Mediante esta prueba se detecta la liberacin de indol en un cultivo

bacteriano. Dicha liberacin se debe a la degradacin del aminocido

triptfano mediante el enzima triptofanasa.
Para la realizacin de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas
en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante
triptfano). Para la posterior deteccin del indol se usa el reactivo de Kovacs
que se puede preparar con los siguientes ingredientes:

Alcohol amlico o isoamlico (puede sustituirse por

alc.butlico)........150ml
p-dimetilamino-benzaldehdo..........................................................10g
HCl (concentrado).........................................................................50ml

Se disuelve primero el aldehdo en el alcohol y despus se agrega lentamente

a esta mezcla el cido. Para el control de calidad del reactivo se pueden
utilizar cultivos conocidos. Las ms convenientes son Escherichia coli
(indol+) y todas las especies de Klebsiella (indol-).
Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al aadir al medio 5 gotas del
reactivo de Kovacs, se producir un anillo de color rojo en la superficie del
caldo y la prueba ser considerada positiva. Si esto ocurre despus de 24
horas, la prueba se considera completa, pero si es negativo deber incubarse
otras 24 horas y repetirse la prueba. Por ello es conveniente hacer siempre la
prueba no en el tubo incubado sino en una porcin de unos 2ml que se retira
de l aspticamente.
Prueba de la lactosa
Esta prueba se usa para diferenciar entre las enterobacterias en general y el grupo de las
coliformes. Se trata por tanto de una prueba de gran importancia debido a que los
coliformes se utilizan como organismos indicadores de contaminacin fecal en anlisis,
sobre todo, de aguas. En bacteriologa se define el grupo de organismos coliformes
como los "bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no
formadores de esporas y que fermentan la lactosa con formacin de gas a 35C en
48 horas". No se trata de un grupo taxonmico e incluye una gran variedad de bacterias,
la mayora de ellas de origen intestinal.
Una manera sencilla de realizar la prueba de la fermentacin de la lactosa en
enterobacterias es sembrar el microorganismo en agar McConkey, ya que este medio,
adems de selectivo frente a bacterias no entricas, es diferencial ya que contiene
lactosa y un indicador de pH (rojo neutro).
En agar McConkey las bacterias Gram positivas ven inhibido su crecimiento debido a la
presencia de sales biliares y cristal violeta y slo crecern las enterobacterias, pero entre
ellas las que fermenten la lactosa (coliformes) liberarn productos cidos que
producirn un cambio de pH que se detectar gracias al rojo neutro. Las colonias lactosa
(+) aparecern de color rojo o violeta contrastando con la coloracin amarillenta de las
colonias lactosa (-).

Estas dos pruebas forman parte del IMVIC de las colimetras y permiten la
diferenciacin dentro de las enterobacterias del grupo coli y aergenes. Las
enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarn la glucosa en dos
fases: primero la metabolizarn aerobiamente (respiracin oxibintica)
consumiendo rpidamente el oxgeno del medio, para, en segundo lugar,
continuar metabolizndola por va anaerobia (fermentacin). sta puede ser
de dos tipos:

Fermentacin cido mixta: La realizan las bacterias del grupo de

E.coli y los productos finales son cidos orgnicos (cidos frmico,
actico, lctico y succnico) que provocan un fuerte descenso del pH
inicial del medio. Puede detectarse por el viraje del indicador de rojo
de metilo que permanece amarillo por encima de pH 5,1 y rojo por
debajo de 4,4.
Fermentacin butiln gliclica: La realizan las bacterias del grupo
Klebsiella-Enterobacter (antiguo aergenes). Los productos finales
son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, producindose
acetona como intermediario que podr ser detectada aadiendo al
medio KOH (reactivo A de Voges-Proskauer) y alfa-naftol (reactivo B
de Voges-Proskauer) que reaccionarn con este compuesto
produciendo un color rojo caracterstico.

Para la realizacin de estas dos pruebas se cultiva el microorganismo en caldo

RMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 30C durante un periodo de 3
das como mnimo y 5 como mximo. Al revelar las pruebas, se separa el
cultivo en dos porciones de unos 2,5ml que servirn para cada uno de los
ensayos.

Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le aade unas gotas (4-5) de

solucin indicadora de Rojo de Metilo. Se agita para homogeneizar y
se observa la coloracin. Se considera positiva si vira al rojo y
negativa si permanece amarillo. Foto de los resultados de esta prueba
Voges-Proskauer: A la otra porcin de cultivo se le aade:
o
0,6ml del Reactivo A de Voges-Proskauer (alfa-naftol
5% en etlico absoluto). El medio adquiere un aspecto
lechoso.
0,2ml del Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH
40%). Desaparece el aspecto lechoso y se agita fuertemente.
Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color
rosado-violceo, ms o menos intenso, que se inicia en la parte
superior del tubo. Si la prueba es negativa no aparece coloracin
alguna.
o

Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos

molculas de amoniaco por accin del enzima ureasa. Esta actividad
enzimtica es caracterstica de todas las especies de Proteus y se usa sobre
todo para diferenciar este gnero de otras enterobacterias que dan negativo o
positivo retardado.
Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este
medio se complementa despus del autoclavado con 50ml/l de urea. sta ser
degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima
ureasa. Esta degradacin produce amoniaco que har variar el color del
indicador de amarillo a rojo, ponindose as de manifiesto la actividad
ureasa.
Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el
tiempo de incubacin ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio
poco despus de la inoculacin y sus resultados deben ser ledos en las
primeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella
pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubacin.
El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de produccin de cido y gas
a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio. Tambien permite la identificacin de la
produccin de SH2.
Esta es una prueba especfica para la identificacin a nivel de gnero en la familia Enterobacteriaceae,
con objetivo de diferenciar entre:

bacterias fermentadoras de la glucosa

bacterias fermentadoras de la lactosa

bacterias fermentadoras de sacarosa

bacterias aerognicas

bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgnicas que contengan azufre.

Prodedimiento:

Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm. del
fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado.
Incubar a 35 durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos.
Resultados:

Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentacin de azucares. Caracterstica de bactrias no

fermentadoras como Pseudomonas sp.

Pico alcalino/fondo cido : Glucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella spp.

Pico alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, produccin

de cido sulfhdrico. Salmonela spp.

Pico cido/fondo cido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o no.
Escherichia coli.

A estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas.

 Agar Citrato
La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin de
enterobacterias. La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de
cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio.
Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.
Procedimiento: Se inocula el agar inclinado en una sola estra en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas
en un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos
por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. Incubar a 35C durante 4 das. El ensayo es
positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompaado o no de un viraje del
indicador al azul.
Resultados:
(+)Klebsiella spp.( - ) Escherichia Coli