I) Une souche de Pseudomonas isole partir du sol est capable de se dvelopper sur le milieu suivant: Glucose: 16g/l ; (NH4)2 SO4: 1g/l ; K2HPO4: 7g/l ; KH2PO4: 3g/l ; MgSO4,7H2O: 0,1g/l . Pour tudier la croissance bactrienne de cette souche, ce milieu a t ensemenc partir d'une culture de 24 h de cette souche sur glose nutritive puis incub dans les conditions optimales de temprature et de pH. Lvolution du nombre de bactries en fonction du temps est schmatise sur la figure 1.
Figure 1 26 25 log2 N
24 23 22 21 20 0
Temps (h)
1) Dlimiter sur le graphe ci-dessus les diffrentes phases de croissance; interprtez et
qualifiez chacune delles. 2) Dterminez la valeur numrique de trois paramtres ncessaires et suffisants pour caractriser cette croissance. 3) D'aprs les conditions exprimentales, de quoi dpend la 1re phase de la courbe ? 4) Expliquez la troisime phase de la courbe partir de la corrlation entre la croissance bactrienne et la consommation du glucose (figure 2).
Figure 2 26
16
24 23
22 4
log2 N
Glucose (g/l)
25 12
21
20 0
3 4 Temps (h)
Glucose ( g/l)
log2 N
II) On rpte la mme exprience de croissance avec la mme souche et sur le mme milieu de culture, mais en prsence de diffrentes concentrations de glucose. Les diffrentes courbes de croissance sont reprsentes sur le mme graphe dans la figure 3.
Figure 3
Glucose (g/l) Ns/ml (x10 )
log2 N
28 27 26 25 24 23 22 21 20 0
32
194
16 8 4 2 1
98 50 25 14 8
0,5
Temps (h)
1) Comparer la croissance totale (Ns - No) et le taux de croissance
max pour les
concentrations 32 , 4 et 0,5 mg/ml.
A partir des mmes donnes exprimentales, on trace une courbe donnant la variation du temps de gnration minimum en fonction de la concentration initiale en glucose dans le milieu (figure 4).
Figure 4 10 Minimum (h)
8 6 4 2 0 0
12
16
Glucose (g/l)
2) Quelle est la relation entre max et min ?
3) Pour quelle valeur seuil le glucose est considr comme facteur limitant ?
III) La souche est cultive sur milieu synthtique contenant une source dazote minrale, des sels minraux et le glucose faible concentration. On mesure la densit optique intervalles de temps rguliers.
1) Au temps 12 h, on ajoute du glucose et on poursuit les mesures. On obtient la courbe de
croissance ci-dessous (figure 5a). Interprtez les rsultats obtenus. 2) Quelle serait l'allure de la courbe (compltez la figure 5b) si au temps 12 h on avait ajout du lactose la place du glucose, sachant que la souche est capable dutiliser le lactose ? Figure 5a 2
DO
1,5 1 0,5 Glucose 0 0
12 Temps (h)
16
20
24
Figure 5b 2
DO
1,5 1 0,5
Lactose
0 0
12
16
Temps (h)
20
24
CROISSANCE BACTERIENNE CORRIGE
Exercice I :
1) Schma du protocole exprimental (Figure P).
2) - Dlimitation des phases de croissance (Figure 1).
-
Interprtation : Phase I : Phase de latence : - Adaptation au nouveau milieu. Prparation de la machinerie enzymatique ncessaire la dgradation des nouveaux substrats. - Dtoxication du milieu. - Pas de division bactrienne ( = zro). Phase III : Phase exprimentale : - Cest la seule phase de la courbe exprimentale dont lvolution correspond la thorie (log2N = t + log2N0 est une courbe du type y = ax + b c..d une droite de pente ). - Les bactries sont dans leur tat physiologique et mtabolique optimum. Do un maximum de synthses surtout dADN et par consquent un maximum de divisions bactrienne. Le taux de croissance est maximum (max). Ce paramtre qui permet de caractriser la croissance doit tre calcul au niveau de cette phase (pente de la courbe). Phase V : Phase stationnaire : - Arrt de croissance. Arrt de divisions bactrienne (m = zro). - Les conditions de culture commencent devenir dfavorables. Phase VI : Phase de dclin : - Les conditions de culture srieusement dfavorables. - Il y a mort des bactries ( < zro). - Existence possible de formes de rsistance (spores) pour les souches qui sporulent.
Phase II : Phase dacclration :
- Phase intermdiaire entre la phase de latence et la phase exponentielle. - Il y a acclration du rythme de division bactrienne (passe de zro et tend vers max).
Phase IV : Phase de ralentissement :
- Phase intermdiaire entre la phase exponentielle et la phase stationnaire ( passe de max et tend vers zro).. - Il y a ralentissement du rythme de division bactrienne.
3) La phase de latence dpend :
- De la nature et la richesse du milieu. Pour un milieu riche (naturel) cette phase est courte ou inexistante alors que pour un milieu pauvre (synthtique) elle est longue. Dans le cas de lexercice la phase de latence est justifie par le passage dun milieu riche et naturel (glose nutritive) un milieu plus pauvre et synthtique (milieu M).
4) La phase stationnaire est conditionne par :
- Lpuisement du milieu en nutriments tels que la source de carbone (ex : Glucose dans ce cas). - Laccumulation de produits toxiques qui ne sont pas ncessairement des dchets mais peuvent tre tout simplement des produits mtaboliques ( ex : thanol pour la fermentation alcoolique) qui deviennent inhibiteurs partir dune certaine concentration. - Le dveloppement dun quilibre physico-chimique dfavorable. Ex : variation du pH du milieu, variation de loxygnation du milieu etc. - Le remplissage du volume du rcipient disponible (il ny a plus despace pour les bactries).
5) Les trois paramtres ncessaires et suffisants pour caractriser la croissance sont :
Le taux de croissance maximum (max), min et la croissance totale (Ns N0). - max est calcul au niveau de la phase exponentielle (Figure 1) par projection sur les axes du graphe. max = log2 N2 log2 N1 / t2 - t1. Sa valeur numrique est environ 2 heure-1. - min = 1 / max = 1 / 2 = 0,5 heure ou 30 minutes. - Ns N0 : Se calcule partir des valeurs sur la Figure 1. Ns = nombre de bactries en phase stationnaire et N0 = nombre de bactries initiales. Sachant que si log2N = x donc N = 2x . N0 = 221 = 2 . 106 u.f.c / ml Ns = 225,5 = 47,45 . 106 u.f.c / ml Ns N0 = (47,45 2) . 106 = 45,45 . 106 u.f.c / ml
Exercice II : 1) Comparaison de la croissance totale (Ns N0 ) et max pour les concentrations de glucose de 0,5, 4 et 32 g/l.
Dans les conditions exprimentales, la croissance totale (biomasse produite) est
directement proportionnelle la concentration du glucose : Plus la concentration du glucose augmente plus la quantit de biomasse produite augmente.
Pour max et donc min, lvolution des courbes max = f([Glucose]) et min = f([Glucose]) sur la figure 4 montre lexistence de 2 phases : - Phase I : - 0 g/l < [Glucose] > 4 g/l. - max augmente et min diminue lorsque la concentration du glucose augmente. - Le glucose est donc considr ici comme facteur limitant la croissance. - Phase II : - [Glucose] 4 g/l. - max constant et maximum et min constant et minimum lorsque la concentration du glucose augmente. - Le glucose nest donc pas considr ici comme facteur limitant la croissance.
2) La valeur seuil de limitation est la concentration de glucose de 4 g/l.
Exercice III: 1) Addition du glucose (figure 5a) : - Il y a reprise de la croissance aprs ajout du glucose. Ce dernier est donc puis et constitue dans ce cas le facteur limitant la croissance. - Il y a dmarrage immdiat (pas de phase de latence L2) aprs ajout du glucose. Ceci sexplique par le fait quil sagit du mme substrat (glucose) et donc le mme milieu et que les bactries sont encore jeunes (dbut de la phase stationnaire). - max1 = max2 et CT2 > CT1 (CT = croissance totale). Ceci nest possible que si la [Glucose]1 et [Glucose]2 ne sont pas limitantes et que [Glucose]2 > [Glucose]1 (voir figure 3).
2) Addition du lactose (figure 5b) :
- Il y a reprise de la croissance aprs ajout du lactose. La source de carbone (glucose puis) est donc dans ce cas le facteur limitant la croissance. - Existence dune phase de latence L2 aprs ajout du lactose. Ceci sexplique par le fait quil sagit de substrats diffrents (lactose au lieu du glucose) et donc de milieux diffrents. - max1 et max2 sont diffrents puisquil sagit de substrats diffrents (lactose au lieu du glucose). On peut avoir ce type de courbe pour des cultures en prsence de co-substrats carbons (ex :glucose et lactose ou glucose et peptones). Le glucose plus simple est dabord utilis par les bactries avant dattaquer le deuxime substrat plus complexe (lactose ou peptone).
