sistema. En este caso se necesitan partculas de
tamao pequeo y de densidad cercana a la del medio para favorecer la fluidizacin, con lo
que se favorece la transferencia de materia entre el medio y el biocatalizador. Sin embargo, su
principal desventaja es el mantenimiento de la fluidizacin que depende fuertemente de la
densidad de las partculas. Este sistema es poco empleado en enzimas aunque existe alguna
aplicacin con lipasas (Fishman y Zviely, 1998).
Un caso particular de reactor fluidizado es el de las columnas de burbujeo en que las

partculas de biocatalizador estn dispersas en la fase fluida por efecto de la ascensin de las
burbujas de un gas, o por efecto conjunto del flujo de gas y lquido.
En el reactor air-Iift se distinguen dos zonas diferenciadas, de las cuales slo una es
alimentada con un gas. La diferencia de composicin en la zona aireada y la no aireada
provoca una diferencia de densidad que provoca la circulacin del fluido. De nuevo, la
ventaja de este tipo de reactores son los elevados coeficientes de transferencia conseguidos.
Existen algunos ejemplos de este tipo de reactor como son la produccin de cido glucnico
con glucosa oxidasa (Nakao etal., 1997).
El sistema ms utilizado para enzimas es el reactor de lecho fijo. Este es el modelo de

bioreactor ms ligado al uso de enzimas inmovilizados. Este es el modelo ms simple de
construccin y operacin en el que la solucin de substrato que se alimenta al reactor circula
en una direccin determinada y simultneamente va teniendo lugar su conversin, por tanto,
ser adecuado en el caso de inhibicin por producto pero no en casos de inhibicin por
substrato. El modelo que sigue este reactor en el caso ideal es el de flujo pistn. La limitacin
ms importante de este tipo de reactor es la prdida de carga que se produce por el paso del
fluido a travs del lecho, as como la difusin en el interior de las partculas. Estos dos
factores sern los que determinen el tamao de la partcula seleccionado, ya que partculas
50 Introduccin
muy grandes provocan poca prdida de carga pero tienen limitaciones difusionales
importantes mientras que con el uso de partculas pequeas se favorece la difusin interna
pero aumentan los problemas de prdida de carga a travs del lecho.
Este sistema est ampliamente utilizado para todo tipo de enzimas, normalmente en el
caso de medios orgnicos con enzimas inmovilizados en distintos tipos de soportes, como
acilasas (Bianchi et al, 1997), enzimas pectolticas (Dinella et al., 1997), amilasas (Arica et
al, 1998), destacando su aplicacin en sistemas de determinacin analtica tipo FIA (Flow
Injection Analysis) (Kiba et al, 1997).
Un caso particular muy utilizado en reactores enzimticos son los reactores con
membranas, cuya configuracin ms habitual es la conocida como fibras huecas (hollow
fibers). Estos reactores operan como flujos en pistn en los cuales la enzima est inmovilizada
en el espacio libre entre las fibras, el substrato difunde a travs de la membrana, reacciona con
la enzima y el producto se devuelve por difusin a la zona de suspensin homognea (Fig.
1.11).
Enzima
Inmovilizado
Alimento * Producto
Producto
Substrato
Fig. 1.11.: Esquema de un reactor de fibras huecas.
Este sistema est muy implementado en todo tipo de enzimas como amilasas (Lopez-
Ulibarri y Hall, 1997), aunque ha sido empleado con xito junto a reactores de membrana en
general fundamentalmente utilizando lipasas debido a la capacidad de stas de inmovilizarse
en superficies (Prazeres et al, 1993; Matsumae et al, 1994).
Introduccin 51
1.6.4. Procesos industrales enzimticos
Godfrey y West (1996) recogen aquellos procesos donde las enzimas se emplean en
procesos a escala industrial. En la tabla 1.9 se recogen algunos de estos procesos.
Proceso Enzima(s) Inmovilizacin Bioreactor utilizado

Fermentacin a-amilasa Enzima libre tanque agitado
alcohlica glucoamilasa
Enzimas analticos Varios Inclusin -
(biosensores) Crosslinking
Enzimas analticos Varios Enzima libre -
(diagnosis)
Produccin de pasta Amilasas Enzima libre tanque agitado
Carbohidrasas
Proteinasas y lipasas
Produccin de cerveza Proteasas Enzima libre tanque agitado
a-amilasa
Produccin de queso Lipasas Enzima libre -
Lisozima
Produccin de fructosa Xilosa isomerasa Enzima libre tanque agitado
Modificacin de aceites Lipasas Adsorcin lecho fijo
y grasas
Produccin de Termolisina Enzima libre tanque agitado
aspartamo
Produccin de esteres Lipasas Adsorcin tanque agitado
que dan sabores lecho fluidizado
lecho fijo
Produccin de Lipasas Enzima libre tanque agitado
emulsifi cantes
Productos Lipasas Adsorcin tanque agitado
farmacuticos Proteasas Enlace covalente lecho fijo
Aci lasas Crosslinking
Aminotransferasas
Detergentes Proteasas Enzima libre
Lipasas
Amilasas
Celulasas
Tratamiento de residuos Varios Enzima libre tanque agitado
Produccin de zumos Varios Enzima libre tanque agitado
Produccin de Acilasas Enzima libre reactor de membrana
aminocidos
Produccin de Lipasas Inclusin reactor de membrana
bloqueantes quirales
Produccin de pieles Proteasas Enzima libre -
Extraccin de aceite Fosfolipasas Enzima libre tanque agitado
52 Introduccin
Produccin de papel Celulasas Enzima libre tanque agitado

Hidrlisis de almidn Ami lasas Enzima libre tanque agitado
Industria textil Amilasas Enzima libre -
Produccin de vino Pectinasas Enzima libre -
Enriquecer alimento Varios Enzima libre -
de animales
Tabla 1.9.: Algunos procesos enzimticos industriales.

Introduccin 53
1.7. Utilizacin de lipasas
1.7.1. Inmovilizacin de lpasas
Las lipasas se han inmovilizado a lo largo de los ltimos aos en un gran nmero de
soportes y utilizando un gran nmero de mtodos. Entre ellos, se han desarrollado mtodos de
adsorcin, inclusin, enlace covalente utilizando prcticamente todo tipo de soportes,
hidroflicos, hidrofbicos de todo tipo de procedencia. En la tabla 1.10 se recogen a modo de
resumen algunas de las aplicaciones ms representativas en las que se han empleado lipasas
inmovilizadas, recogindose tambin la tcnica empleada de inmovilizacin y el soporte
utilizado.
La mayora de los trabajos utilizan la tcnica de adsorcin sobre distintos soportes,

aunque tambin se encuentran presenten los mtodos de enlace covalente y en menor medida
los de inclusin y crosslinking. El gran desarrollo de las lipasas como biocatalizadores
enantioselectivos as como su buen comportamiento en medios orgnicos (Cambou y
Klibanov, 1984) originan que la inmovilizacin sea un factor a tener en cuenta en cualquier
reaccin que implique el uso de lipasas. Sin embargo, la potencialidad fundamental de la
inmovilizacin que es la posible reutilizacin de la enzima rara vez es estudiada (Vzquez-
Lima et al, 1995).
Como factores importantes que pueden destacarse en la inmovilizacin cabe destacar

los siguientes (Tabla 1.10):
- El mtodo usado por excelencia es el de adsorcin sobre soportes de naturaleza muy

diversa, siendo posibles los soportes hidrofbicos y hidroflicos.
- La tcnica de inmovilizacin por adsorcin que es normalmente muy sencilla implica
poner en contacto una solucin de la lipasa que se quiere inmovilizar con el soporte y
dejar un tiempo de contacto (que suele variar entre 1 y 24 horas) en las condiciones
adecuadas (suelen ser ligera agitacin y baja temperatura a un pH cercano al ptimo) hasta
alcanzar el equilibrio de adsorcin que suele venir descrito por una ley de tipo Langmuir
(Gitlensen et a/., 1997). Tras esto se separa el medio por filtracin o lioflizacin. En el
54 Introduccin
primer caso se suele lavar el soporte con agua destilada o tampn mientras que en el
segundo caso se produce una deposicin de la lipasa sobre el soporte.
- Los mtodos de inmovilizacin por enlace covalente son posibles pero se emplean en
menor medida, as como los de inclusin o "crosslinking". Estos mtodos incluyen un
pretratamiento del soporte y suelen provocar prdidas o cambios importantes en la
actividad enzimtica.
- La inmovilizacin de lipasas suele suponer una mejora en la estabilidad de la enzima,
aunque tambin puede cambiar propiedades como los ptimos de temperatura y pH y en
algunos casos parece tener influencia sobre la enantioselectividad.
- Aunque en la mayora de trabajos no se ha estudiado el efecto de la reutilizacin de
lipasas inmovilizadas, en general, se puede concluir que las lipasas pueden reutilizarse sin
tratamientos muy complejos, normalmente tan simples como una operacin de lavado y
secado.
- Las lipasas inmovilizadas con distintos mtodos pueden ser utilizadas en una gran
variedad de reacciones, tanto de hidrlisis como de sntesis, as como en todo tipo de
medios, acuosos, orgnicos o bifsicos.
- Las tcnicas de inmovilizacin se han aplicado a lipasas provenientes de una gran
variedad de microorganismos, e incluso a lipasas obtenidas a partir de mamferos.
Entre todas las lipasas estudiadas que se han inmovilizado, destacan por nmero de
aplicaciones las siguientes:
a) Candida rugosa: se compra de forma libre y se inmoviliza en distintos soportes.
b) Mucor miehei: en concreto Lipozyme distribuido por Novo Nordisk, que es una lipasa
ya inmovilizada en Duolite A568.
c) Candida antrctica: lipasa B comercializada por Novo Nordisk con el nombre de
Novozyme 435, que ya viene inmovilizada en una resina acrlica.
d) Otras lipasas que se usan inmovilizadas en menor proporcin: Pseudomonas sp. (Fishman
y Zviely, 1998), Rhizopus niveus (De Castro y Gago, 1998) y Penicillium roquefortii
(Furebye/a/., 1997).
Introduccin 55
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Ferreira-Dias y Candida rugosa Poliuretano Crosslinking Hidrlisis de aceite Estabilidad No
da Fonseca (1995)
Basnet al. (1996) Candida rugosa Celita Adsorcin Sntesis de esteres Actividad No
Polmeros
Balcaoetal. (1996a) Aspergillus niger Fibras huecas Adsorcin No descrito No descrito No
Candida rugosa
Candida lipolytica
Humicola lanuginosa
Mucor javanicus
Peniclium camembert
Peniclium roquefort
Rhizopus delemar
Rhizopus oryzae
Geotrichum candidum
Snchez et al. (1996) Candida rugosa Agarosa Covalente Hidrlisis Enantioselectividad No
Silica gel Covalente enantioselectiva
Gitlesen efa/. (1997) Aspergillus niger EP 100 Adsorcin No descrito No descrito No
Candida rugosa
P seudomonas flores.
Humicola lanuginosa
Peniclium cyclopiami
Peniclium roquefort
Rhizopus delemar
Rhizopus niveus
Rhizopus jaconicus
Murray et al. (1997) Candida rugosa Poliestireno Adsorcin Hidrlisis de aceite Estabilidad S
EP400 Actividad
Maugardetal. (1997) Candida antrctica Resina acrlica Adsorcin Sntesis de No descrito No
surfactantes
Danielietal. (1997) Candida antrctica Resina acrlica Adsorcin Sntesis No descrito No
enantioselectiva I-
Van den Heuvel et al. Pseudomonas sp. HSC Adsorcin Sntesis Actividad No I
(1997) y otras especies enantioselectiva
Selmietal. (1997) Mucor miehei Duolite Adsorcin Sntesis de esteres No descrito No

Fureby etal. (1997) Penicillium roquefort EP100 Adsorcin Alcohlisis No descrito No I
Bagietal. (1997) Pncreas de cerdo Poliacrilamida Covalente Hidrlisis Estabilidad No
Celita Adsorcin
Glutaraldehdo Crosslinking I
ChenyWang(1997b) Rhizopus niveous Clulas sobre Inclusin Sntesis de esteres No descrito No
celulosa de ceras
BomvQretal. (1997) Rhizopus javanicus Fibras huecas Adsorcin Hidrlisis de grasas No descrito No
Moreno et al. (1997) Candida rugosa Agarosa Covalente Hidrlisis de esteres Estabilidad No
Silica gel Covalente
NaviayClair(1997) No descrito Cristales Crosslinking Biosensores No descrito No
De Castro y Gago Candida antrctica Resina acrlica Adsorcin Sntesis de amidas No descrito No
(1998) Mucor miehei Duolite quirales
Bourg-Garros el al. Candida antrctica Resina acrlica Adsorcin Sntesis de acetatos No descrito No
(1998) Mucor miehei Duolite
Lee y Swaisgood (1998) Pseudomonas Vidrio poroso Adsorcin Hidrlisis de grasas Estabilidad No
fluorescens
Knezevic etal. (1998) Candida rugosa Zeolite Adsorcin Hidrlsis de aceites Actividad S
Tabla 1.10: Resumen de trabajos con lipasas inmovilizadas.

Ferreira-Dias y Candida rugosa Poliuretano Crosslinking Hidrlisis de aceite Estabilidad No
da Fonseca (1995)
Basnet al. (1996) Candida rugosa Celita Adsorcin Sntesis de esteres Actividad No
Polmeros
Balcaoetal. (1996a) Aspergillus niger Fibras huecas Adsorcin No descrito No descrito No
Candida rugosa
Candida lipolytica
Humicola lanuginosa
Mucor javanicus
Peniclium camembert
Peniclium roquefort
Rhizopus delemar
Rhizopus oryzae
Geotrichum candidum
Snchez et al. (1996) Candida rugosa Agarosa Covalente Hidrlisis Enantioselectividad No
Silica gel Covalente enantioselectiva
Gitlesen efa/. (1997) Aspergillus niger EP 100 Adsorcin No descrito No descrito No
Candida rugosa
P seudomonas flores.
Humicola lanuginosa
Peniclium cyclopiami
Peniclium roquefort
Rhizopus delemar
Rhizopus niveus
Rhizopus jaconicus
Murray et al. (1997) Candida rugosa Poliestireno Adsorcin Hidrlisis de aceite Estabilidad S
EP400 Actividad
Maugardetal. (1997) Candida antrctica Resina acrlica Adsorcin Sntesis de No descrito No
surfactantes
Danielietal. (1997) Candida antrctica Resina acrlica Adsorcin Sntesis No descrito No
enantioselectiva I-
Van den Heuvel et al. Pseudomonas sp. HSC Adsorcin Sntesis Actividad No I
(1997) y otras especies enantioselectiva
Selmietal. (1997) Mucor miehei Duolite Adsorcin Sntesis de esteres No descrito No

Fureby etal. (1997) Penicillium roquefort EP100 Adsorcin Alcohlisis No descrito No I
Bagietal. (1997) Pncreas de cerdo Poliacrilamida Covalente Hidrlisis Estabilidad No
Celita Adsorcin
Glutaraldehdo Crosslinking I
ChenyWang(1997b) Rhizopus niveous Clulas sobre Inclusin Sntesis de esteres No descrito No
celulosa de ceras
BomvQretal. (1997) Rhizopus javanicus Fibras huecas Adsorcin Hidrlisis de grasas No descrito No
Moreno et al. (1997) Candida rugosa Agarosa Covalente Hidrlisis de esteres Estabilidad No
Silica gel Covalente
NaviayClair(1997) No descrito Cristales Crosslinking Biosensores No descrito No
De Castro y Gago Candida antrctica Resina acrlica Adsorcin Sntesis de amidas No descrito No
(1998) Mucor miehei Duolite quirales
Bourg-Garros el al. Candida antrctica Resina acrlica Adsorcin Sntesis de acetatos No descrito No
(1998) Mucor miehei Duolite
Lee y Swaisgood (1998) Pseudomonas Vidrio poroso Adsorcin Hidrlisis de grasas Estabilidad No
fluorescens
Knezevic etal. (1998) Candida rugosa Zeolite Adsorcin Hidrlsis de aceites Actividad S
Tabla 1.10: Resumen de trabajos con lipasas inmovilizadas.

58 Introduccin
1.7.2. Cinticas enzimtcas para lipasas
En general, las cinticas descritas para lipasas son muy variadas y dependern
bsicamente de tres factores:
- del tipo de reaccin que se est estudiando.

del medio de reaccin: acuoso, orgnico o bifsico.
- de si la lipasa se encuentra inmovilizada o no.
El mecanismo natural de las lipasas cuando trabajan en forma soluble hidrolizando

substratos insolubles (actividad lipoltica) no se corresponde habitualmente con una cintica
de tipo Michaelis-Menten (Verger et al, 1990), debido a que el mecanismo de reaccin
normalmente incluye una primera etapa de adsorcin sobre la superficie del substrato, etapa
que muchas veces puede ser limitante (Marangoni, 1994) y que normalmente es la que se
intenta mejorar por distintos mtodos (Kim et al., 1984; Kim y Chung, 1989). Otro factor que
tendrn que tener en cuenta los modelos cinticos detallados es la conocida activacin
interfacial que se produce en las lipasas al encontrar una interfase orgmco-acuosa y que se ha
descrito como altamente variable en funcin del microorganismo y del substrato (Jaeger et al.,
1994;Martinelleea/., 1995).
Sin embargo, cuando los esteres que se hidrolizan son solubles (actividad estersica)
no existe dicha interfase y las lipasas suelen seguir cinticas de tipo Michaelis-Menten
(Redondo^ al, 1995).
No obstante, hay que sealar que en muchas ocasiones, aunque no se siga una cintica
simple, se adopta el uso de pseudocinticas de tipo sencillo como primer orden o la propia de
Michaelis-Menten como simplificacin de cinticas mucho ms complejas, originndose en
este caso lo que se conocen corno constantes aparentes (Gargouri et al., 1991; Arroyo et al.,
1996).
Cuando se trabaja con lipasas inmovilizadas, las diferencias que pueden aparecer con
respecto a la enzima libre son muy importantes, obtenindose constantes cinticas que pueden
Introduccin 59
diferir en rdenes de magnitud para enzimas libres e inmovilizados sobre diferentes soportes o
mediante distintas tcnicas. Por ejemplo, Snchez et al. (1996) obtienen para Candida rugosa
cambios de hasta 20 veces en las constantes cinticas cuando se inmoviliz covalentemente la
enzima en silica y agarosa, aunque estos cambios eran notablemente diferentes en el caso de
que se tratara de actividad estersica o lipoltica. Al mismo tiempo, cuando las lipasas
inmovilizadas se utilizaron para llevar a cabo reacciones quirales, las velocidades de reaccin
para cada enantimero eran distintas.
Otros autores, sin embargo, han encontrado diferentes resultados para otros tipos de
lipasas. Lieberman y Ollis (1975) utilizando mtodos de inmovilizacin tipo "crosslinking"
con lipasa pancretica sealan la obtencin de los mismos parmetros cinticos para la enzima
libre e inmovilizada. Pencreac'h y Baratti (1997) con lipasas de Pseudomonas cepacia
observan que la enzima libre o inmovilizada sobre polipropileno poroso obedeca a cintica de
Michaelis-Menten pero con constantes variables segn el tipo de substrato con respecto a la
lipasa libre.
Por lo que se refiere a lipasas libres e inmovilizadas trabajando en medio orgnico,

recientemente se han publicado diversos trabajos proponiendo distintas cinticas asociadas a
diversos mecanismos de reaccin, adems de las clsicas pseudocinticas descritas para
medios acuosos. Entre ellas destacan:
1) Botta et al. (1997): realizan una aproximacin a la cintica mediante el estudio

tridimensional de las molculas que participan en la reaccin. Mediante las estructuras del
centro activo determinadas experimentalmente, se deducen la afinidad de la lipasa de
Candida rugosa hacia ciertos substratos. Los autores sugieren una va de simulacin para
realizar estos clculos.
2) Otra aproximacin para explicar valores cinticos es la desarrollada por Parve et al.
(1997) donde se interpretan los datos de velocidad inicial a partir de la teora de
localization de orbitales.
3) En muchos casos, donde aparecen esterifcationes en las que se produce agua, se
correlaciona la cintica con el comportamiento que tiene el agua en el sistema y se seala
60 Introduccin
la actividad de agua como un factor determinante en la formulacin y clculo de la

cintica (Selmiet al., 1997).
4) Chen y Wang (1997b): proponen una cintica de tipo Ping-Pong Bi Bi basada en el
mecanismo propuesto por Chulalaksananukul et al. (1990). Un esquema de una sntesis de
una alcohol con un cido graso para generar ster y agua se detalla en la Fig. 1.12.
-r
Fig. 1.12: Esquema del mecanismo de una reaccin de esterifcacin segn el modelo Ping-
Pong Bi Bi descrito por Chen y Wang (1997b). E: enzima. S: cido graso, W: agua, C:
alcohol, P: ster, EC: complejo enzima-alcohol, ES: complejo enzima-cido graso, E*S:
complejo acil-enzima, E*SC: complejo intermediario.
5) Por ltimo, sealar que en trabajos recientes se ha llegado a diferenciar distintos

comportamientos cinticos para isoenzimas A y B puros de lipasa de Candida rugosa
(Plou et al., 1997). En el trabajo se constata como para distintos substratos las cinticas
podan ser diferentes para ambos isoenzimas. A modo de resumen:
- Actividad lipsica (tributirina): el valor de la constante especfica aparente de Michaelis-
Menten es el doble para la lipasa A.
- Actividad estersica (p-nitrofenil acetato): comportamiento cintico muy similar para
ambas isoenzimas. Se sigue una cintica de tipo Michaelis-Menten.
- Enantioselectividad (2-cloro-metil-propionato): ninguna de las isoenzimas sigue una
cintica de Michaelis-Menten sino de tipo sigmoidal. Al mismo tiempo, se observan
ligeras diferencias en la enantioselectividad.
Introduccin 61
1.7.3. Bioreactores con lipasas
En general, se puede considerar que el sistema ms econmicamente favorable para

trabajar con lipasas en un bioreactor es el de utilizarlas inmovilizadas. Esto es debido
normalmente al aumento de estabilidad que normalmente lleva asociado el proceso de
inmovilizacin y que en sistemas en continuo es el factor determinante de la viabilidad del
proceso.
Los cinco tipos de bioreactores que ms comnmente se han empleado con lipasas
inmovilizadas son:
- reactor discontinuo de tanque agitado

reactor de lecho fijo o empacado
- reactor continuo de tanque agitado
- reactor de lecho fluidizado
- reactor de membrana
En el trabajo deBalcao etal. (1996b) se recogen con detalle muchos de los trabajos en
los que se han desarrollado reactores con lipasas inmovilizadas.
Los reactores discontinuos de tanque agitado son los ms utilizados,

caracterizndose por un sistema de operacin sencillo as como una recuperacin simple por
filtracin o centrifugacin de la enzima. Sin embargo, el problema de operar en discontinuo
genera la aparicin de tiempos de carga y descarga que limitan en ciertos procesos su
aplicacin a gran escala. En esteriflcaciones en medio orgnico, donde se produce agua que
puede ser causante de un descenso en el rendimiento del reactor, normalmente este sistema
tendr que llevar acoplado un sistema efectivo de eliminacin del agua de los que el ms
habitual es la adicin de sales o de tamiz molecular (Vzquez-Lima et al., 1995; Han y Rhee,
1998). En este sistema se han desarrollado la mayora de reacciones descritas con lipasas tanto
libres como inmovilizadas (Balcao etal., 1996b).
62 Introduccin
Los reactores de lecho fijo constituyen una buena alternativa debido a su alta
eficacia, facilidad de constmccin y forma de operar (como reactor de flujo pistn) y han sido
utilizados tradicionalmente en operaciones a escala industrial. En este caso tambin suele ser
necesario algn sistema de control de agua en reacciones de esterifcacin (Rosell et al.,
1996). Normalmente, los problemas asociados a este tipo de reactor son la prdida de carga a
travs del reactor y la posible limitacin de la difusin. Esta configuracin de reactor se ha
empleado en reacciones en medio orgnico incluyendo sntesis de esteres, interesterificacin,
transesterificacin, alcohlisis y en algunas casos para hidrlisis de aceites cuando la
inmovilizacin era de tipo covalente (Balcao et al., 1996b) y en algunas resoluciones de
mezclas racmicas (Battistel et al., 1991).
Por lo que se refiere al reactor continuo de tanque agitado, su uso es bastante

limitado a pesar de su bajo coste debido a que normalmente requiere mayor volumen de
reaccin para las cinticas que describen el comportamiento de las Hpasas. Otro impedimento
importante que presenta es el efecto negativo que suele tener la agitacin mecnica sobre el
soporte de inmovilizacin y sobre la propia enzima (Lee y Choo, 1989). Esta configuracin se
ha empleado en algunas reacciones de hidrlisis, acidlisis y sntesis de esteres (Balcao et al.,
1996b).
El reactor de lecho fluidizado se presenta como un intermedio entre los dos tipos
anteriores y es una opcin para eliminar restricciones difusionales. Sin embargo, su
complejidad de operacin ha limitado su uso con Hpasas a algunas reacciones de
esterifcacin (Balcao et al, 1996b).
Los reactores de membrana han sido ampliamente utilizados con Hpasas. En estos
reactores, la lipasa se inmoviliza en una membrana, que puede ser en forma de superficie o en
forma de fibra hueca. Estos reactores son muy indicados en sistemas bifsicos y su principal
problema operacional es el de la polarizacin de la membrana. Un resumen de las posibles
configuraciones se recoge en el trabajo de Prazeres y Cabral (1994). Los tipos de membranas
que se han utilizado son muy variables, hidroflicas e hidrofbicas, aunque en trabajos
recientes se sealan las hidroflicas como las mejores en trminos de productividad (Bouwer
et al., 1991).
Introduccin 63
Algunas de las reacciones en las que se han aplicado con xito lipasas inmovilizadas en
reactores de membrana se detallan en la tabla 1.11.
Autor Lipasa Reaccin Tipo de Configuracin

membrana
Hoqetal. (1984) Chromobacterium Sntesis de Microporosa de Superficie
viscosum glicridos polipropileno
(Hidrofbica)
Hoqetal. (1985) Candida rugosa Hidrlisis de Microporosa de Fibra hueca
aceite de polipropileno
oliva (Hidrofbica)
Y aman et al. (1986) Pseudomonas flor escens Glicerlisis de Microporosa de Superficie
grasas polipropileno
(Hidrofbica)
Taylor et al. (1986) Thermomyces lanuginosus Hidrlisis de Microporosa de Superficie
grasas niln
(Hidrofbica)
Pronke/a/. (1988) Candida rugosa Hidrlsis de Celulosa Fibra hueca
triglicridos (Hidroflica)
Mulcatuetal. (1992) Aspergillus niger Hidrlisis de Microporosa de Fibra hueca
aceite polipropileno
(Hidrofbica)
64 _ _ Introduccin
1.7.4. Formas de expresar v calcular la enantioselectividad
Desde el inicio del desarrollo de reacciones cuyo objetivo era resolver una mezcla
racmica, ha existido la necesidad de cuantificar el progreso o la calidad del producto
obtenido. La referencia clsica es la proporcionada por Chen et al. (1982) donde se definen
los siguientes conceptos:
Exceso enantiomrico (EE):
(8)
El exceso enantiomrico siempre se refiere a uno de los dos enantimeros R o S, y puede

referirse al producto o al reactivo (Ecuacin (8)), viniendo el uso de uno u otro condicionado
por la facilidad de anlisis de productos o reactivos. El exceso enantiomrico tomar valores
entre el O y el 100%.
Enantioselectividad o "enantiomeric ratio" (E):
Este valor relaciona la conversin total con el exceso enantiomrico para dar un valor entre O
para reaccin no enantioselectiva e infinito para una reaccin completamente enantioselectiva.
En trminos generales, se considera una reaccin enantioselectiva a partir de valores de E
superiores a 25, aunque este valor depende fuertemente de la rente consultada. La ventaja de
usar este valor es que no depende de la conversin y, por tanto, no ha de variar a lo largo de la
reaccin, teniendo su origen en consideraciones cinticas. Tambin puede ser calculado a
partir del EE del producto o del reactivo.
Conversin (X):
Este valor tiene el significado general de conversin, con lo que se puede calcular de distintas
formas a partir de las concentraciones de productos o reactivos.
Introduccin 65
En el trabajo de Straathof y Jongejan (1997) se hace una recopilacin de distintas

formas de evaluar la enantioselectividad a partir del valor propuesto por Chen et al. (1982).
En este trabajo se estudian mtodos de clculo de este parmetro y se discute la influencia que
tienen factores como:
- Presencia de reacciones paralelas

- Cintica y termodinmica de la reaccin principal
- Inhibicin enzimtica
Concentracin en exceso de enzima
Homogeneidad de las fases
- Equilibrio qumico
- Limitacin por difusin
- Mezcla incompleta
- Tipo de reactor
Aunque los parmetros descritos por Chen et al. (1982) han sido ampliamente
utilizados en todo tipo de resoluciones (Kazlauskas et al., 1991; Chiou et al., 1992;
Santaniello et al., 1993, Secundo et al., 1997), algunos autores proponen otras formas de
cuantificar la enantioselectividad; as, Straathof et al. (1995) proponen el uso de un balance
quiral en el caso de que la resolucin sea cintica,
Por otro lado, Lpez-Belmonte et al (1997) proponen un nuevo parmetro

denominado factor enantiomrico (EF) que permite evaluar la enantioselectividad de forma
sencilla. El factor enantiomrico se calcula como el cociente del exceso enantiomrico
experimental (calculado segn la ecuacin (8)) y el denominado exceso enantiomrico terico
(ecuacin (9)), que corresponde al valor que tendra el exceso enantiomrico si slo
reaccionara el enantimero de velocidad de reaccin ms rpida. As pues, un valor del factor
enantiomrico de 1 significa enantioselectividad perfecta, mientras que un valor de O
corresponde a ausencia de resolucin.
= EEIEET con EEr = -(xlOO) V (10)

lOO-JT '
66 Introduccin
1.7.5. Resolucin de cidos 2-aril propinicos con lipasas
1.7.5.1. Precedentes
Durante los ltimos aos, la resolucin va hidrlisis, sntesis y transesterificacin, de

productos finales o intermediarios de la industria en general y farmacutica en particular se ha
incrementado espectacularmente tanto en la investigacin acadmica como en la industrial
(Federsel, 1993; Margolin, 1993; Stinson, 1994).
Las principales razones que han motivado este cambio en el inters por este tipo de
compuestos son:
El beneficio mdico de usar nicamente el compuesto pticamente puro que tiene la

actividad biolgica. Hay numerosos ejemplos en los que el principio activo deseado se
encuentra exclusivamente en uno de los enantimeros. La presencia del otro enantimero
puede causar prdida de potencia en el enantimero de inters, inactivacin en incluso
actuar con efecto totalmente opuesto al deseado, pudiendo llegar a causar trastornos en el
paciente (Arien, 1986).
Cambios en la normativa de regulacin del uso de este tipo de medicamentos. Las nuevas
normativas promovidas por las autoridades correspondientes estn favoreciendo
fuertemente el desarrollo de productos farmacuticos que contengan nicamente el
enantimero biolgicamente activo y no la mezcla racmica, siendo prohibida, en un futuro
no muy lejano, la presencia del racmico incluso en aquellos casos en que parezca ser
inocuo la presencia del biolgicamente no activo.
Los grandes avances producidos en la sntesis de compuestos pticamente puros. De

manera que es posible la produccin de grandes cantidades de enantimeros mediante el
uso de sntesis qumica asimtrica, cintica enzimtica, cristalizacin enantioselectiva o
cromatografa quiral. Entre estos mtodos la aplicacin de enzimas o microorganismos est
aumentando considerablemente (Klibanov, 1990; Schoffersea/., 1996).
Introduccin 67
De entre los muchos compuestos que actualmente se resuelven va enzimtica se va a

centrar el estudio en la resolucin de cidos 2-aril-propinicos (profenos). En la tabla 1.12 se
recogen los principales componentes de este grupo.
Compuesto Frmula Estructura

Acido 2-fenil
propinico
HO
O
Ibuprofeno C13H1802
Naproxeno
Ketoprofeno
Flunoxaprofeno Ci6Hi2FN03
Benoxaprofeno Ci6H12ClN03
Flurbiprofeno Ci5H13F02
Tabla 1.12: Estructuras de algunos de cidos 2-aril propinicos resueltos con lipasas.
68 Introduccin
Estos compuestos forman un importante grupo de frmacos antiinflamatorios no

esteroidales, conocidos bajo las siglas NSAIDs ("non-steroidal anti-inflamatory drugs"). Su
actividad farmacolgica reside principalmente en el (S)-enantimero (Hutt y Caldwell, 1984).
Por ejemplo, se ha demostrado que el (S)-ibuprofeno es 160 veces ms activo que el (R) en la
inhibicin de la sntesis de la prostaglandina in vitro (Adams et al., 1976). Ante estos
resultados queda manifiesto el gran esfuerzo que se est produciendo para conseguir sintetizar
el enantimero de inters puro, a pesar de que a excepcin del (S)-naproxeno y el (S)-
flunoxaprofeno se estn utilizando en los productos teraputicos como mezcla racmica.
De entre toda esta familia de compuestos el estudio se centrar en el cido 2-fenil

propinico, como el precursor de la familia, y el ibuprofeno. El ibuprofeno, como integrante
de la familia NSAIDs, es un agente antiinflamatorio no esteroidal usado en el tratamiento de
la artritis y otras enfermedades similares (Davies y Avery, 1971; Hamman et al., 1997;
Yoshida et al., 1997). Por otro lado, la resolucin de llevar a cabo mediante esterificacin de
estos cidos con un alcohol lineal en medio orgnico.
1.7.5.2. Factores que afectan a este tipo de reacciones
Los principales factores que afectan a este tipo de reacciones de sntesis, en las que
intervienen un cido orgnico de naturaleza quiral y un alcohol en medio orgnico, se pueden
resumir en los siguientes puntos:
1. Naturaleza y fuente de la enzima (microbiana, extraccin de rganos de animales, etc.).

2. Tipos de alcoholes y cidos utilizados.
3. Relacin cido-alcohol empleada.
4. Concentracin de la enzima.
5. Concentracin de los substratos.
6. Factores fsicos externos (temperatura, agitacin, etc.).
7. Tipo de disolvente.
8. Influencia del agua.
9. Tiempo de reaccin.
10. Modificacin de la enzima.
Introduccin 69
El comentario de estos puntos se va a centrar en la utilizacin de lipasas microbianas

para la sntesis de esteres de cidos 2-aril-propinicos, y particularmente el ibuprofeno. Es
importante sealar que estos factores citados pueden afectar tanto a la velocidad de
esterifcacin como a la enantioselectividad. No siempre la mayor velocidad de esteriflcacin
proporcionar la mxima enantioselectividad. Por este motivo, como la enantioselectividad
suele ser el factor determinante, las condiciones ptimas no siempre coinciden con las de la
mxima velocidad de esteriflcacin.
Fuentes de lipasas microbianas
Existe un gran nmero de microorganismos productores de lipasas cuyos preparados

enzimticos se pueden obtener comercialmente de diversos proveedores. De hecho Mustranta
(1992) realiz un amplio estudio para determinar el tipo de lipasas ms adecuado para la
resolucin del ibuprofeno racmico mediante la esterifcacin en medio orgnico. En la tabla
1.13 se recogen los preparados utilizados ampliados con los utilizados por otros grupos de
investigacin.
Suministrador Origen microbiano

Biocatalyst (UK) Candida rugosa
Geotrichum candidum
Rhizopus arrhizus
Aspergillus niger
Penicillium cyclopium
Amano Pharmaceutical (JP) Aspergillus niger
Candida rugosa
Pseudomonas fluorescens
Mucor javanicus
Sigma (USA) Rhizopus arrhizus
Candida rugosa
Extracto de pncreas porcino
Meito-Sangyo (JP) Candida rugosa
BDH(UK) Candida rugosa
Novo Industri (DM) Rhizomucor miehei (Lipozyme IM)
Candida antrctica (Novozyme 435)
Tabla 1.13: Principales lipasas comerciales probadas para la esterifcacin de cidos 2-aril-
propinicos en medio orgnico (Mustranta, 1992).
70 Introduccin
De todos estos preparados enzimticos los nicos que fueron capaces de realizar la
sntesis del ibuprofeno fueron los derivados de Candida rugosa, Mucor javanicus, y los
preparados de Novo Industri de Khizomucor miehei y Candida antrctica, catalizando
preferencialmente la esterificacin del S-enantimero. Mustranta (1992) centr sus estudios
en el preparado de Candida rugosa por la mayor enantioselectividad mostrada en
comparacin con la de Khizomucor miehei bajo las mismas condiciones de ensayo. Pero
tambin existen estudios interesantes de la resolucin del ibuprofeno con Mucor javanicus
(Goto et al, 1996), Rhizomucor miehei (Lpez-Belmonte et al, 1997) y Candida antrctica
(Arroyo y Sinisterra, 1994).
Es muy curioso tambin ver las diferencias manifiestas entre los preparados
suministrados por los diversos proveedores. Si bien esta dispersin podra entenderse entre
diferentes suministradores, se han encontrado discrepancias en las propiedades catalticas de
un mismo suministrador dependiendo del lote utilizado. Estas variaciones muchas veces no
slo deben imputarse al suministrador, sino tambin a la manipulacin del preparado y al
almacenamiento del mismo (Tsai y Dordick, 1996b).
Mustranta (1992) presenta una interesante tabla de comparacin entre la lipasa de

Candida rugosa en funcin del suministrador. Los parmetros de comparacin utilizados
fueron:
1. La actividad lipoltica determinada a partir de la reaccin de hidrlisis del aceite de oliva y

expresada en unidades de actividad por mg.
2. El contenido en protena como % en peso seco utilizando el mtodo de Lowry.
3. El rendimiento de la reaccin de esterificacin 12mM de ibuprofeno, utilizando alcohol
amlico 24 mM en n-hexano y expresado corno (imol/g de lipasa.
Los resultados se recogen en la tabla 1.14. En dicha tabla se observa una correlacin
entre los valores de actividad de hidrlisis frente a aceite de oliva con los de esterificacin de
ibuprofeno, mientras que esta correlacin no existe en el caso del contenido en protena total.
Segn esto, una medida de actividad lipoltica sera ms representativa que una de protena
total.
Introduccin 71
Suministrador A. Lipoltica (U/mg) Protena (%) Rendimiento de la

(aceite de oliva) esterifcacin de
ibuprofeno
(u,mol/g de lipasa)
Biocatalyst 670 10.0 480
Meito-Sangyo 750 12.9 432
Amano 145 9.0 168
BDH 77 7.3 48
Sigma 85 7.0 24
Tabla 1.14: Comparacin de la lipasa de Candida rugosa dependiendo del suministrador.
Tipos de alcoholes y cidos utilizados.
Con relacin al tipo de alcohol, en general se puede afirmar que, independientemente

del origen de la lipasa microbiana, la mxima velocidad de esterifcacin se obtiene para
alcoholes primarios, disminuyendo para alcoholes secundarios y siendo nula para alcoholes
terciarios. Esta tendencia se observa con Candida rugosa (Mustranta, 1992) Rhizomucor
miehei (Lpez-Belmonte et a/., 1997) y Candida antrctica (Arroyo y Sinisterra, 1994).
Si se compara el efecto del nmero de tomos de carbono de los alcoholes primarios

lineales, se observa que los alcoholes de cadena corta (metanol, etanol) presentan una baja
actividad ya que son capaces de deshidratar la enzima (Gorman y Dordick, 1992). No tan
clara es la seleccin entre el propanol o el butanol y uno de cadena ms larga como el octanol,
obtenindose resultados contradictorios en funcin de la lipasa microbiana utilizada. La
utilizacin de alcoholes ramificados cortos como el 3-metil-l-butanol provocan una
importante disminucin de la velocidad de esterifcacin, debido a impedimentos estricos, de
manera que el radical metilo en la posicin 3 puede impedir el acercamiento del alcohol al
centro activo de la enzima.
Parece claro que sern los alcoholes hidrofbicos los ms apropiados para ser
reconocidos por el centro activo de la lipasa debido a su conocida naturaleza hidrofbica. No
obstante ste no debe ser el nico parmetro considerado y parmetros como la geometra de
72 Introduccin
los alcoholes deben ser tambin tenidos en cuenta. En cuanto a la enantioselectividad el

alcohol puede influir de manera importante. As con Lipozyme las largas cadenas lineales
parecen incrementar la enantioselectividad. Estos resultados estaran de acuerdo con los
observados en la esterificacin del cido octanoico con diferentes alcoholes quirales (Gatfield,
1984). Como conclusin los alcoholes ms comnmente utilizados para la resolucin del
ibuprofeno son propanol, butanol y octanol.
Aunque nuestro estudio se centra en la resolucin del ibuprofeno se han realizado

estudios con otros cidos 2-aril-propinicos. Concretamente con Lipozyme Lpez-Belmonte
et al. (1997) obtienen que el rendimiento sigue el siguiente orden despus de 72 horas de
operacin:
Ibuprofeno > naproxeno > ketoprofeno > cido 2-fenil-propinico
Esta tendencia es diferente para el Novozyme (Arroyo y Sinisterra, 1994) igualmente

despus de 72 horas de operacin:
Ketoprofeno > ibuprofeno > cido 2-fenil-propinico > flurbiprofeno > naproxeno
Independientemente de los rendimientos y del origen del preparado enzimtico la

enantioselectividad expresada como relacin o "enantiomeric ratio" es baja en todos los casos,
puesto que no supera el valor de 4.
A destacar que si bien la resolucin es mayoritariamente del S-enantimero, en el caso

del ketoprofeno el enantimero mayoritario que se resuelve es el R-enantimero.
Relacin cido-alcohol empleada.
Generalmente se trabaja con exceso del compuesto no quiral, que en la reaccin a

estudio sera el alcohol con objeto de asegurar la completa conversin del reactivo
enantiomrico. En la bibliografa se recogen relaciones desde 1:1 hasta un mximo de 1:4.
Introduccin 73
Concentracin de la enzima
Existe un ptimo de concentracin del preparado enzimtico a utilizar. Este ptimo

corresponde a la mxima productividad expresada como (moles de producto/substrato
(producido-consumido) por mg del biocatalizador y hora. En la prctica se observa que a
partir de una determinada concentracin de la enzima la conversin final o la evolucin de la
curva del ster producido frente al tiempo es constante.
Algunos autores comentan que cuanto mayor sea la concentracin de la enzima se

puede observar una disminucin en la enantioselectividad. De todas maneras este es un efecto
presente cuando se comparan diferentes cantidades de enzima utilizadas a un mismo tiempo
de reaccin, bsicamente porque para altas concentraciones de enzima la conversin supera el
50% y por consiguiente se est sintetizando el ster del R-enantimero una vez que
prcticamente se ha consumido todo el S-enantimero. Este descenso de enantioselectividad
no sera tal y se podra evitar simplemente parando la reaccin antes.
Aunque es difcil comparar entre las diferentes enzimas, en la tabla 1.15 se presentan
las cantidades utilizadas por diversos autores.
Fuente Preparado enzimtico Volumen de Cantidad utilizada

Bibliogrfica reaccin (mi) (mg)
Mustranta (1992) C. rugosa (Biocatalyst) 40 100-500
Arroyo y Sinisterra Candida antrctica 10 100-500
(1994) Novozyme 43 5 (Novo)
KimyLee(1996) C. rugosa (Sigma) 10 300-500
Goto et al. (1996) C. rugosa (Amano) - 0.2 g/1
M. Javanicus (Amano)
Lpez-Belmonte et Rhizomucor miehei 10 300-700
al. (1997) Lipozyme IM20 (Novo)
T sai et al. (1997) C. rugosa (Meito Sangyo) 25 250
Tabla 1.15: Cantidades utilizadas de diferentes preparados de lipasas comerciales.

74 Introduccin
De la tabla 1.15 se desprende que la concentracin de enzima utilizada est

comprendida entre 2.5 g/1 y 70 g/1 si exceptuamos la ltima referencia. Siendo un valor
bastante comn 30 g/1.
Concentracin de los substratos
Es otro de los puntos a optimizar dependiendo de la enzima utilizada y de la reaccin

en que se aplique. Se han observado efectos inhibitorios a medida que se aumentan las
concentraciones tanto del cido como del alcohol. Hay que tener en cuenta que un exceso de
cido puede disminuir el pH microambiental alrededor del centro activo de la enzima,
mientras que un exceso de alcohol puede desnaturalizar la enzima.
Las mximas concentraciones de cido referenciadas en la bibliografa han sido de

125mM utilizando idntica concentracin de alcohol. (Lpez-Belmonte et al., 1997). No
obstante generalmente las concentraciones de cido suelen ser menores, del orden de 50 mM,
y en algunos casos extremadamente bajas 3mM (Tsai et al., 1997). La importancia de trabajar
a las mayores concentraciones posibles es clara desde el punto de vista de aplicacin
industrial del proceso.
Factores fsicos externos
La temperatura es uno de los factores externos ms estudiados debido a su influencia

en la actividad enzimtica. Generalmente un aumento de la temperatura supone un aumento
de la velocidad de reaccin, siempre que no se produzca la desactivacin trmica de la
enzima. Sin embargo este efecto es contrario si se sigue el criterio de favorecer la
enantioselectividad. Esta se encuentra favorecida a temperaturas bajas. A altas temperaturas
se puede producir la "deformacin" del centro activo, lo que se traduce en una flexibilidad del
reconocimiento del substrato. Mientras que a bajas temperaturas el centro activo se
encontrara ms rgido. Por consiguiente ser un parmetro a optimizar.
No obstante, hay otros factores externos que pueden determinar la temperatura a

emplear como el punto de ebullicin del disolvente o de los substratos/productos que
Introduccin 75
determinar el ptimo de temperatura. Generalmente la temperatura utilizada se sita

alrededor de los 40C.
La agitacin es un factor menos estudiado y que aparentemente entre 300 y 700 rpm
(con agitacin magntica) no parece afectar significativamente a las prestaciones de la
reaccin enzimtica.
Tipo de disolvente
El estudio de la naturaleza del disolvente ha sido fuente de muchos trabajos y se ha

demostrado la gran influencia que tiene sobre la actividad y estabilidad de la enzima
(Kvittingen, 1994; Carrea et al., 1995; Ducret ei al., 1998). Es un hecho que la actividad
cataltica de las lipasas microbianas en medios orgnicos es mayor en disolventes no polares
que en disolventes de naturaleza ms hidroflica, incluso miscibles en agua.
El parmetro que se utiliza para cuantificar la relacin entre la hidrofobicidad y la

hidrofilicidad es el log P, que corresponde al coeficiente de particin del disolvente entre el
sistema de dos fases 1-octanol/agua. En la tabla 1.16 se recogen los valores de log P para
diversos disolventes.
Disolvente Log P
Acetona -0.25
Dietileter 0.85
Cloroformo 2.00
Tolueno 2.50
Pentano 3.00
Ciclohexano 3.20
n-Hexano 3.50
Heptano 4.00
Isooctano 4.50
Decano 5.60
Tabla 1.16.: Valores de log P para distintos disolventes (Laane et al., 1987).
76 Introduccin
El valor de log P por debajo del cual no se observa actividad enzimtica depender del
tipo de lipasa microbiana. Por ejemplo, para Lipozyme BVI20 de Novo Nordisk (lipasa de
Rhizomucor miehe) slo aparece actividad por encima de valores de 2, mientras que para
Candida rugosa el valor mnimo es del orden de 3. Estas variaciones se justifican por el hecho
de que para disolventes por debajo del valor de 2 del log P, los disolventes son capaces de
separar el agua esencial de las enzimas, que juega un papel primordial en el mantenimiento de
la conformacin nativa de la enzima (Reslow e a/., 1992).
Las diferencias observadas para preparados diferentes no slo se deben a diferente

origen microbiano, sino que tambin tienen una fuerte dependencia de si se trata de enzimas
inmovilizados o libres. En el primer caso, el soporte es un factor muy importante ya que
muchas veces acta de reservorio de agua, impidiendo la prdida de la capa de hidratacin. En
el segundo caso, cuando los enzimas son libres, tambin hay que tener en cuenta los
estabilizantes, conservantes y otros compuestos que acompaan a la mayora de enzimas
comerciales cuya naturaleza es habitualmente hidroflica y que, por tanto, pueden ayudar a
preservar el agua que tiene la enzima.
La relacin entre log P y la conversin parece clara, cuanto mayor es log P mayor es la
conversin. No obstante, esta correlacin es mucho ms difusa al compararse con la
enantioselectividad, en cuyo caso no existe una relacin clara. Estudios recientes (Ducret et
al., 1998) con lipasa B de Candida antrctica atribuyen diferencias de enantioselectividad y
conversin a la conjuncin de dos factores como son el log P y la actividad de agua del
medio, adems de sugerir el uso de otras caractersticas del disolvente, como la constante
dielctrica, el ndice normalizado de acotacin de electrones o la solubilidad de Hildebrand
como parmetros de comparacin.
Los disolventes ms utilizados son isooctano y n-hexano, este ltimo pese a tener un
log P menor y menores prestaciones (Vzquez-Lima et a/., 1995) es muy utilizado debido a su
amplio uso en procesos industriales (Mustranta, 1992).
Introduccin 77
Influencia del agua
El efecto del agua en reacciones en medio orgnico ha sido objeto de estudio en

multitud de reacciones y en todo tipo de procesos (Vzquez-Lima et al., 1995; Furutani et al,
1997; De Castro y Gago, 1998), dando lugar a un conjunto de sistemas cuya funcin es la de
controlar este factor.
Wehtje etal. (1997) recogen diversos sistemas de eliminacin y control de la actividad

de agua para sistemas en discontinuo y continuo con diferentes configuraciones, por ejemplo,
para un reactor de lecho fijo proponen acoplar un sistema compuesto de un primer reactor sin
control de actividad de agua donde se alcanza una parte de la conversin, seguido de una
trampa para eliminar el agua que forma una fase diferente del medio y tras esto un segundo
reactor de silicona permeable sumergido en una disolucin con actividad de agua constante
donde se alcanza una conversin final del orden del 95 % (Fig. 1.13).
Fig. 1.13: Sistema de control de actividad de agua diseado por Wehtje et al. (1997).
Otros autores disean diversos sistemas de control o eliminacin de agua, como son
evaporacin o pervaporacin (Van der Padt et al., 1993; Kwon et al., 1995) mediante el
acoplamiento de condensadores, la adicin de tamiz molecular (Vzquez-Lima et al., 1995;
Han y Rhee, 1998) o ajustando el medio de reaccin a una actividad de agua fijada por el
contacto con una sal de hidratacin conocida (Svensson et al., 1994; Dudal y Lortie, 1995).
78 Introduccin
En el caso de la esterifcacin de los cidos 2-aril propinicos, el contenido de agua

del medio ha sido objeto de discusin por lo que se refiere a su efecto en la conversin y en la
enantioselectividad. As, para la esterifcacin del ibuprofeno, Mustranta (1992) seala que
usando enzima libre, la presencia de agua disminuye la conversin por la reversibilidad de la
reaccin, asimismo, con lipasa de Candida rugosa, la enantioselectividad era menor cuanto
mayor era el contenido en agua, explicando esto en trminos de rigidez de la enzima. Por otro
lado, Kim y Lee (1996), utilizando tambin lipasa de Candida rugosa para la resolucin del
ibuprofeno encuentran que aadiendo silica gel y diferentes porcentajes de agua a distintos
disolventes, incrementan la enantioselectividad hasta 16 veces.
Lpez-Belmonte et al. (1997) han descrito recientemente con lipasa de Rhizomucor

miehei (Lipozyme IM 20) para la esterifcacin de ibuprofeno en ciclohexano que realizando
un diseo de experimentos factorial el factor ms influyente en el rendimiento de la reaccin
era el contenido en agua del medio, viniendo este contenido regulado por la capacidad del
soporte de inmovilizacin de captar parte del agua formada.
Por otro lado, Ducret et al, (1998) hacen un estudio riguroso de la esterifcacin del
ibuprofeno con lipasa de Candida antrctica tipo B (Novozym 435) con distintas actividades
de agua y su influencia en la enantioselectividad obtenida. En este trabajo se constata como
cada enantimero presenta un comportamiento distinto a variaciones en el contenido de agua,
resultando as una dependencia entre la enantioselectividad y el contenido en agua. As, con
disolvente hidrofbicos con actividad de agua controlada se obtiene una mayor conversin,
pero los mejores resultados en trminos de enantioselectividad se obtiene con disolventes ms
hidroflicos.
Por ltimo, sealar que recientemente el empleo de las isotermas de adsorcin de agua
tanto de enzimas libres como inmovilizados se ha demostrado como una herramienta til para
predecir las necesidades de agua y el comportamiento de los preparados enzimticos en medio
orgnico (De la Casa et al., 1996).
Introduccin 79
Tiempo de reaccin
Este es un factor muy variable y que depender en gran medida de la carga enzimtica
utilizada, y de otros factores clave como lipasa utilizada, contenido de agua, disolvente,
temperatura, etc. pero recopilando los trabajos sobre el tema se puede generalizar a que un
tiempo mnimo de reaccin estar entre las 24 y las 48 h, mientras que la mayora de casos se
sita entre las 100 y 200 horas, pudiendo llegar hasta 500 horas de reaccin.
Modificacin de la enzima
Algunos autores proponen algn tipo de modificacin de la enzima para la mejora de

la actividad enzimtica. As, para la esterifcacin del ibuprofeno Goto et al. (1996)
desarrollan un biocatalizador a partir de la interaccin entre la enzima y un surfactante,
obteniendo aumentos importantes en la conversin para las lipasas de Mucor javanicus y
Candida rugosa pero sin describir una importante mejora en la enantioselectividad. Otros
autores tambin describen la adicin de surfactantes para mejorar la productividad y
selectividad en la resolucin del naproxeno (Tsai et a/., 1996a).
Otra posibilidad descrita en la bibliografa es el empleo de los denominados CLEC

("cross-linked enzyme crystal"). En concreto, Lalonde et al. (1995) describe el uso de este
tipo de cristales de lipasa de Candida rugosa en la resolucin de cidos 2-aril propinicos,
obteniendo mejoras en la estabilidad de la enzima y en la enantioselectividad de la reaccin.
En este captulo tambin se puede incluir las modificaciones originadas al utilizar las
lipasas inmovilizadas covalentemente. En este tipo de inmovilizacin se produce siempre una
modificacin qumica en alguno o algunos aminocidos de la protena, lo que puede provocar
cambios en la actividad y enantioselectividad de la enzima (Snchez et al., 1996; Moreno et
al, 1997).
Otro tipo de modificaciones son las originadas por el hecho de tratar la enzima con
disolventes polares de cadena corta. As, Chamorro et al. (1998) describen como el
tratamiento del crudo de lipasa de Candida rugosa proporcionado por Sigma con disolventes
80 Introduccin
orgnicos polares de cadena corta (metanol, etanol, 1 y 2-propanol, 1 y 2-butanol y acetona)

origina mejoras en la actividad tanto en reacciones de hidrlisis como en reacciones de
esterifcacin y transesterifcacin en las que participa el ketoprofeno. Los autores sugieren
que este tratamiento modifica la enzima por apertura de la tapa descrita por Grochulski et al.
(1994).
1.7.6. Resolucin de ram-2-fenil-cicloliexanol con lipasas
El inters de este producto es debido a que se trata de un auxiliar quiral utilizado en

procesos de induccin asimtrica que se puede obtener de forma enantiomricamente pura por
va enzimtica y que permite la substitucin de otros productos como 8-fenil-mentol (Novak y
Zemis, 1985).
En la bibliografa existen pocas referencias en las que se haga referencia a la

resolucin de este compuesto mediante lipasas. En concreto Basavaiah y Rao (1994) usando
esterasa de hgado de pollo en reaccin de hidrlisis obtuvieron purezas enantiomricas
superiores al 99 % para conversiones entre el 20 y el 30 % pero con tiempos de reaccin del
orden de 10-12 das.
Ms recientemente, Carpenter et al. (1996) describen la resolucin del trans-2-fQnil-

ciclohexanol utilizando Lipasa Amano PS30 (Pseudomonas cepacia) y obteniendo resultados
superiores al 99 % de exceso enantiomrico.
Introduccin 81
1.8. Valoracin econmica de procesos
1.8.1. Estimacin de las partidas necesarias
Una metodologa descrita para la evaluacin de procesos qumicos se detalla en los

trabajos de Vin (1991) y Peters y Timmerhaus (1980). Esta metodologa consta de los
siguientes passos:
1. Estimacin de las ventas: conociendo el precio del producto en el mercado o bien

estimando su valor a partir de la rentabilidad que se quiera obtener con el proceso y
conociendo los costes totales. Otra opcin es a partir de coeficientes de giro que
relacionan las ventas con el valor del inmovilizado (Vin, 1991).
2. Estimacin de la partida de inmovilizado: incluye los equipos necesarios para la

construccin de la planta y aunque existen diferentes mtodos aproximados como
coeficientes de giro o la regla de Williams (Vin, 1991) la mejor evaluacin es determinar
el precio de mercado de los equipos que se vayan a utilizar en el proceso. En el trabajo de
Happel y Jordn (1981) se presentan abundantes tcnicas y datos para estimar el valor de
esta partida.
3. Estimacin del capital circulante: referido el capital que entra en el ciclo de produccin
pero que es retornado incluye valor de materias primas en existencia, de productos an no
cobrados, en almacn o en ciclo de produccin as como repuestos y existencias en caja,
bancos o valores. Suele estimarse como un porcentaje del inmovilizado (Vin, 1991).
4. Estimacin de costes: los costes se dividen en dos tipos que a su vez se dividen en varios
subtipos:
a) Costes de fabricacin: que se dividen en:
Costes directos: asociados directamente a la fabricacin del producto:
- Materia prima
- Mano de obra directa
82 Introduccin
- Patentes
Costes indirectos: no asociados al producto:
- Mano de obra indirecta
- Servicios generales
- Suministros
- Conservacin
- Servicios generales
- Mantenimiento
- Laboratorio
- Envasado
- Expedicin
- Directivos y tcnicos
- Amortizacin
- Alquileres
- Impuestos
- Seguros
b) Costes generales:
- Gastos comerciales
- Gerencia
- Gastos financieros
- Investigacin y servicios tcnicos
La mayora de los costes se determinan en base al valor de la partida de inmovilizado,

asignndoles un porcentaje de esta partida. Distintos criterios de evaluacin de los costes se
presentan en los trabajos de Vin (1991) y Peters y Timmerhaus (1980).
El valor de la partida de amortizacin suele determinarse aparte y corresponde a

repartir a lo largo de los diferentes ejercicios el coste total de la partida de inmovilizado.
Existen distintos criterios de amortizacin, constante, regresiva, suma de dgitos, saldo
decreciente que se aplicarn en funcin de las necesidades del proceso (Vin, 1991).
Introduccin 83
1 .8.2. Clculo de Net Cash Flow CNCF) y Rent Discounted Cash Flow (RDCF)
Una vez conocidas las distintas partidas necesarias para la evaluacin del proceso, la
rentabilidad de un proceso se suele evaluar por el valor del KDCF ("Rent Discounted Cash
Flow") que es el valor del inters para el cual el valor actual neto (VAN) de todos los ingresos
y desembolsos es nulo para la inversin propuesta. En funcin de este valor se decidir si la
inversin es lo suficientemente atractiva.
Un anlisis detallado del clculo y significado del RDCF se presenta en el trabajo de

Richart (1977). En general, el RDCF ser el valor de i que hace que la ecuacin (11) se
cumpla:
ai)
donde i es el valor del RDCF que queremos calcular, t es el valor en aos que dura el proceso
(su vida esperada) y NCF ("Net Cash Flow") el movimiento neto de caja para cada ao que se
puede calcular de forma simple como:
NCF = Beneficios netos - Capital Inmovilizado ^ Capital Circulante (**}

* Suele aplicarse el ao O
** De signo negativo en el ao 1 y de signo positivo en el ao t
Beneficios netos = Base imponible-(100-% de Impuestos^)/100

* Se empiezan a pagar en el ao 2
Base imponible = Ventas - Costes - Amortizacin
para cada ao j se calcula el valor del NCF que despus se actualiza con el factor l/(l+iy para
cada ao. La suma de NCF actualizados es lo que se conoce como VAN y el valor de i para el
que el VAN es cero se conoce como RDCF.
84 Introduccin
84 Introduccin
Objetivos 85
2. OBJETIVOS
El objetivo principal del trabajo es la utilizacin de las lipasas producidas por Candida rugosa
mediante fermentacin a escala piloto en la resolucin de compuesto quirales con
aplicabilidad en la industria farmacutica.
Este objetivo general consta de los siguientes objetivos parciales:
1. Desarrollo de la mejor secuencia de separacin para la obtencin de la enzima en estado

slido a partir del medio de fermentacin con la menor prdida de actividad posible.
2. Estudio econmico de la viabilidad del proceso de produccin de lipasas de Candida

rugosa mediante fermentacin.
3. Caracterizacin y purificacin de las diferentes protenas que contiene el preparado

slido obtenido y comparacin con las descritas para lipasas de Candida rugosa
comerciales.
4. Utilizacin de la lipasa UAB libre en reacciones de sntesis en medio orgnico y

comparacin de la actividad cataltica de la lipasa UAB en estos medios con lipasas de
Candida rugosa comerciales.
5. Diseo de una biocatalizador con lipasas UAB inmovilizadas en algn soporte que
permita su uso en medio orgnico y su recuperacin del medio. Comparacin con lipasas
comerciales inmovilizadas.
6. Puesta a punto de los mtodos analticos y de clculo necesarios para el seguimiento de

las reacciones de sntesis de naturaleza quiral, as como de la optimizacin de las
condiciones de reaccin.
86 Objetivos
1. Utilizacin de la lipasa UAB inmovilizada en la resolucin de compuestos quirales de

inters farmacutico. Resolucin de derivados 2-aril propinicos y del /ra/w-2-fenil-
ciclohexanol mediante esterificacin en medio orgnico. Determinacin de las
condiciones ptimas de reaccin.
8. Diseo de un sistema en continuo para la produccin de compuestos enantiomricamente

puros mediante lipasas UAB y comerciales. Estudio de la estabilidad del reactor,
descripcin de un modelo de flujo y reutilizacin de la enzima.
Materiales y Mtodos 87
3.1. METODOLOGA EXPERIMENTAL
3.1.1. Fermentacin
3.1.1.1. Montaje experimental de la fermentacin
Para el crecimiento de la levadura y correspondiente produccin de lipasas se

emplearon los siguientes fermentadores:
- Un fermentador Braun Biolab de 1.5 litros de capacidad mxima, con 0.5 litros de
volumen de trabajo.
- Un fermentador Braun Biostat E de 6.4 litros de capacidad mxima, con 5 litros de
volumen de trabajo.
Un fermentador Braun Biostat UD con cuba de acero inoxidable de 70 litros de volumen
mximo y un volumen de trabajo de 55 litros.
El fermentador posee diversos mdulos de control de variables de proceso que permiten

fijar diferentes puntos de consigna. Las variables sobre las que se tiene posibilidad de realizar
una accin de control son:
Temperatura: 30C.
- Porcentaje de oxgeno disuelto: 30-40 % de saturacin.
- pH: 6.3.
Control de la velocidad de agitacin: 500 rpm para todos los casos excepto en el Braun
Biostat UD donde se trabaj a 400 rpm.
Asimismo, la adicin de la fuente de carbono (cido oleico) se realiza mediante una

microbureta Crison microBUR 2031. Permite el empleo de jeringas de diferentes volmenes
utilizndose una jeringa Hamilton modelo 1001 TLL de 1 mi de capacidad total. Para el
fermentador Biostat UD se emplea una jeringa de 2.5 mi de capacidad total. Dispone de una
entrada RS232 lo que permite la comunicacin con el ordenador principal que gestionar los
volmenes adicionados y la frecuencia de adicin.
88 Materiales y Mtodos
Como otra instrumentacin utilizada cabe sealar:

- Cmara de flujo laminar Telstar BH-10.
- Autoclave Hirayima manufacturing corporation HA-30.
- Autoclave P-S electa.
- Microscopio Olympus BH-2.
- Microscopio Zeiss Axioskop.
- Estufa de inoculacin de placas Memmert: Edelstarht Rost Frei.
3.1.1.2. Medio v reactivos de la fermentacin
Reactivos de fermentacin:
- Agua desionizada
- Extracto de malta Adsa-Micro
- Extracto de levadura Pronadisa
- Triptona Adsa-Micro
- Agar bacteriolgico Adsa-Micro
- KH2PO4 Panreac para anlisis
- K2HP04 Panreac para anlisis
- Na2HP04.12H20 Panreac para anlisis
- (NH4)2SO4 Panreac para anlisis
- MgS04-7H2O Panreac pursimo
- NH4OH30% Panreac para anlisis
- FeCl3-6H2O Panreac pursimo
- Inositol Fluka para microbiologa
- Biotina Fluka para microbiologa
- Tiamina-HCl Fluka para microbiologa
- Antiespumante Braun Biotech
cido oleico Sigma pursimo
El medio de cultivo est formado por una solucin bsica de composicin por litro: KH2PO4, 15
g; K2HPO4, 5.5 g; (NH4)2SO4, 4 g; MgS04.7H20, 1 g; biotina, 0.008 mg; tiamina.HCl, 0.2 mg;
inositol, 0.004 mg y FeCl3, 10 mg.
3.1.1.3. Mantenimiento de la levadura v sistema de inculos
En este trabajo se ha utilizado la levadura Candida rugosa ATCC 14830. La levadura

era mantenida a -20C en anillos porosos en glicerol, mediante el kit Microbank de Pro-Lab
Diagnostics. La cepa es traspasada a una placa de petri conteniendo agar con extracto de malta
donde es incubada durante 48 h a 30C. Esta siembra de placas se realiza por triplicado. A partir
de una de las placas se inocula una botella de 250 mi con 50 mi de volumen til conteniendo 2
g/1 de cido oleico y el medio especificado. Las botellas se realizan por duplicado y su tiempo
de inoculacin se fija en 24 h. A partir de una de las botellas se inocula el fermentador Braun
Biolab de 0.5 1 de volumen conteniendo 4 g/1 de cido oleico y el medio especificado. En esta
fermentacin, cuya duracin es de 24 h, no se tiene control del pH ni del oxgeno disuelto. Los
0.5 1 de este fermentador sirven de inoculo para el Braun Biostat E, donde se repite la operacin
en discontinuo llevada a cabo en el fermentador Braun Biolab pero con 5 1 de volumen, que
servirn de inoculo para el fermentador piloto Braun Biostat UD.
En este fermentador, un proceso en discontinuo de 2 g/1 de cido oleico precede a la

operacin en fed-batch a caudal de adicin constante de 0.2 g/(h-l fermentador). Este caudal se
aade mediante una microbureta programada. La duracin del proceso en discontinuo es del
orden de 10 h, mientras que la del fed-batch es del orden de 30 h. En las dos ltimas etapas de la
fermentacin, se sigue un control riguroso de los parmetros fsicos de sistema, como
temperatura, pH, oxgeno disuelto y agitacin, as como de los parmetros biolgicos, de los
que se siguen biomasa, actividad lipoltica y observaciones al microscopio.
Una descripcin detallada del sistema experimental de fermentacin y de la

instrumentacin desarrollada se encuentra en los trabajos de Gordillo (1996) y Sanz (1998).
3.1.2. Separacin
Para la separacin de la lipasa del medio de cultivo se utiliz la siguiente instrumentacin:
1) Centrifugacin: centrfuga en continuo Westfalia Separator AG (CSA 1-06-475)

trabajando a SOOOg y 20 1/h. Para volmenes menores de 5 litros se utilizaron las
siguientes centrfugas:
- Centrfuga Kontron Analytical Centrikon/H-401.
- Centrfuga Heraeus Sepatech Megafuge 1.0.
- Centrfuga Beckman J2-21M/E.
2) Microfltracin 0.45 |am: Minitan Millipore con 4 membranas PVDF 0.45 um de corte.
Para volmenes menores a 5 1 se puede utilizar un sistema tradicional de filtracin al vaco
mediante filtros de fibra de vidrio (Whatman GF/F) de 0.45 un de tamao de poro.
3) Ultrafltracin 10 kDa: Centrasette Pali Filtren con 1 membrana OMEGA 10K de corte.
Otros sistemas alternativos para volmenes menores son los siguientes:
- Sistema Minitan Millipore equipado con 4 membranas PMNL de 10 kDa de corte para
volmenes no superiores a 5 1.
- Sistema Prep/Scale TTF Millipore con un PTGC 10 K 2.5 ft2 Cartridge hasta 15 1.
4) Precipitacin de la protena:
- Precipitacin con etanol: la muestra se trata con 2 volmenes de etanol a 0C. La solucin se
mantiene constantemente agitada a 0C durante la adicin y se deja agitando durante 1 h. La
protena precipitada se separa por centrifugacin a SOOOg y el pellet se seca a temperatura
ambiente.
- Precipitacin con sulfato amnico: se aaden a la muestra diversas cantidades de sulfato
(Harris and Angal, 1989). La solucin se mantiene constantemente agitada a 0C durante la
adicin y se deja agitando durante 1 h. La protena precipitada se separa por centrifugacin a
SOOOg y el pellet se seca a temperatura ambiente.
5) Lioflizacin: las muestras se congelan previamente con nitrgeno lquido o una mezcla de
nieve carbnica/acetona y se liofilizan durante 24 h en un liofilizador Virtis Sentry 5L.
3.1.3. Cromatografa en FPLC
El equipo utilizado fue un FPLC System de Pharmacia Biotech equipado con dos
bombas Pharmacia LKB-Pump P-500, un controlador Pharmacia LKB Controller LCC-500
CI, un detector de ultravioleta Pharmacia Monitor UV-M y un colector de fracciones
Pharmacia LKB-Frac-200, todo ello comandado por un ordenador con el software Pharmacia
FPLC Director 1.03.
3.1.3.1. Cromatografa de intercambio inico
En este caso, se utilizaron dos columnas basadas en este principio:
- Millipore DEAE Memsep 1000 (1 mi).

Columna Pharmacia FR 5/5 (1 mi) utilizando relleno Pharmacia Source 15Q.
Para la separacin por cromatografa de intercambio inico se utilizaron dos mtodos

distintos:
1) Mtodo en escaln: se preparaban dos lampones denominados A y B de Tris-HCl 20 mM

a pH=7.40. En el buffer B haba adems, NaCl de concentracin 1 M. Con estos lampones
de segua el patrn descrito en la figura 3.1.
2) Mtodo de gradiente: se preparaban los mismos lampones pero la evolucin de la
concentracin de NaCl era en forma de gradiente. Este sistema tambin se muestra en la
figura 3.1
La concentracin ptima de muestra inicial para este tipo de cromatografa es de 1-10 mg

polvo lioflizado/ml de buffer A, centrifugados a lOOOOg previamente a la inyeccin. Un
volumen de inyeccin correcto se sita entre los 100 y 500 ul.
La descripcin de ambos mtodos tal y como se program con el software empleado se recoge
en el captulo 8.13.
1.0 -
Mtodo en escaln
0.9 -
Mtodo en gradiente
0.8 -
0.7 -
0.6 -
o - 5 -
0.4 -
0.3 -
0.2 -
0.1 -
0.0
O 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)
Fig. 3.1.: Distintos mtodos para la cromatografa de intercambio inico.
3.1.3.2. Cromatografa de gel filtracin
En este caso, se utilizaron dos columnas:
- Columna Pharmacia HR 10/30 (24 mi) con relleno Pharmacia Superdex 75 (separacin
entre 3 y 70 kDa).
- Columna Pharmacia HiLoad 26/60 (325 mi) con relleno Pharmacia Superdex 200
(separacin entre 10 y 600 kDa).
La cromatografa se realizaba simplemente con un caudal fijo de un tampon Tris-HCl 20 mM

a pH=7.40. La concentracin ptima de muestra para este tipo de cromatografa es de 1-10
mg polvo lioflizado/ml de buffer A, centrifugados a lOOOOg previamente a la inyeccin. Un
volumen de inyeccin correcto se sita entre los 0.5 y 5 mi.
La descripcin del mtodo empleado tal y como se program con el software empleado se
halla en el captulo 8.13.
3.1.3.3. Cromatografa de interaccin hidrofbica
El relleno utilizado en este caso fue de Phenyl Sepharose High Performance de

Pharmacia Biotech, introducido en dos columnas Pharmacia HR 5/5 (1 ml) y HR 10/30 (24
mi) dependiendo del volumen de muestra deseado.
En este caso, se requera la preparacin de dos tampones A y B de Tris-HCl 20 mM a
pH=7.40, con el tampn A conteniendo tambin sulfato amnico en una concentracin de 1.7
M. En este caso, tras 10 minutos de inyeccin de muestra en el tampn A, se somete a la
columna a un gradiente de fuerza inico decreciente pasando de un 100 % a un O % de
tampn A, que se substituye paulatinamente por el tampn B.
La concentracin ptima de muestra para este tipo de cromatografa es de 1-10 mg
polvo liofilizado/ml de buffer A, dejados agitar durante 30 minutos y centrifugados a lOOOOg
previamente a la inyeccin. Un volumen de inyeccin correcto se sita entre los 100 a 500 \
para la columna HR 5/5 y 1-5 mi para la columna HR 10/30.
La descripcin del mtodo tal y como se program con el software empleado se halla
en el captulo 8.13.
3.1.4. Electroforesis
SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) se llev a

cabo en condiciones desnaturalizantes de acuerdo con los protocolos descritos por Laemmli
(1970), en geles al 12 y 15 % de poliacrilamida. Las electroforesis se realizaron en un Mini
Protean II cell de Biorad.
Las protenas fueron visualizadas con tincin de Coomassie Brilliant Blue o Nitrato de
Plata dependiendo de la concentracin de protena y de acuerdo con los protocolos estndar.
Los polisacridos (y glicoprotenas) fueron teidos con reactivo de Schiff de acuerdo con el
protocolo descrito por Jay et al. (1990).
3.1.5. Reacciones no quirales
3.1.5.1. Reacciones de hidrlisis
Las reacciones de hidrlisis en medio acuoso tuvieron lugar en el fermentador Braun

Biolab con 0.5 1 de volumen de trabajo, controlando la agitacin, que se mantuvo a 500 r.p.m.
y la temperatura, que se mantuvo a 40 C.
El reactor estaba cerrado al ambiente pero con una entrada superior que se abra para
obtener las muestras que una vez filtradas eran introducidas en un bao de agua hirviendo
durante 3 minutos con el fin de desactivar la enzima. Un blanco realizado en las condiciones
de trabajo no supuso la aparicin de hidrlisis apreciable.
3.1.5.2. Reacciones de sntesis
Las reacciones de sntesis en medio orgnico tuvieron lugar en pequeos reactores de

25 mi con 10 mi de volumen de trabajo cerrados hermticamente. La temperatura se mantuvo
a 40 C y las concentraciones de los reactivos fueron de 100 mM si no se especifica lo
contrario. Las muestras eran filtradas por 0.45 jam antes de ser analizadas. Las reacciones se
llevaron a cabo en un incubador orbital con una agitacin de 250 rpm.
3.1.6. Inmovilizacin
3.1.6.1. Inmovilizacin sobre Celita y Poliamida
Se disuelve la cantidad necesaria de preparado liofilizado para obtener 15000 U de

actividad lipoltica en 1 mi tampn Tris-HCl 20 mM a pH=7.40. Sobre este volumen se
aaden 1 g de celita 545 (Fluka) y poliamida 11 (Merck) respectivamente, homogeneizando
continuamente la mezcla slido-lquido. En este mezcla, una proporcin ptima es la de 1 g
de soporte/mi de enzima disuelto. Una vez aadida la cantidad total de soporte se liofiliz
hasta peso constante. La enzima inmovilizada se guarda a -20C.
3.1.6.2. Inmovilizacin sobre Duolite
Se disuelve la cantidad deseada de enzima a inmovilizar (para obtener 100- 1000 U/g
de soporte) en tampn Tris-HCl 20 mM a pH=7.40.
El soporte, Duolite A 568, es humedecido con etanol absoluto a razn de 6 ml/g de
soporte, y despus se lava una vez con 50 mi de tampn fosfato 0.1 M a pH=7.00 durante 30
minutos y dos veces con el mismo tampn pero 0.01 M durante 30 minutos. Eliminando el
lquido del ltimo lavado ya se puede aadir la disolucin de la enzima. Se deja agitando la
mezcla suavemente (en un roller Movil-Rod de P-selecta) durante 1 h.
Tras este perodo se filtra la mezcla y se lava el filtro 2 veces con agua destilada. El
soporte se deja secar a temperatura ambiente. La enzima inmovilizada se guarda a -20C.
3.1.6.3. Inmovilizacin sobre EP100
Se disuelve la cantidad deseada de enzima a inmovilizar (para obtener 100000 U/g de

soporte) en tampn fosfato 20 mM a pH=7.00.
El soporte es humedecido con etanol absoluto a razn de 3 ml/g de soporte,
Eliminando el etanol ya se puede aadir la disolucin de la enzima. Se deja agitando la
mezcla suavemente (en un roller Movil-Rod de P-selecta) durante toda la noche.
Tras este periodo se filtra la mezcla y se lava el filtro 2 veces con agua destilada. El
soporte se deja secar a temperatura ambiente o mediante un desecador. La enzima
inmovilizada se guarda a -20C.
3.1.7. Reacciones quirales
Dada una reaccin de sntesis quiral donde una mezcla racmica compuesta por los
enantimeros R,S reacciona con una agente esterificante para generar dos enantimeros R y S
del ster y agua, se definieron los siguientes conceptos a la hora de seguir una reaccin quiral:
Conversin total (X):
X = (JclOO)
(^ester + Ur H~ C-
siendo Cester la concentracin total de ster formado y Cr y Cs las concentraciones de los

enantimeros R y S del reactivo respectivamente.
En el caso de reacciones con elevada enantioselectividad se puede asumir que la
conversin respecto al enantimero que reacciona (XA) es aproximadamente: XA = 2X, es
decir, suponer que toda la conversin se refiere a uno de los dos enantimeros. Ambos
valores, X y XA tomarn valores desde O a 100. En el caso de enantioselectividad perfecta y
reaccin completa: X = 50 % y XA= 100 %.
Exceso enantiomrico (EE):
el exceso enantiomrico siempre se refiere a uno de los dos enantimeros, y puede referirse al
producto o al reactivo. En el caso estudiado, se referir al exceso enantiomrico del reactivo.
El exceso enantiomrico tomar valores entre el O y el 100 %.
Pureza (PV.
Cr G
Pr = -(xlOO) 0100)
Cr + C G+G
la pureza, al igual que el exceso enantiomrico, tambin se refiere a uno de los dos
enantimeros. En el caso estudiado, se referir a la pureza del reactivo. La pureza tomar
valores entre el O y el 100 %.
Enantioselectividad (E):
este valor relaciona la conversin total con el exceso enantiomrico para dar un valor entre O
para reaccin no enantioselectiva e infinito para una reaccin perfectamente enantioselectiva.
En trminos generales, se considera una reaccin enantioselectiva a partir de valores de E
superiores a 25.
3.1.8. Diseo de experimentos
Por lo que se refiere a la realizacin del diseo de experimentos, se construy un

programa en lenguaje Fortran utilizando el entorno Microsoft Fortran Powerstation versin
4.0 para la resolucin de las matrices que se originan en la bsqueda de la funcin que
optimiza los parmetros. Este software hace uso de las libreras IMSL incorporadas en el
propio entorno. Un ejemplo de programa utilizado se halla en la seccin 8.14.
Para la optimizacin de la funcin objetivo se construy un programa usando el
mismo software, como tambin se describe en la seccin 8.14.
3.1.9. Montaje de las reacciones en continuo
Como RCFP se eligi una columna de acero inoxidable que en realidad era un
columna de FDPLC (Aminex HPX-87H Biorad) vaca de relleno y de dimensiones 30cm x
7.8mm, con lo que se obtiene un reactor de volumen real de 14.3 mi.
El montaje consista en una entrada de alimento cuyo caudal vena regulado por una
microbureta programada para aadir cantidades fijas y precisas de alimento. La columna
estaba hermticamente cerrada y sumergida en un bao termostatizado donde se regulaba la
temperatura. Las muestras se tomaban a la salida. Detalles del montaje se presentan en las
figuras 4.8.7.a/b.
En el captulo 8.15 se presenta el programa desarrollado para controlar la microbureta
desde el ordenador mediante el lenguaje Borland Turbo C++ versin 3.0.
3.2. MTODOS DE ANLISIS
3.2.1. Fermentacin y purificacin
3.2.1.1. Determinacin de la biomasa por peso seco
Para la determinacin del peso seco se filtra un volumen conocido de muestra al vaco
mediante un filtro de fibra de vidrio (Whatman GF/F) de 0.45 um de tamao de poro
previamente tarado en seco. Seguidamente, se lava con 10 mi de una mezcla de dioxano-
propinico 1:1 (v/v) para arrastrar los restos de cido oleico que pueda contener la muestra y
que interferiran en la medida de la biomasa. A continuacin, se lava la muestra con 25 mi de
agua destilada y se coloca a 100 C hasta llegar a peso constante (aproximadamente 12 h).
3.2.1.2. Test de actividad lipoltica por mtodo turbidimtrico
El mtodo consiste en el seguimiento de la variacin de la turbidez de un medio

tamponado que contiene un triglicrido, triolena, CaCb para formar los jabones del cido
graso a medida que aparece el cido oleico en el medio, y un tensoactivo, desoxicolato sdico,
que permite la formacin de la emulsin. La disminucin de la turbidez se debe a la
desaparicin de la triolena al ser hidrolizado su enlace ster por accin de las lipasas.
El anlisis se realiza regenerando en 5 mi de tampn tris-HCl 200 mM a pH=7.40 la

emulsin proporcionada por Boehringer en su test de determinacin de lipasas (Kit 159697).
A 750 ul de este substrato se aaden 250 ul de muestra, se agitan previamente y se introducen
en una cubeta termostatizada a 42 C, y se realizan lecturas de absorbancia cada 30 segundos
durante 7 minutos a 340 nm (previamente se realiza un blanco con agua destilada). Se emple
un Espectrofotmetro UV-VIS Varan Cary 3.
Mediante el calibrado (ver Apndices 8.1) se convierte el valor de la pendiente (en su

parte lineal) en unidades de actividad lipoltica/ml equivalentes al test de valoracin. Los
resultados obtenidos del valor actividad lipoltica son fiables dentro del rango de 0.2 a 0.45
U/ml. Para muestras fuera de este rango se realizan las diluciones pertinentes.
3.2.1.3. Anlisis colorimtrico de la actividad estersica
Este mtodo se basa en el seguimiento del aumento de absorbancia a 348 nm debido a

la formacin de cido /?-nitrofenilpropinico consecuencia de la hidrlisis que las lipasas
producen sobre el correspondiente ster, el /?-nitrofenilpropionato (PNPP).
Reactivos
1. Disolucin 200 mM de/7-nitrofenilpropionato (PNPP) en acetonitrilo guardada a -20 C.
2. Tampon fosfato 0.05 M a pH=7.0.
3. Acetonitrilo.
Procedimiento
Se prepara una solucin que contenga un 80 % de tampn fosfato 0.05 M a pH=7.0 y un 20 %
de acetonitrilo. Se diluye el PNPP 200 mM 500 veces con la solucin anterior. Se lee a 348
nm y a 25 C en cubetas de ultravioleta a doble haz y siempre comparando con blancos de
hidrlisis. Se emple un Espectrofotmetro UV-VIS Varan Cary 3.
El volumen del ensayo es de 1 mi, 750 \i\ de substrato y 250 ul de muestra, se lee la
absorbancia durante 6 minutos cada 30 segundos. La pendiente obtenida se correlaciona con
la actividad estersica dentro del rango de 0.005 a 0.030 U/ml (ver Apndices 8.2).
3.2.1.4. Anlisis de protena total por el mtodo de Lowrv
El mtodo de Lowry (Lowry et al., 1951) se basa en la reaccin de los aminocidos

aromticos de las protenas con una mezcla de molibdato sdico y tugstato sdico en cido
fosfrico (que constituyen el reactivo de Folin-Ciocalteau). Los aminocidos reducen la
mezcla de metalocidos, produciendo unos compuestos de color azul caracterstico, cuya
intensidad es funcin de la concentracin de aminocidos.
Reactivos
A. Solucin acuosa NaaCCb al 5 %.
B. Solucin acuosa de tartrato sdico potsico al 1 % en la que se disuelve CuS04.5H2O al
0.5 %.
100 _ Materiales y Mtodos
C. Reactivo de Folin-Ciocalteau 1 N en
D. Solucin estndar de albmina de suero bovino 400 |ig/ml.
E. Solucin de NaOH 1 N.
Procedimiento
1 . Se aaden 2 ml de B en 48 ml de A inmediatamente antes de la realizacin del anlisis.
2. Se prepara una curva de calibrado (ver Apndices 8.3) a partir de la solucin D con las
siguientes concentraciones de albmina: O, 20, 40, 80, 120, 160, 240 ug/ml.
3. A un volumen final de muestra de 0.5 mi se aaden 0.5 mi de E.
4. Aadir 2.5 mi de la mezcla de reactivos preparada en 1, agitar y esperar 10 minutos.
5. Aadir rpidamente 0.5 mi de reactivo C y esperar 30 min (mximo 60 min).
6. Leer la absorbancia a 750 nm.
3.2.1.5. Anlisis de protena total por el mtodo de Bradford
Este mtodo se basa en el cambio de color del reactivo Azul de Coomassie debido a la
atraccin electrosttica de sus grupos sulfnicos con al protena (Pierce, 1989). Se ha
observado que el reactivo Azul de Coomassie muestra gran afinidad por residuos de arginina,
y tambin se une de forma dbil con histidina, tirosina y triptfano.
Este mtodo es especialmente til puesto que presenta un menor nmero de
interferencias que el mtodo de Lowry, siendo recomendable en el caso de medios en los
cuales la concentracin de sales sea elevada.
Existen dos tipos de procedimientos dependiendo del intervalo de concentraciones de
protena a determinar.
Procedimiento estndar de ensayo: para concentraciones entre 100 y 1500 ug/ml.

1. Agitar previamente el reactivo.
2. Se preparan una serie de concentraciones conocidas de protena diluyendo una solucin
estndar de albmina entre 75 y 1500 ug/ml.
3. Mezclar 0.1 mi de muestra o de patrn con 5 mi de Azul de Coomassie en un tubo 16x100
mm. Usar el disolvente como blanco. Agitar bien.
4. Leer la absorbancia a 595 nm en un tiempo no superior a 90 minutos.
5. Restar la absorbancia del blanco.
Procedimiento de microensayo: para concentraciones entre 1 y 25 ng/ml. Se sigue el mismo

procedimiento que en le caso estndar pero los patrones se preparan entre 1 y 25 ug/ml (ver
Apndices 8.4) y se mezclan 1 mi del reactivo Azul de Coomassie con 1 mi de muestra.
3.2.1.6. Determinacin de los polisacridos totales por el mtodo de la Antrona
Los polisacridos se separan de la muestra (300 jal) por ultrafiltracin mediante un

filtro Ultrafree-MC de 10 kDa de corte molecular de Millipore. La muestra se centrifuga
(SOOOg) hasta sequedad. Los polisacridos que quedan en la superficie del filtro se resuspenden
con 300 fil de agua destilada y se centrifuga de nuevo. Este paso se repite 3 veces para separar
azcares de bajo peso molecular. En la resuspensin final de los polisacridos que quedan en 300
ul se realiza un anlisis de azcares totales por el mtodo de la Antrona (Gerhardt e al., 1981).
Este mtodo es una variacin del test de Molisch en el cual los polisacridos son
hidrolizados mediante cido sulfrico a monosaeridos para formar furfurales que reaccionan
con la Antrona para dar compuestos coloreados.
Procedimiento
Se prepara una disolucin de 1 g/1 de Antrona en cido sulfrico al 75 % en volumen. La
Antrona slida deseada se humedece previamente con etanol absoluto (5 ml etanol/200 mg
Antrona). Agitar hasta disolucin (aproximadamente 1 h). Preparar patrones de fructosa de
concentraciones entre O y 50 ug/ml. Aadir 800 ^1 del reactivo de Antrona a 200 ul de muestra o
patrn. Poner las muestras en un bao a 100 C durante 10 minutos. Sacar las muestras, dejarlas
enfriar y leer la absorbancia 625 nm. Restar la absorbancia del blanco y correlacionar los datos
con el calibrado de fructosa (ver Apndices 8.5).
3.2.2. Reacciones con lipasas
3.2.2.1. Anlisis de cido propnico por Cromatografa de Gases
Este mtodo permite la determinacin de cido propinico en disolventes orgnicos.

La cuantifcacin este se realiza mediante patrn externo entre O y 50 mM (ver Apndices
8.6).
Las condiciones de anlisis son las siguientes:
Instrumentacin:
- Cromatgrafo de gases Hewlett Packard 5890.
- Detector de ionizacin de llama.
- Integracin Millenium 2.15.10
Condiciones cromato grficas:

- Columna: 25% NPAG + 2% H3PO4 WAW 100/200, de 2,7 m x 1/8", de Supelco.
- Portador: Nitrgeno.
- Presin de retroceso: 290 KPa.
- Inyeccin: 0.5 \.
- Tiempo de anlisis: 14 minutos.
- Temperatura horno: isoterma a 145 C.
- Temperatura inyector: 250 C.
- Temperatura detector: 260 C.
La columna debe permanecer saturada con cido frmico para evitar el efecto memoria.
Preparacin de las muestras:

Las muestras a analizar deben estar filtradas por una membrana de 0.45 mm. La inyeccin se
realiza directa sin diluciones.
3.2.2.2. Anlisis de propionato de n-biitilo por Cromatografa de Gases
Este mtodo permite la determinacin de propionato de n-butilo en disolventes

orgnicos. La cuantificacin se realiza mediante patrn externo de 6 niveles, desde O hasta
100 mM (ver Apndices 8.7).
Instrumentacin:
- Inyector automtico Hewlett Packard 7673 A.
- Integracin Millenium 2.15.01.
Condiciones cromatogrficas:
- Columna: HP-INNOWax (Crosslinked Polyethylene Glycol) 30 m x 0.25 mm x 0.25 \im f.
- Portador: He.
- Inyeccin: 1 ui, split 50:1.
- Temperatura horno: isoterma 40 C.
- Presin de retroceso: 24 psi.
- Flujo purga del septum: 4.9 ml/mi n.
- Flujo divisin con venteo: 52 ml/min.

Las muestras a analizar deben estar filtradas pr una membrana de 0.45 um. La inyeccin se
3.2.2.3. Anlisis de hexanol por Cromatografa de Gases
Este mtodo permite la determinacin de hexanol en disolventes orgnicos. La

cuantifcacin se realiza mediante patrn externo de 6 niveles, desde O hasta 100 mM (ver
Apndices 8.8).
Instrumentacin:
- Inyector automtico Hewlett Packard 7673 A.
Condiciones cromatogrfcas:
- Columna: HP-INNOWax (Crosslinked Polyethylene Glycol) 30 m x 0.25 mm x 0.25 um f.
- Portador: He.
- Inyeccin: 1 ui, split 50:1.
- Temperatura horno: isoterma 40 C.
- Presin de retroceso: 24 psi.
- Flujo purga del septum: 4.9 ml/min.
- Flujo divisin con venteo: 52 ml/min.

Las muestras a analizar deben estar filtradas por una membrana de 0.45 um. La inyeccin se
3.2.2.4. Anlisis de butanol por HPLC
Este mtodo permite la determinacin de butanol en medio acuoso. La cuantifcacin

se realiza mediante patrn externo de 8 niveles, desde O hasta 5 g/1 (ver Apndices 8.9).
Instrumentacin:
- HPLC Hewlett Packard 1050.
- Detector de ndice de refraccin Hewlett Packard 1047A
Eluyente:
Como fase mvil se utiliza cido sulfrico 0.015 M disuelto en aguaMilliQ (resistencia<18.2
Q) a pH=3.0. El eluyente es filtrado a travs de 0.45 um y desgasificado mediante vaco.
- Columna: Aminex HPX-87H de Biorad.
- Caudal: isocrtico 0.6 ml/min.
-Inyeccin: 15 ul,
- Temperatura: 65 C.

Las muestras a analizar deben estar filtradas por una membrana de 0.45 um. La inyeccin se
3.2.2.5. Anlisis de enantimeros de ibuprofeno por HPLC
Este mtodo permite la determinacin del exceso enantiomrico de una mezcla de

enantimeros R y S de ibuprofeno (ver Apndices 8.10) en medio orgnico.
Instrumentacin:
- Cromatgrafo de lquidos Hewlett Packard 1090.
- Detector DAD a 226 nm.
Eluyente:
Como fase mvil se utiliza Hexano, Isopropanol, cido trifluoroactico (1000:10:1).
- Columna: fase normal Chiracel OD, de Daicel Chemical Industries LTD.
- Caudal: socrtico de 1.0 mi por minuto.
- Volumen de inyeccin: 5 ul.
- Temperatura: Ambiente.

Las muestras que se desean analizar deben estar previamente filtradas por una membrana de
0.45 um. La inyeccin se realiza directa sin diluciones.
3.2.2.6. Anlisis de enantimeros del cido 2-fenil-propinico por HPLC

enantimeros R y S del cido 2-fenil-propinico (ver Apndices 8.11) en medio orgnico.
Instrumentacin:
Eluyente:
Como fase mvil se utiliza Hexano, Isopropanol, cido trifluoroactico (1000:10:1).
- Caudal: isocrtico de 1.0 mi por minuto.
- Volumen de inyeccin: 5 |il.

0.45 um. La inyeccin se realiza directa sin diluciones.
3.2.2.7. Anlisis de enantimeros del ra;is--2-fenil-l-cclohexanol por HPLC

enantimeros (1R,2S) y (2R,1S) del fras-2-fenil-l-ciclohexanol (ver Apndices 8.12) en
medio orgnico.
Instrumentacin:
Eluyente:
Como fase mvil se utiliza Hexano, Isopropanol (100:2).
- Caudal: socrtico de 1.0 mi por minuto.
- Volumen de inyeccin: 10 ul.

0.45 |im. La inyeccin se realiza directa sin diluciones.
Resultados 109
4.1. PRODUCCIN DE LA LIPASA UAB
4.1.1. Estrategia de fermentacin
Las lipasas UAB de Candida rugosa se producen mediante fermentacin en fed-batch

siguiendo el siguiente sistema: se realizaron inocules sucesivos hasta llegar al fermentador
Braun Biostat UD de 50 1 de volumen de trabajo. Dichos inocules se llevaron a cabo en
discontinuo mientras que en el fermentador de produccin al proceso discontinuo sigui una
operacin fed-batch de caudal de adicin constante de cido oleico. La eleccin de esta
estrategia demostr ser la ptima desde el punto de vista de simplicidad operacional y de
produccin de lipasas cuando se compara con operaciones en discontinuo y continuo
(Gordillo, 1996). En todos los casos el cido oleico fue utilizado como fuente de carbono y
como inductor para la produccin de la enzima puesto que estudios previos haban
demostrado que era el mejor de los substratos probados (Obradors et al., 1993).
En la Figura 4.1.1 se presenta un seguimiento de los puntos de operacin claves del

proceso, mientras que en la Figura 4.1.2 se presenta la evolucin de los parmetros claves de
la fermentacin, biomasa (X) y actividad lipoltica (L) durante un proceso fed-batch en planta
piloto. Tambin se presentan las concentraciones iniciales de cido oleico (S).
Placa Petri Pre-inculo Braun Biolab (0.5 Braun Biostat ED Braun Biostat UD
Botellas (50 mi) 1) Discontinuo (5 1) Discontinuo (50 1) Discontinuo
So=2 g/1 S0=4 g/1 S0=4 g/1 So=2 g/1
Xf=4. 1 g/1 Xf=3.6g/l Xf=2.6 g/1
Lj=2.8 U/ml Lf=15.7U/ml Lf=10.5 U/ml
Fed-batch
q=0.2 g/(h-l ferm.)
Xf=6.3 g/1
Lf=143.4 U/ml
Fig. 4.I.I.: Evolucin de los parmetros claves de fermentacin en el sistema de inocules para
la produccin en planta piloto de lipasas por Candida rugosa.
no Resultados
200 -| 7- r 200
- 160
180 - BATCH i FED-BATCH ,* - 180
6- i y'' A
- 140
160 - i A''' - 160
f 140-
"1
5-
Xx A /
/'""v
' Fin adicin
" 12 1
- 140
1
S3 A _ r 100 S - 120 "cs

12 :
f " w ^ 7 /
/ i
cido olecio
O
g 100 - 1- - 100
r
1 -80 1
1 ;g 1
J: 80 -
1
/ i - 60 ^
- 80 "o
OH
60-
40 -
2- :
t-^-r / ^
/'
)' /
KM
iX jjyj
r~i
LJ i i
LJ
- 40 '
- 60
- 40
!
V / V/ :
ii / rh ^ i r
20 - - 20
- 20
4
n n .N i^-\ \ n A
Tiempo (h)
Fig. 4.1.2.: Seguimiento de un fed-batch de produccin de lipasas por Candida rugosa en

Biostat UD (q=0.2 g/(h-l ferm)).
Los valores obtenidos para esta estrategia de operacin suponen una elevada
productividad comparando con experimentos en discontinuo tanto en trminos de actividad
lipoltica/g de biomasa como en el caso de actividad lipoltica/(volumen de
fermentadortiempo), alcanzando los resultados de:
22.7-103 U de actividad producidas en total/g de biomasa:

4.04-103 U de actividad producidas en discontinuo/g de biomasa
35.3-103 U de actividad producidas en fed-batch/g de biomasa
3.18-103 U de actividad producidas en total/(l fermentador-h de operacin)

0.88-103 U de actividad producidas en discontinuo/O fermentadorh operacin batch)
4.02-103 U de actividad producidas en fed-batch/(l fermentador-h operacin fed-batch)
Resultados 111
Tambin es importante destacar que la parada de la adicin del cido oleico se realiza
en un momento en el cual todava no se ha detenido la produccin y el crecimiento de la
biomasa es prcticamente lineal, lo que indica que dicho crecimiento del microorganismo
todava no se encuentra limitado por la escasez o falta de substrato. El motivo de detener en
este punto la fermentacin es el de evitar la aparicin en concentraciones elevadas de
productos finales como polisacridos u otras protenas que suelen producirse en fases
avanzadas del crecimiento cuando empieza a haber limitacin de substrato. Estos compuestos
interfieren fuertemente en la separacin, purificacin y utilizacin posterior de las lipasas, por
lo que se prefiri detener la fermentacin en un momento en el cual todava no eran
importantes. En particular, es notable la interferencia que tienen los polisacridos en
operaciones de cromatografa y filtracin, como se comentar en el apartado 4.3.
4.1.2. Determinacin de la ley de adsorcin de las lipasas sobre el

cido oleico
Un fenmeno importante que tiene lugar en la produccin de lipasas por Candida

rugosa, cuando crece utilizando cido oleico como substrato, es la adsorcin de la enzima
sobre la interfase orgnico-acuosa formada debido a la inmiscibilidad del cido oleico en la
fase acuosa mayoritaria. El hecho de que enzimas lipolticos tengan tendencia a adsorberse a
la interfase orgnico-acuosa est ampliamente referenciado (Brgstrom y Brockman, 1984) y
provoca que la enzima producida por el microorganismo se encuentre repartida entre la fase
acuosa y la fase orgnica. Los anlisis de actividad lipoltica se realizan sobre muestras
filtradas y libres de biomasa y de cido oleico con lo que la medida slo refleja la cantidad de
enzima presente en la fase acuosa.
De cara a mejorar el modelo matemtico de produccin de la lipasa incluyendo este

fenmeno, se desarroll un sistema para describir la ley fsica de adsorcin de las lipasas
sobre el cido oleico. En este sistema se iban aadiendo al fermentador cantidades variables
de cido oleico. El fermentador contena el medio habitual de fermentacin estril y una
cantidad conocida de lipasa de Candida rugosa, observndose la disminucin de la actividad
lipoltica al producirse el fenmeno de adsorcin. El fermentador utilizado fue un Braun
Biostat E de 5 1 de capacidad cuya geometra es similar a los utilizados en el proceso de
112 Resultados
fermentacin ya que estudios anteriores de este fenmeno en botellas agitadas demostraron

una fuerte dependencia de este fenmeno con las propiedades Teolgicas del sistema
bsicamente por lo que se refiere a agitacin y aireacin (Gordillo, 1996).
La ley de Langmuir ha sido ampliamente empleada para la descripcin de sistemas de

este tipo (Malcata e al., 1992; Gitlesen et a/., 1997). Dicha ley para nuestro sistema tendra la
siguiente expresin:
K
(1)
1 + Kl Lpaq
donde Liporg sera la concentracin de soluto (actividad enzimtica) adsorbido en la interfase,

A sera el equivalente a la concentracin de adsorbente, en nuestro caso el rea interfacial
generada por la emulsin de cido oleico, y Lipaq sera la concentracin de soluto en la fase
acuosa no adsorbida, valor que se puede determinar analticamente. Como primera
aproximacin se realiz una simplificacin de la ecuacin (1), considerando que el soluto
adsorbido era slo proporcional a la concentracin de soluto no adsorbido, es decir,
despreciando Ks\
'aq (2)
La expresin del rea interfacial para unas condiciones de trabajo y para unos valores
constantes de densidad, viscosidad y tensin interfacial que se mantienen para cada tipo de
substrato viene dada por:
K'-S
A= (3)
K'j+S
El balance de actividad lipoltica viene dado por:
Lptot = Lipaq + L (4)

Resultados 113
Substituyendo (3) en (2) y teniendo en cuenta (4):
Lipa, _ 1
(5)
Lip 1+ Ka-S
K'j+S
Para la determinacin de las constantes KJ y K' se realizaron tres experimentos a
diferentes actividades lipolticas iniciales en las que se iba aadiendo cido oleico y se
observaba la evolucin del cociente Lipag/Liptot. En la Figura 4.1.3. se representan los datos
experimentales obtenidos, y en la Tabla 4.1.1 se recogen los datos ajustados parala obtencin
Liptot = 35.4 U/ml

Lip,ot = 26.2U/ml
Lip tot = 13.6 U/ml
\ i i r
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0
Acido oleico (g/1)
Fig. 4.I.3.: Comportamiento de la ley de adsorcin simplificada para distintos valores de la

actividad lipoltica total inicial.
114 Resultados
Liptot (U/ml) Kd K'd

35.4 63 148
26.2 41 6+2
13.6 3.6+0.4 l.OdbO.3
Tabla 4.1.1.: Valores de Kd y K'd obtenidos mediante el ajuste de los valores de la Fig. 4.1.3.
Si la ecuacin (5) describiese correctamente el fenmeno, los valores de Kd y K'd

tendran que ser iguales para cualquier valor de Lip!0, y el cociente Lipaq/Liptot tendra que ser
constante si se mantiene constante la concentracin de cido oleico. La figura 4.1.4 recoge un
experimento en el que se vari la actividad lipoltica total manteniendo constante la
concentracin de cido oleico. En ella se observa como la relacin Lipaq/Liptot vara con la
actividad lipoltica introducida en el fermentador para una concentracin de cido oleico
constante (0.5 g/1).
LO -
0.9 -
0.8 -
0.7 -
0.6 -
0.5 -
"
0.4 -
0.3 -
0.2 -
0.1 -
0.0 -
O 10 12 14
Lip
F (U/ml)
tot v
Fig. 4.I.4.: Evolucin del cociente Lipaq/LipM para una concentracin constante de cido
oleico de 0.5 g/1.
Resultados 115
As pues, parece claro que la simplificacin considerada en la ecuacin (5) no es

representativa del sistema, y que el porcentaje de adsorcin representado por el cociente
Lipaq/Liptot vara sensiblemente con la concentracin de enzima total del medio, es decir, que
la lipasa influye de forma clara en su propia adsorcin, posiblemente debido a un efecto de
estabilizacin de la emulsin de cido oleico (Kierkels et al., 1994).
Ante este comportamiento se pas a considerar la ecuacin de Langmuir completa. A

partir de la ecuacin (1) y usando las mismas estrategias que para obtener la ecuacin (5) se
obtiene la ecuacin (6):
Lip 1
Ki-S (6)
Lip*>
1+
K'd+S
Esta ecuacin representa la ley de Langmuir completa para este sistema. Hay que
sealar que en esta ecuacin, l porcentaje de lipasa adsorbida depende de dos variables: la
concentracin de cido oleico y la concentracin de lipasa total, tal y como se deduce de los
valores variables de las constantes de la tabla 4.1.1. Por consiguiente, las grficas que
representarn los perfiles de adsorcin sern tridimensionales. En la Figura 4.1.5 se muestra la
representacin de los puntos experimentales as como la superficie de ajuste de dichos puntos
mediante la ecuacin (6). En la grfica queda manifiesta la dependencia de la ley de adsorcin
de la concentracin de cido oleico y de la lipasa acuosa.
El ajuste de los valores experimentales a la ecuacin (6) gener tres nuevos

parmetros, Kj, KS y K'd, que sern los que definan la ley de adsorcin para este sistema y
cuyos valores fueron los siguientes:
K\ = 8.0 1.0
3 = 0.28 0.05 ml/U

116 Resultados
Puntos sobre la superficie

o Pimos bajo la superficie
1.0
Fig. 4.I.5.: Representacin de los puntos experimentales y ajuste de los mismos mediante la
ecuacin (6) que representa la ecuacin de adsorcin de Langmuir completa para este sistema.
La bondad del ajuste se refleja claramente en la importante disminucin del error de

ajuste de los parmetros con respecto a los determinados mediante la ecuacin simplificada,
situndose en valores inferiores al 20% para todos los casos. Por tanto, parece claro que una
ecuacin de Langmuir completa describe el sistema de una manera satisfactoria y que estos
parmetros pueden ser introducidos en el modelo matemtico de descripcin del proceso.
Es conocido el hecho de que las enzimas o las protenas en general tienden a generar
fenmenos de adsorcin en multicapa (Lee y Park, 1996). Se llega a un punto de saturacin a
partir del cual las protenas se siguen adsorbiendo sobre si mismas, una vez ocupados todos
los puntos de adsorcin sobre el soluto. En nuestro caso, este fenmeno se tendra que traducir
en que el sistema respondiera mejor a un ajuste del tipo multicapa como describe la ecuacin
(7) propuesta por Brunauer et al, (1938) y conocida como ley de B.E.T.
Resultados 117
Lip,'org K-Lip,'aq
LeydeB.E.T. (7)
(Lips - Lipaq)[ 1 + (#4 - 1)
Lips
donde Lips representa el valor de saturacin a partir del cual se produce el fenmeno
multicapa. Sin embargo, en el sistema estudiado, y para el rango de actividades lipolticas y
concentraciones de cido oleico estudiadas, no se observ dicho comportamiento como se
observa en la Figura 4.1.6. En dicha figura se representa en lneas discontinuas el
comportamiento terico tpico para un fenmeno multicapa descrito por la ley de BET.
Punios experimentales
7 Prediccin Langmuir
Prediccin multicapa
^ 6
t'~N
5
i
I 4-1
o 3-
o.

2-
1 -
i l I
10 15 20 25 30 35
Lipaq (U/ml)
Fig. 4.I.6.: Prediccin de ley de adsorcin con fenmeno multicapa con respecto a ley de
Langmuir y comparacin con los puntos experimentales.
118 Resultados
Otra comprobacin realizada fue determinar la influencia que poda tener la propia
biomasa en la adsorcin. Dada la naturaleza lipdica de la membrana celular, podra
producirse el fenmeno de adsorcin de la enzima sobre las propias clulas. Para ello, se hizo
crecer Candida rugosa sobre galactosa, substrato en el que la produccin de lipasa es mnima,
recuperndose la biomasa por centrifugacin. La biomasa centrifugada se resuspendi en
medio :de cultivo sin fuente de carbono de manera que se obtuvieron concentraciones
variables de biomasa. Para cada una de estas concentraciones se aadi una solucin de
actividad lipoltica conocida, analizndose la actividad remanente en la solucin acuosa. Los
resultados se presentan en la figura 4.1.7.
Como se observa en dicha figura el fenmeno de la adsorcin de la lipasa sobre la
biomasa tiene lugar en el sistema pero con valores no superiores al 15 %. La adsorcin de la
lipasas en la interfase biomasa-acuosa es mucho menor que en la interfase orgnico-acuosa
formada por el cido oleico, en la que el % de adsorcin llegaba a alcanzar el 60 %. Debido a
estas marcadas diferencias no se consider este efecto en la expresin final de la ley de
adsorcin.
1.0 4
0.9 -
\
* - ... ,
~ -- -- -, " -
0.8 -
0.7 -
0.6 -
.i
la 0.5 -
3 0.4 -
0.3 -
0.2 -
0.1 -
0.0 - t i l )
C 1 2 3 4 5
Biomasa (g/1)
Fig. 4.I.7.: Adsorcin de la lipasa sobre las clulas de Candida rugosa en ausencia de cido
oleico para distintas concentraciones de biomasa.
Resultados 119
En consecuencia se eligi la ecuacin (6) con los parmetros determinados

anteriormente, para describir la adsorcin de las lipasas de Candida rugosa sobre cido
oleico. La ley tendra la siguiente expresin:
Lipa,, _ 1
(8)
Lip* S'S 1
(1.1 +S) (1 + 0.28
La ecuacin (8) fue validada eliminando del ajuste experimentos completos de distintos
valores de laLiptot (los correspondientes a las figuras 4.1.3 y 4.1.4). Al realizar esta operacin
se observ que los cambios en los parmetros eran mnimos, as como el error relativo medio
de estimacin (MRE). La variacin de estos parmetros se recoge en la tabla 4.1.2 y fue
marcadamente menor que en el caso de usar una ley de adsorcin lineal (Tabla 4.1.1).
Puntos considerados Ki K'd (g/1) K3(ml/U) M.R.E.

Todos (48) 8.0 1.0 1.1 0.1 0.28 0.05 0.11
Todos excepto Liptot=35.4 U/ml (35) 9.0 1.0 1.20.1 0.29 + 0.05 0.11
Todos excepto Liptot=26.2 U/ml (32) 8.0 1.0 1.0 0.1 0.28 0.05 0.10
Todos excepto Liptot=13.6 U/ml (40) 8.0 1.0 1.10.1 0.25 0.05 0.13
Tabla 4.1.2.: Variacin de las constantes de la ecuacin (8) y del error medio relativo de
ajuste (MRE) al eliminar experimentos completos de una actividad lipoltica determinada.
Como conclusin, la ley de adsorcin completa descrita por la ecuacin (8) se incluy
en el modelo matemtico del proceso para conocer la actividad lipoltica total extracelular
presente en el medio (acuosa + adsorbida). Esta ley est validada para las actividades
lipolticas y concentraciones de cido oleico habituales presentes en las fermentaciones en
fed-batch. El conocimiento de este valor permitir, por ejemplo, poder realizar balances de
actividad lipoltica total extracelular.
120 Resultados
4.1.3. Conclusiones
Como conclusiones a este apartado se pueden destacar:
Se ha diseado un sistema de produccin de lipasas mediante operacin en fed-batch a

escala planta piloto (501).
Se ha determinado la productividad del sistema de fermentacin empleado, resultando
superior a los sistemas en discontinuo y continuo utilizados anteriormente.
Esta lipasa se denominar lipasa UAB.
Se ha determinado la expresin de la ley de adsorcin de Langnur de la lipasa UAB
sobre cido oleico bajo las condiciones de operacin, permitiendo su inclusin en el
modelo matemtico que describe la produccin de las lipasas UAB de Candida rugosa.
Resultados 121
4.2. SEPARACIN DE LA LIPASA UAB
4.2.1. Obtencin de un concentrado lquido de lipasas UAB
La lipasa producida por Candida rugosa es una enzima extracelular, si bien y

dependiendo de las condiciones de operacin puede encontrarse mayoritariamente en el interior
de la clula (Gordillo, 1996). En este trabajo slo se har referencia a la purificacin y
recuperacin de la enzima extracelular.
La operacin en fed-batch a baja velocidad de adicin constante de cido oleico (q=0.2 g

cido oleico/(h-l de fermentador)) ha resultado ser la ms productiva en trminos de actividad
lipoltica total presente en el medio de cultivo. Esta actividad enzimtica se cifra en torno a las
100-150 U/ml, siendo la concentracin de protena total correspondiente entre 60-100 ug/ml y la
biomasa final presente en un rango de 6-8 g/1. Electroforesis de este caldo de cultivo permiten
estimar entre un 20 y un 30% el contenido en lipasa en referencia a la protena total (Gordillo et
al., 1995).
El diseo de las diferentes etapas para la separacin de la lipasa UAB extracelular del
medio de cultivo se representa en la Figura 4.2.1. Este proceso consta de una centrifugacin
previa a SOOOg (Westfalia Separator AG), en la que se elimina la mayora de la biomasa del
medio, seguido de una microfiltracin por 0.45u,m (Minitan Millipore) con objeto asegurar la
total eliminacin de la biomasa. Este lquido clarificado se esteriliz qumicamente mediante la
adicin de.azida sdica (0.02%), la adicin de la misma no supone ninguna prdida de actividad
por parte de la enzima. Teniendo en cuenta que la lipasa comercial de Candida rugosa (Sigma
1754,tipo VE) tiene un peso molecular aproximado de 60 kDa(Ra et al, 1993), resultado que
se confirma por electroforesis en nuestras fermentaciones (Gordillo et al, 1995), la siguiente
etapa consisti en una ultrafiltracin utilizando membranas de lOkDa de cut-off, en esta etapa se
concentraba el volumen de fermentacin 40 veces, este concentrado se dilua hasta su volumen
inicial mediante la adicin de tampon Tris-HCl 20 mM pH = 7.4, ptimo para la lipasa UAB
(Gordillo et al, 1995). Volvindose a ultrafiltrar por lOkDa con una reduccin del volumen de
40 veces obtenindose el concentrado final de lipasas. En esta ltima etapa, similar a una
122 Resultados
diafiltracin, se consegua la prctica eliminacin de las sales del medio de fermentacin as

como la eliminacin de la mayora de protena no lipoltica de peso molecular inferior a 10 kDa.
Diafiltracin
Tris-HCl
20 mM
pH=7.40
Sales
Protena<10000D
Fig. 4.2.I.: Separacin de la lipasa UAB desde el caldo de fermentacin hasta la obtencin de un
concentrado lquido dializado.
En la tabla 4.2.1 se presentan los rendimientos referentes a actividad lipoltica obtenidos

en las diferentes etapas numeradas del proceso y la actividad lipoltica especfica para un
experimento en fed-batch estndar en un fermentador Braun Biostat E de 5 1 de volumen. Los
resultados obtenidos han sido corroborados con el uso de fermentadores de escala piloto como
los Braun Biostat ED de 15 1 o Braun Biostat UD de 501 de volumen.
El punto crtico en el escalado del proceso de separacin es, sin lugar a dudas, la etapa de
ultrafiltracin, para ello se trabajo con tres sistemas en funcin del volumen de que se tratara:
a) Sistema Minitan Millipore equipado con 4 membranas PMNL de 10 kDa de corte para
volmenes no superiores a 5 1.
Resultados 123
b) Sistema Prep/Scale TTF Millipore con un PTGC 10 K 2.5 ft2 Cartridge hasta 15 1 de
volumen.
c) Sistema Centrasette Pali Filtren con una membrana Omega 10K hasta 1001 de volumen.
En todos estos sistemas el corte elegido de 10 kDa asegur la recuperacin total de la actividad
lipoltica como se puede observar en la Tabla 4.2.1.
Punto de proceso Act. Lipoltica Protena Vol. Act. Lipoltica Rendimiento

(U/mi) total O) espec. en act. lip.
....M/mD..... ffi/mg) (%)
Final Fermentacin 98 146 5.0 671 100
Caldo centrifugado 125 173 4.1 723 104.6
Filtracin 0.45 um 120 169 4.1 710 100.4
Primer retenido 10 kDa 3810 3547 0.128 1074 99.5
_
Primer filtrado 10 kDa 0 53 4.0 0
Redisolucin en tampn 23 __, 113 4.0 088 100.4
Segundo retenido 10 kDa 5010 3270 0.100 1532 102.2
Segundo filtrado 10 kDa 0 27 3.900 0 -
Tabla 4.2.1.: Balance de actividad lipoltica en los puntos del proceso de down-stream para la
obtencin de lipasas de Candida rugosa.
Al final del proceso de centrifugacin se observa un aumento de aproximadamente un

5% en la actividad lipoltica probablemente debido a la liberacin de la mayora de la enzima que
se encuentra adsorbida sobre la biomasa y que estudios previos haban estimado como mximo
en un 15% del total (Captulo 4.1). Por lo que respecta al balance de protena total en la Figura
4.2.2 se recoge el mismo.
Segundo Prdida de
filtrado protena
(10 kDa) 7% Segundo
15% retenido
(producto
final)
47%
Primer
filtrado
(10 kDa)
31%
Fig,:4.2.2,: Balance de protena total en las dos operaciones de ultrafltracin a travs de 10 kDa.
124 Resultados
En dicha figura se observa que se ha eliminado en el filtrado aproximadamente un 47%

de protena total presente inicialmente en el caldo de cultivo de peso molecular inferior a 10 kDa,
siendo la prdida de protena total aproximadamente del 7%. Esta prdida se puede justificar en
base a un posible fenmeno de adsorcin sobre las placas de ultrafiltracin, no obstante este es
un problema que, en principio, no es preocupante ya que esta protena adsorbida no tiene carcter
lipoltico como lo demuestra el hecho de que no se observan prdidas de actividad lipoltica al
final del proceso.
A destacar que el balance de actividad lipoltica se cierra en el punto final con un valor
del 100% lo que demuestra la gran estabilidad de la enzima, ya demostrada en anteriores trabajos
(Gordillo etal., 1995) y la validez del proceso diseado.
4.2.2. Obtencin de una lipasa UAB slida
En este apartado se siguieron tres estrategias clsicas para la obtencin de un slido que
contenga la lipasa con la menor prdida posible de actividad lipoltica.
4.2.2.1. Precipitacin con etanol
El uso de disolventes orgnicos para la precipitacin de protenas est ampliamente

referenciado (Deutscher 1988). El etanol ha sido utilizado como agente precipitante con lipasas
comerciales de Candida rugosa (Sigma tipo VII) obtenindose resultados que van desde el 84%
de recuperacin de protena y el 93% de actividad lipoltica (Veeraragavan y Gibbs, 1989), al
45% de recuperacin de protena y el 84% de actividad (Ra et al., 1993). Si bien no se tiene
conocimiento de la precipitacin de lipasas de Candida rugosa con disolventes orgnicos a partir
del caldo de cultivo si existen referencias producidas por otros microorganismos. As la lipasa
producida por Trichosporon fermentan WU-C12 se recuper del caldo de cultivo mediante
precipitacin con acetona obtenindose una recuperacin de protena del 14% y una
recuperacin de actividad lipoltica del 80% (Chen et a/., 1994).
Sin embargo, en el caso de la lipasa UAB producida bajo las condiciones de

fermentacin anteriormente comentadas, estos buenos resultados no se repitieron y se produjeron
Resultados 125
importantes prdidas de actividad lipoltica y de protena total. En la Tabla 4.2.2. se presentan

estos resultados para una precipitacin tpica.
Muestra Actividad Volumen Actividad lipoltica Rendimiento

lipoltica (U/ml) (mi) total (U) (%)
Inicial 3500 22 77000 -
Pellet 1060 22 23320 30.3
Sobrenadante 47 43 2021 2.6
Tabla 4.2.2.: Recuperaciones de actividad lipoltica con etanol.
Para la determinacin de los valores presentes en la tabla 4.2.2 y dada la interferencia del
etanol en los anlisis de protena total y de actividad lipoltica, se elimin el etanol de las
muestras mediante evaporacin en rotovapor y despus se resuspendieron los slidos en el
mismo volumen de tampn. La lipasa es estable a estas operaciones, por tanto, las importantes
prdidas de actividad lipoltica reflejadas en la tabla 4.2.2 tenan que ser debidas al etanol, con lo
que este sistema de recuperacin no era el idneo para la lipasa UAB.
4.2.2.2. Precipitacin con sulfato amnico
El sulfato amnico es otro de los agentes precipitantes clsicos para protenas (Harris y
Angal, 1989). El sulfato amnico fue aadido en distintas proporciones con respecto al valor de
saturacin. La recuperacin de actividad lipoltica y protena total para dichos porcentajes de
saturacin se representa en la Figura 4.2.3. Las condiciones ptimas de separacin se
consiguieron para el 60 % de saturacin en sulfato amnico, en el que se produca una
recuperacin superior al 70 % con respecto a la actividad lipoltica, y del 55% con respecto a la
protena. Estos resultados aun siendo mejor que los obtenidos con la precipitacin con etanol se
encuentran lejos de los obtenidos con lipasas de Fusarium heterosporum, del orden del 93%
(Shimadae a/., 1993) pero mejores que los obtenidos con Pseudomonas aeruginosa IGB 83, del
orden del 15% en cuanto a recuperacin de la actividad lipoltica (Palmeros et al, 1993).
126 Resultados
En este sistema, la cantidad de sulfato amnico a aadir para conseguir una determinada
proporcin 82 de sulfato amnico respecto al valor de saturacin viene dada por la ecuacin (1):
6 v
100-0.3S '
en este caso Si=0 y S2==60, por lo que la concentracin de sulfato amnico ptima para la
precipitacin de lipasas de Candida rugosa resulta ser de 390 g/1.
100 100
90 H - 90
'S' 80 -
o

70 - -70 g
1
13 60 - - 60 B.
S 50 H - 50
*O
a 40 H - 40
30 - - 30
I
20 - -20
t
10 - - 10
O O
10 20 30 40 50 60 70 80 90
Sulfato amnico (%)
Fig. 4.2.3.: Recuperacin de actividad lipoltica y protena total en la precipitacin con sulfato
amnico.
En este caso, los valores de recuperacin de actividad lipoltica ya eran parecidos a los
descritos por Ra et al. (1993) y este sistema poda ser una posibilidad para la recuperacin
ptima de la lipasa en forma de slido.
Resultados 127
4.2.2.3. Lioflizacin directa
Otra posibilidad de obtencin de preparados slidos de lipasas es una lioflizacin directa

del concentrado lquido de lipasas. Este sistema se desarroll congelando previamente el
concentrado con una mezcla de nieve carbnica y acetona y posterior lioflizacin durante 24
horas. La lioflizacin directa del concentrado de caldo de cultivo, siguiendo el diseo
anteriormente comentado, provoc una prdida de actividad lipoltica prxima al 25%.
Es conocido que la adicin de azcares previos a la liofilizacin consigue una mayor

estabilizacin de las protenas en general (Monsan y Durand, 1971). De hecho en los preparados
comerciales de lipasa de Candida rugosa, se detectan cantidades importantes de azcares.
Concretamente, en la lipasa comercial de Sigma el 70% del preparado comercial es lactosa. Ante
este hecho se estudi la influencia que diversas concentraciones de lactosa aadidas al
concentrado de lipasas pudiera tener con respecto a la prdida de actividad lipoltica en el
proceso de lioflizacin.
En la Figura 4.2.4 se observa como al variar la concentracin de lactosa se produce un

importante aumento de la recuperacin de la actividad lipoltica en la lioflizacin. Sin embargo,
para no generar una notable disminucin de la actividad especfica por aumento de la cantidad de
slido se eligi como ptimo el valor de 10 g/1 de lactosa con el que se obtenan recuperaciones
del 90 % de actividad. Como se observa en la figura 4.2.4, por encima de esta concentracin el
porcentaje de recuperacin aumenta muy ligeramente, con lo que lo nico que se conseguira es
una disminucin de la actividad especfica del preparado slido. En este preparado liofilizado
final, correspondiente a 10 g/1 de lactosa, el % de lactosa final es del orden del 50% del slido
que se obtiene.
128 Resultados
100
E3
~ 95 -
a,
^
90 -
'
85 -
-g
80 -
I
U
75 r~
10 20 30 40 50
Lactosa (g/1)
Fig. 4.2.4.: Recuperacin de la actividad lipoltica en la lioflizacin en presencia de lactosa.
En la Tabla 4.2.3 se recogen, a modo de resumen, los resultados obtenidos con los tres
sistemas en trminos de recuperacin. A la vista de los anteriores resultados y de la facilidad
operacional de un sistema de lioflizacin se eligi este mtodo para la obtencin de lipasas en
forma slida a partir del concentrado lquido.
Mtodo de obtencin de lipasa en % recuperacin % recuperacin Factor de

forma slida de act. lipoltica de protema purificacin
Precipitacin con etanol -30 -27 1.11
Precipitacin con sulfato amnico -70 -55 1.27
Lioflizacin directa -90 -100 0.90
Tabla 4.2.3.: Resumen de mtodos de obtencin de lipasa slida de Candida rugosa a partir del
concentrado lquido.
Resultados 129
Sin embargo, hay que tener en cuenta que los factores de purificacin eran mejores en el
caso de la precipitacin con sulfato amnico, como se observa en la tabla 4.2.3, debido a que en
el proceso de liofilizacin no hay eliminacin de protena total, mientras que en los procesos de
precipitacin siempre se produce un fenmeno de selectividad hacia alguna de las protenas
presentes.
Respecto a la liofilizacin cabe decir que la inclusin de lactosa en la liofilizacin, pese a

tener un efecto beneficioso en la recuperacin de actividad lipoltica, no se incorpor al
protocolo general de separacin, debido a que en muchos casos interesaba determinar el grado de
glicosilacin de las protenas y la lactosa supona una interferencia importante difcil de eliminar
completamente, as pues, no fue incluida en la mayora de los casos.
4.2.3. Conclusiones
Como resumen al captulo, se lleg a las siguientes conclusiones:
Se ha diseado un sistema de downstream para la obtencin de un concentrado lquido de

lipasaUAB con recuperaciones de actividad cercanas al 100%.
En este proceso se produce una disminucin de la concentracin de protena del orden del
50%, correspondiendo a protenas de peso molecular inferior a 10 kDa.
- Para conseguir un preparado slido se probaron tres tcnicas clsicas, precipitacin con
disolvente orgnico, con sulfato amnico y liofilizacin, siendo este ltimo el que origin
mejores resultados en recuperacin de actividad (90%).
La lactosa demostr ser un buen estabilizante para la lipasa UAB, aunque no se us por
generar interferencias en la caracterizacin de la lipasa UAB.
130 Resultados
Resultados 131
4.3. ESTIMACIN ECONMICA DEL PROCESO DE

PRODUCCIN DE LIPASAS UAB
4.3.1. Partidas que componen la estimacin econmica
Para determinar si este proceso era rentable econmicamente de acuerdo con los
precios actuales de la lipasa de Candida rugosa, se pas a determinar las distintas partidas que
corresponden a este tipo de estudios. En este estudio se consider trabajar con un volumen de
fermentacin de 1 m3 al ritmo de 1 fermentacin por semana y una vida media del proceso de
10 aos.
4.3.1.1. Ventas fV)
El precio de la lipasa de Candida rugosa proporcionado por la empresa Amano, que lo

comercializa a partir de 100 gramos, es de 375 ptas/g. Esta lipasa tiene una actividad
especfica entre 30-40 veces inferior a la producida en nuestro laboratorio en planta piloto,
siendo su principal componente azcares que se usan para su estabilizacin.
Con estos datos de puede estimar el precio obtenido con la produccin propuesta,
teniendo en cuenta que aproximadamente se producen 0.5 g producto/1 fermentador:
1 m3 x 50 fermentaciones x 1000 1 x 0.5 g/1 x 375 ptas/ g x 30 = 281.3 MM/ao (V)
4.3.1.2. Inmovilizado fl)
El precio de la partida maquinaria y equipos se puede calcular teniendo en cuenta los

siguientes precios:
Equipos:
Sistema de inoculacin: 0.5 MM
- Braun Biostat ED 15 1: 14 MM .
- Braun Biostat UD 1 m3: 3 5 MM
Resultados 132
- Centrfuga en continuo 20 1/h: 5 MM

- Sistema filtracin/ultrafltracin 1 m3: 1.5 MM
- Membranas filtracin 0.45 um: 6 x 0.15 MM = 0.9 MM
- Membranas ultrafltracin 10 kDa: 6 x 0.15 MM = 0.9 MM
- Liofilizador 141/24 h: 1.7 MM
Analtica:
- pHstato = 0.8 MM
- Microscopio = 0.7 MM
- Espectrofotmetro = 0.5 MM
En total, Maquinaria y aparatos: X = 61.5 MM.
El precio de la partida de inmovilizado se calcular con el mtodo de los porcentajes descrito

por Vin (1991). En este mtodo el valor del inmovilizado se divide en una serie de partidas
que corresponden a porcentajes del valor de Maquinaria y aparatos.
Instalacin: entre 0.35X y 0.50X, para aparatos pequeos como es el caso se coger el
valor mnimo, es decir: 0.35X = 21.5 MM.
- Tuberas: entre 0.10X y 0.60X que corresponden a slidos y fluidos, en este caso,
cogeremos un valor intermedio: 0.35X = 21.5 MM.
- Instrumentacin: entre 0.05X y 0.30X, de donde se tomar el mnimo dado que los
equipos comprados incorporan instrumentacin: 0.05X = 3.1 MM.
- Aislamiento: entre 0.03X y 0.10X, el valor mnimo dado que no se tienen temperaturas
elevadas en estos procesos: 0.03X = 1.8 MM.
Instalacin elctrica: entre 0.10X y 0.20X, se tomar un valor intermedio, 0.15X = 9.2
MM.
- Edificios: entre 0.20X y 0.30X para instalaciones interiores, se tomar el valor intermedio
0.25X=15.4MM.
Servicios auxiliares: entre 0.25X y 0.70X, el valor ms bajo para este tipo de empresa
que necesita pocos servicios tipo vapor o agua de refrigeracin: 0.25X = 15.4 MM.
Resultados 133
Con la suma de todas estas partidas se obtiene el capital fsico (Y):
Y = 87.9 MM
El proyecto y direccin de obra se calcula como 0.20Y =17.6 MM, sumando este valor al
capital fsico se obtiene el capital directo (Z):
Z = 105.5 MM
a los que se aplican los gastos de:

Contratista: entre 0.04Z y 0.1 OZ, se tomar el valor mnimo debido a la escasa
complejidad de la planta: 0.04Z = 4.2 MM.
Imprevistos: entre 0.10Z y 0.30Z, se tomar el valor mnimo dada la experiencia que se
tiene del proceso: 0.10Z = 10.6 MM.
Con ello se obtiene un valor final para la partida de inmovilizado (I) de 181.8 MM.
Utilizando la regla de Lang descrita por Vin (1991) se puede obtener una estimacin directa
del capital inmovilizado a partir de la partida de maquinaria y aparatos:
I = Coeficiente de Lang factor de correccin X
Tomando los valores recomendados por Vin se obtiene:
I = 4.74 x 0.6 x 61.5 = 174.9 MM
por tanto, en este caso es una muy buena aproximacin.
4.3.1.3. Costes
El sistema de evaluacin de los costes tambin se basa en un clculo detallado de las

partidas que los componen. Los costes se suelen dividir en dos grandes bloques, los
denominados costes de fabricacin (M) que son los directamente asociados con la produccin
y los gastos generales (G) que no dependen de la produccin.
Resultados 134
Para este sistema:
a) Costes de fabricacin (M):
1) Materias primas (MI): los reactivos necesarios y su precio de mercado se recogen en la

tabla 4.3.1.
Compuesto Precio unitario (ptas) Cantidad (Kg/ao) Precio (ptas /ao)

K2HPO4 71 145/50 Kg 275 392000
KH2PO4 53528/50 Kg 750 803000
MgSC-4 8708/25 Kg 50 17000
(NH4)2SO4 39353/50 Kg 200 157000
NH3 30 % 27459/60 1 250 (I/ao) 114000
Acido oleico 9380/41 400 4216000
Tabla 4.3.1.: Evaluacin del coste de las materias primas para la produccin de lipasa UAB.
Despreciando el precio del resto de reactivos (agua destilada, vitaminas, FeCls y

antiespumante) se obtiene un total de 5.7 MM/ao.
2) Mano de obra directa (M2): considerando el elevado nivel de instrumentacin de los

equipos presentes, se puede estimar en 5 el nmero de personas necesarias para desarrollar
el proceso. Considerando un valor medio de 4 MM/persona y ao se tiene un valor de 20
MM.
3) Patentes (M3): entre 1 y 5 % de las ventas, en este caso, un valor medio del 3% originara
M3 = 0.03V = 8.5 MM.
4) Mano de obra indirecta (M4): entre 15 y 45 % del valor de la mano de obra directa, en
este caso se toma el valor mnimo por el tipo de empresa: M4 = 0.15M2 = 3 MM.
5) Servicios generales (M5): esta partida ser muy baja en nuestro caso, y slo habra que
tener en cuanta el vapor necesario en la esterilizacin. Se despreci en relacin con el
resto de trminos.

RECUPERACIÓN PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LIPASAS PRODUCIDAS POR Candida Rugosa

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RECUPERACIÓN PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LIPASAS PRODUCIDAS POR Candida Rugosa

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Universitat Autnoma de Barcelona

ESCOLA TCNICA SUPERIOR D'ENGINYERIA

DEPARTAMENT D'ENGINYERIA QUMICA

RECUPERACIN, PURIFICACIN Y CARACTERIZACIN

Memoria que para optar al grado de Doctor en Ingeniera Qumica presenta:

ANTONIO SNCHEZ FERRER

Y para que conste a los efectos que corresponda,

Francisco Valero Barranco Feo. Javier Lafuente Sancho

A Caries Sol, por sus clases.

A Manel Poch, por haberse interesado siempre en m y en mi trabajo.

A los programas BIO-4-96-0005 (European Program on Biotechnology), QFN94-4627-C02-1 (Programa

3.1.3. Cromatografa en FPLC 91

3.2.2.6. Anlisis de enantimeros del cido 2-fenil-propinico

4. Resultados y discusin 109

4.8.9. Conclusiones 223

En esta memoria se presentan los resultados obtenidos en el estudio de la aplicacin de

En el presente trabajo se ha iniciado la separacin de lipasas producidas por

Se ha conseguido la caracterizacin de las protenas presentes en el preparado slido

Se ha comprobado la potencialidad del uso de la lipasa UAB en reacciones de sntesis

Se ha estudiado la inmovilizacin de la lipasa UAB sobre distintos soportes: celita,

Se ha estudiado la utilizacin de la lipasa UAB inmovilizada sobre EP100 en la

Se ha desarrollado un sistema en continuo para la resolucin altamente

El sistema en continuo tambin se utiliz con xito en la resolucin altamente

1.1. El papel de las lipasas en la Biotecnologa

1.1.1. Enzimas. Definicin de lipasas: actividad lipoltica y estersica

Una de las aplicaciones ms comunes de la Biotecnologa es la produccin y

Las lipasas (triacilglicerol ster hidrolasas: EC. 3.1.1.3) pertenecen a un grupo de

Trigcrido Glioerol Acido graso

Fig. 1.1.: Accin tpica de las lipasas hidrolizando un triglicrido.

En la naturaleza, las lipasas actan en la interfase orgnico-acuosa, y su modelo

En el caso de la actividad estersica la situacin es completamente diferente puesto

1.1.2. Fuentes de obtencin de lipasas. Especificidad

Si bien la primera fuente de obtencin de las lipasas fue a partir de pncreas de

La produccin de lipasas a partir de cada uno de los microorganismos depende en gran

En el Departament d'Enginyeria Qumica de la Universitat Autnoma de Barcelona se

Recientemente se ha constatado el efecto que sobre la produccin de lipasas tiene el tamao

1) Posicional: cuando se hidrolizan preferentemente ciertas posiciones del triglicrido,

1.1.3. Reacciones catalizadas por lipasas

El inters de algunos tipos de lipasa es consecuencia de su accin especfica sobre

catalizar la reaccin inversa lo que permite la sntesis de esteres, la transesterifcacin y la

La transesterificacin se define como una reaccin de sntesis en la cual el acil

Fig. 1.2.: Tipos de transesterificaciones con lipasas.

Por otro lado, la interesterificacin es un proceso til para cambiar la composicin de

Fig. I.3.: Tipos de intersesterificaciones con lipasas.

1.1.4. Aplicaciones biotecnolgicas de las lipasas

Actualmente, el estudio de las lipasas se encamina a una serie de aplicaciones de

- Preparacin de cicloalcanoles enantiomricamente puros como intermediarios de

Bioconversin de triglicridos con cidos grasos poliinsaturados a hidroperxidos de alta

1.2. Precedentes en la produccin lipasas

Hace aproximadamente 12 aos que en el Departament d'Enginyeria Qumica de la

A lo largo de estos aos se han realizado avances importantes en la produccin de la

Toda esta informacin obtenida a travs de experimentos en discontinuo y continuo ha

1.3. Mtodos de purificacin y caracterizacin de protenas

1.3.1. Mtodos de concentracin de protena

Normalmente, la concentracin de protena resultante al final de una fermentacin es

Un proceso tipo para la obtencin de un producto obtenido por va biotecnolgica

1. Eliminacin de insolubles: bsicamente filtracin y centrifugacin como operaciones

En casos reales, como operaciones de separacin de la biomasa se pueden destacar:

1. Centrifugacin: operacin unitaria slido-lquido en la que un slido y un lquido se

2. Filtracin: operacin bsica en la que se separan slidos en suspensin en un lquido

1. Dilisis: usada para la eliminacin de componentes de bajo peso molecular, normalmente

3. Liofilizacin: se trata de la evaporacin por sublimacin de la solucin congelada

1.3.2. Mtodos de precipitacin