ACIDUL HIALURONIC

1. Structura, obtinerea si proprietile acidului hialuronic

Structura
Acidul hialuronic este o polizaharid descoperita de Karl Meyer i J.W. Palmer n 1934.
Aceasta polizaharid este compus prin repetarea unor uniti dizaharidice, acidul D-glucuronic
(1,3) i N-acetil-D-glucozamin legate prin legturi glicozidice (1,4) (figura 1), care pot fi ntre
200 20 000 uniti glicozidice pe lan.

Fig 1. Structura HA nativ

Masa sa molecular poate s ajung pn la 10 7 gmol-1. n soluie, moleculele de HA
formeaz o reea continu, foarte hidratat, posednd proprieti reologice, de rezisten, de
presiune osmotic si de excluziune. Aadar, HA este o polizaharid cu mas molecular mare,
fcnd parte din marea familie de polimeri numit glicozoaminoglicani (GAG).
GAG sunt molecule polizaharidice neramificate formate din uniti dizaharidice repetitive
care au pe suprafata lor numeroase sarcini negative date de radicalii sulfat i carboxil. O unitate
repetitiv este formata dintr-un glucid aminat (N-acetil-galactozamina sau N-acetil-glucozamina)
si un acid uronic. Sarcinile negative au urmatoarele roluri:
Atrag ionii de Na+ care vor atrage la rndul lor apa i se va realiza structura de gel
puternic hidratat.
Sarcinile negative se resping ntre ele si prin urmare, moleculele de GAG ocup un
volum mare n raport cu greutatea lor moleculara. n spaii se va gsi faza lichida a
gelului, fapt care permite mobilitatea celulelor, proliferarea i nutriia lor.
Marea majoritate a GAG, cu exceptia acidului hialuronic, se leag covalent de miezuri
proteice, formnd proteoglicani.
Clasificarea GAG se face in 5 clase, n funcie de tipul unitii repetitive, numrul de grupri
sulfat i localizarea lor.
1. Acidul hialuronic (hialuronan), format din acid glucuronic si N-acetil-glucozamina. Este
singurul nesulfatat, deci sarcinile sale negative vor proveni doar de la gruparile carboxil.
2. Dermatan sulfatul, format din acid iduronic si N-acetil-galactozamina
3. Heparina (heparan sulfatul), format din acid iduronic si N-acetil-glucozamina
4. Condroitin sulfatul, format din acid glucuronic si N-acetil-galactozamina
5. Keratan sulfatul este o exceptie, el fiind format din galactoza si N-acetil-glucozamina.

Conformaia zaharidelor individuale din HA este un factor de asemenea important

contribuind la forma general a macromoleculei. Acidul glucuronic si N-acetilglucozamina din
macromolecula de HA apar predominant n forma scaun. Aceasta limiteaza flexibilitatea lanului
zaharidic care este o trstur comun a familiei de polimeri GAG. n funcie de aceste
constrngeri , HA poate avea n soluie pe lng segmentele de caten rigide i segmente foarte
flexibile.
HA este un polimer natural compus din uniti dizaharidice ale acidului glucuronic si Nacetilglucozamina. Masa molecular a HA nativ este de obicei de ordinul milioanelor. Fiecare
unitate dizaharidic a HA conine trei poziii posibile pentru modificare: o grupa hidroxilic, una
carboxilic i alta acetamidic.
Hialuronanul se gsete n matricele extracelulare ale esuturilor vertebratelor, n general,
n asociaie cu proteinele, dar cu precdere n lichidul sinovial, umoarea vitroas a ochilor i in
cordonul ombilical. Rolul su a fost considerat nainte doar acela de a umple spaiile
intracelulare, datorit capacitii sale de a reine apa, ns n prezent este stabilit faptul c HA
intervine n numeroase procese biologice fundamentale cum ar fi: reproducerea, adeziunea,
diferenierea celular i inflamaiile. El este n aceeai msur cunoscut att pentru proprietile
fizico-chimice ct i a celor biologice, proprieti ce depind puternic de lungimea lanului
polimeric. Astfel c, n funcie de lungimea lanului de HA, proprietile acestuia pot fi chiar
antagoniste.

Obinerea
Acidul hialuronic poate fi obinut, prin
extracie din diverse esuturi animale, cum ar fi creasta de coco, cordonul ombilical,
umoarea vitroas a ochiului,
fermentaii bacteriene avnd ca surs familia Streptococcus.
n ambele cazuri el trebuie purificat. HA obinut prin aceste procedee posed o mas
molecular foarte mare care i confer o vscozitate ridicat.
Studiile recente pe oligozaharide HA n complex cu HA degradat enzimatic au artat c i
lanurile scurte de HA pot fi stabilizate ntr-o varietate de conformaii pentru a se lega de
proteine. Aceste observaii conduc la ipoteze cum c proteinele pot aciona pentru organizarea
HA, fixnd i favoriznd anumii conformeri ai polimerului, ducnd la formarea unor structuri
bine ordonate cu funcionaliti specifice. Acest lucru este ilustrat n figura 2 unde trei populaii
distincte de HA sunt vizibile pe o singur celula a muchiului neted. Acestea includ fii de HA
pe suprafaa celular, care sunt asociate cu receptori de HA tip CD44, dar i fire lungi de HA. Pe
suprafaa celulei se mai gsesc i baghete de HA care sunt imunoreactive. Interesant este faptul
c leucocitele mononucleare ader la firele de HA (prin receptorii de tip CD44 de pe suprafaa
celulei) dar nu se asociaz cu fiile sau fibrele de HA, astfel indicndu-se existena unor
populaii de HA diferite din punct de vedere structural i funcional.

Figura 2. Trei populaii diferite de HA ntr-o singur celul de muchi neted

Proprietile soluiei de HA
Proprietile HA sunt greu de determinat cu ajutorul metodelor clasice n care au fost
dezvoltate analize simple pentru proteine i care cer proprieti apropiate de soluiile ideale
Newtoniene. Comportamentul acidului hialuronic nu se apropie nici pe de parte de idealul
Newtonian. Sandy Ogston, Torvard Laurent, Endre Balazs i mai trziu Bob Cleland au elaborat
teorii i structuri experimentale care stau la baza cercetrii proprietilor biofizice ale HA.
n soluie apoas HA este descris ca un ghem statistic cu o rigiditate intrinsec
considerabil. Aceast rezisten a fost atribuit legturilor de hidrogen intramoleculare de-a
lungul a dou legturi glicozidice. S-a artat ca solventul i lungimea lanului joac un rol
important n formarea legturilor de hidrogen.

Fig. 3 Comportamentul acidului hialuronic n soluie diluat i respectiv concentrat

Metoda FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) este o metod puternic de

determinare a proprietilor soluiilor concentrate de polimeri, cum ar fi HA, de asemenea este i
o metod de echilibru care se aplica soluiilor fr gradient de concentraie, n absena curgerii i
fortelor de forfecare.

Fluorescence Recovery After Photobleaching

Exist cativa factori care pot contribui la propriettile solutiei de HA, cum ar fi:
1. interaciunile electrostatice dintre grupele carboxilice;
2. legturile de hidrogen dintre zaharidele adiacente;
3. domeniul de suprapunere i ncalcire a polimerului;
4. asocierea lan-lan prin mecanisme ce au la baza interaciuni hidrofobe.
S-a artat ca metoda FRAP permite calculul concentraiilor soluiilor de HA peste
concentraia critic la care are loc suprapunerea lanurilor macromoleculare. Deci, aceast
metod este potrivit studiilor de ncalcire i asociere lan-lan. Deoarece proprietile reologice
i hidrodinamice ale soluiei depind de efectele electrostatice i ionice ale reelei de HA, s-a
studiat sensibilitatea acestora in funcie de tipul i valena contraionului. Influena legturilor de
hidrogen a fost studiat prin compararea proprietilor soluiilor n apa deionizat, 0,5 M NaCl si
0,5 M NaOH. S-a artat ca electrolitul a ecranat interaciunile electrostatice iar ioni HO- au
influenat rigiditatea lanurilor de HA. Prezena asocierilor lan-lan, care poate implica
interaciuni hidrofobe, a fost studiat n condiii fiziologice, n solveni cu polaritate diferit.
Asocierile intermoleculare lan-lan au fost deasemenea studiate prin folosirea de oligozaharide
HA ca i compusi competitori (cu masa molecular mic).

2. Importan i aplicaii
Exist o familie de enzime numite Hialuronidaze (HA-ze), care sunt capabile s
hidrolizeze HA dup diverse mecanisme. O importan deosebit a cuplului HA/HA-ze a fost
demonstrat n unele boli, ca artrita reumatic, dar mai ales n cancer.
n decursul timpului, HA a fcut posibile diverse aplicaii n domeniul medical,
farmaceutic i cosmetic. Datorit proprietilor fizico-chimice unice, el este folosit pentru
aplicaii ca lubrefiani (pentru articulaii i oftalmologie), pentru construirea de biomateriale
pentru ingineria esuturilor, pentru elaborarea de dispozitive cu eliberare controlat a principiilor
active si pentru fabricarea de produse cosmetice de nfrumuseare cu proprieti de hidratare a
pielii.

Figura 3. HA utilizat n domeniul cosmetic

Aplicaii posibile ale HA nemodificat

Oftalmologie
Picturile apoase de pus n ochi au dezavantajul c mai mult de 75% din soluia aplicat
se pierde prin drenaj n primele 2 minute. De aceea se adaug polimeri soluiei cu rolul de a mri
vscozitatea si de a creste astfel timpul de stationare al medicamentului. Gurny si colaboratorii
au aratat ca solutiile de HA au capacitatea unica de a prelungi timpul de stationare al pilocarpinei
in apropierea precorneei. Acestia au sugerat ca HA interactioneaza direct cu membrana celulara a
tesutului corneal.

Eliberarea controlat de medicamente

n unele experimente s-a observat ca HA marcat izotopic s-a deplasat din fluidul sinovial
n nodulii limfatici. Dup injectarea intravenoas n oarece a unei cantiti mari de HA marcat sa observat ca dup un timp HA se gsete n nodulii limfatici. Aceast observaie a artat
potenialul HA de a fi folosit ca purttor de medicamente prin sistemul limfatic ctre locul int
pentru tratarea diferitelor tumori maligne.

Dermatologie
Datorita permeabilitii slabe si naturii lipofilice a pielii umane, foarte puine
medicamente pot fi livrate transdermal pentru atingerea nivelelor terapeutice n piele. n ultimii
ani s-au obinut rezultate promitoare n tratamentul artritei i cancerului de piele cu ajutorul
unor medicamente pe baz de HA. Rezultate foarte bune obinndu-se n cazul diclofenacului.

Chirurgie
Prevenia formrii postoperatorii a adeziunilor este o problem mereu actual.
S-a artat c soluiile de HA reduc adeziunile dup chirurgia abdominal i ortopedic. Mitchell
i colaboratorii au artat c adeziunile pericardice postoperatorii sunt mult diminuate dac se
administreaz animalului o solutie de 0,4% HA in timpul pericardiotomiei. Mecanismul real prin
care soluiile de HA previn formarea adeziunii este nc necunoscut.

Implanturi
Bioincompatibilitatea unor implanturi mamare, cum ar fi gelurile siliconice, a dus la
cutarea de noi alternative. Lin i colaboratorii au studiat posibilitatea folosirii HA ca material de
umplere. S-a artat c implanturile pe baz de HA au aceeai consisten ca gelurile siliconice,
dar permit o mai bun vizualizare a structurii snului n jurul implantului. Dup primul an de la
implantare n animal nu s-a observat nici o reacie advers.
Viscosuplimentarea reprezint o tehnic relativ recent i const n injectarea unui lichid
coninnd acid hialuronic n articulaia genunchiului. Acidul hialuronic reprezint o substan
natural, component a lichidului sinovial (lichidul care se gsete n articulaie) i care are efect
de lubrefiere, pentru a permite extremitilor oaselor s alunece una pe cealalat, absoarbind
ocurile transmise n articulaie prin ncrcare.

3. Biodegradarea acidului hialuronic

Biodegradarea acidului hialuronic este un process treptat. n spaiul extracelular a
majoritii esuturilor se gsete HA cu mas molecular mare. mpreun cu alte structuri
macomoleculare HA contribuie la proprietile mecanice ale reelei. Prin urmare, pentru a fi
eliberat din aceast reea solid, polimerul trebuie s fie cel puin parial degradat prin
mecanisme mediate de receptori sau prin endocitoz. n compartimentul lizozomal, acidul
hialuronic este hidrolizat la oligozaharide de ctre hialuronidazele intracelulare, fragementele
fiind n cele din urm degradate la monozaharide de ctre exo-glucozidazele aflate n lizozomi.
n esuturile tari, cum ar fi osul sau cartilajul, cu sau fr drenaj limfatic, HA este
degradat "in situ", mpreun cu alte molecule ECM (colagen i proteoglacani). n pielii i
articulaii, doar o fraciune minor (aproximativ 20-30%) de HA este stocat i degradat n
esuturi Aproximativ 50% din HA din organism se gsete n esuturile pielii.

Fig. 4 Principalele ci de catabolizare a acidului hialuronic

Degradarea enzimatic
Cea mai important degradare a HA n mediul biologic este catalizat de enzimele numite
hialuronidaze sau liaze. Conform mecanismului de degradare, hialuronidazele sunt mprite
n trei categorii:
(1) hialuronat-4-glicanohidrolaze, care hidrolizeaz legturile -N-acetilglucozaminice;
(2) hialuronat-3-glicanohidrolaze;
(3) hialuronat-liaze.
8

Asemntor hidrolizei acide, HA este hidrolizat enzimatic de ctre hialuronidaze printrun mecanism statistic de degradare.
CH2OH

HOOC
O

HO

CH2OH

HO

HO
OH

AcNH

AcNH

HOOC

CH2OH

HO

OH

AcNH

OH

CH2OH

HO

O
HO

O
AcNH

Fig 4. Aciunea hialuronidazei bacteriale asupra hialuronanului (Ac = acetat).

Degradarea enzimatic a hialuronanului are loc de obicei n soluie tampon de acetat de
sodiu la care se adaug acid acetic pentru a se obine un pH 4,8-6,0, unde majoritatea acestor
enzime sunt active. Temperatura de degradare este de obicei 37 oC.
Degradarea prin metode non-enzimatice
n ciuda faptului c HA este un compus stabil n condiii normale, scindarea lanurilor de
polimer se pot face i prin intermediul unor metode non-enzimatice fie prin reacii cimice dar i
prin metode fizice n condiii critice precum:
uscarea prin congelare;
forfecare
amestecare, agitare
Celulele formeaz specii reactive de oxigen (ROS) ca o consecin a respiraiei anaerobe
normale. Rspunztori de scindarea lanului polimeric al acidului hialuronic sunt doar cateva
dintre aceste specii precum:
anioni superoxid - -radical liber de oxigen care are un electron in plus,
fiind foarte reactiv si toxic;
radicalul hidroxil - acest radical are un electron nepereche n orbita sa
electronic cea mai ndeprtat, care se unete cu ali electroni,
formnd legturi chimice;
Ion hipoclorit est ClO- ;
Specii derivate din peroxinitrii.
Aceste specii reactive de oxigen sunt implicate n cteva procese biodegenerative i
inflamatorii precum artrita. Depolimerizarea acidului hialuronic n fluidul sinovial n timpul
debutului precoce al artritei este considerat a fi cauzat de ROS i nu de hialuronidaz. Fluidul
sinovial normal este vscoelastic datorit prezinei de HA de masa molecular mare.
Sinoviocitele secret continuu macromolecule n fluidul sinovial, inclusiv HA. Fluidul este
mpins n afara cavitii articulaei n microcapilare integrate n sinoviu, pe msur ce presiunea
crete. Pe aceast cale moleculele de HA ies prin pori interstiiali de drenaj n cptueala
sinovial (garnitura articular de 30 90 nm), scznd motilitatea asemenea moleculelor de HA
mai mici (Fig. 5).
9

Fig. 5 Drenarea HA-ului din fluidul sinovial n sistemul limfatic

Concluzii
Metabolizarea HA-ului este dinamic. Unele celule, precum condrocitele sintetizeaz i
catbolizeaz HA astfel nct s menin o concentraie constant n organism. Alte celule, de
exemplu, celulele cutanate, sintetizeaz HA mai mult dect catabolizeaz.
Hialuronidaza i ROS pot depolimeriza HA+ul suficient de mult pentru a putea fi eliberat
din matricea extracelular. Apoi, acesta este fie imediat absorbit n celule i degradat de lizozomi
fie este transferat n sistemul limfatic i condus spre ficat, glande limfatice sau rinichi spre a fi
catabolizate. Produi finali de degradare, acidul glucuronic i N acetilglucozamina pot fi
reutilizai pentru biosinteza de HA. n aceast manier, acidul hialuronic din organismul uman
este ndepartat metabolic i nlocuit zilnic.

10

Bibliografie
1. Chemistry and Biology of Hyaluronan, H.G. Garg and C.A. Hales;
2. http://en.wikipedia.org/wiki/Hyaluronan
3. Inhibition of hyaluronidase at high substrate concentration, Trias ASTERIOU, JeanClaude VINCENT and Brigitte DESCHREVEL.

11