PRUEBAS BIOQUIMICAS

Las pruebas bioqumicas consisten en distintos test qumicos aplicados a

medios biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, nos permiten identificar
distintos microorganismos presentes en un determinado cultivo.
Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la
actividad de una va metablica a partir de un sustrato que se incorpora en un
medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.
Para realizar las pruebas bioqumicas se dispone de mltiples medios, los cuales
se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.
Entre las pruebas bioqumicas de mayor relevancia encontramos:
Prueba de la Oxidasa
En microbiologa la prueba de la oxidasa se utiliza como una
caracterstica fenotpica en la identificacin de cepas bacterianas pues
determina si la bacteria produce citocromo oxidasa y por lo tanto utiliza
oxgeno en la cadena de transporte de electrones.
El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la
enzima Citocromo C oxidasa. Esta se detecta utilizando el tetraparafenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a
ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora,
pero cuando se oxida cambia a color prpura.

Identificar todas las especies de Neisseria (+)

Diferenciar Pseudomonas de los miembros
las enterobacterias.

oxidasa

negativos

de

Prueba Catalasa
La catalasa es
una enzima perteneciente
a
la
categora
de
las oxidorreductasas que
cataliza la
descomposicin
del perxido de
hidrgeno (H202) en oxgeno y agua; El perxido de hidrgeno es un residuo

Pruebas bioqumicas para bacterias.

MICROBIOLOGIA.
Esp. Aura M. Muoz

La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para

del metabolismo celular de muchos organismos vivos y tiene entre otras una
funcin
protectora
contra
microorganismos
patgenos,
principalmente anaerobios, pero dada su toxicidad debe transformarse
rpidamente en compuestos menos peligrosos. Esta funcin la efecta esta
enzima que cataliza su descomposicin en agua y oxgeno. La prueba se
considera como positiva si observamos burbujas de oxgeno.

Prueba Coagulasa

La coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo

resultante se llama estafilotrombina, y permite que la enzima proteasa
convierta el fibringeno en fibrina. Esto hace que se coagule la sangre.
La prueba de la coagulasa se usa para diferenciar el Staphylococcus
aureus del coagulase-negative staphylococci. S.aureus produce 2 formas de
coagualasa (por ejemplo, coagulasa ligada y coagulasa libre). La coagulasa
ligada se puede detectar mediante la realizacin de una prueba de
portaobjetos y la coagulasa libre con una prueba de coagulasa de tubo.
Prueba del portaobjetos se hace conjuntamente con un control negativo para
descartar auto aglutinacin. Se ponen 2 gotas de solucin salina en el
portaobjetos microscpico rotulado con un nmero de muestra, Test (T) y
control (C). Las 2 gotas son emulsionadas con la prueba de organismo
mediante el uso de un palo de madera. Se pone una gota de plasma (plasma
de conejo con anticoagulante EDTA), en la gota de solucin salina inoculada
correspondiente a la prueba y se mezcla bien con un una varilla de madera.
Agitar el portaobjeto con cuidado unos 10 segundos.

Si es positivo: Se podr observar aglutinacin macroscopica en el plasma

en los 10 segundos mientras que no se observara aglutinamiento en la gota
de solucin salina.

Pruebas bioqumicas para bacterias.

MICROBIOLOGIA.
Esp. Aura M. Muoz

La coagulasa es una protena producida por varios microorganismos que

permite la conversin del fibringeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para
distingir entre diferentes tipos de Staphylococcus. Un resultado de coagulasa
positivo indica que la muestra contiene S. aureus.

Si es negativo: No se observara aglutinamiento.

NOTA: Si la prueba de la coagulasa de portaobjetos fuera negativa, debera

hacerse una prueba de tubo como confirmacin. El aglutinamiento en las dos
gotas es un indicativo de auto aglutinacin y por lo tanto debemos descartar
la prueba de tubo.

Prueba del tubo de ensayo: se utiliza plasma que ha sido incoculado con una
colonia de staphylococcal; Luego el tubo se incuba a 37 grados Celsius en 1
horas. Si es negativo entonces continuamos la incubacin por unas 18 horas.

Si sale positivo (por ejemplo, la colonia problema es S. aureus), el suero

coagular, dando como resultado un cogulo (a veces el cogulo esta
tan desarrollado que el lquido se solidifica completamente).
Si sale negativo, el plasma permanece lquido.

Prueba IMVIC
El IMVIC se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de metilo, VogesProskauer y Citrato. Su finalidad es identificar un organismo del grupo de
los coliformes. La presencia de estos indica contaminacion fecal.
La prueba
del
indol:
es
una prueba
bioqumica realizada
en especies bacterianas para determinar la habilidad del organismo de
romper el indol del aminocido triptfano.
Mediante esta prueba se detecta la liberacin de indol en un cultivo
bacteriano. Dicha liberacin se debe a la degradacin del aminocido
triptfano mediante el enzima triptofanasa.
Para la realizacin de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas
en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante
triptfano). Para la posterior deteccin del indol se usa el reactivo de Kovacs
que se puede preparar con los siguientes ingredientes:

Pruebas bioqumicas para bacterias.

MICROBIOLOGIA.
Esp. Aura M. Muoz

Alcohol amlico o isoamlico (puede sustituirse por alc.butlico)........150ml

p-dimetilamino-benzaldehdo..........................................................10g
HCl (concentrado).........................................................................50ml

Se disuelve primero el aldehdo en el alcohol y despus se agrega lentamente

a esta mezcla el cido. Para el control de calidad del reactivo se pueden
utilizar cultivos conocidos. Las ms convenientes son Escherichia coli (indol+) y
todas las especies de Klebsiella (indol-).

Rojo de Metilo: es un indicador de pH. Acta entre pH 4,2 y 6,3 variando desde
rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite determinar la formacin
de cidos orgnicos que se producen durante la fermentacin de un
carbohidrato. El microorganismo en estudio se cultiva en un caldo de cultivo
con algn carbohidrato fermentable, el ms comn es la glucosa aunque se
pueden utilizar otros carbohidratos como lactosa, sacarosa, manitol, etc,
adicionado con el rojo de metilo como indicador de pH. Una reaccin
positiva, es decir, el viraje del medio a un color rojo, indica que el
microorganismo realiza la fermentacin de la glucosa por la va cido-mixta y
el pH del medio se torna hasta 4.2 por la gran cantidad de cidos orgnico
producidos. Una prueba negativa no cambia el color del medio (color
amarillo)

Pruebas bioqumicas para bacterias.

MICROBIOLOGIA.
Esp. Aura M. Muoz

Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al aadir al medio 5 gotas del

reactivo de Kovacs, se producir un anillo de color rojo en la superficie del
caldo y la prueba ser considerada positiva. Si esto ocurre despus de 24
horas, la prueba se considera completa, pero si es negativo deber incubarse
otras 24 horas y repetirse la prueba. Por ello es conveniente hacer siempre la
prueba no en el tubo incubado sino en una porcin de unos 2ml que se retira
de l aspticamente.

Citrato (C): Sirve para determinar si un microorganismo puede crecer utilizando

citrato como nica fuente de carbono debido a la sntesis de la enzima citrato
permeasa la cual permite la introduccin del citrato al interior de la clula, una
vez dentro, el citrato es incorporado al ciclo de los cidos tricarboxilicos o ciclo
de Krebs. Se hace crecer al microorganismo en estudio en caldo citrato. Un
resultado positivo es cuando se observa turbidez en el tubo, debido al
crecimiento bacteriano. Un resultado negativo es cuando no se observa
crecimiento. Actualmente el medio ms utilizado es el Agar Citrato de
Simmons un medio slido en tubo con pico de flauta el cual posee un
indicador de pH (azul de bromotimol) si el microorganismo es capaz de crecer,
producir cidos orgnicos provenientes de la utilizacin del citrato, el medio
se alcaliniza y el indicador vira a color azul, esto ser un resultado positivo, el
medio sin inocular es de color verde, de esta manera un resultado negativo no
habr crecimiento y el color seguir siendo verde.

Pruebas bioqumicas para bacterias.

MICROBIOLOGIA.
Esp. Aura M. Muoz

Voges-Proskauer (VI): Algunos microorganismos producen acetona o acetil

metil carbinol por descarboxilacin de dos molculas de cido pirvico
(producto final de la gluclisis). La acetona es un producto intermedio de la
fermentacin, la cual en un medio fuertemente alcalino (NaOH o KOH) y en
presencia de Oxgeno se oxida a diacetilo. El diacetilo reacciona con
compuestos que contengan ncleos de guanidina, como la arginina, presente
en el medio (peptona por ejemplo), y da un compuesto color rojo-rosadoviolceo.
Esta
prueba
caracteriza
a
ciertas
especies
de
las
Enterobacteriaceae, e indicar que la glucosa es fermentada por la va
butanodilica.

Prueba Agar TSI

Esta prueba se recomienda para la identificacin de patgenos entricos
gram negativos. Se emplea para detectar la fermentacin de lactosa,
sacarosa y glucosa, con formacin de cido y gas, y tambin para detectar
produccin de cido sulfhdrico.
En este medio la concentracin de glucosa es la dcima parte de la
concentracin de la lactosa y la sacarosa, lo cual permite determinar cundo
ste es el nico glcido fermentado. La pequea cantidad de cido
producido por la fermentacin de la glucosa es rpidamente oxidado en el
bisel donde hay abundancia de oxgeno, quedando el color rojo
correspondiente a un medio alcalino; por el contrario, en el taco donde la
tensin de oxgeno es baja, la reaccin cida se mantiene.
Para que las reacciones antes indicadas ocurran, el medio tiene que estar en
un tubo que permita un fcil acceso del aire, por lo que debe estar provisto de
un tapn de algodn flojo.
Procedimiento
Realice una puncin en el taco y una estra en el bisel. Incube a 35C.
Observar a las 18-24 horas, ni menos ni ms.
Resultados
Taco cido (amarillo): Glucosa fermentada.
Bisel cido (amarillo): Lactosa y/o sacarosa fermentada.
Taco cido (amarillo): Glucosa fermentada.

Taco alcalino (rojo) y bisel alcalino (rojo): Ninguno de los tres glcidos es
fermentado
La aparicin de burbujas en el taco indica que la fermentacin se ha
efectuado con produccin de gas y un ennegrecimiento en el medio indica la
produccin de cido sulfhdrico

A. Glucosa, lactosa y/o sacarosa fermentada

Pruebas bioqumicas para bacterias.

MICROBIOLOGIA.
Esp. Aura M. Muoz

Bisel alcalino (rojo): Lactosa y/o sacarosa no fermentada.

B. Glucosa fermentada con produccin de cido sulfdrico y gas

C. Glucosa fermentada con produccin de cido sulfdrico
D .Ninguno de los tres azcares es fermentado.

Prueba de ureasa
Medio utilizado para la identificacin de microorganismos, en base a la
actividad
uresica.
Es particularmente til para diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la
familia Enterobacteriaceae.
Fundamento
Algunas bacterias son capaces de emplear la urea como nica fuente de
nitrgeno. En tal caso la bacteria ha de poseer un enzima, la ureasa, capaz de
atacar la urea. Al descomponerse se libera amoniaco que alcaliniza el medio.

Sistemas de Identificacion multipruebas (API)

La batera de pruebas API es un sistema de identificacin rpida para

bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram -.
Bsicamente consta de 21 tests bioqumicos estandarizados y miniaturizados, y
una base de datos. Este sistema presenta las ventajas de ser rpido, eficaz y
de permitir realizar numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API contiene 20
microtubos o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una
prueba bioqumica distinta. La prueba nmero 21, la oxidasa, se hace de
forma independiente a la tira.

Pruebas bioqumicas para bacterias.

MICROBIOLOGIA.
Esp. Aura M. Muoz

El medio de cultivo posee un indicador de pH que vira a un color

rosa intenso cuando dicho pH se hace bsico; de esta forma podemos
detectar la produccin de amoniaco y, en ltima instancia, la presencia del
enzima ureasa. El medio de cultivo a emplear es el agar urea.

Prueba
ONPG
ADH
LDC
ODC
CIT
H2S
URE

Reaccin / Enzimas
Beta-galactosidasa
Arginina deshidrolasa
Lisina descarboxilasa
Ornitina descarboxilasa
Utilizacin del citrato
Produccin de H 2 S
Ureasa

TDA
IND
VP

Triptfano desaminasa
Produccin de indol
Produccin de acetona (Voges-Proskauer)

GEL
GLU

Gelatinasa
Fermentacin/oxidacin de glucosa

MAN
INO
SOR
RHA
SAC
MEL
AMY
ARA
OX

Fermentacin/oxidacin de manitol
Fermentacin/oxidacin de inositol
Fermentacin/oxidacin de sorbitol
Fermentacin/oxidacin de ramnosa
Fermentacin/oxidacin de sacarosa
Fermentacin/oxidacin de melobiosa
Fermentacin/oxidacin de amigdalina
Fermentacin/oxidacin de arabinosa
Citocromo oxidasa

Procedimiento
A patir de una colonia bien aislada del microorganismo, hacer una suspensin
en 5 mL de solucin salina (1% de NaCl) o 5 mL de agua estril.
Llenar con la suspensin de bacterias los tubos, no la cpula (cada pocillo
tiene un tubo y una cpula, parte aerobia), de todos los pocillos.
Llenar la cpula de los pocillos CIT , VP, GEL con la suspensin de bacterias.
Cubrir con parafina las cpulas de los pocillos ADH, LDC, ODC, URE, H2S para
obtener anaerobiosis.
Poner la tira en su propia cmara hmeda de incubacin. Previamente poner
agua en los alvolos de la cmara para proporcionar una atmsfera hmeda
durante la incubacin.

Pruebas bioqumicas para bacterias.

MICROBIOLOGIA.
Esp. Aura M. Muoz

Las pruebas de que consta la galeria son las siguientes:

Incubar a 37 C durante 18-24 h.

Tras la incubacin se anotan los resultados inmediatos, es decir, los que no
requieren ser revelados.
Determinadas pruebas requieren ser reveladas, para el revelado se tienen que
tener en cuenta dos criterios:
TDA: Aadir una gota de FeCl3 10 %.
VP: Aadir una gota del reactivo 1 (KOH al 40%) y una gota del reactivo 2 (C2
H5 OH).
IND: Aadir una
cinamaldehido.

gota

de

reactivo

de

Kovacs

de

Dimetilamino-

Oxidasa: Aadir una gota del reactivo (tetrafenilendiamina) recin preparado.

Interpretacion

Prueba
ONPG
ADH
LDC
ODC

Reaccin / Enzimas
Beta-galactosidasa
Arginina deshidrolasa
Lisina descarboxilasa
Ornitina descarboxilasa

Negativo
sin color
amarillo
amarillo
amarillo

CIT

Utilizacin del citrato

verde

H2S

Produccin de H 2 S

URE
TDA

Ureasa
Triptfano desaminasa

IND

Produccin de indol

VP

Produccin de acetona (Vogessin color

Proskauer)

rosa-rojo

GEL

Gelatinasa

sin difusin

difusin
pigmento

azul o verde

amarillo

azul o verde

amarillo

GLU
MAN

Fermentacin/oxidacin
glucosa
Fermentacin/oxidacin
manitol

Positivo
amarillo
rojo o naranja
rojo o naranja
rojo o naranja
azul
oscuro
turquesa

sin precipitado
precipitado negro
negro
amarillo
rojo o naranja
amarillo
marrn-rojo
color rosa o anillo
amarillo
rosa-rojo

de
de

de

Pruebas bioqumicas para bacterias.

MICROBIOLOGIA.
Esp. Aura M. Muoz

La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparacin de los colores de

cada pocillo con los de las tablas de lectura, y anotando el resultado como
positivo o negativo.

INO
SOR
RHA
SAC
MEL
AMY
ARA
OX

Fermentacin/oxidacin
inositol
Fermentacin/oxidacin
sorbitol
Fermentacin/oxidacin
ramnosa

de

Fermentacin/oxidacin
sacarosa

de

Fermentacin/oxidacin
melobiosa
Fermentacin/oxidacin
amigdalina
Fermentacin/oxidacin
arabinosa

de

de
de

de
de

azul o verde

amarillo

azul o verde

amarillo

azul o verde

amarillo

azul o verde

amarillo

azul o verde

amarillo

azul o verde

amarillo

azul o verde

amarillo

Citocromo oxidasa

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Tira API