Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
3. Inverter a lmina sobre esta lamnula e deixar por 1 hora em cmara mida a 37C;
4. Remover a lamnula e lavar 3 vezes em 1xPBD a 45C, por 5 minutos, NO
ESCURO.
6) Caso deseje Amplificar o sinal:
5. Incubar com 40 L de anti-avidina-biotina conjugada (1,0 L anti-avidina + 39 L 1x
PBD) por lmina durante 20 minutos em cmara mida e escura, a 37C
6. Remover a lamnula e lavar 3 vezes em 1xPBD a 45C, por 5 minutos, NO
ESCURO.
7. Sobre uma lamnula colocar 3,5 L de FITC (1:100) + 46,5 L de BSA 5%.
8. Inverter a lmina sobre esta lamnula e deixar por 20 minutos em cmara mida a
37C;
9. Remover a lamnula e lavar 3 vezes em 1xPBD a 45C, por 5 minutos, NO
ESCURO.
7) Montagem das lminas
Incubar a lmina em 1xPBD at a montagem. Na proporo de 25L de meio de
montagem DABCO + 1L de MgCl2 50mM + 1L de soluo de Iodeto de Propdio
(50g/mL); ou 1 L DAPI (2g/mL) por lmina. Guardar no escuro a 4C.
SOLUES
Paraformaldedo 4%:
4 g de paraformaldedo
98 mL de gua destilada a 60C
2mL de NaOH 1 M
NaOH - 1M
1M = peso molecular em 1000 mL
40g - 1000 mL ou 4 g - 100mL
20xSSC - pH 7,0
Cloreto de Sdio - 175,6 g
Citrato de Sdio 2 H2O - 88,2 g
Dissolver em 500 ml de gua no agitador e depois completar para 1 litro.
*** Para a mistura de hibridao preparar separadamente com gua milli-Q, sendo o
volume de 10 mL, filtrar, alicotar e congelar.
Cloreto de Sdio 1,756 g
Citrato de Sdio 2 H2O 0,882 g em 10 mL de gua milli-Q.
2xSSC
20xSSC --------------1000mL
2xSSC----------------