Microscopa invertida y vertical

Captulo 1. Microscopa ptica invertida y vertical

Introduccin
Los posibles inventores del microscopio compuesto fueron Hans Janssen y Zacharias Janssen
en 1590, que consista en dos lentes soportados en tubos de latn de unos 25 centmetros de
largo que se deslizaba, (facilitando el enfoque) dentro de otro; sin embargo, algunos atribuyen a
Galileo Galilei su invencin en la primera mitad del siglo XVII, gracias a que l difundi el
microscopio y su uso. Los primeros usuarios de los microscopios fueron Marcello Malpighi, de
Italia, Antony Van Leeuwenhoek, de Holanda; Robert Hooke y Nehemiah Grew, de Inglaterra.
Leeuwenhoek fabric un microscopio simple (1632) y Hooke (1670) utiliz un microscopio
compuesto.
Debido a que la mayora de las clulas son demasiado pequeas para ser observadas a simple
vista, el estudio de las clulas ha dependido primordialmente del uso del microscopio. Es ms,
el descubrimiento de las clulas surgi del desarrollo del microscopio: Robert Hooke fue el
primero que creo el trmino de Clulas, haciendo observaciones de corcho con un simple
microscopio ptico en 1665. Antony Van Leeuwenhoek, en 1670 y aos posteriores utilizando
un microscopio que ampliaba los objetos hasta 300 veces su tamao real, fue capaz de
observar diferentes tipos de clulas. Los estudios microscpicos de tejido vegetal por Matthias
Schleiden y los de tejido animal por Theodor Schwann condujeron a la conclusin Todos los
organismos estn compuestos por clulas. El microscopio ptico contina siendo un
instrumento bsico para la biologa celular, que con la implementacin de nuevas tcnicas
permiten la visualizacin de los detalles aumentados de la estructura celular.
La invencin del microscopio invertido se acredita al profesor Lawrence Smith de la Universidad
de Louisiana, mejorando el modelo de Chevalier de 1834. Posteriormente, Nachet, basndose
en dibujos de Smith, construye numerosos ejemplares, denominndole microscopio qumico.
Figura 1.
A principios del siglo XX la fabricacin de microscopios se concentr en Alemania y en los aos
sucesivos se desarroll instrumentos que abrieron muchas posibilidades en el campo de la
microscopa, como son

la fluorescencia, contraste de fase, interferencia, holografa, luz

ultravioleta, rayos X, mtodos con electrones y protones, microscopios computarizados para la

observacin, cuantificacin y anlisis tridimensional.

Microscopa invertida y vertical

Figura 1: Microscopio invertido qumico. Modificado: The Nachet-Smith inverted Chemical

Microscope.
Unidades de medida empleadas en microscopa
El micrmetro (m), es la unidad de longitud equivalente a una millonsima parte de un
metro,

abreviado

(plural

latino:

micra).

Tambin

conocido

como

micrn.

El nanmetro (nm), es la unidad de longitud que equivale a una mil millonsima parte de un
metro.

Utilizada

adems

para

medir

las

longitudes

de

onda

de

las

radiaciones

electromagnticas. Esta unidad se ha hecho importante en el campo de la Nanotecnologa,

disciplina que estudia materiales cuyas dimensiones son en el orden de escasos nanmetros.
El ngstrm (), es la unidad de longitud empleada principalmente para expresar longitudes
de onda, distancias moleculares y atmicas. Su nombre viene dado por el fsico sueco Anders
Jonas ngstrm. Actualmente su uso en microscopa es restringido, en cierto modo ha sido
sustituido por el nanmetro.
Equivalencias: Relaciones entre las diferentes unidades de medida empleadas en
microscopa:
1 mm (milmetro) = 1000 m (micrmetro)
1 m (micrmetro) = 1000 nm (nanmetro)
1 nm (Nanmetro)= 10 (ngstrm)
1 (ngstrm)= 0.1 nm (nanmetro)
1 (ngstrm) = 0.0001m (micrmetro)
Principio de la microscopa ptica invertida y vertical
Existen diversas clases de microscopio, segn la conformacin, la naturaleza de los sistemas
de luz y los elementos para obtener las imgenes.

Microscopa invertida y vertical

El microscopio compuesto de uso comn tambin se conoce con el nombre microscopio ptico
vertical, y se basa en que sus propiedades derivan del empleo de lentes pticas y a que posee
la fuente de luz ubicada en la base, por debajo de la platina. El microscopio ptico puede ser
monocular, binocular, trinocular (para microfotografa).
Por su parte el microscopio invertido es una variante del microscopio ptico convencional
(Microscopio vertical), como su nombre lo indica la estructura del microscopio es invertida: La
fuente de luz y el condensador estn sobre la platina apuntando hacia abajo de manera que la
trayectoria de los rayos de luz se transmiten desde arriba hacia abajo a travs de los objetivos y
es alterada por un sistema de espejos de tal manera que llega al ojo desde abajo. Los objetivos
y el revolver estn debajo de la platina apuntando hacia arriba. El tubo binocular o trinocular y la
muestra se coloca sobre platina mecnica con igual disposicin tanto en el microscopio vertical
como en el invertido, as mismo, el principio de funcionamiento y la formacin de la imagen es
semejante. Figura 2 a y b.
En el microscopio ptico, una fuente de luz es necesaria para iluminar la muestra, adems, se
requiere un condensador para concentrar los rayos de luz dispersos, procedentes de la fuente
e iluminar la muestra con un pequeo cono de luz con intensidad suficiente para permitir
observar las partes muy pequeas de la muestra luego de la amplificacin. Los rayos de luz
enfocados sobre la muestra por el condensador tambin son recolectados por la lente objetivo.
El cono de luz precedente de la lente del condensador que atraviesa directamente hacia la lente
objetiva, constituye la luz de fondo sobre el campo visual. Los rayos de luz procedentes de la
muestra son conducidos al foco por la lente objetivo para formar una imagen real amplificada
del objeto observado dentro de la columna del microscopio.
La imagen creada por la lente objetivo se emplea entonces por un segundo sistema de lentes,
la lente ocular, que utiliza como objeto la imagen formada por la lente objetivo para establecer la
imagen virtual amplificada. Un tercer sistema de lentes, localizados enfrente del ojo, usa como
objeto la imagen virtual producida por la lente ocular para generar una imagen real sobre la
retina. La amplificacin total alcanzada por el microscopio es producto del aumento producido
por la lente objetiva y por la lente ocular (aumento total). Sin embargo, la propiedad ms
importante de cualquier microscopio no es el aumento, sino su resolucin.

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a. Microscopio ptico convencional

b. Microscopio ptico invertido

Figura 2. Microscopios pticos. a. Convencional b. invertido

La resolucin, se define como la capacidad para distinguir dos objetos o puntos ubicados uno
muy cerca del otro en el campo visual como entidades diferentes. Si las dos partes distintas de
un objeto no estn separadas por una distancia suficiente, se vern como una sola, es decir, no
sern resueltas. La resolucin de una lente microscpica es la distancia mnima entre dos
objetos que permiten distinguirlos como tales; mientras ms pequea sea mejor ser la
resolucin.
El lmite de resolucin del microscopio ptico es aproximadamente de 0.2 m, dos objetos
separados por menos de esta distancia aparecen como una nica imagen, en lugar de
distinguirse una de otra, es decir, nunca puede resolver objetos que estn separados por menos
de 0.2 m.
La resolucin est determinada por dos factores, la longitud de onda () de la luz visible, que
generalmente

es de 0.5 m o 527nm y el poder de captacin de luz de las lentes del

microscopio, que corresponde a la apertura numrica (AN), por lo general el valor ms alto de la
apertura numrica es de 1,4. Ecuacin 1.

Microscopa invertida y vertical

Ecuacin 1
0.61: Constante de proporcionalidad
Constitucin principal del microscopio
Objetivos: Es un sistema de lentes complejos localizados debajo o encima de la platina
mecnica. Los objetivos de alto poder (40x, 60x o 100x), utilizados en la microscopa ptica
convencional, tienen muy corta distancia de trabajo, generalmente menor de 1mm, por lo tanto,
deben acercarse a la muestra para su enfoque. Por el contrario, en el microscopio invertido para
las observaciones, se suelen usar recipientes cuyo espesor de fondo difiere considerablemente
del espesor de 0.17mm de los cubreobjetos habituales, por tal motivo, los objetivos son
adaptados para trabajar a largas distancias, debido a que el grosor de los recipientes impide el
contacto estrecho entre el objetivo y la muestra. En la actualidad, existen objetivos
denominados de Larga Distancia (LD). Por ejemplo, el objetivo de 40x tiene una distancia de
trabajo libre de 2.0 mm para espesores de 1mm,

de 1.9 mm para espesores de 1.2 mm y

1.5mm para espesores de 1.8 mm.

El objetivo se caracteriza por el tipo de correccin, el material ptico empleado para su
construccin, su factor de aumento, su apertura numrica y s est diseado para trabajar en
campo claro, en contraste de fases, en campo oscuro, polarizacin, fluorescencia, entre otros.
Los datos grabados en los objetivos proporcionan informacin relevante que describe las
propiedades individuales para su uso correcto, por ejemplo:
Nombre del fabricante: Olympus, Carl zeiss, Leica, entre otros.
Correcciones pticas: Achro, Achromat (acromticos), Fluar, Neofluar (semi-apocromticos),
apo (apocromticos), plan, plano (corrige curvatura de campo).
Aumento de 1x hasta 200x. A cada escaln de aumento est asignado un anillo de color
definido. Figura 3.
Distancia de trabajo expresada en milmetros (WD).
LD (Long Distance): Los objetivos que tienen una distancia de trabajo relativamente larga que
permiten el trabajo en recipientes de fondos ms gruesos.

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Longitud mecnica del tubo: Es la longitud que separa al objetivo del ocular, usualmente en
milmetros (160, 170, 220 mm) o con el smbolo infinito () para objetivos con correccin infinita.
Espesor del cubreobjetos:

estandarizado a 0.17 mm o una raya () que significa que no

necesita cubreobjetos.
Adems, algunos objetivos ameritan el uso de medios de inmersin y para ello se emplea un
cdigo de colores o las abreviaciones Oil, Oel (aceite): color negro; W, Water, Wasser (agua):
color blanco y Gly (Glicerol): color naranja.
Finalmente, la Apertura numrica (A.N) y otras especificaciones cuya nomenclatura depende
del fabricante. Figura 3.
La Apertura Numrica (A.N.): Est normalmente grabada en los objetivos y en las lentes
condensadoras; expresa matemticamente el cono slido de luz que la lente condensadora
arroja sobre la muestra y que capta el objetivo. Cuanto mayor sea la apertura numrica de un
objetivo, mayor ser la resolucin del mismo. Sin embargo, para que se cumpla esta condicin
es necesario que la A.N. de la lente condensadora sea igual o mayor que la A.N. del objetivo.
Por ejemplo, una lente condensadora con una A.N. 0.55, es insuficiente para aprovechar toda la
capacidad de resolucin de un objetivo de 100x en aceite de inmersin, cuya A.N. es de 1.25.
Ocular: Es el conjunto de lentes de aumento ms cercano al ojo con el que el observador
visualiza ampliada la imagen real formada por las lentes del objetivo. Adems, aplana y aclara
el campo ptico o plano circular en el que aparece el objeto. La lente superior se denomina
lente ocular y es la que produce el aumento de la imagen real del objetivo; la lente inferior se
llama colectora, sta lente aplana y aclara el campo.
El ocular produce un aumento adicional a la imagen proporcionada por el objetivo. El valor de
este aumento est inscrito en la superficie del ocular y generalmente es de 10x, 12,5x, 15x, 20x
o 25x. Posterior, al aumento grabado precedido de una diagonal se encuentra el valor de la cifra
de campo que consiste en el dimetro en milmetros de la apertura fija del diafragma, la cual
puede variar desde 18mm hasta 26.5 mm. Figura 4.
Otra de las aplicaciones del ocular consiste en la cuantificacin o medicin de estructuras del
espcimen en estudio (Ver captulo de medicin celular).

Microscopa invertida y vertical

Figura 3. Datos grabados en los Objetivo

Microscopa invertida y vertical

Figura 4. Datos grabados en el ocular

Aplicaciones

ventajas

de

la microscopa

invertida

respecto al microscopio

convencional
- La microscopa invertida, se emplea para observar clulas vivas en cultivos celulares o tejidos,
microrganismos y parsitos en condiciones relativamente naturales.
- Se puede colocar un cultivo o muestras grandes en recipientes de diferente grosor que
permiten ver todo el contenido

en condiciones ms naturales (aunque sigue siendo en

condiciones in vitro), pero son condiciones menos estresantes, porque se puede sostener la
vida por un perodo de tiempo mucho ms amplio, ya que el diseo de la tapa de los recipientes
evita la evaporacin y permiten el intercambio de gas; as mismo, se tiene un mejor control de
la temperatura, aunque se pueden evidenciar cambios, ya sean morfolgicos o fisiolgicos con
el paso del tiempo.
- La principal ventaja, es poder observar los organismos y tejidos vivos, en comparacin con el
tratamiento con colorantes tincin ptica que es necesario en otros microscopios pticos,
donde las clulas u organismos pueden morir.

Microscopa invertida y vertical

- Facilita monitorear actividades de crecimiento y comportamiento en diferentes

tejidos,

organismos y muestras en estados ms naturales, disminuyendo las condiciones de estrs,

mientras que el microscopio ptico convencional requiere que la muestra se coloque sobre un
portaobjetos de vidrio, normalmente bajo un cubreobjetos; esto generalmente, significa la
eliminacin de una pequea muestra de un cultivo y colocarla en un ambiente artificial creado
por el portaobjetos y cubreobjetos.
La temperatura y el contenido de oxgeno de la muestra pueden cambiar rpidamente. Adems,
las clulas o los organismos estarn bajo una presin mayor, en un espacio confinado y
antinatural como resultado del cubreobjetos, por otro lado, la muestra se seca rpidamente por
evaporacin, al menos, que se aplique repetidamente agua, pero sta adicin de agua puede
cambiar la salinidad de la muestra. Estos cambios ocasionan estrs severo en las clulas que
pueden afectar su comportamiento y/o matarlas al poco tiempo. En la actualidad, se han
propuesto algunas soluciones parciales a estos inconvenientes como son la fabricacin de
portaobjetos con una pequea cmara y la tcnica de gota colgante para evitar la evaporacin,
el aumento de la presin y reduciendo el confinamiento.
- El microscopio invertido, tiene objetivos de alto poder corregidos para una distancia ms larga
de trabajo, estos objetivos son distinguidos como LWD (larga distancia de trabajo) y ULWD
(Ultra larga distancia de trabajo), que permiten observar a travs del fondo de diferentes
recipientes, espesores y caractersticas pticas variables, tales como placas de Terasaki,
frascos Corning, frascos Roux y cajas de Petri. El material plstico es pticamente superior que
el de vidrio, debido a que es ms delgado y uniforme. Adicionalmente, el condensador ULWD
tambin debe permitir una distancia larga de trabajo para que los recipientes grandes puedan
ser colocados en la platina. Por el contrario, el

microscopio ptico convencional, los objetivos

de alto poder (40x y 100x) estn optimizados para un espesor especfico de un cubreobjetos de
vidrio que es bastante delgado (0.17 mm) y suelen tener una distancia de trabajo muy corta, de
tal manera, que quedan muy cerca del objeto a enfocar.
Distancia libre de trabajo: Se denomina as, a la distancia que existe entre la superficie de la
laminilla cubreobjetos (preparacin) y la lente frontal del objetivo, cuando la imagen est
enfocada. Esta distancia ser mayor, cuanto menor sea el aumento propio del objetivo y
viceversa.
Campo del microscopio (dimetro del campo visual): Es el crculo visible que se observa en
el ocular. Tambin se puede definir como la porcin del plano visible observado a travs de las
lentes. Si el aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual quiere decir, que el campo es

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inversamente proporcional al aumento del microscopio. La forma del campo est determinada
por el diafragma fijo del ocular, que generalmente es de forma circular, aunque tambin puede
ser cuadrado.
Objetivos acromticos: Presentan correccin cromtica para la luz azul y roja. Correccin de
esfericidad para el verde. Dan mejores resultados con filtro de luz de color verde y son ideales
para microfotografa blanco y negro. Se asume que un objetivo es acromtico cuando no posee
ninguna denominacin.
Objetivos semi-apocromticos: Elaborados a partir de cristales de fluorita. Corrigen para el
azul, el rojo y en cierto grado para el verde. La correccin de esfericidad es para dos colores, el
verde y el azul. Dan buenos resultados con luz blanca y estn mejor diseados para la
microfotografa en colores.
Objetivos apocromticos: Poseen el ms alto nivel de correccin de aberraciones y por ello,
son ms costosos. Presentan correccin cromtica para cuatro colores (azul oscuro, azul, rojo y
verde); correccin de esfericidad para dos o tres colores. Son los mejores objetivos para
microfotografa y video a color. Debido a su alto grado de correccin, estos objetivos poseen
mayores aperturas numricas que los acromticos y las fluoritas. Esto puede ser un
inconveniente puesto que el campo de observacin se presenta un poco curvo.
Los tres tipos de objetivos proyectan imgenes con cierta distorsin que se manifiesta como
curvaturas y al ser corregidos para este defecto se denominan plan-acromticos, plan-fluoritas o
plan-apocromticos.

Objetivos
- Comparar el funcionamiento y aplicaciones del microscopio ptico invertido con el microscopio
ptico vertical
-Realizar la observacin de cultivos celulares y micropreparados mediante la manipulacin de
las partes del microscopio.
- Analizar los clculos correspondientes al lmite de resolucin, poder de resolucin, aumento
total y dimetro del campo visual
Materiales
Microscopio invertido

Micropreparados celulares

Microscopio convencional

*Portaobjetos

Cultivos celulares

*Cubreobjetos

* Materiales que debe traer el estudiante

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Observaciones y preguntas
En la figura 5 se esquematiza el procedimiento a seguir para realizar las observaciones

Figura 5. Metodologa

En la figura 6 coloque los datos que estn en el objetivo del microscopio que est utilizando

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Microscopa invertida y vertical

Figura 6. Objetivo

Identifique e indique las siguientes partes en los microscopios ptico invertido y convencional.
Figura 7 y 8.
1. Fuente de luz
2. Condensador
3. Diafragma
4. Filtros
5. Oculares
6. Tubo binocular

7. Perilla macromtrico y micromtrico

8. Revlver porta-objetivos
9. Objetivos
10. Platina
11. Conector del equipo a la red
12. Regulador de la intensidad luminosa

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Figura 7: Esquema del microscopio invertido. (Carl Zeiss)

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Figura 8: Esquema del microscopio vertical. (Carl Zeiss)

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4.3. Por medio de la manipulacin de las partes del microscopio enfoque el cultivo y el
micropreparado celular.

Microscopio ptico vertical

Microscopio ptico invertido

Describa las clulas

Describa las clulas

A partir de los datos grabados en los elementos pticos (ocular y objetivo), se puede calcular el
aumento total, el lmite de resolucin y el dimetro del campo visual. Tenga en cuenta, que la
longitud de onda de la luz visible es 0.5m (=0.5 m), A es el aumento y AN es la apertura
numrica del objetivo y del condensador.
Calcule los siguientes datos para cada uno de los objetivos del microscopio, con la formula
correspondiente.

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Microscopa invertida y vertical

a. El lmite de resolucin

b. El poder de resolucin

c. Aumento total (AT)

d. El dimetro del campo visual (DCV)

AN: Apertura numrica : Longitud de onda A: aumento CCO: Cifra del campo visual del ocular

En la tabla 1, escriba los resultados obtenidos de los clculos realizados anteriormente

Tabla 1
OCULAR

OBJETIVO

Aumento

Cifra o
valor de
campo

Aumento

10x

18 mm

4x

IMAGEN

Apertura
numrica

Aumento Lmite de Poder de Dimetro

total
resolucin resolucin del campo
visual

0.1

40x

Concluya al comparar los siguientes datos:

Apertura numrica/lmite de resolucin/ poder de resolucin:

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3.05 m

0.32 m

4.5 mm

Microscopa invertida y vertical

Aumento del objetivo/ Dimetro del campo visual:

Cul es el lmite de resolucin mnimo para el microscopio ptico que utiliz en la

prctica?_____________________________________________________________________
Cules son las semejanzas y diferencias entre un microscopio compuesto binocular y un
microscopio invertido?
Consulte la definicin de lmite de resolucin, poder de resolucin, poder de aumento y campo
visual.
Consulte la funcin del aceite de inmersin (medio de inmersin) en microscopa y los ndices
de refraccin del aceite de inmersin, glicerol, agua, cubreobjetos (vidrio), cultivo de clulas.
Consulte el lmite de resolucin para los siguientes sistemas pticos:
Ojo humano
Microscopa ptica
Microscopa electrnica
Teniendo en cuenta el concepto de lmite de resolucin, explique el siguiente esquema:

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Microscopa invertida y vertical

Consulte la funcin de cada una de las partes del microscopio

Proponga un esquema metodolgico para el estudio de las clulas por microscopia.
Bibliografa
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http://www.antiquemicroscopes.com/photos/Nachet_Chemical_Inverted_microscope.htm

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Notas

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