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TRABAJO DE GRADO
Presentado por:
DIANA LUCA SUREZ ROZO.
DIANA MARCELA OROZCO GIRALDO.
TRABAJO DE GRADO
Presentado por:
DIANA LUCA SUREZ ROZO.
DIANA MARCELA OROZCO GIRALDO.
Dirigido por:
phD. GLORIA EDITH GUERRERO ALVAREZ.
Presentado por:
DIANA LUCA SUREZ ROZO.
DIANA MARCELA OROZCO GIRALDO.
Los suscritos director y jurado del presente trabajo de grado, una vez
revisada la versin escrita y presenciando la sustentacin oral decidimos
otorgar:
La nota de: _____________________________
Con la connotacin: _____________________
Para constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy _________________
Director: __________________________
phD. Gloria Edith Guerrero lvarez
Doctora en Ciencias Qumica.
Jurado: ___________________________
Ing. Pablo Alejandro Pelez Marn.
Ingeniero Agrnomo.
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTOS
Primero agradecemos a Dios por permitirnos concluir esta etapa tan importante de
nuestras vidas y poder aplicar todo el conocimiento adquirido en la carrera
profesional, en pro de contribuir a una industria sostenible amigable con el
ambiente.
A nuestras familias por su apoyo incondicional, contribucin financiera en estos
aos de formacin y motivacin continua.
A nuestra directora de trabajo de grado Gloria Edith Guerrero por brindarnos la
oportunidad de realizar el trabajo de grado dentro de su grupo de investigacin,
por el apoyo otorgado en este tiempo y participacin continua en la elaboracin del
estudio realizado.
A la industria chocolatera nacional por facilitarnos la cascarilla de cacao, producto
matriz de nuestro estudio.
A nuestro evaluador Pablo Alejandro Pelez por su colaboracin y aporte en
conocimiento.
Al profesor Carlos Humberto Montoya por permitirnos y facilitarnos el uso de
equipos e instalaciones necesarios para el estudio realizado.
A la Escuela de Tecnologa Qumica, profesores y administrativos, por los
conocimientos brindados y facilitarnos el espacio propicio para el desarrollo de
nuestra carrera.
RESUMEN
ABSTRACT
TABLA DE CONTENIDO.
Pg.
NOTA DE ACEPTACION DEL TRABAJO DE GRADO ......................................... 3
DEDICATORIA ....................................................................................................... 4
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................ 5
RESUMEN.............................................................................................................. 6
TABLA DE CONTENIDO. ...................................................................................... 8
INDICE DE TABLAS ............................................................................................ 13
NDICE DE FIGURAS .......................................................................................... 14
NDICE DE ANEXOS ........................................................................................... 16
1.
2.
INTRODUCCIN. .......................................................................................... 18
3.
OBJETIVOS. ................................................................................................. 21
5.
METODOLOGA ........................................................................................... 53
10
11
12
INDICE DE TABLAS
Pg.
TABLA 1. PRODUCCIN NACIONAL DE CACAO . .......................................................... 28
TABLA 2 CONDICIONES DE SEPARACIN POR CLAE DEL CIDO DGALACTURNICO. ..................................................................................................... 60
TABLA 3 PRINCIPALES CARACTERSTICAS DE LA CASCARILLA DE Theobroma
Cacao L. ESTUDIADA. ................................................................................................ 63
TABLA 4. RESULTADOS DEL ANLISIS PRELIMINAR DE LA PECTINA EXTRADA DE
LA CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma Cacao L........................................... 65
TABLA 5 RESULTADOS DE LAS CARACTERSTICAS QUMICAS EVALUADAS A LA
PECTINA EXTRADA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma Cacao L.,
APLICANDO EL DISEO FACTORIAL 22. ................................................................. 69
TABLA 6. PRUEBA DE NORMALIDAD DE LAS DIFERENTES TEMPERATURAS DE
EXTRACCIN DE PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma
Cacao L. ....................................................................................................................... 70
TABLA 7. PRUEBA DE HOMOGENEIDAD DE VARIANZA. .............................................. 71
TABLA 8. ANOVA DE DOS FACTORES PARA CARACTERSTICAS QUMICAS EN LAS
CONDICIONES DE EXTRACCIN DE PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO
Theobroma Cacao L. ................................................................................................... 71
TABLA 9. CONTINUACIN ANOVA DE DOS FACTORES PARA CARACTERSTICAS
QUMICAS EN LAS CONDICIONES DE EXTRACCIN DE PECTINA DE LA
CASCARILLA DE CACAO Theobroma Cacao L. ....................................................... 72
TABLA 10 MEDIAS CARACTERSTICAS QUMICAS EN INTERACCIN ENTRE
TEMPERATURA-TIEMPO ........................................................................................... 74
TABLA 11. CORRELACIN ENTRE EL CONTENIDO DE METOXILO Y CONTENIDO DE
CIDO GALACTURNICO. ........................................................................................ 75
TABLA 12 ANLISIS DE ACIDEZ LIBRE Y PESO EQUIVALENTE DE LA PECTINA DE
LA CASCARILLA DE CACAO DEL Tehobroma Cacao L........................................... 76
TABLA 13 ANLISIS CONTENIDO DE CIDO GALACTURNICO, METOXILO Y
GRADO DE ESTERIFICACIN DE PECTINA. .......................................................... 77
TABLA 14 CONCENTRACIN DE FENOLES TOTALES DE LA PECTINA DE LA
CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma Cacao L. ............................................... 78
TABLA 15 CONCENTRACIN CARBOHIDRATOS TOTALES DE LA PECTINA. ........... 79
TABLA 16 RF DE ESTNDARES Y PECTINA HIDROLIZADA. ....................................... 81
TABLA 17 RESUMEN MODELO DE REGRESIN LINEAL DEL ESTNDAR DE CIDO
GALACTURNICO POR CLAE. ................................................................................. 83
TABLA 18 REPETITIVIDAD DEL ESTNDAR DE CIDO D-GALACTURNICO. .......... 83
TABLA 19 REPRODUCIBILIDAD DEL ESTNDAR DE CIDO D-GALACTURNICO. .. 84
TABLA 20 CONCENTRACIN DEL CIDO D-GALACTURNICO PRESENTE EN LA
PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma Cacao L.................... 84
TABLA 21. VISCOSIDAD Y PESO MOLECULAR DE LA PECTINA EXTRADA DE LA
CASCARILLA DE CACAO Theobroma Cacao L. ....................................................... 87
TABLA 22 RESULTADOS DEL GRADO DE GELIFICACIN DE LA PECTINA DE LA
CASCARILLA DE CACAO (Theobroma Cacao L.) ..................................................... 88
TABLA 23 RESULTADOS DE ANLISIS PROXIMAL DE LA PECTINA EXTRADA DEL
CACAO DEL Theobroma Cacao L. ............................................................................. 89
13
NDICE DE FIGURAS
FIGURA 1 RBOL Theobroma Cacao L. ......................................................................................... 24
FIGURA 2 FLOR Theobroma Cacao L............................................................................................ 24
FIGURA 3 FRUTO Theobroma Cacao L. ......................................................................................... 25
FIGURA 4 SEMILLA Theobroma Cacao L. ...................................................................................... 25
FIGURA 5 CACAO CRIOLLO ......................................................................................................... 26
FIGURA 6 CACAO FORASTERO .................................................................................................... 26
FIGURA 7 CACAO TRINITARIO...................................................................................................... 26
FIGURA 8 PRODUCCIN DE CACAO EN AMRICA (2008-2013) ................................................ 27
FIGURA 9 DIAGRAMA DE PRODUCCIN DE LOS DERIVADOS DEL CACAO. ......................... 29
FIGURA 10 CASCARA DE CACAO DESECHADA. ........................................................................ 30
FIGURA 11 CASCARILLA DE CACAO. ........................................................................................... 31
FIGURA 12 ESTRUCTURA DE LA PARED CELULAR PRIMARIA ................................................. 33
FIGURA 13 ESTRUCTURA DEL CIDO -D-GALACTURNICO ................................................. 34
FIGURA 14 REPRESENTACIN SIMPLIFICADA DE LA ESTRUCTURA DE
RAMNOGALACTURONANAS ................................................................................................. 35
FIGURA 15 REPRESENTACIN SIMPLIFICADA DE LA ESTRUCTURA ...................................... 36
FIGURA 16 REPRESENTACIN SIMPLIFICADA DE LA ESTRUCTURA DE
ARABINOGALACTANAS I ...................................................................................................... 36
FIGURA 17 (A Y B) ALTERNATIVAS PARA REPRESENTAR LA CADENA PCTICA. ................. 37
FIGURA 18 PECTINAS DE BAJO NDICE DE METOXILO ............................................................ 38
FIGURA 19 PECTINA DE ALTO NDICE DE METOXILO (HM) ...................................................... 38
FIGURA 20. PECTINA DE BAJO METOXILO AMIDADA ................................................................ 39
FIGURA 21. REACCIN DE LA MOLCULA DE CIDO D-GALACTURNICO CON NAOH. ...... 44
FIGURA 22. REACCIN Y MECANISMO DE SAPONIFICACIN DEL CIDO DGALACTURNICO [53]. ......................................................................................................... 46
FIGURA 23. ESTRUCTURA DE LOS IONES TARTRARO Y CITRATO ......................................... 48
FIGURA 24. REACCIN DE AZCAR REDUCTOR CON REACTIVO DE FEHLING O BENEDICT
................................................................................................................................................ 48
FIGURA 25. A) Y B) REACCIONES DE DESHIDRATACIN Y CONDENSACIN DE HEXOSAS Y
PENTOSAS POR EL MTODO DE DUBOIS .......................................................................... 49
FIGURA 26 CASCARILLA DE CACAO DEL THEOBROMA CACAO L. .......................................... 53
FIGURA 27. CASCARILLA DE CACAO DEL THEOBROMA CACAO L. MOLIDA. ......................... 53
FIGURA 28. MONTAJE EXTRACCIN SOXHLET PARA DESENGRASE. .................................... 54
FIGURA 29 MONTAJE EXTRACCIN DE PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL
Theobroma Cacao L. MEDIANTE REFLUJO. ......................................................................... 55
FIGURA 30. PRECIPITACIN DE LA PECTINA CON ETANOL. .................................................... 55
FIGURA 31. SECADO POR CONVECCIN DE LA PECTINA. ....................................................... 56
FIGURA 32. VIRAJE EN EL COLOR DE LA SOLUCIN PCTICA. ............................................... 57
FIGURA 33 TRIPLICADO DE LA SOLUCIN PCTICA EN LA DETERMINACIN DE FENOLES
TOTALES. ............................................................................................................................... 58
FIGURA 34. PATRONES PARA CURVA DE DUBOIS. ................................................................... 59
FIGURA 35 CASCARILLA DE CACAO Theobroma Cacao L. ......................................................... 63
FIGURA 36 PECTINA OBTENIDA DEL CACAO (Theobrama Cacao L.), APLICANDO EL
PARMETRO DE EXTRACCIN A, TEMPERATURA DE 95C-100MINUTOS..................... 66
FIGURA 37. PECTINA OBTENIDA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL Theobrama Cacao L.,
APLICANDO EL PARMETRO DE EXTRACCIN B, TEMPERATURA DE 95 C Y 95
MINUTOS. ............................................................................................................................... 66
FIGURA 38. PECTINA OBTENIDA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL Theobrama Cacao L.
APLICANDO EL PARMETRO DE EXTRACCIN C, TEMPERATURA DE 80 C Y 85
MINUTOS. ............................................................................................................................... 67
14
FIGURA 39. PECTINA OBTENIDA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL Theobrama Cacao L.,
APLICANDO EL PARMETRO DE EXTRACCIN D, TEMPERATURA DE 70 C Y 75
MINUTOS. FUENTE: AUTORAS ............................................................................................ 67
FIGURA 40 PRUEBA DE FEHLING PARA LA HIDROLISIS DE PECTINA DE LA CASCARILLA DE
CACAO DEL Theobroma Cacao L. ......................................................................................... 80
FIGURA 41 CROMATOPLACA DE ESTNDARES DE AZCAR E HIDROLIZADO DE LA
PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma Cacao L. ................................ 80
FIGURA 42 CROMATOGRAMA ESTNDAR DE CIDO D- GALACTURNICO. .......................... 81
FIGURA 43 CROMATOGRAMA MUESTRA DE PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO
(Theobroma Cacao L.)............................................................................................................. 82
FIGURA 44 A) Y B) ESPECTROS INFRARROJO DE PECTINA ESTUDIADA Y COMERCIAL. .... 86
FIGURA 45 RESULTADOS DEL ANLISIS DEL GRADO DE GELIFICACIN DE LA PECTINA
ESTUDIADA. ........................................................................................................................... 88
FIGURA 46 GELIFICACIN DE LA PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO (Theobroma
Cacao L.) EN PRESENCIA DE CALCIO. ................................................................................ 89
15
NDICE DE ANEXOS
16
17
2. INTRODUCCIN.
La especie vegetal del cacao, ha sido llamado Theobroma cacao L. por el botnico
Caroulus Lineo quien fue el primero en clasificarla [3], es una planta de origen
americano, sin embargo debido al sistema nmada llevado a cabo por los
primeros habitantes de este continente, es prcticamente imposible decir cual fue
especficamente el lugar de origen; los estudios de Pound Cheesman 1, sugieren
que el cacao es originario de Amrica del Sur, en el rea del alto Amazonas,
comprendido por pases como Colombia, Ecuador, Per y Brasil, los cuales tras su
descubrimiento y colonizacin permitieron su distribucin a las dems reas
habitadas del planeta, comenzando su comercializacin y uso [4] .
Colombia, un pas de biodiversidad gracias a su ubicacin geogrfica y
caractersticas topogrficas, basa su economa especialmente en el sector
agropecuario. Este pas tropical, situado sobre la lnea ecuatorial presenta
condiciones incomparables para la siembra del cacao, en una interesante variedad
de sistemas agroecolgicos, otorgndole gran potencial para el desarrollo del
mismo, tales como temperaturas medias altas, entre los 23-28C, precipitaciones
distribuidas a lo largo del ao de 1500-2500mm, que otorgan una humedad
relativa entre el 70-80%, en zonas ubicadas entre 0 y 1000 m. sobre el nivel del
mar [5]. Hoy por hoy el sector cacaotero colombiano, de las 3.4 millones de
hectreas destinadas al sector agrcola [6], cuenta con unas 125 mil hectreas
para al cultivo de cacao, produciendo alrededor de 40 mil toneladas y exportando
2500 toneladas promedio anual [7]. Segn datos de La Fundacin Mundial del
Cacao, el sector cacaotero est en apogeo, por lo tanto se espera un crecimiento
en los prximos aos del 2,2% por ao, debido al aumento en el consumo de los
productos derivados del cacao, estipulando necesitar 80 mil toneladas anuales del
fruto para satisfacer la demanda otorgada por los consumidores [8].
El grano de cacao es materia prima para las industrias de confitera, productoras
de chocolate, cosmtico y farmacutico; su cadena de produccin est
comprendida bsicamente por tres tipos de bienes,:1-Primarios, constituidos por el
cacao en grano; 2-intermediarios, generados por la manteca (ampliamente
utilizado en los productos cosmticos debido a su capacidad humectante), polvo
(ingrediente de diferentes alimentos que requieran el sabor y olor del chocolate),
licor (usado para la produccin de chocolates y coberturas) y pasta de cacao; 3finales, constituido por el chocolate para mesa y confites [9]. A los productos
derivados del cacao se le atribuyen (adems de agradable olor y sabor) beneficios
como propiedades antioxidantes, disminuyen el colesterol LDL (el cual bloquea las
arterias desarrollando la aterosclerosis) gracias a su contenido en polifenoles,
adems posee un gran valor energtico [3], entre otros aspectos.
1
PAREDES, Alfredo; ENRIQUEZ, Gustavo (1983); EL CULTIVO DEL CACAO. Segunda Edicin. Tema I Historia del caco
y chocolate, p. 11
18
Toda agroindustria en el desarrollo de las etapas del proceso genera residuos, los
cuales algunos por sus propiedades fsicas y qumicas pueden ser usados como
insumos en la produccin de compuestos tiles en otros procesos industriales,
para lo cual deja de ser residuo y es denominado subproducto [10]. Hoy en da,
las cascarillas son el principal subproducto de la industria del cacao; en Colombia
estas representan un grave problema, debido a que otorgarles una disposicin
final resulta ser costoso para las industrias cacaoteras nacionales, aunque se ha
establecido su uso como compostaje en las plantaciones, aprovechando la
presencia de agentes antibacterianos en los extractos de la cascarilla [11],tambin
como alimento para el ganado, sin embargo el contenido de teobromina (alcaloide)
restringe la proporcin en la cual puede ser consumida, por lo que su uso ha sido
limitado (este alimento puede constituir el 20% de una racin para aves de corral,
de 30-50% para cerdos, y 50% para ovejas, cabras y ganado lechero), en
continentes como frica se le ha aprovechado el contenido de sales de potasio (34% sobre base seca), usando las cenizas para fabricar jabn en pases como
Ghana y Nigeria, sin embrago no es atractivo para los consumidores occidentales
[2].
Cada tonelada de semilla seca representa cerca de 10 toneladas de cascarilla de
cacao [2], aunque se han establecido procesos para obtener utilidades de la
misma, las soluciones dadas no satisfacen en su totalidad, debido a la gran
cantidad de cascarilla generada, la cual va en aumento por las iniciativas de
consumo, en busca de otras alternativas se establece la obtencin de sustancias
como la pectina.
La pectina, es un polisacrido compuesto de una cadena lineal de molculas de
cido D-galacturnico, es un producto natural que est presente en la piel de
todos los vegetales, especialmente en las frutas, siendo el principal responsable
de su textura, posee propiedades de gelificacin en presencia de cidos y azcar
[1], por ende se utiliza principalmente en la industria alimenticia para la
preparacin de jaleas, mermeladas y otros productos [12], adems tambin es
ampliamente usada en la industria farmacutica, ya que posee propiedades
hidrocoloidales, teraputicas y aumentan la accin de los principios activos, se
caracteriza por ser antidiarreica, permitiendo la asimilacin de alimentos como los
lcteos por infantes, ya que cumple un papel de protector y regulador del sistema
gastrointestinal [13]. Las propiedades fsicas y qumicas de las pectinas, permiten
clasificarlas en alto o bajo Grado de Metilacin, el cual se refiere a la esterifiacin
de los grupos carboxilos por radicales metilo de acuerdo a su contenido en
metoxilo, es de mayor grado si supera al 7%, lo cual influye en el poder gelificante,
es decir, una pectina con un grado de metilacin alto posee mayor facilidad para
formar geles; el peso molecular de las pectinas es variable y depende del nmero
de molculas de cido D-galacturnico que la formen, interfiriendo en la
resistencia de los geles (a un mayor nmero se permite la formacin de geles ms
resistentes) [14], por otro lado las pectinas poco esterificadas necesitan valores
muy bajos de pH o presencia de calcio en el medio para poder gelificar [15].
19
20
3. OBJETIVOS.
21
4. MARCO DE ANTECEDENTES.
22
23
5. MARCO TEORICO.
24
5.1.1.3. Fruto.
El fruto es una BAYA denominada maraca o
mazorca (Figura 3.), que tiene forma de
calabacn alargado, se vuelve roja o
amarillo purprea y pesa aproximadamente
450 g cuando madura. La fruta, tiene forma
de Vaina y es ovoide, mide 15-30 cm de
largo. Cada mazorca contiene en general
entre 30 y 40 semillas dispuestas en
placentacin axial e incrustada en una
masa de pulpa desarrollada en las capas
externas de la testa o cascarilla [26,27].
Figura 3 Fruto Theobroma cacao L.
Fuente: autoras
5.1.1.5. Semillas.
25
26
27
2008
2009
2010
Santander
48,2
47,82
45,86
Huila
8,81
8,33
10,01
Arauca
11,08
10,98
9,42
Antioquia
5,44
5,62
7,69
Tolima
Resto
departamentos
5,6
5,7
6,83
20,87
21,54
20,18
de
28
29
5.1.5.2 Cascarilla.
Es el subproducto que se obtiene despus de secar el grano de cacao,
fermentarlo y tostarlo. La cascarilla de cacao (Figura 11.) nutricionalmente
aporta como todo alimento macronutriente (protenas, carbohidratos, lpidos)
y micronutrientes (vitaminas y minerales); a su vez contienen entre un 2.85 a
3.14% de grasa en relacin con el 30% a 50% del cacao [2,34].
La cascarilla de cacao contiene ms de 40% de fibra diettica, celulosa,
hemicelulosa y cido galacturnico. A su vez contiene protena, lignina,
minerales, lpidos, hidratos de carbono tales como almidones y azcares,
teobromina, y otros compuestos tales como polifenoles, taninos y cafena
30
31
32
33
34
35
36
37
con los grupos carboxilo de sta. Los geles se pueden obtener entre pH 1 a 7;
el pH no afecta la textura del gel ni el intervalo de slidos solubles, el cual
puede fluctuar entre 0 y 80%, pero la presencia de calcio (40 a 100mg) es el
factor predominante en la formacin del gel [41,42].
38
5.2.5.1 Protopectinas.
Termino aplicado a las sustancias pcticas insolubles en agua, las cuales
bajo condiciones controladas de hidrlisis originan cidos pectnicos. Se
caracterizan por tener todos los carboxilos esterificados y se hallan en mayor
cantidad en los tejidos de los frutos no maduros o verdes [13, 41].
39
5.2.5.3 Pectinas.
Son los cidos pectnicos solubles en agua caliente, con un contenido medio
de ster metlico y grado de neutralizacin. Su principal caracterstica es la
capacidad de formar geles en presencia de suficientes slidos solubles,
cidos o iones polivalentes [13,41].
5.2.5.4 cidos Pcticos.
Son aquellas sustancias pcticas constituidas principalmente por cidos
poligalacturnicos prcticamente libres de grupos metoxilo. Las sales de
estos cidos se denominan pectatos y reaccionan fcilmente con los iones
calcio de las clulas para producir compuestos insolubles en los jugos de
frutas, dando un precipitado visible comnmente en la separacin de fases o
abanderamiento en los nctares [13,41].
5.2.6 PROPIEDADES FSICAS Y QUMICAS DE LA PECTINA.
Como polmeros del cido galacturnico, las pectinas tienen muchas
propiedades fsicas y qumicas nicas, debidas principalmente al grupo
carboxlico presente en las unidades de la cadena [44].
5.2.6.1 Solubilidad.
La pectina es casi completamente soluble en agua a 25C, pero a pesar de su
solubilidad forma grumos viscosos, por lo tanto para una dilucin ms rpida
se adicionan sales amortiguadoras, azcar o se humedece con alcohol [45].
La pectina tambin es soluble en formamida, dimetilformamida y glicerina
caliente e insoluble en solventes orgnicos, soluciones de detergentes
cuaternarios, polmeros, y protenas [43].
5.2.6.2 Viscosidad.
La pectina en agua forma soluciones viscosas dependiendo de su peso
molecular, grado de esterificacin, pH y concentracin electroltica de la
solucin. Las soluciones de pectina completamente esterificadas no cambian
apreciablemente su viscosidad al variar el pH, pero al disminuir el grado de
esterificacin la capacidad de formar geles se vuelve dependiente del pH. El
calcio y otros iones polivalentes aumentan la viscosidad de las soluciones de
pectinas y algunas pectinas de bajo metoxilo pueden gelificar si la
concentracin de calcio supera un cierto lmite [43].
40
5.2.6.3 Acidez.
El pH de las soluciones de pectina vara de 2.8 a 3.4 en funcin del grado de
esterificacin. Sin embargo, las pectinas son neutras en su estado natural.
Como polielectrolitos las pectinas tienen una constante de disociacin
aparente de 0.1 a 10x10-4 a 19C [46,47].
5.2.6.4 Poder de Gelificacin.
Un gel de pectina puede considerarse como un sistema en el cual el polmero
est en una forma entre completamente disuelto y precipitado. Segmentos de
la cadena molecular estn juntos por cristalizacin limitada para formar una
red tridimensional, en la cual el agua, el azcar y otros solutos se mantienen
unidos por los puentes de Hidrgeno; la aproximacin necesaria de las
cadenas pectnicas es posible por la accin deshidratante del azcar y por la
prdida de electronegatividad de las cadenas del cido pctico. El poder
gelificante de un cido pectnico, depende primeramente de su tamao
molecular, pero esta relacin no se conoce muy bien. No hay mucha
concordancia entre los pesos moleculares obtenidos por distintos mtodos, ni
tampoco es muy satisfactoria su relacin con el comportamiento coloidal. La
capacidad de gelificacin y caractersticas intrnsecas del gel tambin
dependen de la pureza [46,47].
5.2.6.5 Peso molecular.
Los pesos moleculares de las pectinas y su distribucin han sido estudiados
sistemticamente por viscosimetra, determinando que los pesos moleculares
variaban entre 20.000g/mol a 300.000g/mol. El peso molecular de la pectina,
est relacionado con la longitud de la cadena, es una caracterstica muy
importante de la que dependen la viscosidad de sus disoluciones y su
comportamiento en la gelificacin o formacin de jaleas. La determinacin
cuidadosa del peso molecular es difcil, debido a la extrema heterogeneidad
de las muestras y a la tendencia de las pectinas a agregarse, an bajo
condiciones no favorables a la gelacin [46,47].
5.2.6.6 Accin de agentes qumicos, fsicos y bioqumicos.
Otra propiedad importante de las pectinas es la degradacin que presentan
por agentes qumicos, fsicos y/o bioqumicos.
41
42
43
5.3 FUNDAMENTOS
APLICADAS.
TERICOS
DE
LAS
TCNICAS
DE
ANLISIS
44
45
.
Figura 22. Reaccin y mecanismo de saponificacin del cido D-Galacturnico
[53].
46
47
Figura 24. Reaccin de azcar reductor con reactivo de Fehling o Benedict [56].
a)
b)
49
5.3.4 CROMATOGRAFA.
La IUPAC define: La Cromatografa es un mtodo, usado primariamente para
la separacin de los componentes de una muestra, en la cual los componentes
se distribuyen en dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras la otra
se mueve. La fase estacionaria puede ser un slido, un lquido retenido en un
slido o un gel, puede estar extendida como una capa o distribuida como una
pelcula, etc. La fase mvil puede ser lquida o gaseosa [60].
50
51
Xi= datos
x= media
N=nmero de datos
Ecuacin 8 Desviacin Estndar [69].
52
6. METODOLOGA
6.1 MATERIAL VEGETAL.
Se emple una mezcla de cascarilla de cacao Husk, suministrada por una
industria chocolatera de la regin. Esta muestra corresponde a una mezcla de
diferentes especies, la cual se conserva a una temperatura de 4C en bolsas
Zipploc. (Figura 25.).
53
54
55
56
58
59
Agilen
AgilentHPLC ChemStation
Detector
UV, =212 nm
Columna
RP C-18
Flujo
0,4 mL/min
Fase mvil
Temperatura columna
Temperatura detector
35 C
Tiempo corrida
5 min
60
61
6.7.3 GRASAS.
Se realiz por el mtodo de extraccin Soxhlet, usando como solvente ter de
petrleo en relacin 1:10 durante 12 horas, aplicando la norma NTC-668 [81].
6.7.4 FIBRA.
Se realiz segn la norma NTC-668 [81]. A la muestra de pectina
desengrasada y seca, se adicion 200mL de cido sulfrico concentrado y se
someti a reflujo. Se filtr al vaco y sec a 100C, posteriormente se adicion
200mL de NaOH concentrado, se llev a ebullicin durante 30min, se filtr y
lav con agua, HCl y ter de petrleo. Finalmente, se coloc en un crisol
previamente tarado y se llev a la mufla durante 3 horas a 550C.
6.7.5 PROTENAS.
A la muestra de pectina se le realiz una digestin con H 2SO4 concentrado y
posteriormente se destil segn mtodo AOAC 920.87 [82], en un equipo VELP
SCIENTIFICA, el producto de destilacin se valor con HCL 0.00122N
utilizando como indicador mixto (rojo de metilo y azul de metileno).
6.8 ANLISIS ESTADSTICO.
Se realiz un anlisis de varianza (ANOVA de dos factores) con el cual se
evaluaron los parmetros de extraccin de la pectina de la cascarilla de cacao
del Theobroma cacao L, incluyendo pruebas especficas de Shapiro- Wilk,
Levene y el coeficiente de correlacin de Pearson.
Para garantizar los mtodos de identificacin y separacin por CLAE del cido
D-Galacturnico, se evaluaron los parmetros de linealidad, precisin y
reproducibilidad mediante el software InfoStat/E 2008.
62
7 RESULTADOS Y DISCUSION.
CARACTERISTICAS
DESCRIPCIN
Color
Olor
Forma
Las cascarillas usadas en este estudio fueron suministras por una industria
chocolatera de la regin cafetera y corresponden a una mezcla de materias
primas que le confiere una alta heterogeneidad a sus diferentes caractersticas
fsicas y qumicas.
63
64
Tabla 4. Resultados del anlisis preliminar de la pectina extrada de la cascarilla de cacao del Theobroma Cacao L.
PARMETROS
Temperatura Tiempo
DE
(C)
(minutos)
EXTRACCIN
95
95
80
70
100
95
85
75
Peso
equivalente
(mg Pectina/
meq NaOH)
Acidez Libre
(meq
carboxilos
libre/ g pectina)
Contenido
de
Metoxilo
(%)
Grado de
esterificacin
(%)
Contenido de
cido
galacturnico
(%)
24,2827
2914,39
0,34
2,78
72,36
21,85
26,7579
3014,79
0,33
2,54
71,19
20,26
26,7192
2884,30
0,35
2,76
72
21,79
PROMEDIO
25,92
2937,83
0,34
2,70
71,85
21,3
12,0311
2363,04
0,42
2,62
66,67
22,34
12,216
2475,25
0,40
2,82
69,23
23,11
12,379
2482,67
0,40
2,50
66,67
21,27
PROMEDIO
12,21
2440,32
0,41
2,65
67,52
22,24
9,5312
3175,74
0,31
2,81
74,19
21,48
9,7547
2832,78
0,35
2,43
68,97
20,02
9,5072
3101,49
0,32
2,87
74,19
21,99
PROMEDIO
9,6
3036,67
0,33
2,70
72,45
21,16
9,892
2073,02
0,48
2,93
66,2
25,12
11,89
2036,37
0,49
2,86
65,25
24,87
11,118
1997,62
0,50
2,92
65,28
25,37
PROMEDIO
11,00
2035,67
0,49
2,90
65,6
24,8
Numero
de
Ensayos
Rendimiento
(%)
65
Figura 37. Pectina obtenida de la cascarilla de cacao del Theobrama cacao L.,
aplicando el parmetro de extraccin B, temperatura de 95 C y 95 minutos.
Fuente: Autoras
66
Figura 39. Pectina obtenida de la cascarilla de cacao del Theobrama cacao L.,
aplicando el parmetro de extraccin D, temperatura de 70 C y 75 minutos.
Fuente: Autoras
67
68
Tabla 5 Resultados de las caractersticas qumicas evaluadas a la pectina extrada de la cascarilla de cacao del
Theobroma Cacao L., aplicando el diseo factorial 22.
Temperatura de
extraccin (C)
70
70
95
95
Tiempo de
extraccin
(minutos)
75
95
75
95
%
Rendimiento
Acidez libre
AL (meq
carboxilos
libre/ g
pectina)
Peso
equivalente
PE (mg
Pectina/ meq
NaOH)
Contenido de
Metoxilos
%MET
Grado de
esterificacin
%EST
Contenido de cido
Galacturnico
%AG
9,89
0,48
2073,02
2,93
66,2
25,12
11,89
0,49
2036,37
2,86
65,25
24,87
11,12
0,5
1997,62
2,92
65,28
25,37
9,1
0,45
2220,52
3,43
71,05
27,38
8,02
0,4
2484,16
3,31
72,6
25,86
9,35
0,43
2299,86
3,47
72
27,33
7,94
0,24
4143,56
2,37
76
17,7
7,59
0,2
5124,75
2,42
80
17,17
7,6
0,22
4513,05
2,44
78
17,73
12,03
0,42
2363,04
2,62
66,67
22,34
12,22
0,4
2475,25
2,82
69,23
23,11
12,38
0,4
2482,67
2,5
66,67
21,27
69
70
se
1. Hiptesis nula Ho: las medias entre los grupos formados por los factores
tiempo y temperatura son iguales.
2. Hiptesis alterna H1: al menos en alguno de los grupos formados por el
factor tiempo y temperatura son diferentes.
Tabla 8. ANOVA de dos factores para caractersticas qumicas en las
condiciones de extraccin de pectina de la cascarilla de cacao Theobroma
cacao L.
71
Modelo
corregido
Interseccin
Origen
Rendimiento (%)
(meq carboxilos libre/ g
pectina)
(mg Pectina/ meq
NaOH)
Contenido de Metoxilos
(%)
Grado de esterificacion
(%)
Contenido de cido
Galacturnico (%)
Rendimiento (%)
,121 b
12411421,810
1,631 d
gl
Media cuadrtica
Sig.
12,426
31,307
,000
,040
127,746
,000
4137140,603
61,341
,000
,544
60,741
,000
91,022
51,374
,000
149,444 f
49,815
113,134
,000
1182,663
1182,663
2979,626
,000
1,786
1,786
5641,289
,000
97549075,031
97549075,031
1446,343
,000
96,844
96,844
10820,560
,000
60059,675
60059,675
33898,504
,000
6313,547
6313,547
14338,651
,000
,013
,013
,032
,863
,063
,063
199,184
,000
5321033,766
5321033,766
78,894
,000
1,172
1,172
130,936
,000
48,763
48,763
27,523
,001
111,691
111,691
253,661
,000
4,165
4,165
10,494
,012
,011
,011
36,026
,000
2578793,553
2578793,553
38,235
,000
Contenido de Metoxilos
(%)
,407
,407
45,476
,000
Grado de
esterificacion(%)
13,042
13,042
7,361
,027
31,137
31,137
70,716
,000
273,065
Tiempoextr
Contenido de cido
Galacturnico (%)
72
Rendimiento (%)
(meq carboxilos libre/ g
pectina)
Tempextr *
Tiempoextr
Error
Rendimiento (%)
Total
Total
corregida
33,100
33,100
83,394
,000
,047
,047
148,026
,000
4511594,490
4511594,490
66,893
,000
,052
,052
5,811
,042
211,260
211,260
119,238
,000
6,616
6,616
15,025
,005
3,175
,397
,003
,000
539562,788
67445,348
,072
,009
14,174
1,772
3,523
,440
1223,117
12
1,910
12
110500059,629
12
98,547
12
60346,914
12
6466,514
12
40,454
11
,124
11
12950984,597
11
1,702
11
287,239
11
152,967
11
73
Rendimiento
(%)
(meq
carboxilos
libre/ g
pectina)
(mg Pectina/
meq NaOH)
Contenido
de Metoxilos
(%)
Grado de
Gelificacin
(%)
Contenido de
cido
Galacturnico
(%)
70C - 75'
10,97
0,49
2035,67
2,90
65,57
25,12
70C-95'
8,83
0,43
2334,85
3,40
71,89
26,86
95C-75'
7,71
0,22
4593,79
2,41
78,00
17,53
95C-95'
12,21
0,41
2440,32
2,65
67,52
22,24
INTERACCIN
TEMPERATURA
- TIEMPO
74
Contenido de
Metoxilos (%)
Correlacin
de Pearson
Sig.
(bilateral)
N
Contenido de Metoxilos
(%)
Contenido de cido
Galacturnico (%)
,920
**
,000
12
12
Una condicin que se puede utilizar para evaluar la condicin lineal entre el
contenido de metoxilo y de cido galacturnico es la correlacin de Pearson
(ver tabla 11), donde la relacin entre ambas fue de 0,920, lo cual muestra
que hay una correlacin positiva y muy fuerte entre ellas, lo que quiere decir
que a medida que aumenta el contenido de metoxilo aumenta el de cido
galacturnico. Esta tendencia puede apreciarse en la en la grfica 1.
75
Temperatura
de extraccin
(C)
70
Tiempo de
extraccin
(minutos)
Peso
equivalente
PE (mg
Pectina/ meq
NaOH)
Acidez libre AL
(meq carboxilos
libre/ g pectina
95
2220,52
2484,16
2299,86
0,45
0,4
0,43
2334,84
135,3
0,426
0,025
Promedio
Desviacin ()
En la Tabla 12. se presentan los resultados por triplicado del anlisis de acidez
libre y peso equivalente de la pectina extrada, los cuales se determinaron
mediante una titulacin acido-base.
Segn la matriz y parmetros de extraccin, las pectinas presentan diferentes
caractersticas [13]. En el anlisis realizado en este estudio se obtuvo un
promedio de 2334,84mg/meq del peso equivalente, este valor es mayor al
obtenido por otro estudio que usa la cascarilla de cacao como matriz de
extraccin pero difieren las condiciones de pH, tiempo y solucin extractora,
reportando valores del peso equivalente entre 385,47 a 464,61 g/equivalente
[23], sin embargo es muy cercano al reportado por otro autor quien obtuvo
valores entre 2512,5 - 2583,33 mg/meq, usando como matriz la guayaba [84].
La pectina estudiada present un valor de 0,43 meq/g de Acidez Libre, la cual
representa los carboxilos libres en la cadena lineal de la pectina [52], el valor
reportado fue muy cercano al obtenido por otro autor quien analiz la pectina
de mango, reportando valores entre 0,1294 y 0,3734 meq/g [85]. Otros estudios
realizados en Ecuador, usando como matriz cascarilla de cacao (Theobroma
cacao L.), pero variando la solucin extractora (cido clorhdrico y EDTA 0,5 %)
reportaron 1,39 meq/g [21], un resultado mayor al obtenido en este estudio,
atribuido a las diferencias en los parmetros de extraccin de pectina.
76
Temperatur
Contenido
Tiempo de
a de
de
extraccin
extraccin
Metoxilo
(minutos)
(C)
%MET
Contenido de
cido DGalacturnico
% AG
Grado de
esterificacin
%EST
Promedio
3,43
3,31
3,47
3,4
27,38
25,86
27,33
26,84
71,05
72,6
72
71,88
Desviacin ()
0,083
0,864
0,782
70
95
77
ANALISIS
FENOLES TOTALES
(g/100g)
9,45
9,75
9,85
Promedio
9,68
Desviacin ()
0,208
78
CARBOHIDRATOS
TOTALES
(g/100g)
42,18
41,13
42,60
Promedio
42,03
Desviacin ()
0,62
79
80
ESTANDAR
Rf
CIDO DGALACTURNICO
GALACTOSA
RAMNOSA
ARABINOSA
GLUCOSA
0,178
0,507
0,740
0,589
0,548
PECTINA
HIDROLIZADA
0,179 Y 0.781
81
Segn
el
perfil
cromatogrfico
del
estndar
de
cido D-galacturnico (mostrado en la Figura 42, este eluye a 1,890 minutos,
presentndose una buena resolucin.
POR
CLAE
DE
CIDO
D-
82
Estndar
Modelo
correlacin de Person (R)
R cuadrado
R cuadrado corregida
Error de estimacin
cambio en F
Gl
Sig. Cambi en F
7.3.8.2 Precisin
Tabla 18 Repetitividad del estndar de cido D-Galacturnico.
Estndar
Conc
(ppm)
rea 1
rea 2
rea 3
% CV
90
1273157
1273157
1273153
1273155,67
0,0001481
cido
150
1593195
1589293
1587356
1589948
0,1527
Galacturnico
300
2135818
2137310
2153050
2142059,33
0,3639
600
3502523
3279663
3528460
3436882
3,2492
1000
5035702
4815946
5030105
4960584,33
2,0622
83
DIA 1
AREA 2
DIA 2
AREA 3
AREA 1
AREA 2
DIA 3
AREA 3
AREA 1
AREA 2
AREA 3
%CV
90
1259239 1273157 1273157 1273090 1272269 1273060 1273151 1273157 1273153 1271493 0,341
150
1524360 1593195 1589293 1587222 1589012 1589125 1589015 1589073 1587356 1581961 1,291
300
2154431 2135818 2137310 2137211 2147602 2136020 2154870 2155080 2153050 2145710 0,393
600
3343658 3502523 3279663 3528562 3527390 3528112 3528392 3528452 3528460 3477246 2,592
1000
4638130 5035702 4815946 4972996 4940130 4870802 5022892 5027099 5030105 4928200 2,557
Estndar
cido
D-Galacturnico
rea
2100709
2099319
2098820
2099616
Concentracin
%m/m
(ppm)
293.36
293.00
292.87
293.08
36.63%
84
20.), mediante anlisis por CLAE. Otros autores, quienes estimaron este
porcentaje por medio del mtodo colorimtrico sulfamate/3-phenylphenol
obtuvieron 66.0% de cido urnico (usando cido ntrico como solucin
extractora) [22] muy similar al obtenido por Vriesmann, 65.1% [20], el cual
realiza la extraccin de la pectina con cido ctrico, estos porcentajes difieren
al obtenido en este estudio.
Por otro lado, mediante el mtodo de valoracin cido-base, se estim un
porcentaje del 26,84%(Tabla 16) inferior al obtenido mediante anlisis por
CLAE, siendo este ltimo el que arroja ms confiabilidad en la determinacin
del porcentaje de cido D-Galacturnico, debido a la sensibilidad del equipo,
sin embargo ambos mtodos arrojan un resultado inferior al reportado por
otros autores [22,20], lo cual indica que la pectina obtenida no se encuentra
conformada en su totalidad por monmeros de cido D-Galacturnico.
7.4 ANLISIS INFRARROJO DE PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO
(Theorboma Cacao L.).
85
86
Temperatur
Tiempo en Bulbo C
Tiempo en Bulbo D
Densidad
Viscosid
a de ensayo
Viscosid
(Segundos)
(Segundos)
(g/ml)
ad
Peso
25C
ad
dinmica
Molecular
relativa
Nmero de
(cP)
1
1
3 Promedio 1
2
3 Promedio 1
1
3 Promedio
Ensayo
Blanco
1,00 1,00 1,02
1,01
1,19 1,18 1,18
1,18
1,03 1,03 1,03
1,03
0,0269
66851
1,48
Pectina
1,21
1,89
1,09
0,0398
1,20 1,22 1,21
1,88 1,90 1,90
1,08 1,09 1,09
87
Ensayo
1
2
3
4
5
Gramos de Pectina
0.4
0.6
0.8
1.0
1.4
Grado de Gelificacin
250
166.7
125
100
71.4
Realizando todos los ensayos a un pH igual a 3.5, 650Brix y pectina dentro de los
lmites de 0,2 a 1,5% (Figura 45), de forma visual se estableci que el ensayo
nmero 5 present mejores resultados de gelificacin (mayor reduccin y
consistencia), correspondiente a 71.4 (Tabla 22), sin embargo ningunos de los
ensayos gelific de manera apropiada, esto se debe a que la pectina obtenida en
este estudio es de Bajo Metoxilo, por lo tanto se esperaba que la adicin Ca+2
permitiera la gelificacin, tal como se muestra en la Figura 46, sin embargo esta
no se dio, atribuyndolo a la cantidad de cido D-galacturnico esterificados de la
pectina estudiada (Tabla 20 )
88
Mtodo utilizado
extraccin Soxhlet
mtodo Kjendahl
gravimtrico
Resultados
(%)
0,24
7,13
12,69
<0,1
15,04
8 CONCLUSIONES
90
91
9 RECOMENDACIONES
Estandarizar el mtodo de cuantificacin y cualificacin del cido DGalacturnico por Cromatografa de Alta Eficiencia (CLAE).
92
10 BIBLIOGRAFA.
[1]
93
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98
99
ANEXOS.
0,700
0,600
0,500
y = 0,001x + 0,0195
R = 0,9998
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000
0
200
400
600
800
1000
CONCENTRACIN (ppm)
ABSORVANCIA (nm)
0,500
0,400
y = 0,0186x - 0,1033
R = 0,9937
0,300
0,200
0,100
0,000
10
20
30
CONCENTRACIN (ppm)
100
40
BULBO C
(mm2/s2)
cSt/s
BULBO D
(mm2/s2)
cSt/s
40
100
0,01345
0,01354
0,01073
0,01081
101
ANEXO 6. Resultados de anlisis proximal de la pectina extrada de la cascarilla de cacao (Theobroma cacao L.).
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