MODUL 8

TEKNIK ASEPTIK DAN PEMBUATAN BIAKAN MURNI

I.

PRINSIP KERJA
Prinsip dari percobaan ini adalah membuat biakan murni dari acetobacter dengan
menerapkan teknik aseptic dan dengan melakukan transfer biakan. Praktikan harus
menyediakan media LB sebagai tempat menumbukan acetobacter. Setelah induk biakan
murni dari acetobacter bertumbuh biak, induk tersebut dipindahkan ke wadah media LB lain
untuk ditumbuhkan biakan murninya. Dalam melakukannya, harus dilakukan sesteril mungkin
dan bebas dari kontaminasi yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri dengan cara
memanaskan alat, dilakukan dengan cepat dan efisien, dan dilakukan di laminar flow (tempat
yang steril).

II. DATA TABEL PENGAMATAN

HARI PERTAMA
1. Menimbang Lucia Bertani sebanyak 1.25 gram dan meletakkannya ke dalam labu
Erlenmeyer
2. Melarutkan LB dengan 50 ml aquades dan mengaduknya hingga rata
3. Menutupnya dengan alumunium foil dan wrap plastic
4. Memanaskannya ke dalam air yang sedang dimasak selama 15 menit setelah mendidih/
mengeluarkan bunyi
5. Mematikan pemanas air dan mendinginkannya selama 5 menit
6. Menuangkan LB yang telah dimasak tersebut ke dalam 4 tabung reaksi: A, B, C dan D
masing-masing 10 ml di laminar flow dengan memanaskan alat untuk proses
pemindahan (seperti jarum ose, bibir tabung, tabung reaksi, gelas ukur, dan pipet)
dengan labu spiritus sesudah dan sebelum prosedur.
7. Memasukkan bakteri acetobacter secukupnya kedalam tabung reaksi A dan B dengan
jarum ose yang telah disterilkan
8. Langsung menutup keempat tabung reaksi dengan alumunium foil dan diikat karet
dalam laminar flow
9. Melakukan inkubasi selama 24 jam
10.Mengamati keempat tabung reaksi
HARI KEDUA
1. Mengamati perubahan yang terjadi pada keempat tabung reaksi
2. Membuka alumunium foil pada tabung A dan C pada laminar flow
3. Memanaskan bibir tabung reaksi A, bibir tabung reaksi C, dan jarum ose
4. Memindahkan acetobacter pada tabung A ke tabung C dengan jarum ose
5. Membakar kembali tabung reaksi A, bibir tabung reaksi C, dan jarum ose
6. Menutup kembali tabung A dan C dengan alumunium foil
7. Mengocoknya selama 30 menit
8. Membuka alumunium foil pada tabung B dan D pada laminar flow
9. Memanaskan bibir tabung reaksi B, bibir tabung reaksi D, dan pipet
10.Memindahkan acetobacter pada tabung B ke tabung D dengan pipet
11.Membakar kembali tabung reaksi B, bibir tabung reaksi D, dan pipet
12.Menutup kembali tabung B dan D dengan alumunium foil
13.Mengocoknya selama 30 menit
14.Menginkubasinya selama 24 jam
HARI KETIGA
1. Mengamati perubahan yang terjadi pada keempat tabung reaksi

III.TEORI DASAR
LUCIA BERTANI
LB merupakan media kultur bakteri banyak digunakan saat ini tetapi memiliki asal-usul dalam
bidang genetika bakteriofag. Giuseppe Bertani menciptakan resep LB ketika mencoba untuk
mengoptimalkan pembentukan plak pada strain indikator Shigella (Bertani, 1952). Menurut
Bertani, LB telah banyak disalahartikan untuk berdiri untuk "Luria Broth", "Luria-Bertani"

menengah, dan "Lennox Broth"; Namun, singkatan awalnya berdiri untuk "Lysogeny Broth"
(Bertani, 2004). Bentuk agar medium harus ditunjuk LA tetapi sering disebut sebagai LB.
Meskipun awalnya dikembangkan untuk studi bakteriofag dan pertumbuhan Shigella, LB
kemudian menjadi media pilihan untuk pertumbuhan Escherichia coli dan spesies enterik
lainnya yang terkait.
Untuk 1 liter Lucia Bertani, bahan yang digunakan adalah Tryptone (10 g), Yeast Extract
(5 g), dan NaCl (10g) (Sambrook and Russell, 2001 Gerhardt, et al. 1994). Di laboratorium
pengajaran mikrobiologi sarjana, LB kadang-kadang digunakan sebagai permukaan
pertumbuhan saat mencoba untuk menganalisis bakteri morfologi koloni
ACETOBACTER
Acetobacter aceti adalah bakteri gram negatif yang bergerak menggunakan peritrichous
flagela . Louis Pasteur membuktikan hal itu menjadi penyebab konversi alkohol untuk asam
asetat pada tahun 1864. Acetobacter adalah sebuah genus bakteri penghasil asam asetat,
ditandai dengan kemampuannya mengubah etanol (alkohol) menjadi asam asetat (asam
cuka) dengan bantuan udara. Ada beberapa bakteri dari golongan lain yang mampu
menghasilkan asam asetat dalam kondisi tertentu, namun semua anggota genus Acetobacter
dikenal memiliki kemampuan ini.
Acetobacter adalah mikroorganisme jinak yang hadir di mana-mana di lingkungan, yang
ada di beralkohol relung ekologi yang meliputi bunga, buah-buahan, lebah madu , serta air
dan tanah. Acetobacter hidup di mana pun fermentasi gula terjadi. Yang terbaik tumbuh di
suhu yang berkisar 25-30 derajat Celcius dan pH yang berkisar 5,4-6,3. Untuk waktu yang
lama telah digunakan dalam industri fermentasi untuk menghasilkan asam asetat dari alkohol
. Acetobacter aceti adalah. aerob obligat yang berarti bahwa ia memerlukan oksigen untuk
tumbuh; hanya memiliki kemampuan untuk metabolisme pernapasan.
TEKNIK ASEPTIK
Aseptik berarti tidak adanya pathogen pada penyakit. Menurut Crow dalam Wina Jivika P
(2007)teknik aseptik adalah usaha mempertahankan sampel sedapat mungkin bebas dari
mikro organisme. Sedangkan menurut Hinchliff dalam Dwi Handayani (2003), teknik aseptik
adalah metode penjagaan yang digunakan dalam setiap tindakan yang membawa resiko
masuknya mikroorganisme ke dalam tubuh pasien.
Teknik aseptik diperlukan dalam bekerja dengan suatu biakan mikroba murni dan untuk
menjaga/memelihara kesterilan suatu media atau larutan. Dengan teknik aseptic, ahli-ahli
bioteknologi dapat mencegah kontaminasi biakan atau larutan oleh mikroba yang tidak
diinginkan. Banyak cawan petri dan plate kultur jaringan yang digunakan untuk menumbuhbiakan mikroorganisme terbuat dari bahan yang telah disterilkan oleh produsennya, pengisian
peralatan-peralatan ini dengan media steril membutuhkan teknik aseptic. Teknik aseptic yang
benar juga melindungi peneliti di bidang bioteknologi dari kontaminasi biakan-biakan yang
berpotensi pathogen. Termasuk dalam teknik aseptic adalah menghindari kontak antara
biakan murni, media steril, dan permukaan steril peralatan bejana dengan mikroorganisme
kontaminan. Untuk mencapai tujuan ini : (1)Tempat kerja harus dibersihkan dengan larutan
antiseptic untuk mengurangi jumlah kontaminan potensial (2)Peralatan disterilkan sebagai
contoh batang ose disterilkan melalui pemanasan dengan pembakar Bunsen sebelum dan
setelah transfer biakan dan (3) Pekerjaan dilakukan secara cepat dan efisien untuk
mengurangi waktu kontak dimana kontaminasi pada biakan atau pekerja laboratorium dapat
terjadi
TRANSFER BIAKAN
Langkah-langkah yang biasa dilakukan dalam transfer biakan dari satu bejana/tabung ke bejana lain
adalah sebagai berikut: (1) Menempelkan jarum ose ke api, (2) Membuka dan menempelkan mulut
tabung biakan ke api, (3) Menggunakan jarum ose, sejumlah biakan diambil dan dipindahkan ke media
segar (4 Menempelkan mulut tabung biakan kea pi dan tabung ditutup kembali (5) Menempelkan
kembali jarum ose ke api
PERTUMBUHAN BAKTERI

Bakteri dapat tumbuh dan berkembang biak dengan cepat bila

dalam keadaan yang menguntungkan. Pertumbuhan bakteri dapat
dibagi menjadi empat fase, yaitu:
1. Fase Adaptasi (Lag Phase)
Merupakan periode penyesuaian diri bakteri terhadap lingkungan
dan lamanya mulai dari satu jam hingga beberapa hari. Lama
waktu ini tergantung pada macam bakteri, umur biakan, dan
nutrien yang terdapat dalam medium yang disediakan. Pada fase
ini bakteri beradaptasi dengan lingkungan, belum mampu
mengadakan pembiakan, terapi metabolisme sel bakteri meningkat
dan terjadi perbesaran ukuran sel bakteri.
2. Fase Pertumbuhan (Log Phase)
Fase ini merupakan periode pembiakan yang cepat dan merupakan periode yang didalamnya dapat
teramati ciri khas sel-sel yang aktif. Selama fase ini pembiakan bakteri berlangsung cepat, sel-sel
membelah dan jumlahnya meningkat secara logaritma sesuai dengan pertambahan waktu, beberapa
bakteri pada fase ini biasanya menghasilkan senyawa metabolit primer, seperti karbohidrat dan
protein. Pada kurva, fase ini ditandai dengan adanya garis lurus pada plot jumlah sel terhadap waktu.
3. Fase Stasioner (Stationer Phase)
Fase ini merupakan suatu keadaan seimbang antara laju peryumbuhan dengan laju kematian, sehingga
jumlah keseluruah bakteri yang hidup akan tetap. Beberapa bakteri biasanya menghasilkan senyawa
metabolit sekunder seperti antibiotika dan polimer pada fase ini.
4. Fase Kematian (Death Phase)
Pada fase ini, laju kematian bakteri melampaui laju pembiakan bakteri. Hal ini disebakan karena
habisnya jumlah makanan dalam medium sehingga pembiakan bakteri terhenti dan keadaan
lingkungan yang jelek karena semakin banyaknya hasil metabolit yang tidak berguna dan mengganggu
pertumbuhan bakteri.
IV. Analisis
Percobaan
Praktikum Teknik Aseptik dan Pembuatan Biakan Murni ini bertujuan untuk mempraktikan teknik
aseptic dan pembuatanm biakan murni. Namun, praktikan hanya melakukan praktikum teknik aseptic.
Dengan metode aseptic, diharapkan tidak ada kontaminan yang mampu mengganggu pertumbuhan
bakteri yang ingin dibiakan dan memperbesar kemungkinan pertumbuhan bakteri yang diinginkan saja.
Praktikan mengembangbiakan bakteri acetobacter dalam media Lucia Bertani dan menerapkan proses
transfer biakan serta teknik aseptic.
Di hari pertama, praktikan menimbang Lucia Bertani sebanyak 1.25 gram dan meletakkannya ke
dalam labu Erlenmeyer. Menggunakan 1,25 gram Lucia bertani karena dalam proses pembuatan media,
konsentrasi Lucia bertani yang ideal adalah 0.025M. Dengan volume aquades yang ditambahkan 50 ml,
maka hanya dibutuhkan 1,25 gram Lucia Bertani. Praktikan kemudian melarutkan LB dengan 50 ml
aquades dan mengaduknya hingga rata. Pengadukan dilakukan untuk menhomogenkan nutriten Lucia
Bertani dalam aquades. LB perlu dilarutkan karena media yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri
pada praktikum ini adalah media LB cair. Bakteri yang tidak punya akar (seperti acetobacter) harus
berada pada permukaan larutan makanan yang cair. Air sangat penting bagi organisme bersel tunggal
sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke dalam sel. Pembuatan
medium sebaiknya menggunakan air suling karena air sadah umumnya mengandung ion kalsium dan
magnesium yang tinggi. (Hadioetomo, 1993).
Setelah itu, praktikan menutupnya dengan alumunium foil dan wrap plastic. Hal ini dilakukan agar
tidak ada udara dan kontaminasi dari senyawa di udara yang mampu mempengaruhi kesetrilan media.
Selanjutnya, praktikan memanaskannya ke dalam air yang sedang dimasak selama 15 menit setelah
mendidih/ mengeluarkan bunyi. Hal ini dilakukan untuk mempercepat pelarutan dari LB dan
menghilangkan kontaminan-kontaminan seperti bakteri lain dalam media cair LB dan labu Erlenmeyer
(Volk, 1993). Sterilisasi yang digunakan dalam percobaan ini adalah secara fisika yaitu menggunakan
panas, dimana panas yang digunakan adalah bersama uap air yang biasanya disebut sterilisasi basah.
Setelah matang, pemanas air dimatikan dan media LB cair didinginkan selama 5 menit. Hal ini
dilakukan agar suhu pada saat bakteri dimasukkan ke media LB tidak terlalu panas dan sesuai dengan
suhu ruang yaitu 37

sehingga bakteri tidak mati.

Praktikan kemudian menuangkan LB yang telah dimasak tersebut ke dalam 4 tabung reaksi: A,B,C
dan D masing-masing 10 ml di laminar flow dengan memanaskan alat untuk proses pemindahan

(seperti jarum ose, bibir tabung, tabung reaksi, gelas ukur, dan pipet) dengan labu spiritus sesudah dan
sebelum prosedur. Pemanasan alat-alat tersebut agar proses transfer biakan tersebut steril dari
kontaminan-kontaminan yang tidak diinginkan. Laminar flow memiliki lampu sinar UV yang mampu
mematikan bakteri-bakteri kontaminan. Selain itu, proses transfer biakan dilakukan dengan cepat
sebagai syarat teknik aseptic. Praktikan kemudian memasukkan bakteri acetobacter secukupnya hanya
ke dalam tabung reaksi A dan B dengan jarum ose yang telah disterilkan. Tabung reaksi A dan B
digunakan sebagai wadah pengembangan induk biakan dan tabung C dan D digunakan sebagai wadah
pengembangan biakan murni. Lalu, praktikan langsung menutup keempat tabung reaksi dengan
alumunium foil dan diikat karet dalam laminar flow.
Melakukan inkubasi selama 24 jam. Medium didiamkan atau disimpan selama 24 jam untuk
menyakinkan bahwa medium masih steril, karena selain pH sebagai penentu tumbuhnya mikroba, alat
dan medium yang steril juga menentukan (Dwidjoseputro, 1994). Terakhir, praktikan mengamati
keempat tabung reaksi.
Di hari kedua, setelah mengamati perubahan yang terjadi, praktikan membuka alumunium foil pada
tabung A dan C pada laminar flow. Kemudian praktikan memanaskan bibir tabung reaksi A, bibir tabung
reaksi C, dan jarum ose. Hal ini dilakukan untuk mensterilkan alat-alat untuk transfer biakan tersebut.
Kemudian, praktikan memindahkan acetobacter pada tabung A ke tabung C dengan jarum ose.
Praktikan membakar kembali tabung reaksi A, bibir tabung reaksi C, dan jarum ose dan menutup
kembali tabung A dan C. Lalu, praktikan mengocoknya selama 30 menit. Pengocokan dilakukan untuk
meratakan bakteri di dalam media cair LB, sehingga bakteri tidak terkonsentrasi pada satu tempat dan
berkompetisi untuk mendapatkan nutrisi. Hal ini dilakukan pula pada tabung B dan D. Terakhir,
praktikan kembali menginkubasinya selama 24 jam. Praktikan kembali mengamati perubahan pada hari
ketiga.
Alat dan bahan
Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah Batang inokulasi (jarum ose), Tabung reaksi,
Laminar flow, lampu spiritus dan rak tabung reaksi. Jarum ose digunakan untuk memindahkan bakteri
dari satu media ke media lain (transfer biakan). Tabung reaksi adala wadah untuk media LB dan tempat
perkembangbiakan bakteri acetobacter. Lampu spiritus digunakan untuk memanaskan alat-alat dalam
proses transfer biakan. Rak tabung reaksi digunakan sebagai tempat untuk meletakaan tabung reaksi
selama proses inkubasi.
Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah LB cair, Acetobacter, aquades dan kertas tissue.
Media LB cair (Luria-Bertani: 10 g/L bacto-tryptone; 5 g/L yeast-extract; 10 g/L NaCl) digunakan karena
didalamnya memiliki kandungan nutrisi yang ideal yang dibutuhkan oleh pertumbuhan bakteri. Selain
itu, larutan lucia Bertani bewarna bening sehingga dapat mempermudah pengamatan pertumbuhan
bakteri dan kekeruhannya dapat dengan mudah diamati. Kekeruhan menandakan adanya proses
metabolisme bakteri. Acetobacter digunakan karena bakteri tersebut bukanlah bakteri yang pathogen
dan mampu berkembangbiak pada suhu kamar tanpa perlakukan khusus. Kertas tissue digunakan
untuk membersihkan alat dari air dalam proses pencucian alat. Aquades digunakan untuk melarutkan
LB cair
Hasil Pengamatan
Pertumbuhanbakteri dalam percobaan ini diliat dari meningkatnya jumlah sel yang konstituen (yang
menyusun). Pada pengamatan hari pertama, setelah dimasukkan bakteri acetobacter ke dalam tabung
A dan B, keempat tabung reaksi masih berisi LB cair bening, yang menandakan bakteri di tabung A dan
B belum melakukan metabolismenya dan tidak adanya bakteri di tabung C dan D.
Pada hari kedua, setelah diinkubasi 24 jam, pada tabung reaksi A, C, dan D, warna media LB cair
menjadi keruh, namun pada tabung reaksi B masih bening. Hal ini menandakan pada A,C, dan D,
terdapat proses metabolism oleh bakteri dan bakteri bertumbuh. Namun, karena hanya A dan B yang
berisi bakteri, dapat dipastikan pada tabung C dan D berisi bakteri kontaminan/bukan acetobacter. Hal
ini dapat terjadi karena adanya proses kontaminasi. Pada keempat tabung reaksi, terdapat endapan
putih didasar tabung reaksi, Enndapan putih inis eperti serabut-serabut tipis layaknya kapas. Hal ini
terjadi karena hasil sampingan metabolism penguraian nutrient yang menandakan adanya perebutan
nutrien. Pda tabung B, endapan putih tersebut relative sedikit. Pada tabung A,C,dan D, terdapat butirbutir putih tipis diatas dalam jumlah yang relative sedikit. Butir-butir putih tipis dipermukaan itu adalah
koloni bakteri hasil pemebalahn biner perkembangan induk biakan
Pada pengamatan selanjutnya yaitu setelah 3x24 jam inkubasi (karena pengamatan di hari terakhir
dilakukan pada hari senin), terlihat endapan putih cukup tebal di permukaan media LB tabung A dan C,
itu adalah koloni bakteri acetobacter dan hasil metabolismenya. Pada tabung B dan D, tidak terbentuk
endapan putih diatas. Timbul bau yang sangat tajam pada tabung C dan D yangmenandakan adanya
proses penguraian nutrisi oleh bakteri.
Kesalahan
Kesalahan-kesalahan pada percobaan ini terjadi karena masih terdapatnya kontaminan-kontaminan
dan kurang sterilnya dalam alat dan bahan. Selainitu, pada saat percobaan, salah satu lampu sinar UV
pada laminar flow mati yang dapat meningkatkankemungkinan pertumbuhan bakteri yang tidak

diinginkan. Kurang cepatnya praktikan melakukan proses transfer biakan juga meningkatkan
kemungkinan kontaminan-kontaminan. Penutupan dengan alumunium foil yang kurang kencang juga
dapat mempengaruhi percobaan.

V. Kesimpulan
1. Pembuatan biakan murni dan transfer biakan harus dilakukan dengan menerapkan
teknik aseptic
2. Teknik aseptic meminimalisir adanya kontaminan yang tidak diinginkan dalam
pembiakan bakteri
3. Pertumbuhan bakteri dapat dilihat dari kekeruhan media LB, endapan putih dalam
media, dan bau yang dihasilkan
4. Kontaminasi dapat terjadi karena ketidaksterilan alat dan udara di lingkungan
5. Bakteri dalam media LB membentuk koloni dan tersebar secara merata

VI.

Referensi

Azhar, M. 1996. Kloning dan Penentuan Urutan Nukleotida Mutan sal4-13, Saccharomces
cereviseae. Tesis Program Master. Jurusan Kimia. Program Pascasarjana Institut Teknologi
Bandung.
Becker, J.M., Caldwell, G.A., and Zachgo, E. A., 1996. Biotechnology: A Laboratory Course. 2nd
ed.USA: Academic Press.
Bertani, G. 1952. "Studies on Lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic
Escherichia coli." J. Bacteriology, 62:293-300
Bertani, G. 2004. "Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental
systems." J Bacteriology, (186):595-600
Bonang, G. dan S. Enggar. Mikrobiologi kedokteran untuk Laboratorium dan Klinik. Gramedia.
Jakarta. 1982
Dwidjoseputro, D, 1994, Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.
Gerhardt, P., R.G.E. Murray, W.A. Wood and N.R. Krieg. 1994. "Methods for General and
Molecular Bacteriology." ASM Press, Washington, D.C.
Hadioetomo, R. , 1993, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi, Gramedia:
Jakarta.
Lim,D, 1998, Microbiology, 2nd Edition, McGrow-hill book, New york.
Sambrook, J and D.W. Russell. 2001. "Molecular Cloning, a Laboratory Manual." Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd
edition. Vol. 1-3. USA : Cold Spring Harbor Laboratory
Schegel, G.H, 1993, General Microbiologi seventh edition, Cambrige University Press, USA.
Suriawiria, U, 2005, Mikrobiologi Dasar, Papas Sinar Sinanti, Jakarta.
Volk & Wheeler, 1993, Mikrobiologi Dasar Jilid 1 Edisi kelima, Erlangga: Jakarta.
Volk and Wheeler. Mikrobiologi Dasar. Jilid 2 edisi V. Diterjemahkan oleh Sumarto
Adisumartono. Penerbit Erlangga. Jakarta. 1990