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Legislao

Para verificar a atualizao desta norma, como revogaes ou alteraes, acesse o Visalegis.

Resoluo - RE n 899, de 29 de maio de 2003

D.O.U. 02/06/2003

O Adjunto da Diretoria Colegiada da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, no uso da atribuio, que lhe confere a
Portaria n. 238, de 31 de maro de 2003,
considerando o disposto no art.111, inciso II, alnea a 3 do Regimento Interno aprovado pela Portaria n 593, de
25 de agosto de 2000, republicada no DOU de 22 de dezembro de 2000,
considerando que a matria foi submetida apreciao da Diretoria Colegiada, que a aprovou em reunio realizada
em 6 de maro de 2003, resolve:
Art. 1 Determinar a publicao do "Guia para validao de mtodos analticos e bioanalticos" anexo
Art. 2 Fica revogada a Resoluo RE no 475, de 19 de maro de 2002.
Art. 3 Esta Resoluo entra em vigor na data de sua publicao.
DAVI RUMEL

ANEXO
GUIA PARA VALIDAO DE MTODOS ANALTICOS E BIOANALTICOS
MTODOS ANALTICOS
1. Consideraes gerais
1.1. As informaes contidas nesse Anexo apresentam as caractersticas a serem consideradas durante a validao
de procedimentos analticos. O objetivo de uma validao demonstrar que o mtodo apropriado para a finalidade
pretendida, ou seja, a determinao qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa de frmacos e outras substncias
em produtos farmacuticos.
1.2. Essas informaes aplicam-se a:
1.2.1. tcnicas analticas que faam uso de mtodos de cromatografia gasosa (CG) ou cromatografia lquida de alta
eficincia (CLAE);
1.2.2. mtodos no-cromatogrficos, desde que estes ofeream uma seletividade aceitvel (por ex. titulometria,
espectrofotometria UV-VIS);
1.2.3. testes imunolgicos ou microbiolgicos, desde que observado o grau de variabilidade usualmente associado a
estas tcnicas.
1.3. A validao deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o mtodo atenda s exigncias das aplicaes
analticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar especificidade, linearidade,
intervalo, preciso, sensibilidade, limite de quantificao, exatido, adequados anlise.
1.4. Deve-se utilizar substncias de referncia oficializadas pela Farmacopia Brasileira ou, na ausncia destas, por
outros cdigos autorizados pela legislao vigente. No caso da inexistncia dessas substncias, ser admitido o uso
de padres de trabalho, desde que a identidade e o teor sejam devidamente comprovados.

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1.5. Para efeito desse guia, considera-se corrida analtica as medies sucessivas de um mesmo analito, efetuadas
nas mesmas condies: mtodo, analista, instrumentao, local, condies de utilizao e em intervalo de tempo
curto entre as medies.
1.6. No caso de metodologia analtica descrita em farmacopias ou formulrios oficiais, devidamente reconhecidos
pela ANVISA, a metodologia ser considerada validada.
1.7. No caso de metodologia analtica no descrita em farmacopias ou formulrios oficiais, devidamente
reconhecidos pela ANVISA, a metodologia ser considerada validada, desde que sejam avaliados os parmetros
relacionados a seguir, conforme especificado nas Tabelas 1 e 2.
1.7.1. Especificidade e Seletividade
1.7.2. Linearidade
1.7.3. Intervalo
1.7.4. Preciso
1.7.5. Limite de deteco (sensibilidade)
1.7.6. Limite de quantificao
1.7.7. Exatido
1.7.8. Robustez
1.8. No caso da transferncia de metodologias da matriz para suas subsidirias no Brasil e/ou das empresas
nacionais para os centro de estudos de equivalncia farmacutica, a metodologia ser considerada validada, desde
que sejam avaliados os parmetros de preciso, especificidade e linearidade. Cpia de toda a documentao original
da validao da metodologia dever ser anexada, como prova de que a metodologia foi originalmente validada e
dever conter, no mnimo, todos os parmetros relacionados no item 1.7.
1.9. Para a garantia da qualidade analtica dos resultados, todos os equipamentos utilizados na validao devem
estar devidamente calibrados e os analistas devem ser qualificados e adequadamente treinados.
1.10. Os testes so classificados em 4 categorias, conforme a Tabela 1.
Tabela 1. Classificao dos testes, segundo sua finalidade:
Categoria
I
II
III
IV

Finalidade do teste
Testes quantitativos para a determinao do princpio ativo
em produtos farmacuticos ou matriasprimas
Testes quantitativos ou ensaio limite para a determinao de
impurezas e produtos de degradao em produtos
farmacuticos e matrias-primas
Testes de performance (por exemplo: dissoluo, liberao
do ativo)
Testes de identificao

1.11. Para cada categoria ser exigido um conjunto de testes, relacionados na Tabela 2.
Tabela 2. Ensaios necessrios para a validao do mtodo analtico, segundo sua finalidade:

Parmetro
Especificidade
Linearidade
Intervalo
Repetibilidade
Preciso
Intermediria
Limite de deteco
Limite de quantificao
Exatido

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Categoria Categoria II
I

Sim
Sim
Sim
Sim
**
No
No
Sim

Ensaio
Quantitativo
limite
Sim
Sim
No
Sim
*
Sim
No
Sim
No
**
Sim
No
No
Sim
*
Sim

Categoria Categoria
III
IV
*

Sim

No

No

Sim

No

**

No

No

No

No

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Robustez

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Sim

Sim

Sim

No

No

* pode ser necessrio, dependendo da natureza do teste especfico.

** se houver comprovao da reprodutibilidade no necessria a comprovao da Preciso Intermediria.
1.12. metodologia analtica dever ser revalidada nas seguintes circunstncias:
1.12.1. mudanas na sntese da substncia ativa;
1.12.2. mudanas na composio do produto acabado;
1.12.3. mudanas no procedimento analtico.
Determinadas outras mudanas podem requerer validao tambm, dependendo da natureza das mudanas.
2. Metodologia
2.1. Especificidade e Seletividade
a capacidade que o mtodo possui de medir exatamente um composto em presena de outros componentes tais
como impurezas, produtos de degradao e componentes da matriz.
2.1.1. Para anlise qualitativa (teste de identificao) necessrio demonstrar a capacidade de seleo do mtodo
entre compostos com estruturas relacionadas que podem estar presentes. Isto deve ser confirmado pela obteno de
resultados positivos (preferivelmente em relao ao material de referncia conhecido) em amostras contendo o
frmaco, comparativamente com resultados negativos obtidos com amostras que no contm o frmaco, mas
compostos estruturalmente semelhantes.
2.1.2. Para anlise quantitativa (teor) e anlise de impurezas, a especificidade pode ser determinada pela
comparao dos resultados obtidos de amostras (frmaco ou medicamento) contaminadas com quantidades
apropriadas de impurezas ou excipientes e amostras no contaminadas, para demonstrar que o resultado do teste
no afetado por esses materiais. Quando a impureza ou o padro do produto de degradao no estiverem
disponveis, pode-se comparar os resultados do teste das amostras contendo impurezas ou produtos de degradao
com os resultados de um segundo procedimento bem caracterizado (por exemplo metodologia farmacopica ou outro
procedimento validado). Estas comparaes devem incluir amostras armazenadas sob condies de estresse (por ex.
luz, calor umidade, hidrlise cida/bsica, oxidao).
2.1.3. Em mtodos cromatogrficos, deve-se tomar as precaues necessrias para garantir a pureza dos picos
cromatogrficos. A utilizao de testes de pureza de pico (por exemplo, com auxilio de detector de arranjo de
fotodiodos ou espectrometria de massas) so interessantes para demonstrar que o pico cromatogrfico atribudo a
um s componente.
2.2. Linearidade
a capacidade de uma metodologia analtica de demonstrar que os resultados obtidos so diretamente proporcionais
concentrao do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado.
2.2.1. Recomenda-se que a linearidade seja determinada pela anlise de, no mnimo, 5 concentraes diferentes.
Estas concentraes devem seguir os intervalos da Tabela 3.
2.2.2. Se houver relao linear aparente aps exame visual do grfico, os resultados dos testes devero ser tratados
por mtodos estatsticos apropriados para determinao do coeficiente de correlao, interseco com o eixo Y,
coeficiente angular, soma residual dos quadrados mnimos da regresso linear e desvio padro relativo. Se no
houver relao linear, realizar transformao matemtica.
2.2.3. O critrio mnimo aceitvel do coeficiente de correlao (r) deve ser = 0,99.
2.2.4. Deve-se apresentar as curvas obtidas (experimental e a resultante do tratamento matemtico).
2.3. Intervalo
O intervalo especificado a faixa entre os limites de quantificao superior e inferior de um mtodo analtico.
Normalmente derivado do estudo de linearidade e depende da aplicao pretendida do mtodo (Tabela 3).
estabelecido pela confirmao de que o mtodo apresenta exatido, preciso e linearidade adequados quando
aplicados a amostras contendo quantidades de substncias dentro do intervalo especificado.
Tabela 3. Limites porcentuais do teor do analito que devem estar contidos no intervalo de linearidade para alguns
mtodos analiticos.

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Ensaio
Alcance
Determinao
quantitativa
do
De 80% a 120% da concentrao
analito em matrias-primas ou em
terica do teste
formas farmacuticas
Do nvel de impureza esperado at
120% do limite mximo especificado.
Quando apresentarem importncia
toxicolgica ou efeitos farmacolgicos
Determinao de impurezas
inesperados, os limites de
quantificao e deteco devem ser
adequados
s
quantidades
de
impurezas a serem controladas
De 70% a 130% da concentrao
Uniformidade de contedo
terica do teste
De 20% sobre o valor especificado
para o intervalo. Caso a especificao
para a dissoluo envolva mais que
um tempo,
Ensaio de dissoluo
o alcance do mtodo deve incluir
20% sobre o menor valor e +20%
sobre o maior valor.

2.4. Preciso
A preciso a avaliao da proximidade dos resultados obtidos em uma srie de medidas de uma amostragem
mltipla de uma mesma amostra. Esta considerada em trs nveis.
2.4.1. Repetibilidade (preciso intra-corrida): concordncia entre os resultados dentro de um curto perodo de tempo
com o mesmo analista e mesma instrumentao.
A repetibilidade do mtodo verificada por, no mnimo, 9 (nove) determinaes, contemplando o intervalo linear do
mtodo, ou seja, 3 (trs) concentraes, baixa, mdia e alta, com 3 (trs) rplicas cada ou mnimo de 6
determinaes a 100% da concentrao do teste;
2.4.2. Preciso intermediria (preciso inter-corridas): concordncia entre os resultados do mesmo laboratrio, mas
obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes.
Para a determinao da preciso intermediria recomenda-se um mnimo de 2 dias diferentes com analistas
diferentes.
2.4.3. Reprodutibilidade (preciso inter-laboratorial): concordncia entre os resultados obtidos em laboratrios
diferentes como em estudos colaborativos, geralmente aplicados padronizao de metodologia analtica, por
exemplo, para incluso de metodologia em farmacopias. Estes dados no precisam ser apresentados para a
concesso de registro.
A preciso de um mtodo analtico pode ser expressa como o desvio padro ou desvio padro relativo (coeficiente de
variao) de uma srie de medidas.
A preciso pode ser expressa como desvio padro relativo (DPR) ou coeficiente de variao (CV%), segundo a
frmula,

em que, DP o desvio padro e CMD, a concentrao mdia determinada.

O valor mximo aceitvel deve ser definido de acordo com a metodologia empregada, a concentrao do analito na
amostra, o tipo de matriz e a finalidade do mtodo, no se admitindo valores superiores a 5%.
2.5. Limite de Deteco
Limite de deteco a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectado, porm no
necessariamente quantificado, sob as condies experimentais estabelecidas.

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2.5.1. O limite de deteco estabelecido por meio da anlise de solues de concentraes conhecidas e
decrescentes do analito, at o menor nvel detectvel;
2.5.2. No caso de mtodos no instrumentais (CCD, titulao, comparao de cor), esta determinao pode ser feita
visualmente, onde o limite de deteco o menor valor de concentrao capaz de produzir o efeito esperado
(mudana de cor, turvao, etc).
2.5.3. No caso de mtodos instrumentais (CLAE, CG, absoro atmica), a estimativa do limite de deteco pode ser
feita com base na relao de 3 vezes o rudo da linha de base. Pode ser determinado pela equao,

em que: DPa o desvio padro do intercepto com o eixo do Y de, no mnimo, 3 curvas de calibrao construdas
contendo concentraes do frmaco prximas ao suposto limite de quantificao. Este desvio padro pode ainda ser
obtido a partir da curva de calibrao proveniente da anlise de um nmero apropriado de amostras do branco; IC a
inclinao da curva de calibrao.
2.6. Limite de Quantificao
a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com preciso e exatido aceitveis sob
as condies experimentais estabelecidas.
O limite de quantificao um parmetro determinado, principalmente, para ensaios quantitativos de impurezas,
produtos de degradao em frmacos e produtos de degradao em formas farmacuticas e expresso como
concentrao do analito (por exemplo, porcentagem p/p ou p/V, partes por milho) na amostra.
2.6.1. O limite de quantificao estabelecido por meio da anlise de solues contendo concentraes decrescentes
do frmaco at o menor nvel determinvel com preciso e exatido aceitveis. Pode ser expresso pela equao,

em que: DPa o desvio padro do intercepto com o eixo do Y de, no mnimo, 3 curvas de calibrao construdas
contendo concentraes do frmaco prximas ao suposto limite de quantificao. Este desvio padro pode ainda ser
obtido a partir da curva de calibrao proveniente da anlise de um apropriado nmero de amostras do branco; IC a
inclinao da curva de calibrao.
2.6.2. Tambm pode ser determinado por meio do rudo. Neste caso, determina-se o rudo da linha de base e
considera-se como limite de quantificao aquela concentrao que produza relao sinal-rudo superior a 10:1.
2.7. Exatido
A exatido de um mtodo analtico a proximidade dos resultados obtidos pelo mtodo em estudo em relao ao
valor verdadeiro.
Vrias metodologias para a determinao da exatido esto disponveis:
2.7.1. Frmaco
2.7.1.1. aplicando-se a metodologia analtica proposta na anlise de uma substncia de pureza conhecida (padro de
referncia);
2.7.1.2. comparao dos resultados obtidos com aqueles resultantes de uma segunda metodologia bem
caracterizada, cuja exatido tenha sido estabelecida;
2.7.2. Forma Farmacutica
2.7.2.1. na anlise de uma amostra, na qual quantidade conhecida de frmaco foi adicionada a uma mistura dos
componentes do medicamento (placebo contaminado);
2.7.2.2. nos casos em que amostras de todos os componentes do medicamento esto indisponveis, aceita-se a
anlise pelo mtodo de adio de padro, no qual adiciona-se quantidades conhecidas do analito (padro de

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referncia) ao medicamento.
2.7.3. Impurezas
2.7.3.1. anlise pelo mtodo de adio de padro, no qual adiciona-se quantidades conhecidas de impurezas e/ou
produtos de degradao ao medicamento ou ao frmaco;
2.7.3.2. no caso da indisponibilidade de amostras de certas impurezas e/ou produtos de degradao, aceita-se a
comparao dos resultados obtidos com um segundo mtodo bem caracterizado (metodologia farmacopica ou outro
procedimento analtico validado).
A exatido calculada como porcentagem de recuperao da quantidade conhecida do analito adicionado amostra,
ou como a diferena porcentual entre as mdias e o valor verdadeiro aceito, acrescida dos intervalos de confiana.
A exatido do mtodo deve ser determinada aps o estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da
especificidade do mesmo, sendo verificada a partir de, no mnimo, 9 (nove) determinaes contemplando o intervalo
linear do procedimento, ou seja, 3 (trs) concentraes, baixa, mdia e alta, com 3 (trs) rplicas cada. A exatido
expressa pela relao entre a concentrao mdia determinada experimentalmente e a concentrao terica
correspondente:

2.8. Robustez
A robustez de um mtodo analtico a medida de sua capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variaes dos
parmetros analticos. Indica sua confiana durante o uso normal.
Durante o desenvolvimento da metodologia, deve-se considerar a avaliao da robustez. Constatando-se a
susceptibilidade do mtodo variaes nas condies analticas, estas devero ser controladas e precaues devem
ser includas no procedimento.
A Tabela 4 relaciona os principais parmetros que podem resultar em variao na resposta do mtodo.
Tabela 4. Fatores que devem ser considerados na determinao da robustez do mtodo analtico.

Estabilidade das solues analticas

Tempo de extrao
Variao do pH da soluo
Espectrofotometria
Temperatura
Diferentes fabricantes de solventes
Variao do pH da fase mvel
Variao na composio da fase mvel
Cromatografia Lquida Diferentes lotes ou fabricantes de colunas
Temperatura
Fluxo da fase mvel
Diferentes lotes ou fabricantes de colunas
Cromatografia Gasosa Temperatura
Velocidade do gs de arraste
Preparo das Amostras

MTODOS BIOANALTICOS
1. Definies
Amostra termo geral que abrange: controles, brancos, amostras processadas e desconhecidas.
Amostra branco amostra de uma matriz biolgica na qual nenhum analito foi adicionado, utilizada para avaliar a
especificidade do mtodo bioanaltico.
Amostra de Controle de Qualidade (CQ) amostra de matriz biolgica adicionada do analito, usada para monitorar o
desempenho de um mtodo bioanaltico e para avaliar a integridade e validade dos resultados das amostras
desconhecidas analisadas numa corrida individual.
Amostra processada extrato final (anterior anlise instrumental) de uma amostra que foi submetida a vrias
manipulaes (ex.: diluio, extrao, concentrao).

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Amostra desconhecida amostra biolgica que objeto de anlise.

Analito composto qumico especfico a ser mensurado, podendo ser o frmaco no-transformado, biomolcula ou
seu derivado, metablito ou produto de degradao em uma matriz biolgica.
Corrida analtica (ou lote) conjunto completo de amostras em estudo, com um nmero apropriado de padres e CQs
para sua validao e que tem sua anlise completa nas mesmas condies.
Especificidade habilidade do mtodo bioanaltico de medir e diferenciar o analito de componentes que possam estar
presentes na amostra, tais como metablitos, impurezas, compostos de degradao ou componentes da matriz.
Estabilidade parmetro que visa determinar se um analito mantm-se quimicamente inalterado numa dada matriz
sob condies especficas, em determinados intervalos de tempo.
Exatido representa o grau de concordncia entre os resultados individuais encontrados e um valor aceito como
referncia.
Faixa de quantificao corresponde a uma faixa de concentrao, incluindo o LSQ e o LIQ, que pode ser confivel e
reprodutivelmente quantificada com exatido e preciso, por meio da relao concentrao-resposta.
Limite de Deteco (LD) menor concentrao de um analito que o procedimento bioanaltico consegue diferenciar
confiavelmente do rudo de fundo.
Limite Inferior de Quantificao (LIQ) menor quantidade de um analito numa amostra que pode ser determinada
quantitativamente com preciso e exatido aceitveis.
Limite Superior de Quantificao (LSQ) maior quantidade de um analito numa amostra que pode ser determinada
quantitativamente com preciso e exatido.
Linearidade corresponde capacidade do mtodo de fornecer resultados diretamente proporcionais concentrao
da substncia em exame (analito).
Matriz biolgica material distinto de origem biolgica, que pode ser amostrado e processado de modo reprodutvel.
Mtodo descrio compreensvel de todos os procedimentos usados em anlises de amostras.
Padro de calibrao matriz biolgica a qual foi adicionada uma quantidade conhecida de analito. Os padres de
calibrao so usados para construir a curva de calibrao, com a qual so determinadas as concentraes do analito
nos CQs e nas amostras desconhecidas em estudo.
Padro Interno (PI) composto, geralmente com caractersticas estruturais similares ao analito, adicionado aos
padres de calibrao e amostras em concentraes conhecidas e constantes, para facilitar a determinao do
analito.
Preciso representa o grau de repetibilidade entre os resultados de anlises individuais, quando o procedimento
aplicado diversas vezes numa mesma amostra homognea, em idnticas condies de ensaio.
Recuperao eficincia de extrao de um mtodo analtico, expressa como a porcentagem da quantidade
conhecida de um analito, obtida da comparao dos resultados analticos de amostras branco acrescidas de padro e
submetidas ao processo de extrao, com os resultados analticos de solues padro no extradas.
Reprodutibilidade preciso entre dois laboratrios. Tambm representa a preciso do mtodo sob as mesmas
condies operacionais, num curto perodo de tempo.
Validao parcial modificao no mtodo bioanaltico validado que no requer a necessidade de uma revalidao
total.
Validao total estabelecimento de todos os parmetros de validao de um mtodo bioanaltico, aplicveis
anlise das amostras.
2. Consideraes gerais
2.1. As informaes contidas neste guia aplicam-se a mtodos bioanalticos, tais como cromatografia gasosa (CG),
cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) e estas combinadas com espectrometria de massa (MS) tais como
LC-MS, LC-MS-MS, CG-MS, CG-MS-MS, utilizados na determinao quantitativa de frmacos e/ou metablitos em
matrizes biolgicas, tais como sangue, soro, plasma ou urina. Tambm se aplica a outras tcnicas analticas, tais
como mtodos microbiolgicos e imunolgicos, ou para outras matrizes biolgicas, embora, nestes casos, pode-se
observar um alto grau de variabilidade.

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2.2. A validao deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o mtodo atenda s exigncias das aplicaes
analticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar preciso, exatido, linearidade,
limite de deteco e limite de quantificao, especificidade, reprodutibilidade, estabilidade e recuperao adequadas
anlise. Desse modo, importante ressaltar que todos os equipamentos e materiais devem apresentar-se
devidamente calibrados e os analistas devem ser qualificados e adequadamente treinados.
2.3. Deve-se utilizar substncias qumicas de referncia e /ou padres biolgicos oficializados pela Farmacopia
Brasileira ou por outros cdigos autorizados pela legislao vigente. Sero admitidos estudos utilizando padres
secundrios desde que seja comprovada sua certificao, na ausncia de substncias qumicas de referncia e/ou
padres biolgicos farmacopicos.
2.4. Para os estudos de biodisponibilidade relativa/bioequivalncia deve-se utilizar padro interno, sempre que
mtodos cromatogrficos forem utilizados. Deve-se justificar a impossibilidade de sua utilizao.
2.5. Deve ser realizada validao total antes da implementao de um mtodo bioanaltico para a quantificao de um
frmaco e/ou metablitos.
2.6. Devem ser realizadas validaes parciais quando ocorrerem modificaes no mtodo bioanaltico j validado. Os
ensaios de validao parcial podem ser desde uma pequena determinao, como a determinao da exatido e
preciso intra-ensaio, at prximo de uma validao total. As mudanas tpicas que podem requerer uma validao
parcial incluem, entre outras:
2.6.1. transferncias de mtodos entre laboratrios e analistas;
2.6.2. mudanas na metodologia analtica, por exemplo, substituio do sistema de deteco;
2.6.3. mudana de anticoagulante na coleta das amostras;
2.6.4. mudana de matriz, por exemplo, de plasma para urina;
2.6.5. mudana no procedimento de preparao da amostra;
2.6.6. mudanas relevantes na faixa de concentrao;
2.6.7. mudanas de instrumentos e/ou softwares;
2.6.8. demonstrao de seletividade do analito na presena de medicaes concomitantes;
2.6.9. demonstrao de seletividade do analito na presena de metablitos especficos.
2.7. A avaliao da robustez deve ser considerada durante a fase de desenvolvimento do mtodo. Constatando-se
suscetibilidade a variaes nas condies analticas, estas devero ser adequadamente controladas ou precaues
devero ser includas no procedimento. Exemplos de variaes:
2.7.1. estabilidade das solues analticas.
2.7.2. tempo de extrao.
Variaes tpicas em cromatografia lquida:
2.7.3. influncia da variao de pH da fase mvel.
2.7.4. influncia da variao da composio da fase mvel.
2.7.5. diferentes colunas (diferentes lotes e/ou fabricantes).
2.7.6. temperatura.
2.7.7. velocidade de fluxo.
Variaes tpicas em cromatografia gasosa:
2.7.8. diferentes colunas (diferentes lotes e/ou fabricantes);
2.7.9. temperatura;
2.7.10. velocidade de fluxo.
3. Validao pr estudo
3.1. Especificidade

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3.1.1. Deve-se analisar amostras da matriz biolgica (sangue, plasma, soro, urina, ou outra) obtidas de seis
indivduos, sendo quatro amostras normais, uma lipmica e uma hemolisada, sob condies controladas referentes
ao tempo, alimentao e outros fatores importantes para o estudo. Cada amostra branco deve ser testada utilizando o
procedimento e as condies cromatogrficas propostas. Os resultados devem ser comparados com aqueles obtidos
com soluo aquosa do analito, em concentrao prxima ao LIQ.
3.1.2. Qualquer amostra branco que apresentar interferncia significativa no tempo de reteno do frmaco,
metablito ou padro interno, deve ser rejeitada. Caso uma ou mais das amostras analisadas apresentarem tal
interferncia, novas amostras de outros seis indivduos devem ser testadas. Caso uma ou mais das amostras deste
grupo apresentarem interferncia significativa no tempo de reteno do frmaco, o mtodo deve ser alterado visando
elimin-la.
3.1.3. Os interferentes podem ser componentes da matriz biolgica, metablitos, produtos de decomposio e
medicamentos utilizados concomitantemente ao estudo. A interferncia da nicotina, cafena, produtos de venda isenta
de prescrio e metablitos deve ser considerada sempre que necessrio.
3.1.4. Caso o mtodo seja destinado quantificao de mais de um frmaco, cada um deve ser injetado
separadamente para determinar os tempos de reteno individuais e assegurar que impurezas de um frmaco no
interfiram na anlise do outro.
3.1.5. A resposta de picos interferentes no tempo de reteno do frmaco deve ser inferior a 20% da resposta do LIQ.
As respostas de picos interferentes no tempo de reteno do frmaco e do padro interno devem ser inferiores,
respectivamente, a 20% e 5% da resposta na concentrao utilizada.
3.2. Curva de calibrao/linearidade
3.2.1. A curva de calibrao representa a relao entre a resposta do instrumento e a concentrao conhecida do
analito. Deve-se gerar uma curva de calibrao para cada frmaco e corrida analtica, a qual ser usada para calcular
a concentrao do frmaco nas amostras, utilizando-se a mesma matriz biolgica proposta para o estudo. A curva de
calibrao deve incluir a anlise da amostra branco (matriz biolgica isenta de padro do frmaco e do padro
interno), da amostra zero (matriz biolgica mais o padro interno) e de, no mnimo, 6 (seis) amostras contendo padro
do frmaco e padro interno, contemplando o limite de variao esperado, do LIQ at 120% da concentrao mais
alta que se pretende analisar.
3.2.2. Para a determinao da curva de calibrao, deve-se analisar amostras extradas da matriz apropriada, no
mnimo 6 (seis) concentraes diferentes. Procedimentos alternativos devem ser justificados, como na obteno de
uma correlao no-linear, em que um maior nmero de concentraes de padres sero necessrios.
3.2.3. Os resultados devem ser analisados por mtodos estatsticos apropriados como, por exemplo, o clculo de
regresso linear pelo mtodo dos mnimos quadrados. Deve-se apresentar as curvas obtidas (experimental e a
resultante do tratamento matemtico), o coeficiente de correlao linear, o coeficiente angular e o intercepto da reta.
3.2.4. Critrios de aceitao da curva de calibrao:
3.2.4.1. desvio menor ou igual a 20% (vinte por cento) em relao a concentrao nominal para o LIQ;
3.2.4.2. desvio menor ou igual a 15 % (quinze por cento) em relao concentrao nominal para as outras
concentraes da curva de calibrao;
3.2.4.3. no mnimo quatro de seis concentraes da curva de calibrao devem cumprir com os critrios anteriores,
incluindo o LIQ e a maior concentrao da curva de calibrao;
3.2.4.4. o coeficiente de correlao linear deve ser igual ou superior a 0,98.
3.3. Preciso
3.3.1. A repetibilidade do mtodo verificada utilizando-se, no mnimo, 3 (trs) concentraes (baixa, mdia e alta),
contemplando a faixa de variao do procedimento, realizando-se, no mnimo, 5 (cinco) determinaes por
concentrao.
3.3.2. A preciso deve ser determinada em uma mesma corrida (preciso intra-corrida) e em corridas diferentes
(preciso inter-corridas).
3.3.3. Pode ser expressa como desvio padro relativo (DPR) ou coeficiente de variao (CV%), no se admitindo
valores superiores a 15%, exceto para o LIQ, para o qual se admite valores menores ou iguais a 20%, segundo a
frmula:

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onde, D P o desvio padro e C M D, a concentrao mdia determinada.

3.4. Exatido
3.4.1. A exatido do mtodo deve ser determinada utilizando-se, no mnimo, 3 (trs) concentraes (baixa, mdia e
alta), contemplando a faixa de variao do procedimento, realizando-se, no mnimo, 5 (cinco) determinaes por
concentrao.
3.4.2. A exatido deve ser determinada em uma mesma corrida analtica (exatido intra-corrida) e em corridas
diferentes (exatido inter-corridas).
3.4.3. O desvio no deve exceder 15%, exceto para o limite de quantificao, para o qual se admite desvios menores
ou iguais a 20%.
3.4.4. A exatido expressa pela relao entre a concentrao mdia determinada experimentalmente e a
concentrao terica correspondente:

3.5. Limite inferior de quantificao (LIQ)

3.5.1. Estabelecido por meio da anlise de matriz biolgica contendo concentraes decrescentes do frmaco at o
menor nvel quantificvel com preciso e exatido aceitveis.
3.5.2. Pode-se, tambm, utilizar a razo de 5:1 entre o sinal e o rudo da linha de base, devendo-se especificar o
mtodo utilizado para determinao do LIQ.
3.5.3. O LIQ deve ser, no mnimo, cinco vezes superior a qualquer interferncia da amostra branco no tempo de
reteno do frmaco.
3.5.4. O pico de resposta do frmaco no LIQ deve ser identificvel e reprodutvel com preciso de 20% (vinte por
cento) e exatido de 80 120 % (oitenta a cento e vinte por cento), atravs da anlise de, no mnimo, 5 (cinco)
amostras de padres.
3.6. Limite de deteco (LD)
Estabelecido por meio da anlise de solues de concentraes conhecidas e decrescentes do frmaco, at o menor
nvel detectvel. Recomenda-se que o LD seja de 2 a 3 vezes superior ao rudo da linha de base.
3.7. Recuperao
A recuperao mede a eficincia do procedimento de extrao de um mtodo analtico dentro de um limite de
variao. Porcentagens de recuperao do analito e do padro interno prximos a 100% so desejveis, porm,
admite-se valores menores, desde que a recuperao seja precisa e exata.
3.7.1. Este teste deve ser realizado comparando-se os resultados analticos de amostras extradas a partir de trs
concentraes (baixa, mdia e alta), contemplando a faixa de linearidade do mtodo, com os resultados obtidos com
solues padro no extradas, que representam 100% de recuperao.
3.7.2. O clculo da recuperao deve ser feito em funo da relao de rea do padro extrado e no extrado, tanto
para o analito quanto para o padro interno separadamente.
3.8. Controle de qualidade (CQ)
3.8.1. CQ do limite inferior de quantificao (CQ-LIQ): mesma concentrao de LIQ.
3.8.2. CQ de baixa concentrao (CQB): menor ou igual 3 x LIQ.
3.8.3. CQ de mdia concentrao (CQM): aproximadamente a mdia entre CQB e CQA
3.8.4. CQ de alta concentrao (CQA): 75 a 90% da maior concentrao da curva de calibrao.

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3.9. Estudo de estabilidade do frmaco em lquidos biolgicos:

3.9.1. Consideraes especficas relevantes
Para a realizao do estudo de estabilidade devem ser observados os parmetros de exatido, preciso, linearidade,
limite de deteco, limite de quantificao, especificidade, limite de variao e robustez, previamente validados.
A estabilidade do frmaco em lquidos biolgicos depende de suas propriedades qumicas, da matriz biolgica e do
material de acondicionamento utilizado. A estabilidade determinada para um tipo de matriz e de material de
acondicionamento especfico no pode ser extrapolada para outros.
As condies de realizao dos ensaios de estabilidade devem reproduzir as reais condies de manuseio e anlise
das amostras. Deve ser avaliada a estabilidade do analito durante a coleta e manuseio da amostra, aps
armazenagem de longa durao (congelamento) e curta durao ( temperatura ambiente), aps ciclos de
congelamento e descongelamento e nas condies de anlise. Deve-se incluir tambm avaliao da estabilidade do
analito nas solues-padro, preparadas com solvente apropriado em concentraes conhecidas.
As determinaes de estabilidade devem utilizar um conjunto de amostras, preparadas a partir de uma soluo
estoque recente do frmaco em anlise, adicionado matriz biolgica isenta de interferncia.
3.9.2. Estabilidade aps ciclos de congelamento e descongelamento
Deve-se testar a estabilidade do frmaco aps trs ciclos de congelamento e descongelamento, utilizando-se, no
mnimo, trs amostras das concentraes baixa e alta determinadas na validao do mtodo analtico, nas seguintes
condies: as amostras devem ser congeladas temperatura indicada para o armazenamento e mantidas por 24
horas, sendo ento submetidas ao descongelamento temperatura ambiente. Quando completamente
descongeladas, as amostras devem ser novamente congeladas temperatura indicada para o armazenamento, por
12 a 24 horas e, assim sucessivamente, at contemplar os trs ciclos, quantificando-se o frmaco nas amostras aps
o terceiro ciclo. Os resultados devem ser comparados com aqueles obtidos da anlise das amostras recmpreparadas.
3.9.3. Estabilidade de curta durao
Para verificao dessa estabilidade utilizam-se, no mnimo, trs amostras das concentraes baixa e alta
determinadas na validao do mtodo analtico. Cada uma delas dever permanecer temperatura ambiente de 4
(quatro) a 24 (vinte e quatro) horas (baseado no tempo em que as amostras do estudo sero mantidas temperatura
ambiente) e analisadas. Os resultados devem ser comparados com aqueles obtidos da anlise das amostras recmpreparadas.
3.9.4. Estabilidade de longa durao
3.9.4.1. O tempo de armazenamento para o estudo de estabilidade de longa durao deve exceder o intervalo de
tempo compreendido entre a coleta da primeira amostra e a anlise da ltima, de acordo com o cronograma
apresentado no protocolo de estudo de biodisponibilidade relativa/bioequivalncia.
3.9.4.2. A temperatura utilizada no ensaio deve reproduzir a recomendada para armazenamento das amostras,
normalmente igual a -20 C.
3.9.4.3. Para verificao dessa estabilidade utilizam-se, no mnimo, trs amostras das concentraes baixa e alta
determinadas na validao do mtodo analtico. As concentraes de todas as amostras de estabilidade devem ser
comparadas com a mdia dos valores anteriormente calculados para as amostras do primeiro dia do teste.
3.9.5. Estabilidade ps-processamento
Em caso de utilizao de equipamentos que empregam sistemas automticos de amostragem/injeo, deve-se
realizar estudo de estabilidade do frmaco, na amostra processada para anlise, incluindo o padro interno, na
temperatura sob a qual o teste ser realizado e por perodo de tempo superior durao da corrida analtica.
Utiliza-se, no mnimo, trs amostras das concentraes baixa e alta determinadas na validao do mtodo analtico.
Os resultados devem ser comparados com aqueles obtidos da anlise das amostras recm-preparadas.
3.9.6. Estabilidade das solues-padro
3.9.6.1. Deve ser avaliada a estabilidade das solues-padro do frmaco e do padro interno, mantidas
temperatura ambiente por, no mnimo, 6 (seis) horas aps preparao.
3.9.6.2. Em caso de tais solues serem armazenadas sob refrigerao ou congelamento, a estabilidade tambm
deve ser avaliada, contemplando a temperatura e o perodo de armazenamento das mesmas.
3.9.6.3. Os resultados desse teste devem ser comparados com aqueles obtidos utilizando-se solues recentemente

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preparadas do frmaco e do padro interno.

3.9.7. Anlise dos resultados
As amostras sero consideradas estveis quando no se observar desvio superior a 15% do valor obtido das
amostras recm-preparadas, com exceo do LIQ, para o qual se aceita desvio de at 20%. Qualquer que seja o
mtodo estatstico utilizado para avaliar os resultados dos estudos de estabilidade, este dever estar descrito
claramente no procedimento operacional padro (POP).
4. Critrios de aplicao do mtodo bioanaltico validado
4.1. A anlise de todas as amostras de um analito em matriz biolgica deve ser concluda dentro do perodo de tempo
para o qual a estabilidade tenha sido determinada.
4.2. Uma corrida analtica deve conter: amostras de CQ, padres de calibrao e amostras desconhecidas de um ou
mais voluntrios do estudo. prefervel que todas as amostras de um mesmo voluntrio sejam analisadas numa
nica corrida.
4.3. No permitido estimar a concentrao das amostras atravs de extrapolao da curva de calibrao abaixo do
LIQ ou acima do maior padro. Em vez disso, a curva deve ser redefinida ou as amostras de concentraes
superiores devem ser diludas e re-analisadas.
4.4. No uso rotineiro do mtodo analtico validado, sua preciso e exatido devem ser monitoradas regularmente para
assegurar a continuidade do desempenho satisfatrio. Para atingir este objetivo, amostras de CQ devem ser
analisadas juntamente com as demais amostras, em cada corrida analtica.
4.5. As amostras de CQ devem ser incorporadas em intervalos adequados, dependendo do nmero total de amostras
da corrida, sempre em igual nmero de replicatas de cada concentrao (CQB, CQM e CQA).
4.6. O nmero de amostras de CQ (em mltiplos de trs) a ser incorporado em cada corrida analtica no deve ser
inferior a 5% (cinco por cento) do nmero de amostras desconhecidas. Para corridas analticas constitudas de at
120 amostras, pelo menos 6 (seis) CQs (uma duplicata de cada concentrao) devem estar presentes.
4.7. Os resultados das amostras de CQ serviro de base para aceitao ou rejeio da corrida analtica. No mnimo,
67% (quatro de seis) das amostras de CQ devem estar dentro de mais ou menos 15% dos seus respectivos valores
nominais, exceto para o LIQ, para o qual se admite desvios menores ou iguais a 20%; 33% (duas de seis) amostras
de CQ podem estar fora destes limites, mas no para a mesma concentrao.

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