Imagen Molecular de macrfagos infiltrantes de tumores, en un

modelo de ratn preclnicos de cncer de mama

evidencia significativa ha indicado que los macrfagos asociados al tumor
(TAM) desempean un papel crtico en la proliferacin, la invasin, la
angiognesis y la metstasis de una variedad de carcinomas humanos. En este
estudio, se investig si la imagen de fluorescencia en el infrarrojo cercano
(NIRF) utilizando un receptor de manosa de los macrfagos (MMR; CD206)
agente -targeting podra ser utilizado para visualizar de forma no invasiva y
cuantificar los cambios en TAM en vivo. El agente NIRF CD206-focalizacin,
Tinte-anti-CD206, se prepar y se caracteriz in vitro e in vivo. Mediante el uso
de imgenes NIRF, hemos sido capaces de no invasiva macrfagos infiltrantes
de tumor de imagen en el modelo de cncer de mama 4T1 de ratn. Es
importante destacar que, de formacin de imgenes NIRF longitudinal revel el
agotamiento de los macrfagos en respuesta a tratamiento con cido
zoledrnico (ZA). Sin embargo, ZA solo no dio lugar a la inhibicin del
crecimiento tumoral 4T1. por lo tanto, se combinaron anti-macrfagos ZA
terapia y tumor citotxico docetaxel terapia (DTX) en el modelo de ratn. Los
resultados demostraron que esta estrategia de combinacin podra inhibir
significativamente el crecimiento del tumor, as como metstasis de tumores a
los pulmones. Basndose en estos hallazgos, concluimos que la imagen
molecular especfica-CD206 puede detectar con sensibilidad los cambios
dinmicos en los macrfagos infiltrantes de tumor, y que la combinacin de
agotamiento de los macrfagos y la terapia citotxica es una estrategia
prometedora para el tratamiento eficaz de tumores slidos.
Palabras clave: Imgenes pticas, CD206, macrfagos asociadas con el tumor,
el agotamiento de los macrfagos, la terapia guiada por imgenes.
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Introduccin

El cncer de mama es una enfermedad maligna diagnosticada con frecuencia

en las mujeres y es una causa principal de muertes relacionadas con el cncer
en todo el mundo . La mortalidad asociada al cncer de mama como resultado
en gran parte de la diseminacin metastsica de las clulas tumorales a los
rganos vitales como los pulmones, el hgado y la deteccin temprana del
hueso y la mejora de las estrategias de tratamiento podran aumentar
considerablemente las probabilidades de curar o controlar esta enfermedad .
Los tumores slidos, incluidos los de cncer de mama, comprenden no slo las
clulas de tumores malignos, pero tambin muchas clulas circundantes de
diversos tipos que crean un microambiente nico; este microambiente regula

las propiedades neoplsicas de los tumores . macrfagos asociados a tumores

(TAM) son un conjunto de macrfagos que residen en el microambiente
tumoral, y TAM promover la migracin de clulas tumorales y la invasin
mediante la secrecin de citocinas y quimiocinas . Cada vez ms pruebas a
partir de estudios clnicos y preclnicos se ha indicado que TAM promover la
invasin tumoral celular, la proliferacin, la supervivencia y metstasis en sitios
locales y distantes . Varios estudios clnicos han demostrado que el aumento de
la infiltracin de macrfagos en tumores confiere pronstico potencial de
metastsica en cncer de mama . los papeles importantes de TAM en cnceres
sugieren que es importante desarrollar nuevas terapias que se dirigen a estas
clulas . Adems, de imagen no invasiva de infiltrados de macrfagos sera de
gran ayuda en la progresin del cncer mejor comprensin y en la evaluacin
del tratamiento del cncer eficacia.

TAM se consideran macrfagos principalmente polarizadas-M2, tambin

conocido como ( "activados alternativamente") macrfagos no inflamatorias,
que son distintos de los macrfagos inflamatorios (M1, o "clsicamente
activado") . La evidencia ha demostrado que el receptor de manosa de
macrfagos (MMR; CD206) no se expresa en los macrfagos M1; Por lo tanto,
CD206 sirve como un marcador til para distinguir M2 de los macrfagos M1 .
Esto sugiere la posibilidad de formacin de imgenes TAM-dirigida de CD206,
as como terapias dirigidas. Un estudio reciente demostr que una CD206 de
metas de nanocuerpos puede ser utilizado con xito para la tomografa
computarizada por emisin de fotn nico (SPECT) de formacin de imgenes
marcado radiactivamente de los macrfagos en tumores slidos in vivo.
Adems, este radiotrazador tambin se puede utilizar para obtener imgenes
de inflamacin de las articulaciones en un ratn modelo de la artritis
reumatoide .

El cido zoledrnico (ZA) es un bisfosfonato que contiene nitrgeno de tercera

generacin que ha sido aprobado por la Administracin de Alimentos y
Frmacos de Estados Unidos para el tratamiento de la enfermedad sea
inducida por el cncer . ZA previene y trata las metstasis seas en pacientes
con tumores slidos mediante la orientacin osteoclastos , que son macrfagos
que casa con el hueso . ZA reduce el nmero de macrfagos asociados al
tumor y la cantidad de vascularizacin, reduciendo as la carga de metstasis .

En este estudio, se preparo un agente formador de imgenes de fluorescencia

en el infrarrojo cercano (NIRF) que se dirige a CD206, y lo caracteriz in vitro e
in vivo. Nuestro objetivo era investigar si las imgenes NIRF CD206-dirigida

puede ser utilizado para visualizar de forma no invasiva y cuantificar los

macrfagos infiltrantes de tumor, y para guiar la terapia anti-macrfagos
basados en ZA. Adems, hemos desarrollado una estrategia teraputica que
combina anti-macrfagos (ZA) y de clulas anti-tumor (docetaxel; DTX)
terapias, y se investig si esta estrategia de combinacin podra ser utilizado
como un tratamiento eficaz para el cncer de mama en un modelo de ratn.
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Materiales y mtodos
Preparacin del agente de imagen NIRF CD206-focalizacin

El agente de formacin de imgenes NIRF CD206-orientacin (Figura

Figure11A) se gener mediante la conjugacin de un anticuerpo anti-ratn de
CD206 (clon C068C2; IgG2a, isotipo; BioLegend, San Diego, CA) con el ster
de succinimidilo DyLight680 (Pierce, Rockford, IL) de acuerdo con el protocolo
estndar como se describi previamente 20. en pocas palabras, el anticuerpo
se mezcl con el ster de colorante en tampn de bicarbonato (pH 9,0) a una
relacin molar 6: 1. Despus de incubacin durante 1 h a temperatura
ambiente, el conjugado anticuerpo-DyLight680 (tinte de anti-CD206) se purific
con una columna de desalacin PD-10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)
utilizando solucin salina tamponada con fosfato (PBS) como el fago mvil. La
pureza de tinte-anti-CD206 se determin por electroforesis en dodecilsulfato de
sodio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), seguido de formacin de imgenes
NIRF usando un sistema de imgenes IVIS pequeos animales (Xenogen,
Alameda, CA). El agente de formacin de imgenes de control NIRF tinte-IgG se
gener mediante la conjugacin de IgG de control de isotipo (IgG2a, isotipo;
BioLegend, San Diego, CA) con DyLight680 utilizando el mismo protocolo.
Figura 1
Figura 1
(A) El esquema de sntesis del Tinte-anti-CD206. (B) SDS-PAGE y formacin de
imgenes NIRF de anti-CD206 anticuerpo y tinte-anti-CD206. (C) CD206 y F4 /
80 tincin de las clulas RAW 264.7 de macrfagos murinos. (D) tincin de
fluorescencia directa de RAW 264.7 y clulas 4T1 usar tintes de anti-CD206 ...
Cultivo de clulas y tincin de las clulas

El cncer de mama 4T1 murino y 264.7 de macrfagos murinos RAW (CD206positivo 7) se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC,

Manassas, VA). Las clulas fueron cultivadas en medio RPMI 1640 (Invitrogen,
Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 C en
una atmsfera humidificada que contiene 5% de CO2.

Para la tincin de superposicin de CD206 y F4 / 80, las clulas RAW 264.7

cultivadas en 35 mm MatTek placas de cultivo de vidrio de fondo se incubaron
con la rata anti-ratn de CD206 (BioLegend, San Diego, CA) y de conejo antiratn de F4 / 80 (Abcam, Cambridge, MA) anticuerpos primarios durante 1 h a
temperatura ambiente, y despus se incubaron con anticuerpos secundarios
conjugados de colorante durante 1 h. Las clulas se montaron con medio que
contiene DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y se examinan bajo un
microscopio confocal (Wetzler, Heidelberg, Alemania).

Para determinar la inmunorreactividad de tinte-anti-CD206, RAW 264.7 o

clulas 4T1 se incubaron con tinte-anti-CD206 (10 nmol / L en PBS) o tinte-IgG
(10 nmol / L en PBS) durante 1 h a temperatura ambiente . Despus de lavar
con PBS y montaje con medio que contiene DAPI, se examinaron las clulas
bajo un microscopio confocal.
NIRF imgenes de animales pequeos

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las

directrices de la Universidad de Pekn Cuidado de Animales y el empleo
Comisin. El modelo de ratn 4T1 portadores de tumores fue establecido por
va subcutnea inoculacin de 2 x 106 clulas en los flancos delanteros
derecho de / c ratones normales BALB (4 ~ 5 semanas de edad; Departamento
de Animales de Laboratorio de Ciencias, Universidad de Pekn). Para determinar
la especificidad del tumor in vivo de tinte-anti-CD206, cada ratn 4T1 tumorcojinete se inyect por va intravenosa con 0,2 nmol de colorante-anti-CD206
(n = 5) o tinte-IgG (como control; n = 5) . A las 2, 8, 24, y 48 h despus de la
inyeccin (p.i.), los ratones fueron NIRF imagen usando un sistema de
imgenes IVIS pequeos animales (Xenogen, Alameda, CA). Para cada anlisis,
una parte alcuota con una cantidad conocida de solucin inyectada Se
obtuvieron imgenes de forma simultnea. La regin de inters (ROI) se ha
elaborado para cada tumor de las imgenes utilizando software Image
habitable (Xenogen, Alameda, CA) como se describi anteriormente 20, 21. Los
resultados se expresaron como el porcentaje de la intensidad de fluorescencia
mediante la normalizacin de los valores de captacin tumoral ([p / seg / cm2 /
sr] / [/ cm2 mu W]) a la dosis total de inyeccin.

Para ex vivo NIRF de imgenes, dos grupos (n = 4 por grupo) de 4T1 ratones
portadores de tumor se inyectaron por va intravenosa con 0,2 nmol de
colorante-anti-CD206 y tinte-IgG, respectivamente. A las 24 h p.i., los ratones
se sacrificaron, y se recogieron la sangre, tumor y los rganos principales de
cada ratn, se pesaron, y se colocan en un papel en blanco, junto con una
parte alcuota de una cantidad conocida de producto inyectado. a continuacin,
se llev a cabo formacin de imgenes NIRF, y los resultados se presentaron
como el porcentaje de dosis inyectada por gramo (% ID / g).

Para imgenes NIRF longitudinal de la respuesta tumoral a ZA usar tintes de

anti-CD206, se utilizaron dos grupos de 4T1 ratones portadores de tumor (n =
5 por grupo). Cada ratn se inyect por va intraperitoneal con ZA (150 mg / kg
en PBS, diariamente) o PBS (control vehculo) durante 7 das (del da 0 a 6)
despus de completar la exploracin de imgenes de lnea de base NIRF (da
0). Los animales se NIRF con imagen formada de nuevo en los das 3, 7 y 11.
Para cada exploracin, se inyectaron ratones a travs de la vena de la cola con
0,2 nmol de colorante-anti-CD206, y de formacin de imgenes NIRF se realiz
a 24 h p.i.
microbiodistribution intratumoral

Para investigar la microdistribucin de tinte-anti-CD206 en tejidos tumorales

4T1, un ratn BALB / c portadores de tumores 4T1 se inyect por va
intravenosa con 1 nmol de colorante-anti-CD206. A las 24 h p.i., se sacrific el
ratn; el tumor se cosech, se congelaron inmediatamente en ptimo de
reduccin de temperatura (OCT) medio, y luego se corta en rodajas de 5 micras
de grosor. Las rodajas tumorales se incubaron con anticuerpo de conejo antiratn de F4 / 80 de anticuerpos (Abcam, Cambridge, MA) durante 1 h a
temperatura ambiente, y luego se visualizaron utilizando isotiocianato de
fluorescena (FITC) conjugado con anticuerpo secundario bajo un microscopio
confocal. El microdistribucin intratumoral de tinte-IgG (como control) tambin
se determin usando el mismo protocolo.
proliferacin celular y de colonias ensayos de formacin

Se realizaron ensayos de viabilidad celular y la formacin de colonias para

investigar el efecto de ZA, DTX, o ambos en la citotoxicidad de clulas 4T1
tumorales. Para el ensayo de viabilidad celular, las clulas 4T1 (2 103 /
pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron a 37 C durante

la noche. Las clulas se trataron entonces con concentraciones crecientes de

ZA o DTX (con o sin la combinacin de 1 M ZA). Despus de incubacin a 37 C
durante 72 h, la viabilidad celular se determin usando el Cell Counting Kit-8
(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japn).

Para el ensayo de formacin de colonias, las clulas 4T1 (1 x 103 / pocillo) se

sembraron en una placa de 12 pocillos y se incub a 37 C durante la noche.
Las clulas se trataron con medio de cultivo que contiene el control del
vehculo, ZA (10 nM), DTX (10 nM), o ambos ZA (10 nM) y DTX (10 nM) durante
48 h. Despus, medio de cultivo celular se cambi, y se dej que las clulas
crecieran durante otros 120 horas a 37 C hasta que las colonias de clulas
eran visibles. Las clulas fueron teidas con 0,1% de Coomassie Brilliant Blue y
se examinaron por microscopa.
En la terapia de tumores in vivo y el examen metstasis de pulmn

los ratones con tumores de aproximadamente 150 mm3 fueron separados en

cuatro grupos 4T1 portadores de tumores: el control del vehculo (n = 24), el
tratamiento ZA (n = 24), el tratamiento DTX (n = 8), y ZA adems DTX
tratamiento (n = 8) grupos. Los animales fueron inyectados por va
intraperitoneal con el control del vehculo, ZA (150 mg / kg en PBS,
diariamente), DTX (5 mg / kg en 13% de etanol, al da), y las dos ZA (150 mg /
kg en PBS, diariamente) y DTX ( 5 mg / kg en 13% de etanol, al da) durante 7
das (del da 0 al da 6). El crecimiento tumoral se midi usando un calibrador, y
el volumen del tumor se calcul usando la frmula: volumen = longitud x
anchura2 / 2. Cuatro ratones de cada uno de los grupos control del vehculo y
de tratamiento ZA fueron sacrificados cada da en los das 0, 3, 7, y se
cosecharon 11. Los tejidos tumorales, se congelaron en medio PTU, y se cortan
en rodajas de 5 micras de grosor. Se realiz a continuacin, tincin de
inmunofluorescencia para determinar CD206 y F4 / 80 niveles de expresin.

Al final (da 12) del estudio de terapia in vivo, se recogieron tejidos tumorales
de cada grupo, y el corte congelado en rodajas 5-m de espesor para la tincin
de inmunofluorescencia de los niveles de Ki67. metstasis de tumor de pulmn
se examin utilizando un anteriormente descrito mtodo de 22. En resumen,
los pulmones de cada ratn se rellenan con tinta India 15% a travs de la
trquea superior y se fijaron en solucin (100 ml de 70% de alcohol de Fekete,
10 ml de formalina al 4%, y 5 ml de cido actico glacial). Las lesiones
metastsicas aparecen como ndulos blancos en las superficies del pulmn
negro despus de este procedimiento. Despus de ser fotografiado, los

pulmones se incluyeron en parafina, corte en secciones, y se sometieron a

hematoxilina y eosina (H & E) tincin.
la tincin de inmunofluorescencia de tejidos

Ex vivo la tincin de inmunofluorescencia de tumor 4T1 o tejidos normales se

realiz para validar los resultados de los estudios in vivo. Se llevaron a cabo los
experimentos, y los resultados de la tincin fueron analizadas por dos
investigadores (D. y C. Gao Zhang) que fueron cegados a los resultados del
tratamiento de imgenes y de tumores in vivo NIRF.

Para CD206 y F4 / 80 tincin de superposicin, tumor 4T1, msculo, hgado, o

cortes de tejido de bazo se incubaron con la rata anti-ratn de CD206
(BioLegend, San Diego, CA) y de conejo anti-ratn de F4 / 80 (Abcam,
Cambridge, MA ) anticuerpos primarios durante 1 h a temperatura ambiente, y
luego se visualizaron con Cy3 o anticuerpos secundarios conjugados con FITC
con un microscopio confocal. Para la tincin de Ki67, las rodajas tumorales se
incubaron con anticuerpo de conejo anti-Ki67 (Millipore, Billerica, MA). Las
rodajas se visualizaron luego con el anticuerpo secundario conjugado con Cy3
bajo un microscopio confocal. Despus de la tincin, se seleccionaron 10 vistas
aleatorias en las rodajas de tumores para los anlisis. El nivel de expresin
CD206 murino se calcul mediante la medicin de la densidad ptica integrada
de imgenes de un rea equivalente utilizando un mtodo descrito
previamente 23. El ndice de proliferacin de clulas tumorales se calcul como
el porcentaje de clulas Ki67 positivas 24.
anlisis estadstico

Los datos cuantitativos se expresan como medias SD. Los datos se

analizaron usando GraphPad versin 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA).
Las diferencias se analizaron mediante prueba t de Student o ANOVA, y los
resultados se consideraron estadsticamente significativas en los valores de p
<0,05.
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resultados
Sntesis de tinte anti-CD206

Hemos sintetizado el agente de formacin de imgenes NIRF CD206focalizacin, Tinte-anti-CD206, conjugando directamente el anticuerpo antiCD206 con un colorante NIRF (Figura Figure11A). La relacin de colorante a la
protena para el tinte-anti-CD206 se calcul que era 3,2 en base a mediciones
ultravioletas de A280 y A684. Por SDS-PAGE y formacin de imgenes NIRF
posterior, no se observ tinte libre en el producto final (Figura Figure11B), lo
que demuestra su alta pureza.
En la tincin de clulas vitro

A continuacin se investig la inmunorreactividad in vitro de tinte anti-CD206.

Desde CD206 se expresa en la superficie de los macrfagos en los tejidos
tumorales y no en las mismas clulas tumorales, elegimos 264.7 clulas de
macrfagos de ratn RAW como una lnea de clulas tumorales CD206-positivo.
Nuestros resultados de la tincin de clulas confirmaron claramente que las
clulas RAW 264.7 fueron CD206-positivo, y que estas clulas altamente
expresado F4 / 80 (Figura Figure11C), otro biomarcador de macrfagos. luego
teidas las clulas RAW 264.7 CD206 positivas usar tintes de anti-CD206.
Como se muestra en la Figura Figure11D, Tinte-anti-CD206 puede etiquetar
especficamente a las clulas RAW 264.7 CD206-positivo, mientras que TinteIgG fue capaz de teir estas clulas, demostrando la especificidad de CD206tinte-anti-CD206. Las clulas 4T1 se incubaron con tinte-anti-CD206 no
mostraron tincin, lo que confirma que CD206 no se expresa en la superficie
celular 4T1 tumor.
Biodistribucin de tinte anti-CD206 in vivo

A continuacin se determin la vivo tumor en la seleccin de caractersticas de

tinte-anti-CD206 en 4T1 ratones BALB / c portadores de tumores. imgenes de
fluorescencia representativas en diferentes momentos despus de la inyeccin
de tinte anti-CD206 se muestran en la Figura Figure22A. Tinte-IgG se utiliz
como control. Los tumores 4T1 eran claramente visibles con alto contraste con
respecto al fondo a partir de las 8 h p.i. Tinte-IgG mostr captacin tumoral
baja, debido a la falta de focalizacin de este agente. La captacin tumoral
cuantificada de tinte-anti-CD206 fue significativamente mayor que la de tinteIgG en los puntos de todos los tiempos examinados (P <0,001; Figura
Figure22B).
Figura 2
Figura 2

(A) En vivo NIRF de imgenes de 4T1 ratones normales BALB / c portadores de

tumor a los 2, 8, 24, y 48 h despus de la inyeccin intravenosa de coloranteanti-CD206 o tinte-IgG. Los tumores se indican por los crculos de trazos. (B)
Cuantificacin y la cintica de las caractersticas de orientacin tumorales in
vivo ...

Para investigar la biodistribucin de tinte anti-CD206 o tinte-IgG en las 4T1

tumores y tejidos normales, se realiz ex vivo de imgenes NIRF a las 24 h p.i.
en otro estudio. Blood, tumor, y los rganos normales se pesaron, se determin
el total de la seal de fluorescencia, y se calcul el% ID / g. Como se muestra
en la Figura Figure22C, D, la absorcin de tinte-anti-CD206 en la mayora de los
rganos normales era comparable a la de tinte-IgG. Sin embargo, la captacin
tumoral de tinte-anti-CD206 fue significativamente mayor que la de tinte-IgG
(13,23 2,78% vs. 7,30 0,84%, P <0,01), que es consistente con los datos
de imagen en vivo NIRF en ratones vivos . Se observ que la absorcin de tinteanti-CD206 en el hgado fue tambin significativamente superior a la de tinteIgG (19,07 4,12% vs. 11,55 3,03%, P <0,05).
La tincin de inmunofluorescencia

Se investigaron los patrones de expresin de CD206 en tejidos tumorales 4T1

mediante tincin de inmunofluorescencia. Como se muestra en la Figura
Figure33A, tejidos tumorales 4T1 fueron positivos tanto para F4 / 80 y CD206.
tincin de superposicin mostr que la mayora de la zona de CD206-positivo
tambin se tieron para F4 / 80, como se esperaba en los macrfagos. Los
resultados confirmaron la expresin positiva de CD206 en los macrfagos de
los tejidos tumorales 4T1. Para examinar el tejido normal, el msculo no
expres F4 / 80 o CD206, mientras que el hgado y el bazo expresan altos
niveles de F4 / 80 y CD206 (Material complementario: Figura S1).
figura 3
figura 3
(A) Superposicin de la tincin de inmunofluorescencia de F4 / 80 y CD206 en
4T1 tejido tumoral. (B) La tincin de inmunofluorescencia de F4 / 80 en tejidos
tumorales 4T1 recogidas de ratones portadores de tumores 24 h despus de la
inyeccin de tinte-anti-CD206 o tinte-IgG. El color verde del FITC para ...
microbiodistribution intratumoral de tinte anti-CD206

Adems, investig la microdistribucin intratumoral de tinte anti-CD206 en

tejidos tumorales 4T1. Se cosecharon el tejido del tumor de un ratn 4T1
portadores de tumores a las 24 h p.i. de tinte anti-CD206. Los tejidos tumorales
se tieron para F4 / 80 para localizar los macrfagos. Como se muestra en la
Figura Figure33B, en comparacin con las seales de tinte-IgG, se observaron
seales de DyLight680 ms fuerte en los tejidos tumorales 4T1. Es importante
destacar que la mayor parte de la zona de tinte-anti-CD206-positivo tambin
fue positiva para F4 80 de tincin /, mientras que la ubicacin de tinte-IgG no
mostr evidente co-localizacin con F4 / 80. Estos resultados demostraron la
localizacin de macrfagos-dirigida de tinte anti-CD206 en 4T1 tumores.
NIRF de imgenes longitudinal de tinte anti-CD206 in vivo

Se realiz formacin de imgenes NIRF serie utilizando tinte-anti-CD206 en el

modelo de ratn portador de tumor 4T1 para determinar si se puede utilizar
para controlar dinmicamente la expresin de CD206 durante la terapia antimacrfagos utilizando ZA. exploraciones NIRF tanto de control y ratones
tratados tumorales 4T1-ZA se adquirieron en los das 0, 3, 7, y 11. Como se
muestra en la Figura Figure44A, Tinte-anti-CD206 mostr la captacin de alto
contraste en el control y tratados 4T1-ZA tumores en el da 0. con el
tratamiento ZA, la intensidad de fluorescencia del tinte-anti-CD206 en los
tumores tratados con ZA disminuyeron gradualmente en relacin con la de los
tumores de control. La captacin tumoral cuantificada de tinte-anti-CD206 en
los tumores tratados con ZA fue significativamente menor que en los tumores
de control en los das 3 (5,27 0,86% vs. 7,22 1,36%, P <0,05), 7 (5,40
0,69 % vs. 7,63 0,85%, P <0,01), y 11 (6,27 0,11% frente a 7,76 0,84%;
p <0,05) (Figura Figure44B). La captacin tumoral inferior de tinte-anti-CD206
en los tumores tratados con ZA comparacin con la de los tumores de control
sugiere una disminucin en la expresin de CD206.
Figura 4
Figura 4
Longitudinales imgenes in vivo NIRF (A) y captacin tumoral cuantificada (B)
de 4T1 ratones portadores de tumores a las 24 horas despus de la inyeccin
de tinte anti-CD206 en los das 0, 3, 7 y 11 despus del cido zoledrnico (ZA;
150 mg / kg en PBS al da durante 7 das) o PBS tratamiento (control). ...

Para validar los resultados de las imgenes dinmicas en vivo, hemos realizado
ex vivo tincin de inmunofluorescencia tanto CD206 y F4 / 80. Los resultados
de la tincin de superposicin de CD206 y F4 / 80 se muestran en Material

complementario: Figura S2, y los resultados de tincin para CD206 slo se

muestran en la Figura Figure44C. La expresin de CD206 en los tumores
tratados con ZA fue significativamente menor en los das 3 (33.41 6.03% vs.
82.99 20.73%, p <0,001), 7 (51,29 19,50% frente a 113,43 28,04%, P
<0,01) y 11 (42,08 10,91% vs 104.89 30.49%, p <0,01) en comparacin a
la de los tumores de control (Figura Figure44D), que confirm la reduccin de la
expresin de CD206 en el tumor despus del tratamiento 4T1 ZA. Estos
resultados demostraron que el tratamiento ZA de hecho puede resultar en el
agotamiento de los macrfagos CD206-positivo, y este agotamiento se pueden
visualizar de forma no invasiva in vivo mediante formacin de imgenes de
tinte anti-CD206 NIRF.
La terapia combinada utilizando ZA y DTX

La citotoxicidad in vitro de ZA y DTX se determin en clulas 4T1 tumorales.

Como se muestra en la Figura Figure55A, el tratamiento con ZA s solo no tiene
un efecto evidente sobre la proliferacin de clulas 4T1, lo que sugiere que ZA
no tiene ningn efecto citotxico sobre las clulas tumorales. En contraste, se
observ un notable efecto anti-proliferacin de tratamiento con DTX solo, con
la viabilidad celular de menos de 30% del control despus del tratamiento con
dosis mayores de 10 nM. La terapia combinada utilizando DTX y ZA mostr una
curva de inhibicin de clulas tumorales casi idntica a la de DTX solo, lo que
sugiere que no hubo un incremento en el efecto antitumoral cuando se
combina el tratamiento DTX y ZA in vitro.
Figura 5
Figura 5
(A) efecto citotxico in vitro de cido zoledrnico (ZA), docetaxel (DTX), o ZA
ms DTX en 4T1 clulas tumorales. (B-C) Fotografa de la placa de pocillos 12
(B) y el examen de microscopa (C) de la formacin de colonias de clulas 4T1
tratadas con el control del vehculo, ...

Se observaron resultados similares en el ensayo de formacin de colonias de

clulas 4T1. Como se muestra en la Figura Figure55B, C, en el grupo de
tratamiento ZA, las colonias de clulas formadas eran comparables con la del
grupo de control. Sin embargo, DTX o ambos DTX y el tratamiento ZA
condujeron a una inhibicin significativa en la formacin de colonias de clulas
4T1. En general, los vitro de proliferacin celular y la formacin de colonias en
los estudios demostraron que ZA no tener un efecto anti-tumoral, mientras que
DTX tuvo notable citotoxicidad in vitro.

A continuacin cambiamos a los estudios de terapia in vivo combinados en los

ratones portadores de tumores 4T1. Elegimos una dosis relativamente baja (5
mg / kg) de DTX con el fin de observar el efecto antitumoral de la terapia
combinada. Como se muestra en la Figura Figure55D, la curva de crecimiento
del tumor en el grupo tratado con ZA era casi idntica a la del grupo control.
tratamiento DTX condujo a la inhibicin del crecimiento tumoral leve en el da
8, pero no se encontr ninguna diferencia estadsticamente significativa en el
crecimiento del tumor en comparacin con la del grupo control. En contraste, el
tratamiento con DTX ms ZA comenz a mostrar una tendencia del efecto
teraputico en el da 4, y mucho menos el crecimiento del tumor se observ
desde el da 10 (286,84 93,42 frente a 657,09 377,98 mm3; P <0,05) al
da 12 (349,18 100,58 810,97 431,91 vs. mm3; P <0,01) en comparacin
con la del grupo control. Estos hallazgos sugieren que la deplecin combinada
macrfagos (ZA) y la terapia citotxica (DTX) ejercen un fuerte efecto
teraputico contra 4T1 tumores in vivo.
La validacin de la eficacia de la terapia combinada

Se realiz la tincin de inmunofluorescencia Ki67 para examinar la proliferacin

celular en los tumores que reciben ZA, DTX, o ambos tratamientos ZA y DTX.
Como se muestra en la Figura Figure66A, B, tratamiento ZA no caus una
disminucin significativa en el ndice de proliferacin celular (P> 0,05). En
contraste, el ndice de proliferacin celular en el grupo de terapia combinada
ZA y DTX (5,38 1,07%) fue significativamente menor que en el control (46,24
7,15%, p <0,001) y se trat-DTX (17,97 4,76%; P <0,05) tumores.
Figura 6
Figura 6
(AB) La tincin de inmunofluorescencia de Ki67 (A) y las clulas Ki67 positivas
por ciento (B) en los tejidos 4T1 tumorales cosechadas en el da 12 de ratones
tratados con vehculo (control), el cido zoledrnico (ZA), docetaxel (DTX), o ZA
plus DTX. (C-E) Las fotografas de la India lleno de tinta ...

clulas 4T1 son clulas de cncer de mama altamente metastsicas, que

pueden conducir a la metstasis evidente en los ratones despus de la
inoculacin 25, 26. Por lo tanto, se investig an ms el efecto anti-metasttica
de ZA, DTX, y ZA ms DTX en los ratones portadores de tumor 4T1. Las
imgenes representativas de los pulmones y los nmeros contados de las
lesiones metastsicas en los diferentes grupos se muestran en la Figura

Figure66C y la Figura Figure66D, respectivamente. En el grupo de control, todos

los ratones tenan una amplia metstasis de tumores en los pulmones en el da
12. Los nmeros contados de tumores en los pulmones fueron 11,67 1,52,
2,00 1,73, 8,00 2,00 y 0,67 0,58 para el control, ZA, DTX , y los grupos
ms ZA DTX, respectivamente. tratamiento ZA condujo a la formacin de un
nmero significativamente menor de las lesiones metastsicas pulmonares en
comparacin con la del grupo de control (P <0,001). No se observ ninguna
metstasis de pulmn evidente en el grupo de tratamiento ZA ms DTX. El
examen histolgico mediante tincin H & E confirm la reduccin en las
lesiones tumorales despus del tratamiento con ZA ZA o ambos y DTX (Figura
Figure66E). Estos resultados sugieren que ZA tuvo efectos significativos sobre
la inhibicin de la metstasis tumoral, y que ZA ms DTX metstasis inhibi
casi completamente de los tumores a los pulmones.
Ir:
Discusin

En este estudio, hemos preparado un agente de imagen NIRF-dirigida de

CD206 de ratn, Tinte-anti-CD206, y demostr su potencial en la visualizacin
no invasiva de TAM en vivo por imgenes NIRF usar tintes de anti-CD206. Se
evalu la eficacia de tinte anti-CD206 en el modelo de cncer de mama 4T1 de
ratn, en el que tanto los macrfagos y las clulas tumorales eran de origen
murino. Creemos que este modelo imita mejor la situacin clnica en
comparacin con un modelo de ratn que lleva xenoinjertos de tumores
humanos. Se observ que la lnea celular de macrfagos RAW 264.7, pero no
las clulas tumorales 4T1, expresa CD206. Con los estudios microdistribucin
intratumoral, se confirm que el tinte anti-CD206 localiza en los macrfagos de
los tejidos tumorales 4T1 (Figura Figure33B).

Debido a los papeles fundamentales de TAM en la progresin, invasin y

metstasis de cnceres, recientemente se han realizado varios estudios
pioneros para desarrollar agentes radiomarcados para la formacin de
imgenes molecular de TAM en modelos animales. Movahedi et al. 14
informaron el desarrollo de nanocuerpos anti-CD206 99mTc-labled in vivo para
SPECT de TAM. Alta especificidad de CD206 nanocuerpos anti-CD206 99mTclabled se observ en los tumores slidos, lo que demostr la posibilidad de
formacin de imgenes CD206-selectiva de subpoblaciones de TAM en vivo 14.
Adems de los anti-CD206 nanocuerpos, varias nanopartculas modificadas por
el ligando natural de CD206, manosa , tambin se investigaron para la imagendirigida de TAM 27 y la entrega guiada por imagen molecular de los frmacos
qumicos 28. en comparacin con radiotrazadores que se han descrito

previamente 14, 15, 27, agentes de imagen NIRF como tinte anti-CD206 son un
costo relativamente bajo. Su sntesis es tambin sencilla y no conlleva el riesgo
de exposicin a la radiacin. Por otra parte, la imagen de fluorescencia es
policromtica, lo que permite obtener imgenes multicolor usando fluorforos
con diferentes longitudes de onda de emisin 29, 30. Agentes para orientar las
clulas tumorales 4T1 no estaban disponibles para nosotros; Por lo tanto,
decidimos probar la imagen de dos colores en el portador de un tumor A549
modelo de ratn desnudo, en el que las clulas A549 son epidrmico humano
receptor del factor de crecimiento 2 (HER2) -positivo 31, y los macrfagos
infiltrantes de tumores son CD206-positivo ( material complementario: Figura
S3 B). A travs de HER2-especfica simultnea (mediante DyLight755
etiquetado anticuerpo anti-HER2 [Dye755-anti-HER2]) y CD206-especfica
(usando tinte anti-CD206) de imgenes NIRF, podramos simultneamente las
clulas tumorales de imagen y macrfagos in vivo (Figura S3 A) . Por ex vivo
tincin de fluorescencia, hemos demostrado que no se encontr ninguna
superposicin entre HER2 y CD206 (Figura S3B), lo que confirma la expresin
distinto de estos marcadores en las clulas tumorales y los macrfagos
infiltrantes de tumor, respectivamente. Estos resultados confirmaron adems
que el agente de imagen del tinte-anti-CD206 se une in vivo a TAM pero no a
las clulas tumorales.

Mediante el uso de imgenes in vivo NIRF en, hemos demostrado la orientacin

especfica de tinte-anti-CD206 en tejidos tumorales 4T1, como lo demuestra la
captacin tumoral significativamente mayor de tinte-anti-CD206 en
comparacin con la de tinte-IgG (Figura Figure22A, B ). Desde imgenes de
fluorescencia tiene limitaciones en la penetracin en el tejido y la intensidad de
fluorescencia de cuantificacin de 32 aos, hemos realizado estudios de
biodistribucin ex vivo para validar los resultados de las imgenes en vivo. Ex
vivo resultados de biodistribucin fueron consistentes con los resultados de
formacin de imgenes in vivo en los animales vivos, que muestra la absorcin
de tumor significativamente mayor de tinte-anti-CD206 en comparacin con el
control de isotipo (Figura Figure22C, D). Un estudio previo 14 usando
nanocuerpos anti-CD206 99mTc-labled han demostrado alta captacin en el
bazo, debido a la alta expresin de CD206 en este rgano (Material
complementario: Figura S1). Sorprendentemente, en el estudio de
biodistribucin ex vivo no se observ una captacin significativa de tinte antiCD206 en el bazo. Este resultado fue consistente con el de un estudio
recientemente publicado 28, que tambin mostr baja captacin de un agente
de CD206 orientada en el bazo in vivo, a pesar del bazo que muestra una
fuerte tincin para CD206. Este fenmeno puede explicarse por diferentes
cinticas de las sondas CD206 orientada en el tumor y el bazo, debido a las
propiedades fisiolgicas distintas (por ejemplo, el flujo sanguneo, la
permeabilidad vascular, y la presin fisiolgica) de estos rganos. Los

macrfagos CD206-positivo en el tumor y el bazo tambin pueden diferir

significativamente como resultado de las diferencias en sus microambientes.
Adems, slo hemos determinado la biodistribucin in vivo de tinte anti-CD206
en un punto temporal (24 h), que pueden no haber captado la captacin
mxima de esta sonda en el bazo. En estudios futuros, la observacin a largo
plazo (por ejemplo, desde 1 h hasta 240 h) de los comportamientos in vivo de
tinte anti-CD206 puede ser necesaria para caracterizar mejor la absorcin de
esta sonda de imagen ptica en los rganos normales.

En contraste con el bazo, el hgado, otro CD206-expresin de rgano alto

(Material complementario: Figura S1), mostr la acumulacin de alta y
especfica de tinte-anti-CD206, como lo demuestra la significativamente mayor
captacin de tinte-anti-CD206 en comparacin con la de tinte-IgG en este
rgano (Figura Figure22D). Niu et al. 28 recientemente tambin mostraron que
el agotamiento de los macrfagos por ZA condujo a una reduccin en la seal
de las nanopartculas fluorescentes dirigidos-CD206 en el hgado. Sin embargo,
en un estudio reciente 33, se demostr que la gran mayora de las clulas
CD206 positivas en el hgado son clulas endoteliales CD31-positivo (en lugar
de macrfagos) y que el agotamiento de los macrfagos no dio lugar a
reduccin de la seal en el hgado. Una posible explicacin de la discordancia
en estos resultados es que el hgado no es slo un rgano CD206-positivo, pero
tambin un rgano de aclaramiento, de manera que las macromolculas
portadoras de seal, tales como el anticuerpo intacto (utilizado en este
estudio) y nanopartculas (utilizado en el 28) se borran a travs de la va
heptica.

En este estudio, hemos examinado el efecto del tratamiento con ZA en el

modelo de ratn portador de un tumor 4T1. ZA se ha demostrado que disminuir
el nmero de macrfagos tumor infiltrante 34, 35; tambin, ms
concretamente, para poder agotar TAM por revertir la polarizacin de los
macrfagos de un M2 a un fenotipo M1 36, 37. Mediante la tincin de
inmunofluorescencia, se observ que el tratamiento ZA llev a la deplecin de
CD206-positivo macrfagos (Figura Figure44C ).lugar a la inhibicin del
crecimiento tumoral 4T1. por lo tanto, se combinaron anti-macrfagos ZA
terapia y tumor citotxico docetaxel terapia (DTX) en el modelo de ratn. Los
resultados demostraron que esta estrategia de combinacin podra inhibir
significativamente el crecimiento del tumor, as como metstasis de tumores a
los pulmones. Basndose en estos hallazgos, concluimos que la imagen
molecular especfica-CD206 puede detectar con sensibilidad los cambios
dinmicos en los macrfagos infiltrantes de tumor, y que la combinacin de

agotamiento de los macrfagos y la terapia citotxica es una estrategia

prometedora para el tratamiento eficaz de tumores slidos
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