UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

INGENIERA AGROINDUSTRIAL

Ing.
Jorge
Domingu
ez

ESPECTROFOTOMETRA
I.

INTRODUCCION
La interaccin de la radiacin electromagntica con la materia
es el principio fundamental del desarrollo de una serie de
tcnicas analticas. La radiacin electromagntica es una clase
de energa que se transmite por el espacio a enormes
velocidades,

puede

adoptar

muchas

formas

(calor,

luz,

radiaciones gamma, rayos x, ultravioleta, microondas, etc.).

Fig. 1. Espectro electromagntico. Regin visible con

de 400 a 700 nm.

La espectroscopia es una rama de la ciencia en la que la luz se

o radiacin visible se descompone en sus longitudes de onda
originando espectros, que se usan para estudios tericos de la
estructura de la materia. Actualmente este trmino fue
ampliado para incluir la utilizacin no solo de la luz visible, sino
tambin de otros tipos de radiacin electromagntica.
1

ESPECTROFOTOMETRA

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

INGENIERA AGROINDUSTRIAL

Ing.
Jorge
Domingu
ez

La absorcin de la radiacin es un proceso en el que la energa

electromagntica se transfiere a los tomos, iones o molculas
que constituyen
la muestra. La absorcin promueve estas partculas desde su
estado normal a temperatura ambiente, o estado fundamental
a uno o varios estados de energa ms elevados o excitados.
Para que se produzca la absorcin de la radiacin, la energa de
los fotones excitados debe coincidir exactamente con la
diferencias de energas del estado fundamental y uno de los
estados excitados de las especies absorbentes.

En la regin visible se aprecia el color visible de una solucin y

que corresponde a las longitudes de onda de la luz que
transmite, lo que absorbe. El color que absorbe es el
complementario de color que transmite. Por tanto, para realizar
mediciones de absorcin es necesario utilizar las longitudes de
onda en la que absorbe luz la solucin coloreada.

Para que una sustancia se activa en el visible debe ser colorida:

el que una sustancia tenga color, es debido a que absorbe
ciertas frecuencias o longitudes de onda del espectro visible y
transmite otras ms.

II.

OBJETIVOS

ESPECTROFOTOMETRA

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

INGENIERA AGROINDUSTRIAL

Ing.
Jorge
Domingu
ez

Determinar la longitud de onda adecuada (longitud de onda

de mxima absorcin) y niveles de concentracin tambin
adecuados

para

el

anlisis

cuantitativo

por

espectrofotometra.

III.

MARCO TERICO
Cuando se pretende determinar, espectrofotomtricamente la
concentracin de un soluto de una disolucin, es imprescindible
conocer las longitudes de onda a las que se produce la mxima
absorcin. Lo ideal es hacer incidir sobre la solucin un haz de
luz con la longitud de onda que se produce la mxima
absorcin; para descubrir la capacidad de absorcin de una
sustancia a distintas longitudes de onda, se hace un barrido de
longitudes de onda.
Cada sustancia tiene su espectro caracterstico, por lo que
podemos

identificarla

en

una

solucin

cuya

composicin

desconocemos, y esto se suele emplear en la determinacin de

txicos en lquidos biolgicos.
Existen dos formas de llevar a cabo los espectros de absorcin:
Manualmente: se lleva a cabo en un espectrofotmetro
de haz simple, se coloca en la cubeta la solucin y vamos
midiendo las absorbancias a distintas longitudes de onda.

ESPECTROFOTOMETRA

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

INGENIERA AGROINDUSTRIAL

Automticamente:

se

Ing.
Jorge
Domingu
ez
lleva

cabo

en

un

espectrofotmetro de haz doble, en el que se sita la

cubeta con el blanco en una de sus celdas y en la otra la
solucin problema, se programa el aparato para q haga
incidir distintas longitudes de onda y este hace el barrido.

AZUL DE METILENO 1%
DESCRIPCIN
Sinnimos : Azul de Metileno 3-Hidrato en solucin - Azul
de Metileno Trihidratado en solucin - Azul de Metileno
Indicador en solucin - Azul Bsico 9 Trihidratado en
solucin.
Formula Qumica: C16H18N3SCl x 3H2O
Concentracin: 1.0%
Peso molecular: 373.90
Grupo Qumico: Compuesto Orgnico Indicador
Nmero CAS: 7220-79-3 (Azul de Metileno 3-Hidrato).
61-73-4 (Azul de Metileno Anhidro).
Nmero NU: No regulado.
Cdigo Winkler: 50160

PROPIEDADES FISICAS Y QUIMICAS

Estado Fsico: Lquido.

Apariencia: Color verde - azul claro.
Olor: Sin olor.
PH: 3.0 - 4.5 (solucin acuosa al 1% a 25C).

ESPECTROFOTOMETRA

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

INGENIERA AGROINDUSTRIAL

Ing.
Jorge
Domingu
ez

Temperatura de Ebullicin: 100C aproximadamente.

190C (Azul de Metileno slido se descompone).

Temperatura de Fusin: 0C aproximadamente. 100 -

110C (Azul de Metileno slido).

Densidad (Agua1): 1.0 kg/L a 20C aproximadamente.
Presin de Vapor: No reportado.
Densidad de Vapor (Aire1): No reportado.
Solubilidad: Soluble en Agua.

IDENTIFICACION DE RIESGOS

Riesgo Principal: Nocivo e Irritante leves

SUSTANCIAS ACTIVA DEL AZUL DE METILENO

El azul de metileno (un colorante catinico), reacciona con
aniones orgnicos para formar sales hidrofbicas de color azul
intenso, que pueden extractarse fcilmente con un solvente
orgnico y cuantificarse posteriormente por fotometra. Ya que
la mayora de los jabones y detergentes que se emplean
habitualmente son de naturaleza aninica, se utiliza esta
propiedad del azul de metileno para valorar el contenido de
surfactante anionico en aguas limpias y residuales.

ESPECTROFOTOMETRA

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

INGENIERA AGROINDUSTRIAL

Ing.
Jorge
Domingu
ez

Los surfactantes anionicos se encuentran entre las ms

destacadas de las muchas sustancias, naturales y sintticas que
muestran actividad frente al azul de metileno. As, aun cuando
el mtodo es til para medir el contenido de surfactante
anionico en muestras de aguas, debe tenerse siempre en
cuenta la posibilidad de que existan en la muestra otros tipos
de sustancias activas al azul de metileno, diferentes de los
jabones.

IV.

MATERIALES Y MTODOS

RECEPCION

PREPARACION

AFORAR

SELECCIONAR

EQUIPO

EVALUAR

DETERMINAR

Azul de metileno a una

concentracin de: 0.1%
Se
prepar
soluciones
a
diferentes concentraciones: 1;
1,5;
2;
3ppm;
5ppm;
10ppm; 15ppm; 30ppm
Diluir hasta 50 ml con agua
destilada

Solucin a 1 ppm

Calibramos el
espectrofotmetro con agua
destilada
Hallamos la longitud de
mxima absorcin
Con la longitud hallada, damos
lecturas las dems concentraciones,
determinando la ecuacin de la recta
con ayuda del programa excel

ESPECTROFOTOMETRA

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

INGENIERA AGROINDUSTRIAL

Ing.
Jorge
Domingu
ez

Analizamos el valor R2

ANALIZAR

Determinamos el coeficiente de
extincin molar de la muestra (azul
de metilo)

DETERMINAR

Por ltimo determinamos la

concentracin de una muestra
problema

DETERMINAR

V.

PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS
Para la realizacin de esta prctica, utilizamos Azul de metileno a una
concentracin de 0.1%.

Azul de Metileno
0.1%

Preparamos diversas soluciones de Azul de metileno a 1ppm, 1.5ppm,

2ppm, 3ppm. Aforando hasta 50ml con Agua destilada.
Tenemos una concentracin de Azul de
Metileno 0.1%, entonces:

0.1 gr 1000 mg
x
=1mg/ml
1000 ml
1 gr
ESPECTROFOTOMETRA
0.1 =

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

INGENIERA AGROINDUSTRIAL

Ing.
Jorge
Domingu
ez

Se sabe que:
1mg 1000ml 1ppm
Xmg 50ml 1ppm
1mg 1000ml 1ppm
Xmg 50ml 1ppm

x=

1mg x 50 ml
1000 ml

= 0.05mg
0.05ml
de Az

0.05mg 50ml 1ppm

Xmg 50ml 2ppm

x=

0.05 mg x 2 ppm
1 ppm

= 0.1mg

0.1ml de
Az

ESPECTROFOTOMETRA

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

INGENIERA AGROINDUSTRIAL

Ing.
Jorge
Domingu
ez

0.05mg 50ml 1ppm

Xmg 50ml 3ppm

x=

0.05 mg x 3 ppm
1 ppm

= 0.15mg
0.15ml
de Az

A esta longitud de onda (660nm), determinamos la absorbancia de cada

muestra, en este caso Azul de metileno a 1 ppm, 2ppm, 2.5ppm y
3ppm.
CONCENTRACIN
1 ppm
1.5 ppm
2 ppm
3 ppm

ABSORBANCIA
0.3137
0.075
0.55921
0.7774

ESPECTROFOTOMETRA

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

INGENIERA AGROINDUSTRIAL

Determinacin del rango de concentraciones:

Ing.
Jorge
Domingu
ez

Los datos se colocaron en el

Programa Excel, para as
obtener la ecuacin de la
recta y el valor de R2

Absorbancia
1
0.8
0.6

f(x) = 0.23x + 0.08

R = 1

0.4
0.2
0
0.5

10

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

ESPECTROFOTOMETRA

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

INGENIERA AGROINDUSTRIAL

Ing.
Jorge
Domingu
ez

El valor de R2 = 0.9993 y la ecuacin de la recta es:

y = 0.2331x + 0.0807

VI.

DISCUCIONES

La ley de Beer-Lambert slo se cumple para concentraciones

bajas, a partir de una concentracin 0,01M empieza a haber
desviaciones de la linearidad.

11

ESPECTROFOTOMETRA

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

INGENIERA AGROINDUSTRIAL

Ing.
Jorge
Domingu
ez

Adems, si la radiacin utilizada no es monocromtica, tambin

puede haber errores.
La existencia de otros equilibios qumicos en disolucin, como
cido-base, de precipitacin, de formacin de complejos,
aunque no modifican la ley en s misma, s que pueden
modificar la concentracin de la sustancia que estamos
midiendo, y puede producir un error en el resultado.
Fuente:

http://es.answers.yahoo.com/question/index?

qid=20070410202232AASVZOV

Con los datos obtenidos en el espectrofotmetro, se puede

deducir que la absorbancia aumenta con la concentracin de
las soluciones y la distancia que recorre el rayo de luz, debido a
que hay mayor cantidad de analito ( mayor cantidad de
molculas que absorben energa para excitarse). Las cuales
toman esta energa del rayo de luz, disminuyendo la intensidad
de la radiacin, por lo que la transmitancia disminuye al
aumentar la concentracin.
La absorbancia es directamente proporcional a la concentracin
y la transmitancia es inversamente proporcional a esta.

12

ESPECTROFOTOMETRA

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

INGENIERA AGROINDUSTRIAL

VII.

Ing.
Jorge
Domingu
ez

CONCLUSIONES

No

se

comprob

la

linealidad

de

mtodo

empleado,

obteniendo un coeficiente de determinacin menor a 0.995,

la cual nos indica que hubo deficiencias en la preparacin de
las soluciones.
La espectrofotometra nos ayud a medir la concentracin
que el azul de metileno.
Pudimos observar a travs del espectrofotmetro como es
que varan las absorbancias con diferentes longitudes de
onda.
Hemos concluido que a mayor concentracin de soluto
mayor va ser la absorcin de dicha solucin.
Las sustancias orgnicas adsorben energa a una determina
longitud de onda.

13

ESPECTROFOTOMETRA

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

INGENIERA AGROINDUSTRIAL

Ing.
Jorge
Domingu
ez

VIII. RECOMENDACIONES
Se recomienda siempre trabajar con reactivos de referencia
actuales, disponer de los certificados de calibracin de los
equipos, tener los manuales de trabajo actualizados y
trabajar respetando las polticas de manejo del laboratorio.
Se recomienda diluir bien la muestra, para que las diferentes
soluciones concentradas

tengan la misma posibilidad de

absorber la luz.
Se recomienda que las concentraciones preparadas sean
generalmente menor a 0.01M.
Se recomienda que la luz incidente sea monocromtica.

14

ESPECTROFOTOMETRA

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

INGENIERA AGROINDUSTRIAL

IX.

Ing.
Jorge
Domingu
ez

BIBLIOGRAFA

www.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/recursos/r22541
.DOC

www.winklerltda.com/ficha_new.php?id=1065
gemini.udistrital.edu.co/comunidad/grupos/.../calaguas_cap1
5.pdf

15

ESPECTROFOTOMETRA