DISRUPCIN CELULAR

Operaciones y Procesos Biotecnolgicos II

DISRUPCIN CELULAR

Objetivos de Operaciones y Procesos Biotecnolgicos II:

1) Estudiar los procesos habitualmente empleados en la

industria para separar y/o purificar productos de
inters.
2) Evaluar las variables que permiten optimizar los
procesos habitualmente involucrados en la separacin
de residuos insolubles, el aislamiento y la purificacin
de un determinado producto.

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Disrupcin celular

Lpidos

Protenas recombinantes
ADN, ARN

Microorganismo
Productor

Productos de inters liberados

naturalmente al medio

Antibiticos
Enzimas

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Proceso General
Que clase de clula
se quiere destruir?

Conclusiones

Cul es el producto
que queremos
extraer?

Evaluacin
acerca de los
rendimientos
obtenidos

Seleccin del
mtodo de
disrupcin celular
a emplear

Puesta a punto
del mtodo
seleccionado

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Qu es lo que debemos
conocer de la clula a la
hora de diagramar una
disrupcin?

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Membrana Plasmtica
Estructura de la Membrana Plasmtica

- Actualmente el modelo que describe la membrana plasmtica es el del

mosaico fluido.

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Membrana Plasmtica
Las principales funciones de la membrana plasmtica son:
Aislar selectivamente el contenido de la clula del ambiente externo.

Regular el intercambio de sustancias entre el interior y exterior celular

(lo que entra y sale de la clula).
Comunicacin intercelular.
Proteccin.
Ayudar a la divisin de compartimientos sub-celular.

Servir de receptores que reconocen seales de determinadas molculas

y transducir la seal al citoplasma.
Servir de sitio estable para la catlisis enzimtica.
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Pared Celular
o La pared celular es una estructura rgida y compleja que
protege a la clula del ambiente, manteniendo su forma y
presin osmtica.
o El tipo de clula con el que se vaya a trabajar es importante:
- bacterias (Gram positivas y Gram negativas)
- hongos y levaduras
- clulas vegetales (plantas y algas)

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Pared Gram Positiva

- La red de murena (peptidoglicano) esta
muy desarrollada (puede presentar hasta
50 capas).
- Es frecuente la presencia de los
aminocidos L-diaminopimlico o de
lisina.
- En ella se encuentran cidos teicoicos y
lipoteicoicos.
- No presentan lipo-polisacridos.
- Presentan una sola bicapa lipdica.
- Presentan bajo contenido proteico.
- Alto contenido de lpidos.

Staphylococcus
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Pared Gram Negativa

- La red de murena presenta una sola
capa.
- Contiene nicamente mesodiaminopimlico y nunca contiene lisina.
- Hasta ahora no han podido
encontrarse cidos teicoicos o lipoteicoicos.

- Se encuentran grandes cantidades de

lipoprotenas y lipo-polisacridos que
representan hasta el 80 % del peso seco
de la pared celular.
- Tienen dos bicapas lipdicas.
- Presentan porinas en la membranas
externa.

E. Coli

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Pared celular de Hongos y Levaduras

- Es una estructura muy gruesa (100-200 nm)
- Representa del 15-25% del peso celular en base seca.
- La pared celular esta compuesta por dos capas de polisacridos, una
capa interna transparente y amorfa, constituida principalmente de 1,3 y -1,6-glucanos. En la capa externa se encuentran ubicadas las
mano-protenas, ancladas a la capa interna de -glucanos o bien
atravesndola.

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Pared celular Clulas Vegetales

- Laminilla media: Es el lugar
que une las paredes primarias
de dos clulas contiguas.
- Pared primaria: mide entre
100 y 200 nm de espesor,
compuesta entre un 9 y un
25% de celulosa

- Pared secundaria: (cuando existe) se

relaciona con la especializacin de cada tipo
celular. A diferencia de la pared primaria,
contiene una alta proporcin de celulosa,
lignina y/o suberina. Operaciones y Procesos Biotecnolgicos II
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Clula animal (carece de pared celular)

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Dificultad Para la Disrupcin Celular

Clulas Animales
Micelios
Bacilos Gram (-)
Bacilos Gram (+)
Clulas Vegetales
Levaduras
Cocos Gram (-)
Esporas

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Mtodos de Disrupcin Celular

Mtodos no mecnicos:
Rompen las cubiertas celulares induciendo la lisis celular, a travs
de medios qumicos, fsicos o enzimticos.
- Por lo general son menos
severos que los mecnicos.

- Por s mismos, estos mtodos

no suelen ser muy eficientes.

- No generan grandes daos

a las clula, facilitando la
posterior purificacin del
producto de inters.

- Pocos mtodos no mecnicos

pueden llegar a ser escalados
exitosamente.

- Son mas especficos.

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Mtodos no-mecnicos
Dentro de estos tipos de mtodos podemos clasificar tres
sub-clases principales:
1) Mtodos qumicos

2) Mtodos fsicos

3) Mtodos enzimticos

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Mtodos no-mecnicos
1) Mtodos Qumicos
Tratamiento con solventes orgnicos (cloroformo, tolueno)
Los solventes orgnicos permeabilizan las membranas celulares disolviendo
componentes hidrofbicos de la pared, como los fosfolpidos de la membrana
interna en bacterias Gram (-).
Tratamiento con lcalis (hidrxido de sodio)
Se produce la saponificacin de los lpidos de las membranas. Es una tcnica muy
severa pero efectiva y de bajo costo, siempre y cuando el producto de inters sea
resistente a la degradacin a pH elevados.
Tratamiento con cidos (cido clohdrico)
Tratamientos con HCl 6N han logrado hidrolizar diferentes tipos de clulas. Sin
embargo el proceso es lento (ms de 6 horas) y durante el mismo se pueden
producir la hidrlisis de amino cidos y protenas de inters.
Agentes Caotrpicos (urea, clohidrato de guanidina)
Interfieren con los enlaces no covalentes (puentes de hidrgeno, fuerzas de van
der Walls) desorganizando la estructura del agua hacindola menos hidroflica,
debilitando las interacciones soluto-soluto.
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Mtodos no-mecnicos
1) Mtodos Qumicos
Agentes Quelantes (EDTA):
Este agente quela los iones Ca2+ y Mg2+ que unen los LPS adyacentes
haciendo que se liberen parte de los LPS conteniendo protenas y
fosfolpidos de la membrana (Gram -).

Antibiticos:
Son efectivos contra bacterias Gram (-) (-lactmicos). Distintos
antibiticos causan la lisis por distintos mecanismos. No se utilizan a
gran escala.
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Mtodos no-mecnicos
1) Mtodos Qumicos

Tratamiento con detergentes

La efectividad del mtodo radica en la
qumica del detergente, ya que son
anfipticos.
Forman micelas con los lpidos de las
membranas, desestabilizndolas.
Se clasifican en tres tipos: catinicos
(sales de tetra-alquil-amonio, pH
bsico), aninicos (SDS, pH cido) y
no-inicos (Triton-X,).

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Mtodos no-mecnicos
2) Mtodos Fsicos
Shock osmtico
- Es el mtodo fsico mas simple.
- El estrs osmtico es generado cuando las clulas son situadas en
medios hiper/hipotnicos.
- Las clulas con paredes celulares son mas difciles de romper.

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Mtodos no-mecnicos
2) Mtodos Fsicos
Congelamiento/descongelamiento:
Los cristales de hielo que se forman y crecen durante el congelamiento,
rompen mecnicamente la integridad del interior de la membrana
celular, hacindola mas permeable.

Enfriamiento lento

Enfriamiento rpido

Se ha visto que la congelacin lenta no funciona tan bien como la rpida.

La congelacin rpida lesiona ms especficamente las membranas
celulares produciendo lisis celular.
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Mtodos no-mecnicos
2) Mtodos Fsicos
Descompresin:
- Es un proceso por el cual las clulas se mezclan con un gas
presurizado por un tiempo especfico. El gas entra en las clulas y
luego al liberar la presin aplicada el mismo se expande causando
la disrupcin.

Termlisis:
- Es un proceso bastante comn a gran escala. Las clulas son
llevadas a mayores temperaturas con el fin de romper o debilitar la
membrana externa.

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Mtodos no-mecnicos
3) Mtodos Enzimticos
Disrupcin Enzimtica:
- La lisis enzimtica es un mtodo muy
preciso, pero que requiere de una
comprensin precisa de la estructura de
las paredes celulares que se desean
destruir.

Lisozima
(muramidasa)

- La principal limitacin de este mtodo es su elevado costo. La

inmovilizacin puede ser una herramienta til para la reduccin de
costos

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Mtodos no-mecnicos
3) Mtodos Enzimticos
Auto-lisis:
- Es un proceso por el cual las clulas inducen su propia destruccin.
Se produce la activacin de seales que activan la liberacin de
enzimas que degradan las organelas y membranas de las mismas
clulas.

- Por s mismo es un mecanismo lento. Lo que se hace es

transformar cepas a fin de hacer estos sistemas auto-lticos mucho
mas activos, introduciendo genes que codifican antibiticos y
enzimas que degraden mas rpidamente las distintas organelas y
membranas celulares.

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Mtodos de Disrupcin Celular

Mtodos mecnicos:
Se basan en fuerzas de corte (shear stress) que deforman las clulas
hasta el rompimiento de sus cubiertas.
-Suelen ser mas efectivos
que los mtodos qumicos.

- Son inespecficos.

- Generalmente son mas

fciles de escalar que los
mtodos no-mecnicos .

- Requieren mucha energa.

- Generan elevadas temperaturas.

- Pueden llegar a daar productos
lbiles.
- La separacin del producto
deseado de otros materiales (ac.
nucleicos, protenas, trozos de la
pared celular, etc.) puede llegar a
ser dificultosa.
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Mtodos mecnicos
Sonicadores (ultrasonido)
- El ultrasonido utiliza frecuencias entre 20 y 50
kHz.

- Las ondas de ultrasonido crean muchas

micro-burbujas en muchos sitios de nucleacin
dentro de la suspensin celular. Estas microburbujas luego colapsan implosionando
durante
el
perodo
de
rarefaccin
(compresin) de la onda.
- Este fenmeno, denominado cavitacin,
produce un shock de ondas muy intenso,
generando un fuerte estrs local, deformando
al lmite las clulas y produciendo as su
consecuente ruptura.
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Mtodos mecnicos
Homogenizadores de alta presin
Es uno de los mas utilizados para disrupcin celular a gran escala.
Se aplica una elevada presin a una suspensin
de clulas forzndolas a travs de una vlvula,
sometiendo a las clulas a un alto estrs de
corte, rompiendo las membranas.
El mecanismo de disrupcin se dara
por fuerzas de corte en la regin de
la vlvula, cavitacin (debido a las
regiones de baja presin generadas)
y al impacto contra el anillo.

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Mtodos mecnicos
Homogenizadores de alta presin

dR
k Rmax R
dN

Rmax
a
ln

k
N
P

R
max

k ' k Pa
N: nmero de ciclos
P: presin de trabajo
a: constante relacionada a la dureza de la clula
k: constante relacionada a factores del sistema
R: es la cantidad de protena liberada al medio
Rm: es la mxima cantidad de protena posible de
ser liberada

Mtodos mecnicos
Homogenizadores Microfluidizadores (microfluidizer homogenizer)
En los microfluidizadores, el lquido se divide en dos o ms corrientes que se
bombean a elevadas presiones (en algunos equipos ms de 270 MPa) y grandes
velocidades, unas contra otras en un ngulo de 180 cayendo repentinamente
la presin tras chocar ambas corrientes.

El mecanismo de disrupcin realizado por este

equipo genera partculas de mayor tamao que
el homogenizador de alta presin.

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Mtodos mecnicos
Bead mills (molinos de perlas)

- Son de los mas utilizados a

gran escala.

- Bsicamente consiste en un agitador a discos montado sobre un

motor central que gira en una cmara central, la cual es cargada con
esferas de vidrio, metal u otro material.
- Aspectos a considerar al trabajar con estos equipos: tamao de las
esferas (0,2-1,5mm), cantidad y material de las esferas; velocidad de
agitacin; temperatura de trabajo; velocidad de flujo y concentracin de
la suspensin a tratar.
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Mtodos mecnicos
Bead mills (molinos de perlas)

dR
k Rm R
dt

Rm
ln
kt
Rm R

k: constante del modelo

R: es la cantidad de protena liberada al medio
Rm: es la mxima cantidad de protena posible de ser liberada

uL A
k
V

Rm uL A
ln
t

Rm R V

A: rea transversal de la cmara

V: Volumen de la cmara
uL: Velocidad de la suspensin

k k' u p

Rm
ln
k' u p t
Rm R

up: Velocidad de giro de la paleta

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Mtodos mecnicos
Bead mills (molinos de perlas)

dR
k Rm R
dt

Rm
ln
kt
Rm R

Modelos no-lineales

k a1S a2 S a3
2

S a5
k k' 1
b
b

a4
S 1 X

1
3

a5

Rm
2
ln

a
S
a2 S a3 t

1
Rm R

S a6
Rm
ln
k' 1 t
b
Rm R

an: constantes del modelo

S: concentracin celular

an: constantes del modelo

S: concentracin celular
X: grado de disrupcin
b: distancia entre clulas

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Mtodos mecnicos
Bead mills (molinos de perlas)
Modelo de dos etapas

dC
k1 C0 C
dt
dA
k2 AD A
dt

C C0 1 exp k1 t
A AD 1 exp k2 t
C
AD Am
C0

dA
k2 Am 1 exp k1 t A
dt

k1: constantes del modelo

referida a la ruptura celular
k2: constantes del modelo
referida a la liberacin de la
protena
C: concentracin de clulas
destruidas
C0: concentracin de
clulas iniciales

k2 exp k1 t k1 exp k2 t

A Am
k2 k1

A: concentracin de protena liberada

AD: mxima concentracin de protena liberada a partir de las clulas destruidas
Am: mxima concentracin de protena disponibles para ser liberadas

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Mtodos Combinados
Puede verse que los distintos mtodos de disrupcin poseen diversos
principios de accin, lo que hace factible su combinacin de forma
sinrgica para aumentar el rendimiento del proceso en un solo
mtodo combinado.

Mtodos no-mecnicos combinados

Disrupcin mecnica con pre-tratamientos no mecnicos

Evaluacin de la eficiencia de los mtodos de disrupcin

Mtodos directos: Consisten en contar el nmero total de clulas
destruidas e intactas.
- Recuentos en cmara.
- Contadores electrnicos.
- Recuentos en placa.
- Utilizacin de centrfugas analticas.
Mtodos indirectos: Consisten en determinar el grado de
liberacin al medio externo de algn metabolito celular luego de
que las membranas celulares son destruidas (determinacin de
protenas solubles, actividades enzimticas, etc.).
Clculo del Rendimiento Alcanzado
Se determina el rendimiento alcanzado en funcin de la eficiencia de los
mtodos realizados, teniendo en cuenta no solo la disrupcin celular o
el porcentaje de producto recuperado, sino tambin las condiciones
operativas que se necesitaron para llevarlo a cabo.

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Conclusiones
- Existen distintas clases de microorganismos productores con una
gran diversidad de metabolitos de inters.
- Existen una gran diversidad de mtodos de disrupcin.
- Cada mtodo posee diferentes principios de accin, por lo que
presentan una serie de ventajas y desventajas frente a los dems.
- Necesidad de desarrollar y poner a punto tcnicas que permitan
la determinacin de la eficiencia de los mtodos utilizados.
- No existen protocolos universales de disrupcin celular.

CUL ES EL MEJOR MTODO?

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