MARCO TEORICO

La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin

diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre
todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram,
que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la
morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin
a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las
bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que
se visualizan de colodiferenciacin de Gram positivo y Gram negativa
Morfologa colonial y agrupacin de las bacterias.
Por su similitud morfolgica existen 4 grupos de bacterias: los cocos, que son de
forma esfrica; los bacilos, en forma de pequeos bastones; los espirilos en forma
de tirabuzn con eje helicoidal; y los vibrios de gran movilidad generalmente
curvados.
Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes
celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa
de peptidoglucano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la
cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se
encuentra el cido lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido teicoico que
est anclado solamente en el peptidoglucano (tambin conocido
como murena)
Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es
delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior
(de composicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una
capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior
por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha
de protena, fosfolpido y lipopolisacrido.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a
estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya
que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las
Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram
negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a
que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes
orgnicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de
peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener

el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto

este complejo se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por
el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms resistente y
con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin
del solvente orgnico, sino que este
acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda
escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la
rosa o rojo o grosella.

INTRODUCCION
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de
ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la
clula y el medio que lo rodea. El modo ms simple de aumentar el contraste es la
utilizacin de colores.
Si se desea simplemente aumentar el contraste de las clulas para la
microscopia, son suficientes los procedimientos que s e usan un solo colorante
llamados de tincin simple. Sin embargo, a menudo se utilizan mtodos que no
tien de igual modo todas las clulas, es el proceso denominado tincin
diferencial. Uno es muy usado en microbiologa es la tincin Gram. Basndose en
su reaccin ala tincin Gram, las bacterias pueden dividirse en 2 grupos:
Grampositivas y Gramnegativas. Esta tincin tiene gran importancia en taxonoma
bacteriana ya que indica la diferencias fundamentales de la pared celular de las
distintas bacterias.
Mientras que las bacterias Gramnegativas son constantes en su reaccin, los
microorganismos Grampositivos pueden presentar ciertas respuestas variables en
ciertas condiciones (son gramlabiles). Por ejemplo, los cultivos viejos de algunas
bacterias Grampositivas pierden su propiedad de retener el cristal violeta, y en
consecuencia, se tien por la safranina apareciendo Gramnegativas. Anlogo
efecto se produce en ocaciones por medio del organismo, o por ligeras
modificaciones en la ejecucin de la tcnica. Por este motivo, es preciso atenerse,
en la prctica al procedimiento establecido.

Para explicar el mecanismo de la tincin de gran se han propuesto varias hiptesis

fundadas en la naturaleza qumica de las paredes celulares de los
microorganismos.
Aqu podemos ver las diferencias estructurales y qumicas de 2 tipos de paredes
de bacterias:

Pared Gram+
Capas densas y uniformes de 200 a 800 A cidos teicoicos
Polisacridos
Protenas (pocas veces)
Glicopeptido (50% del peso seco)

Pared GramCapa interna delgada de 20 a 30 A cubierta por capas externas de densidad

menor
Lipopolisacaridos
Lipoprotenas
Protenas
Glicopeptido (10% del peso seco)

OBJETIVOS

1. La presente tiene como objetivo el conocimiento de la tcnica para la

observacin de bacterias Gram positivas o Gram negativas-, de acuerdo a
la coloracin en la coloracin de pptidoglucano de la bacteria.

2. Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la

caracterizacin e identificacin de las bacterias.

MATERIALES Y REACTIVOS

Microscopio
Mechero de alcohol
Portaobjetos
Papel de filtro
Asa de siembra
Lugol
Cubeta de tincin
Alcohol acetona
Cultivo bacteriano
Safranina
Pinzas frasco lavador
Tierra
Heces de animal
Aceite de inmersin

PROCEDIMIENTO

Preparar la frotis bacterianos

Teir con cristal violeta 1min.
Lavar con abundante agua el exceso de colorante
Cubrir con lugol 1min.
Lavar con agua el exceso de lugol
Decolorar con alcohol acetona o simplemente con alcohol hasta que la
preparacin deje de perder color (30seg)
Lavar con abundante agua para eliminar el colorante del contraste.
Secar la preparacin

Examinar al microscopio fijndose sobre todo el color en cada preparacin.

Usar aceite de inmersin. Ver con el objetivo de 100x:
Los tiempos de exposicin a los colorantes son orientativos. Cada vez que
se prepara la bacteria de colorantes para realizar la tincin Gram presenta
algunas diferencias respecto a los preparados en el momento, por lo que
puede ser ajustar los tiempos.
En un laboratorio de microbiologa, cada vez que se preparan los
colorantes, suelen hacerse pruebas de cultivos patrn de 2 tipos (Gram+ y
Gram-) para ajustar as los tiempos y tener la certeza de que el resultado de
todas las tinciones que se hagan mientras duren colorantes sean fiables.