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Universidade Estadual de Londrina

Departamento de Biologia Geral


Laboratrio de Citogentica Animal - LACA

Hibridao in situ por fluorescncia FISH


O protocolo descrito a seguir foi baseado nos procedimentos adotados por Pinkel et al.
1986, com modificaes.
1) Preparaes de lminas
Desidratar em srie de etanol 70% e 100%, 5 minutos cada e logo aps secar ao ar.
2) Tratamento com RNAse
1. Colocar 90 L de RNAse uso (O,4% RNAse/2xSSC) em cada lmina, cobrir com
uma lamnula plstica e incubar a 37C por uma hora em cmara mida. (*J colocar a
formamida 70% para aquecer a 70C).
RNAse uso: 0,4 L de RNAse estoque (10mg/mL) x n de lminas = _____
- 100 L de 2xSSC x n de lminas = _____

2. Lavar as lminas em 2xSSC por 10 minutos a temperatura ambiente no agitador


(depois de 1-2 minutos retirar as lamnulas que estaro boiando)
3. Lavar as lminas em paraformaldedo 4% a temperatura ambiente, por 10 minutos
no agitador.
Paraformaldedo 4% - NA CAPELA: 4g de paraformaldedo despolimerizado
em 98 mL de gua destilada a 60C no agitador.
Acrescentar 2mL de NaOH 1 M

4. Descartar o paraformaldedo no vidro de descarte apropriado e colocar novamente


2xSSC, por 10 minutos, no agitador.
5. Descartar o 2xSSC e colocar 1xPBS, por 5 minutos, no agitador.
6. Descartar o 1xPBS e colocar lcool etlico 70% por 5 minutos, no agitador.
7. Descartar o lcool 70% e colocar o lcool 100% por 5 minutos, no precisa agitar.
8. Descartar o lcool 100% e deixar as lminas secando a temperatura ambiente por
no mnimo 30 min ou no mximo 3 horas (Enquanto isso, preparar o mix de
hibridao e deix-lo a temperatura ambiente ou 37C para dissolver o DNA marcado
no mix e vortexar bastante).

Mix de Hibridao: (quantidade suficiente para uma lmina)


Em um tubo Eppendorf 0,6 mL adicionar:
-7,5 L da sonda marcada,
-30 L de formamida (concentrao final 50%),
-12 L de sulfato de dextrano 50% (concentrao final 10%)
-10,5 L de 20xSSC
(*Misturar bastante o mix de hibridao depois de pronto e deix-la a temperatura
ambiente at o uso)
(Obs: No caso de Double FISH adicionar 7,5 L da sonda 18S e 7,5 L da sonda 5S).

9. Desnaturar as lminas em formamida 70%*** a 70 C por 4 minutos (Tomar


cuidado para no ultrapassar esse tempo e fazer no mximo duas lminas por vez).
***Formamida 70%: - 24,5 mL Formamida
- 10,5 mL 2xSSC

10. Imediatamente desidratar as lminas em srie de etanol 50% e 100% por 5


minutos cada, ambas no gelo. Deixar secar ao ar.
11. Colocar o mix de hibridao no banho-maria previamente aquecido a 80C, por
10 minutos.
12. Retirar e colocar imediatamente no gelo at o uso (no mnimo 10 minutos). (*
Ressuspender o mix de hibridao antes de colocar na lmina, pois o sulfato de
dextrano fica no fundo)
3) Hibridao:
13. Colocar 50 L do mix de hibridao sob lamnula de vidro, colocando em seguida
o lado da lmina com o material em contato com a lamnula. Incubar as lminas de
maneira invertida (lamnula para baixo) em cmara mida a 37C, overnight. (A
cmara mida deve ser preparada com toalhas de papel molhadas com gua destilada
e 2xSSC).
4) Lavagens Ps-hibridao:
1. Colocar as solues de 2xSSC e 1xPBS no banho-maria para aquecer a 45C.
Enquanto isso, preparar a soluo de 1xPBD.

1xPBD (para 1000 mL). Quantidade calculada para lavagem de 4 lminas


200 mL 20xSSC;
6 mL Triton 100;
10 g de leite em p desnatado;
800 mL gua destilada qsp. 100; pH 7,0
2. Lavar as lminas em 2xSSC aquecido a 45C por 5 minutos com agitao, repetir
mais uma vez essa lavagem.
3. Lavar as lminas em 1x PBS aquecido a 45C por 10 minutos com agitao.
5) Deteco e amplificao do Sinal
1. Incubar as lminas em 1xPBD (* At a avidina-FITC estiver pronta).
2. Colocar 50 L da soluo de deteco sobre uma lamnula de plstico.
Soluo de deteco avidina-FITC (quantidade por lmina): 5 L de FITC (1:100) +
45L de BSA 5% x n lminas = ______
para Double FISH 0,25 L de anti-Digoxigenina + 5 L de FITC (1:100) + 44,75 L de

BSA 5% x n lminas = ______

3. Inverter a lmina sobre esta lamnula e deixar por 1 hora em cmara mida a 37C;
4. Remover a lamnula e lavar 3 vezes em 1xPBD a 45C, por 5 minutos, NO
ESCURO.
6) Caso deseje Amplificar o sinal:
5. Incubar com 40 L de anti-avidina-biotina conjugada (1,0 L anti-avidina + 39 L 1x
PBD) por lmina durante 20 minutos em cmara mida e escura, a 37C
6. Remover a lamnula e lavar 3 vezes em 1xPBD a 45C, por 5 minutos, NO
ESCURO.
7. Sobre uma lamnula colocar 3,5 L de FITC (1:100) + 46,5 L de BSA 5%.
8. Inverter a lmina sobre esta lamnula e deixar por 20 minutos em cmara mida a
37C;
9. Remover a lamnula e lavar 3 vezes em 1xPBD a 45C, por 5 minutos, NO
ESCURO.
7) Montagem das lminas
Incubar a lmina em 1xPBD at a montagem. Na proporo de 25L de meio de
montagem DABCO + 1L de MgCl2 50mM + 1L de soluo de Iodeto de Propdio
(50g/mL); ou 1 L DAPI (2g/mL) por lmina. Guardar no escuro a 4C.

SOLUES
Paraformaldedo 4%:
4 g de paraformaldedo
98 mL de gua destilada a 60C
2mL de NaOH 1 M
NaOH - 1M
1M = peso molecular em 1000 mL
40g - 1000 mL ou 4 g - 100mL
20xSSC - pH 7,0
Cloreto de Sdio - 175,6 g
Citrato de Sdio 2 H2O - 88,2 g
Dissolver em 500 ml de gua no agitador e depois completar para 1 litro.
*** Para a mistura de hibridao preparar separadamente com gua milli-Q, sendo o
volume de 10 mL, filtrar, alicotar e congelar.
Cloreto de Sdio 1,756 g
Citrato de Sdio 2 H2O 0,882 g em 10 mL de gua milli-Q.
2xSSC
20xSSC --------------1000mL
2xSSC----------------

x= 100mL de 20xSSC + 900 mL de H2O


Formamida Deionizada
450mL de formamida
2 colheres de ch de resina Resina AG 501/X8 da BIO-RAD (no deixar na luz)
***10 mL de formamida (para a mescla)
***1 colher de pesagem de resina
Colocar no erlemeyer coberto com papel alumnio e colocar no agitador overnight ou
at ficar com uma cor dourada (2 a 3 horas).
***Para filtrar a formamida usar um papel filtro novo e limpo (no usar o milipore).
Colocar 3 folhas de papel filtro na seringa.

Dextran sulfato 50%


5g de dextran
10 mL de gua milli-Q
Alicotar em eppendorf e congelar
RNAse (10mg/mL) - soluo de estoque
0,01 g (10 mg) de RNAse
1 mL de gua milli-Q

Avidina-FITC 500 g/mL (soluo estoque)


5 mg (0,005 g)
10 mL de BSA 5% em 4xSSC/Tween 20
[ ] = 0,005 = 5000 g/10 mL ou 500 g/mL

Avidina-FITC 5 g/mL (soluo uso)


10 L FITC soluo estoque
990 L de BSA 5%

BSA 5% (Bovine Sorum albumine)


Lavar muito bem o frasco com gua milli-Q
Soluo A: 2mL de 20xSSC + 8mL de H2O milli-Q + 200 l de Tween da Gibco = 10
mL
0,5 g de BSA
10 mL da soluo A
Dissolver bem em banho-maria a 60C, filtrar e alicotar em eppendorf e congelar.
10x PBS (soluo estoque)
75,8 g de NaCl (1,36M)
4,14 g de NaH2PO4 (30mM)
Dissolver em 800 mL de gua destilada. Completar para 1 L.
Autoclavar
1xPBS
50 mL de 10x PBS
450 mL de gua destilada