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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA E PARASITOLOGIA APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA CURSO: NUTRIÇÃO FLORIANÓPOLIS, SC SEMESTRE 01/2016 SUMÁRIO AULA PRÁTICA 1: Introdução ao Laboratório de Microbiologia e Normas de Segurança .... 3 AULA PRÁTICA 2: Microbiologia do ar.................................................................................. 4 AULA PRÁTICA 3: Meios de Cultura ...................................................................................... 7 AULA PRÁTICA 4: Microbiologia do ambiente .................................................................... 10 AULA PRÁTICA 5: Técnicas de Semeadura .......................................................................... 12 AULA PRÁTICA 6: Preparações microscópicas .................................................................... 16 AULA PRÁTICA 7: Esterilização e Desinfecção ................................................................... 19 AULA PRÁTICA 8: Coloração de Gram: Cocos e Bacilos .................................................... 27 AULA PRÁTICA 9: Coloração de Gram (amostras: oral, culturais, ar) ................................. 30 AULA PRÁTICA 10: Microbiologia industrial (leite fermentado, iogurte, fermento biol.) ... 32 AULA PRÁTICA 11: Contagem em placa .............................................................................. 34 AULA PRÁTICA 12: Análise bacteriológica da água ............................................................ 36 AULA PRÁTICA 13: Identificação bacteriana ....................................................................... 40 2 AULA PRÁTICA 1: Introdução ao Laboratório de Microbiologia e Normas de Segurança Objetivo Discutir sobre biossegurança em Laboratório de Microbiologia e normas de trabalho. 1. Deixar os materiais como bolsas, pastas, livros e cadernos na estante, na entrada do laboratório, e nunca sobre as bancadas de trabalho. 2. Usar guarda-pó adequado e limpo. 3. Lavar as mãos com detergente antes e depois da aula prática. Se for portador de algum ferimento nas mãos, avisar ao professor para não participar das atividades práticas. 4. Antes de iniciar os procedimentos, identificar os materiais que serão utilizados nas análises. 5. NUNCA pipetar nada com a boca. 6. Não comer, beber ou fumar no laboratório. 7. Evitar colocar a mão na boca, olhos e ouvidos durante a aula. 8. Prender cabelos longos para evitar exposição a chama do bico de Bunsen. 9. Nunca aplicar maquiagem e cosméticos ou retirar lentes de contato no laboratório. 10. Avisar o professor em caso de contaminação acidental, ferimentos ou cortes ocorridos durante a aula. 11. Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais os deixando sobre a bancada. 12. Flambar as alças, agulhas e pinças antes e após o uso. 13. Limpar a bancada após finalizar as análises. 14. Quando necessário, trabalhar na zona de segurança, que compreende a área mais próxima possível do bico de Bunsen. 15. Transportar e manter os tubos de cultura em uma estande adequada para evitar acidentes e contaminações de pessoas e ambientes. 16. Em caso de quebra ou derramamento de culturas, é necessário avisar ao professor responsável, cobrir toda a área com toalhas de papel e derramar sobre elas o líquido desinfetante disponível no laboratório. Após 15 minutos, remover as tolhas e descartá-las corretamente. 17. Manter atenção constante nas ações executadas, evitando movimentação e conversas desnecessárias que possam causar distrações e provocar acidentes. 3 AULA PRÁTICA 2: Microbiologia do ar Objetivo Observar a diversidade de bactérias e fungos no ar. Introdução A diversidade de bactérias e fungos encontrados em diversos ambientes (água, solo, animais, seres humanos) é possível devido a características especiais, tais como: a) Tamanho reduzido: grande capacidade de dispersão; b) Variabilidade e flexibilidade metabólica: adaptação e tolerância a condições ambientais adversas; c) Genética: capacidade de transferência horizontal de genes, recombina caracteres positivos para persistir em longo tempo, adaptandose as condições adversas instáveis. Os micro-organismos em condições adequadas, multiplicam-se originando colônias. As características que apresentam ao crescer em meios de cultura são expressões fenotípicas do material genético e portanto são úteis na sua identificação. A morfologia das colônias auxilia na classificação das bactérias. Podem ser classificadas conforme o aspecto, pigmentação, superfície e bordas. 1. Tamanho: mm 2. Aspecto (textura) Bactérias e leveduras: cremosa, mucóide e butirosa (brilhante e translúcida). Fungos: cotonoso, aveludado, granular e pulverulento (arenoso). 3. Formas: puntiforme, circular, filamentosa, irregular... 4. Pigmentação (cor): verso e reverso 5. Superfície (elevação): plana, elevada, convexa, ondulada... 6 Bordas (margens): liso, ondulado, filamentoso... 4 Figura 1. Morfologia das colônias (Silva-Filho e Oliveira, 2007). 5 Procedimento - Distribuir 2 placas de meio de cultura agar Nutriente (pH 7,4) e 2 placas de meio de cultura agar Saboraud (pH 5,6) para cada dupla ou grupo formado. - Identificar o fundo da placa com o nome do grupo, curso, data, número do laboratório, tempo de exposição do ar (5 ou 15 minutos) e local da coleta. - O local da coleta deve ser diferente entre as equipes. Pode ser no interior do laboratório ou fora dele, como em cozinha, lanchonete, refeitório, banheiro, corredor/escada ou outros locais próximo ao laboratório de origem. - Abrir as placas e deixar a superfície do meio de cultura exposta no ambiente pelo tempo determinado de 5 (1 placa) ou 15 (1 placa) minutos para cada meio de cultura (simples e saboraud). - Após o tempo, fechar as placas e incubá-las. O meio de cultura agar simples deve ser incubado a 37ºC por 24 a 48 horas, já o meio de cultura agar saboraud será incubado a temperatura ambiente por cerca de 1 semana (ou 25ºC de 5 a 7 dias). - Após o tempo de incubação, realizar a leitura. Leitura - Observar a presença de colônias na superfície dos meios de cultura e avaliar o número e as características morfológicas das mesmas. - Anotar o número de colônias obtidas em cada placa. - Descrever as colônias quanto ao tamanho, aspecto, formas, pigmentação, superfície (elevação) e bordas. - Comparar os resultados com aqueles obtidos pelos outros grupos. 6 AULA PRÁTICA 3: Meios de Cultura Objetivo Conhecer os diferentes meios de cultura disponíveis no Laboratório de Microbiologia para o cultivo dos micro-organismos. Introdução Meios de Cultura: são substratos adequados ao crescimento, multiplicação e desenvolvimento dos micro-organismos fora de seu hábitat natural. Servem para: crescimento bacteriano, isolamento bacteriano, estudo da morfologia das colônias, pesquisa da patogenicidade e pesquisa das características bioquímicas. O cultivo dos micro-organismos exige que determinadas condições sejam atendidas. As exigências nutritivas e ambientais são variáveis com o tipo de micro-organismo, tornando impossível a produção de um único tipo de meio que satisfaça todas as condições de todos os tipos de micro-organismos. Por outro lado, é difícil e impraticável a formulação de um meio de cultura ideal para cada tipo de micro-organismo. No preparo de um meio de cultura é necessário conhecer as exigências nutricionais dos micro-organismos. São considerados componentes essenciais do meio de cultura: - Fonte de energia (ex: glicose) - Fonte de carbono (ex: proteínas, carboidratos e lipídeos) - Fonte de nitrogênio (ex: peptonas, nitrato, amônio) - Fatores de crescimento (ex: vitaminas) - Fonte de minerais (ex: P, K, S, Ca, Fe, Mg, Mn, Zn) - Água Ainda, além dos nutrientes, o meio de cultura deve suprir algumas condições ambientais: - pH: cada micro-organismo exige um pH adequado para o seu crescimento. - Atmosfera: condições para o crescimento de micro-organismos aeróbios, anaeróbios, anaeróbios facultativos e microaerófilos. 7 - Pressão osmótica: regulada pelos constituintes do meio. Para organismos marinhos e halofílicos, há necessidade da adição de uma certa quantidade de sal, de modo a obter a concentração adequada para o seu crescimento. Os meios de cultura podem ser classificados de acordo com a origem, composição, estado físico e finalidade. 1. Quanto à origem: a) Naturais: se estão prontos na natureza. Ex: leite, sangue. b) Artificiais: aqueles que são elaborados. Ex: ágar nutriente. 2. Quanto à composição: a) Complexos: não apresentam composição química definida. Ex: agar sangue, agar chocolate. b) Sintéticos: tem composição química definida. Ex: agar nutriente, agar mueller-hinton. 3. Quanto ao estado físico: a) Líquido: nutrientes são dissolvidos em uma solução aquosa. b) Semi-sólido: possuem na sua composição, além de nutrientes, uma pequena porcentagem de agar (0,5 a 0,75%). c) Sólido: possuem uma porcentagem maior de agar (1,5%), além dos nutrientes. 4. Quanto à finalidade: a) Meios Básicos: possuem os componentes essenciais para o crescimento de microorganismos pouco exigentes. Ex: agar nutriente. 8 b) Meios Seletivos: favorecem o desenvolvimento de determinados micro-organismos, em detrimento de outros, pela adição de substâncias inibidoras. Ex: agar SS (SalmonellaShigella). c) Meios Diferenciais: permitem o desenvolvimento de grupos de micro-organismos com características relativamente definidas, o que permite diferenciar um grupo ou uma espécie. Ex: agar MacConkey. d) Meios Enriquecidos: permitem o desenvolvimento de micro-organismos fastidiosos, pois são adicionados ao meio simples substâncias enriquecedoras como sangue, soro, ovo, extrato de leveduras. Ex: agar sangue. e) Meios de Manutenção: destinados a manter a viabilidade de uma cultura. Ex: meio BHI com glicerol. f) Meios de Transporte: meio isento de nutrientes, que contém agentes redutores, tais como tioglicolato ou cisteína. Geralmente mantém um pH favorável que previne a desidratação de secreções durante o transporte e evita a oxidação enzimática dos patógenos presentes. Ex: meio de Stuart, meio de Cary Blair, caldo tioglicolato. 9 AULA PRÁTICA 4: Microbiologia do ambiente Objetivo Observar a diversidade de bactérias e fungos no ambiente e realizar a contagem de microorganismos presentes. Introdução Os micro-organismos desempenham papéis importantes, dependendo do tipo de interação existente com o alimento e seus nutrientes. No entanto, quando patógenos estão presentes em unidades de alimentação, podem ser responsáveis por graves enfermidades. A qualidade do alimento está intimamente relacionado a higiene de ambientes, manipuladores e superfícies durante seu processamento e armazenamento. Já o tipo de alimento e as condições ambientais regulam a multiplicação dos micro-organismos. As unidades de alimentação e nutrição acabam de tornando ambientes favoráveis para o aparecimento destes micro-organismos, uma vez que possuem fatores que colaboram com o seu crescimento, tais como: água, nutrientes, pH, oxigênio e temperatura. A contaminação nestes locais pode ser ainda mais critica quando são encontradas bactérias do grupo coliforme, que indica condições inadequadas de higiene de manipuladores. Neste caso, o risco de doenças transmitidas por alimentos é ainda maior. Procedimento - Distribuir 1 placa de meio de cultura agar nutriente para cada dupla ou equipe formada. - Realizar a coleta dos micro-organismos em diversos ambientes: maçanetas, ar condicionado, celular, bancada, dinheiro, mãos. Cada equipe irá escolher um local diferente para a coleta. - Identificar o fundo da placa com o nome do grupo, curso, data, número do laboratório e local da coleta. - Umedecer o swab em salina estéril próximo ao bico de Bunsen e levar ao local de coleta. - Delimitar um espaço com dimensões de 10 cm x 10 cm para a coleta com o swab. - Para a coleta das mãos, o algodão deve ser friccionado em direção a cada um dos dedos a partir do punho. Em seguida, a partir do punho, friccionar o algodão do mesmo swab entre os dedos, retornando novamente ao punho. 10 - Para a coleta de superfícies, o swab deve ser friccionado com pressão, formando um ângulo de 30º, vinte vezes na forma “zigue-zague”, no espaço delimitado. Deve-se rodar continuamente o swab, para que toda a superfície do algodão entre em contato com a amostra. - Levar o swab próximo ao bico de Bunsen e transferi-lo para um tubo de ensaio contendo 10 mL de solução salina 0,9% estéril. - Agitar o swab na solução salina para transferir os possíveis micro-organismos coletados. - Após, fazer somente uma diluição (10-1), retirando com auxílio de uma pipeta esterilizada, 1 mL da solução salina e transferir para um tubo contendo 9 mL de solução salina estéril. - Agitar este tubo e transferir 0,1 mL, utilizando uma pipeta esterilizada, para uma placa de meio de cultura agar nutriente ou Mueller-hinton. - Espalhar o líquido por toda a superfície da placa de agar, com auxílio de uma alça de drigalski, até que este seja absorvido pelo meio. - Identificar as placas com nome do grupo, data, turma, número do laboratório e local da coleta. - Incubar as placas a temperatura de 37ºC por 24 a 48 horas. Leitura - Proceder a contagem das colônias. - Calcular o número de bactérias em Unidade Formadora de Colônia por mL (UFC/mL), da seguinte maneira: Número de bactérias (UFC/mL) = média do nº de colônias x diluição utilizada (101) x 10* * fator de correção. 11 AULA PRÁTICA 5: Técnicas de Semeadura Objetivo Cultivar os micro-organismos de forma eficiente, utilizando as técnicas de semeadura. Introdução A escolha da técnica varia com o tipo de meio de cultura e a finalidade de cultivo. A inoculação dos micro-organismos pode ser realizada em meio líquido (tubo), meio sólido (tubo e placa de Petri) e meio semi-sólido (tubo). Procedimento 1. Meio líquido - Realizar o trabalho próximo ao bico de Bunsen adotando procedimentos que evitem a contaminação. - Esterilizar a alça bacteriológica na chama do bico de Bunsen e esfriá-la próximo à chama (ou no próprio meio de cultura líquido estéril). - Retirar a tampa do tubo do meio de cultura líquido contendo micro-organismos, segurando-o com o dedo mínimo. - Flambar a boca do tubo e mantê-la próxima ao bico de Bunsen. - Introduzir e agitar a alça bacteriológica neste tubo e após fechá-lo. - Retirar a tampa do tubo com meio de cultura líquido BHI estéril, segurando-o com o dedo mínimo. - Flambar a boca do tubo e mantê-la próxima ao bico de Bunsen. - Introduzir e agitar a alça bacteriológica carregada de micro-organismos no meio de cultura líquido estéril. - Flambar a boca do tubo e recolocar a tampa. - Esterilizar a alça bacteriológica e recolocá-la no suporte. - Identificar o tubo com o nome do grupo, curso, data, número do laboratório e nome da bactéria. - Incubar a 37º C por 24 a 48 horas. - Após o tempo de incubação, realizar a leitura. 12 Leitura - Observar a turbidez evidenciada no tubo com o meio líquido devido ao crescimento bacteriano. Figura 1. Cultivo de micro-organismos em meio de cultura líquido. 2. Meio semi-sólido - Realizar o trabalho próximo ao bico de Bunsen adotando procedimentos que evitem a contaminação. - Esterilizar a agulha bacteriológica na chama do bico de Bunsen e esfriá-la próximo à chama. - Retirar a tampa do tubo com meio de cultura líquido contendo micro-organismos, segurando-o com o dedo mínimo. - Flambar a boca do tubo e mantê-la próxima ao bico de Bunsen. - Introduzir e agitar a agulha neste tubo e após fechá-lo. - Retirar a tampa do tubo com meio de cultura SIM semi-sólido estéril, segurando-o com o dedo mínimo. - Flambar a boca do tubo e mantê-la próxima ao bico de Bunsen. - Introduzir a agulha carregada de micro-organismos no meio de cultura semi-sólido, fazendo uma “injeção” (em linha reta). - Flambar a boca do tubo e recolocar a tampa. - Esterilizar a agulha e recolocá-la no suporte. - Identificar o tubo com o nome do grupo, curso, data, número do laboratório e nome da bactéria. - Incubar a 37º C por 24 a 48 horas. - Após o tempo de incubação, realizar a leitura. Leitura 13 - Observar a crescimento na linha de picada e verificar a mobilidade da bactéria. Classificar a bactéria como móvel ou imóvel. Figura 2. Cultivo de micro-organismos em meio de cultura semi-sólido. 3. Meio sólido (em tubo) - Realizar o trabalho próximo ao bico de Bunsen adotando procedimentos que evitem a contaminação. - Esterilizar a alça bacteriológica na chama do bico de Bunsen e esfriá-la próximo à chama. - Retirar a tampa do tubo com meio de cultura líquido contendo micro-organismos, segurando-o com o dedo mínimo. - Flambar a boca do tubo e mantê-la próxima ao bico de Bunsen. - Introduzir e agitar a alça bacteriológica neste tubo e após fechá-lo. - Retirar a tampa do tubo com meio de cultura nutriente sólido inclinado, segurando-o com o dedo mínimo. - Flambar a boca do tubo e mantê-la próxima ao bico de Bunsen. - Encostar levemente a alça na parte mais baixa do plano inclinado e subir fazendo estrias na superfície do agar. - Flambar a boca do tubo e recolocar a tampa. - Esterilizar a alça bacteriológica e recolocá-la no suporte. - Identificar o tubo com o nome do grupo, curso, data, número do laboratório e nome da bactéria. - Incubar a 37º C por 24 a 48 horas. Leitura - Após o tempo de incubação, realizar a leitura. - Observar o crescimento bacteriano nas estrias realizadas com a alça. 14 Figura 3. Cultivo de micro-organismos em meio de cultura sólido inclinado. 4. Meio sólido (em placa) - Realizar o trabalho próximo ao bico de Bunsen adotando procedimentos que evitem a contaminação. - Esterilizar a alça bacteriológica na chama do bico de Bunsen e esfriá-la próximo à chama. - Retirar a tampa do tubo com meio de cultura líquido contendo micro-organismos, segurando-o com o dedo mínimo. - Flambar a boca do tubo e mantê-la próxima ao bico de Bunsen. - Introduzir e agitar a alça bacteriológica neste tubo e após fechá-lo. - Retirar a tampa da placa com meio de cultura sólido e inocular corretamente os microorganismos com a alça, fazendo estrias isoladas na superfície do meio (técnica de esgotamento), conforme Figura 4. - Fechar a placa. - Esterilizar a alça bacteriológica e recolocá-la no suporte. - Identificar a placa com nome do grupo, curso, data, número do laboratório e nome da bactéria. - Incubar a 37º C por 24 a 48 horas. Leitura - Após o tempo de incubação, realizar a leitura. - Observar o isolamento das colônias pela técnica de esgotamento. Figura 4. Cultivo de micro-organismos em meio de cultura sólido para isolamento de colônias. 15 AULA PRÁTICA 6: Preparações microscópicas Objetivo Observação dos micro-organismos em microscópio óptico por meio de preparações microscópicas a fresco. Introdução Duas técnicas em geral são empregadas em preparações microscópicas: preparações a fresco e preparações fixadas e coradas. A preparação a fresco permite o exame de micro-organismos nas condições normais de vida e são preferencialmente utilizadas: • Quando a morfologia da célula pode estar danificada em preparações fixadas e coradas. • Durante a verificação da mobilidade. • Observações de processos fisiológicos. • Observação de corpúsculos (vacúolos e material graxo). Ainda, as preparações a fresco podem ser realizadas com ou sem coloração, de acordo com as seguintes técnicas: Entre lâmina e lamínula: é uma técnica bastante utilizada na visualização de diferentes tipos de micro-organismos. Gota Pendente: método mais seguro que leva à diminuição no tempo de observação e a conclusões errôneas, particularmente em relação à mobilidade bacteriana. A gota fica suspensa ou pendente por tensão superficial. Microcultivo: muito utilizado em micologia, já que permite a visualização da morfologia fúngica no seu arranjo natural, sem a destruição das estruturas de crescimento. Procedimento Entre lâmina e lamínula - Flambar a alça e esfriá-la próximo ao bico de Bunsen. 16 - Abrir o tubo contendo a cultura líquida de leveduras, removendo a tampa com o dedo mínimo. - Passar rapidamente a boca do tubo no bico de Bunsen e transferir uma gotícula da cultura líquida com a alça para o centro de uma lâmina. - Em seguida, colocar a lamínula em cima da lâmina. - Flambar novamente a alça e guardá-la. - Levar a lâmina ao microscópio no aumento de 400x para a visualização. Gota pendente - Untar a borda de uma lâmina escavada com vaselina. - Transferir uma gotícula da cultura líquida contendo os micro-organismos para o centro de uma lamínula, e em seguida unir a lâmina e a lamínula. - Examinar ao microscópio óptico no aumento de 400x para observar o movimento próprio ou direcional, além do movimento brawniano dos micro-organismos, sem esquecer de diminuir a intensidade de luz. Figura 1. Lâmina escavada para técnica da gota pendente. Microcultivo - Receber o microcultivo pronto* contendo o crescimento fúngico. - Remover a lâmina dentro da placa de microcultivo e levá-la ao microscópio. - Observar as estruturas dos fungos crescidos (hifas e esporos) em microcultivo por meio do microscópio em aumento de 400x. - Observar também lâminas prontas contendo os fungos crescidos em microcultivo. * Preparação do microcultivo realizado anteriormente a aula prática 17 - Esterilizar placas contendo no seu interior um disco de papel-filtro, um suporte de lâmina, uma lâmina e uma lamínula. - Colocar sobre a lâmina 0,1 mL do meio de cultura apropriado para o crescimento do fungo a ser estudado (ex: PDA, Saboraud). - Deixar o meio solidificar. - Inocular o meio com um palito estéril contendo porções (hifas e esporos) do fungo já crescido. - Cobrir o meio de cultura inoculado com lamínula. - Umedecer o papel filtro do interior da placa com água destilada esterilizada. - Incubar a placa em temperatura de 25ºC a 30ºC, até o surgimento das estruturas a serem observadas (de 2 a 5 dias). Figura 2. Placa de microcultivo pronta para ser inoculada. 18 AULA PRÁTICA 7: Esterilização e Desinfecção Objetivo Avaliar a eficiência da esterilização por calor úmido (autoclave) e a ação de antissépticos frente a micro-organismos patogênicos. Introdução Termos utilizados para o controle microbiano: Esterilização: Destruição e remoção de todas as formas de vida microbiana, incluindo os endosporos. Esterilização comercial: Tratamento de calor suficiente para matar endosporos de Clostridium botulinum em alimentos enlatados. Desinfecção: Destruição de patógenos na forma vegetativa. Antissepsia: Destruição de patógenos na forma vegetativa em tecidos vivos. Degerminação: Remoção de micro-organismos de uma área limitada, como a pele ao redor do local de aplicação de uma injeção. Sanitização: Tratamento que reduz as contagens microbianas nos utensílios alimentares. Como os agentes antimicrobianos podem matar ou inibir os micro-organismos? Podem causar alterações na permeabilidade da membrana plasmática: a membrana regula a passagem de nutrientes. Danos aos lipídeos e proteínas da membrana causam o extravasamento do conteúdo celular e interferem no crescimento da célula. Também causam danos as proteínas e ácidos nucleicos: os agentes antimicrobianos podem romper as ligações de hidrogênio que unem a cadeia de aminoácidos (forma a proteína). Isso causa a desnaturação da proteína e perda de sua função. Danos ao DNA e RNA podem ser letais para a célula, pois perdem a capacidade de se replicar e realizar funções metabólicas normais como a síntese de enzimas. 1. Esterilização É o ato ou processo de destruir ou eliminar todas as formas vivas de um material, ambiente ou objeto. Este processo inclui os endósporos, que são formas de resistência ao meio. Esta pode 19 ser feita através de diferentes processos, empregando-se agentes físicos (calor, radiação, filtração, gases) e agentes químicos. Os métodos mais utilizados são: 1.1. Esterilização por calor úmido 1.1.1. Autoclave - Causa desnaturação de proteínas. - Leva em consideração a pressão, temperatura, umidade e tempo de exposição (Ex: 1,2 atm, 121ºC, 15 a 30 min). Figura 1. Autoclave. 1.2. Esterilização por calor seco 1.2.1. Estufa - Mata os micro-organismos por efeito de oxidação. - Leva em consideração a temperatura e o tempo (Ex: 170ºC por 2 horas). Figura 2. Estufa de secagem. 1.3. Outros métodos de esterilização 1.3.1. Filtração 20 - Serve para esterilizar materiais sensíveis ao calor. Ex. Filtros de membrana, uso industrial e laboratorial. Os poros do filtro são pequenos para não passar bactérias (0,22µm e 0,45µm) e até os vírus (0,01µm). Figura 3. Processo de filtração para esterilização de líquidos (Tortora, Funke, Case, 2012). 1.3.2. Baixas temperaturas Na temperatura de refrigerador (0 a 7ºC) a taxa metabólica é reduzida. A temperatura de congelamento tende a tornar o micro-organismo dormente, mas não necessariamente irá matálo. Embora o ciclo congelamento/descongelamento pode romper estruturas celulares. 1.3.3. Alta pressão As estruturas moleculares das proteínas e dos carboidratos serão alterados, resultando na inativação das células. No entanto, os endosporos são resistentes. Vantagens: mantêm o sabor, coloração e valor nutricional dos alimentos. Ex: suco de frutas. 1.3.4. Pressão osmótica Altas concentrações de sais e açúcares (ambiente hipertônico). Os fungos conseguem se desenvolver melhor neste ambiente do que as bactérias. 1.3.5. Radiação - Radiação ionizante: raios gama, raios-X e feixe de elétrons. Causam mutações nos microorganismos. - Radiação não-ionizante: ultra-violeta (UV). Causam danos ao DNA das células expostas, tem que ser aplicada diretamente no micro-organismo. 21 Tabela 1. Tabela de alguns alimentos autorizados para tratamentos por irradiação no Brasil e doses permitidas em kGy. Produto Dose (kGy) Arroz 1,0 Batata 0,18 Cebola 0,18 Feijão 1,0 Milho 1,0 Trigo 1,0 Farinha de Trigo 1,0 Especiarias 10,0 Mamão 1,0 Morango 3,0 Peixe 1,0 - 2,2 Frango 7,0 ANVISA, 1997, 2001 Resolução - RDC nº 21, de 26 de Janeiro de 2001 2. Desinfecção É definida como a eliminação dos micro-organismos presentes, capazes de transmitir infecções, patógenos, portanto, em um determinado meio e/ou ambiente, através de um agente desinfetante, reduzindo ou inibindo o crescimento. Estes podem ser divididos em 3 grupos: agentes químicos, físicos ou quimioterápicos. Para que possamos atingir uma desinfecção correta, deve ser observado a concentração do produto, as condições do ambiente e o tempo de exposição do mesmo. Este processo pode ser classificado como desinfecção de alto, intermediário ou de baixo nível, dependendo da quantidade de micro-organismos inativados. Desinfecção de alto nível: inativa todos os microrganismos, exceto esporos. Ex: HBV, HIV e Mycobacterium tuberculosis. Este tipo de desinfecção é indicado para itens classificados como “semi-críticos”, ou seja, que entram em contato com mucosas íntegras e pele não íntegra (p. ex. abridor de boca, condensadores de amálgama, espátulas para inserção de resinas, etc.). 22 Desinfecção de nível intermediário: é aquela que inativa bactérias na forma vegetativa (M. tuberculosis), fungos e a maioria dos vírus. É indicada para uso em itens classificados como “não-críticos”, ou seja, aqueles materiais que entram em contato apenas com a pele íntegra. (p. ex. estetoscópios, termômetros, esfigmomanômetros, gorro, máscara, refletor, etc.) Desinfecção de baixo nível: inativa a maioria das bactérias na forma vegetativa, exceto M. tuberculosis, alguns fungos e vírus. É indicada também para itens de uso “não-crítico”. 2.1. Desinfecção por agentes físicos 2.1.1. Pasteurilização É o aquecimento lento a baixas temperaturas, suficiente para eliminar as células vegetativas de micro-organismos, mas não os esporos, portanto, é um método de desinfecção de alto nível. É indicado o uso de temperatura de 77ºC por 30 minutos, aquecimento suficiente para matar os micro-organismos, sem alterar o sabor do produto. Ex. Leite, sorvete, iogurte, cerveja. Tem tempos e temperaturas diferentes. Ex: LTLT (long temperature long time), HTST (high-temperature, short-time) e UHT (ultra-high temperature). Figura 4. Pasteurilização por LTLT. 2.2. Desinfecção por agentes químicos 2.2.1. Método de desinfecção de alto nível 23 Glutaraldeído: é indicado para qualquer objeto sensível ao calor, e para rápida desinfecção de itens reutilizados. É utilizado em solução a 2% com pH alcalino (7,5-8,5) por 30 minutos. Formaldeído: Pode ser encontrado na forma sólida (pastilhas formalina) ou como solução aquosa 37-40% (diluído em álcool ou água). A solução deve ser usada por 30 minutos sendo a concentração de 8% em solução alcoólica e 10% em solução aquosa. Peróxido de Hidrogênio: Age em presença de matéria orgânica e deve-se fazer a imersão do material em solução com concentração de 3-6% por 15-30 minutos. Ácido Peracético: A concentração de uso é variável para a desinfecção, sendo que o tempo de exposição deve ser no mínimo de 20 minutos. 2.2.2. Método de desinfecção de nível intermediário Álcoois (Etílicos e Isopropílicos): Seu mecanismo de ação é através da desnaturação de proteínas. São usados em concentração de 70% por 10 minutos, para a desinfecção de superfícies. O uso destas substâncias é contra-indicado para materiais médico-cirúrgicos, borracha, plásticos e acrílico. Halogênios: Iodo e cloro. Iodo: impede a síntese de algumas proteínas e causa alterações nas membranas celulares microbianas. Utilizado para desinfecção de pele e no tratamento de feridas. Cloro: sua ação germicida é causada pelo ácido hipocloroso (HOCl) que se forma quando o cloro é adicionado à água. Impedem o funcionamento do sistema enzimático celular. Vários compostos são eficazes para desinfetar equipamentos de fábricas de laticínios e utensílios de restaurantes. Ex: hipoclorito de sódio, de cálcio, dióxido de cloro (não deixa odores e sabores residuais). Fenólicos: Seu mecanismo de ação é através do rompimento da parede celular, precipitando proteínas, quando usado em alta concentração, e alteração dos sistemas enzimáticos fundamentais, quando utilizado em baixa concentração. Sua concentração para uso é de 0,45% sendo que o tempo de exposição deve ser menor ou igual a 10 minutos. Seu uso é indicado para descontaminação de ambiente hospitalar, itens cirúrgicos e médicos nãocríticos, sendo que devem ser consideradas as limitações devido a toxicidade e ação residual em materiais porosos. 24 Iodóforos: Sua ação é através de seu alto poder de penetração na parede celular, levando a ruptura de proteínas. São utilizados em concentração de 30 a 50 ppm por um tempo menor ou igual a 10 minutos. 2.2.3. Método de desinfecção de baixo nível Alcoóis Compostos clorados Fenólicos: em concentração menor que 5%. Iodóforos: em concentração menor que 30 ppm. Compostos de Amônio Quaternário: Age através da inativação de enzimas, desnaturação de proteínas essenciais e ruptura da membrana celular. Sua concentração para uso é de 0,4 a 0,6% por um tempo de no mínimo 10 minutos. É indicado para a limpeza de ambiente hospitalar (pisos, paredes e superfícies). Detergentes: São emulsionante. Podem Amônio), Aniônicos agentes tensioativos, com ação detergente, umectante e ser classificados como Catiônicos (p. ex. Quaternários de (p. ex. sabões, detergentes sulfatados ou sulfonados), e Enzimáticos. Este último tem como princípio ativo enzimas proteinases, amilase e lípases, e, portanto, causam transformações em proteínas, polissacarídeos e gorduras. Procedimento Avaliação da ação da autoclave - Abrir o tubo contendo meio de cultura líquido com crescimento de micro-organismos, removendo e segurando a tampa com o dedo mínimo, próximo ao bico de Bunsen. Passar rapidamente a boca do tubo no bico de Bunsen. - Transferir 100 µl da cultura bacteriana (com auxílio de uma micropipeta com ponteira estéril), para dois tubos contendo caldo nutriente estéril, separadamente e de forma asséptica. - Identificar os tubos, destinando um para a autoclave (A) e o outro para a estufa (E). Além disso, acrescentar nome da equipe, data, turma, número do laboratório e nome da bactéria utilizada. - O tubo identificado com a letra “E” deve ser levado imediatamente para a incubação a 37ºC por 24 a 48 horas. 25 - O tubo identificado com a letra “A” deve ser encaminhado para a autoclave. Neste caso, a equipe de técnicos do departamento irá realizar a autoclavação e após este processo, o tubo será incubado a 37º por 24 a 48 horas. Leitura Verificar a turbidez de cada tubo incubado e discutir sobre a eficiência da autoclave e sua ação frente aos patógenos. Avaliação da ação dos antissépticos - Abrir o tubo contendo meio de cultura líquido com crescimento de micro-organismos, removendo e segurando a tampa com o dedo mínimo, próximo ao bico de Bunsen. Passar rapidamente a boca do tubo no bico de Bunsen. - Umedecer o swab estéril neste tubo, removendo o excesso, pressionando levemente o swab na parede interna do tubo. - Semear a suspensão retida no swab sobre a superfície do meio de cultura agar nutriente em até três direções para obter um inóculo uniforme, evitando que qualquer superfície do ágar fique isenta do crescimento bacteriano. - Identificar os poços na parte de baixo da placa de Petri com caneta de retroprojetor, nomeando-os com os seguintes títulos: AI e A70%. Além disso, acrescentar nome da equipe, data, turma, número do laboratório e nome da bactéria utilizada. - No poço AI, adicionar 50 µ l de álcool-iodado e no poço A70% o mesmo volume de álcool 70% (com auxílio de uma micropipeta com ponteira estéril). - Esperar evaporar o líquido antes de virar a placa para incubação. - Incubar a placa a 37ºC por 24 a 48 horas. Leitura - Verificar o halo de inibição formado e discutir sobre a eficiência dos antissépticos e sua ação frente aos patógenos. 26 AULA PRÁTICA 8: Coloração de Gram: Cocos e Bacilos Objetivo Diferenciar as bactérias em gram-positivas e gram-negativas por meio da coloração de Gram. Introdução As bactérias coradas pela técnica de Gram pertencem a duas categorias distintas: grampositivas e gram-negativas. As diferenças entre os dois grupos é resultado da estrutura de suas paredes celulares, visto que as paredes das células gram-negativas possuem um conteúdo lipídico mais elevado que das gram-positivas. A parede celular da bactéria é composta por uma rede macromolecular denominada peptideoglicano. O peptiodeoglicano consiste em dissacarídeos repetitivos (N- acetilglicosamina e ácido N-acetilmurâmico) ligados por polipeptídeos. O peptideoglicano auxilia na diferenciação das bactérias gram-positivas e gram-negativas, já que as grampositivas apresentam uma camada espessa de peptideoglicano, enquanto que nas gramnegativos, a camada é mais fina. No entanto, as gram-negativas possuem uma membrana externa contendo lipossacarídeos, lipoproteínas e fosfolipídeos. Coloração de Gram A coloração foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram, que classifica as bactérias em dois grandes grupos: gram positivas e gram-negativas. A reação de Gram de uma bactéria pode fornecer informações valiosas para o tratamento da doença. As bactérias gram-positivas tendem a ser mortas mais facilmente por penicilinas e cefalosporinas. Já as bactérias gram-negativas geralmente são mais resistentes pois os antibióticos não podem penetrar a camada de lipopolissacarídeo. Procedimento Esfregaço da cultura bacteriana líquida • Cultura padrão, meio líquido com crescimento bacteriano. 27 - Flambar uma alça e deixá-la esfriar, mantendo-a próximo a chama do bico de Bunsen. - Abrir o tubo contendo a cultura bacteriana, removendo a tampa com o dedo mínimo. - Passar rapidamente a boca do tubo no bico de Bunsen e retirar uma amostra da cultura com a alça bacteriológica. - Depositar esta gota contida na alça no centro da lâmina. - Espalhar o material com a alça em movimento circular, obtendo um esfregaço de forma oval, uniforme e fino. - Fixar o esfregaço, passando a lâmina na chama do bico de Bunsen, cortando a chama rapidamente e repetindo este procedimento em até 3 vezes, para que o material fique bem aderido. Coloração - Colocar a lâmina sobre o suporte que está localizado na pia. - Pingar sobre o esfregaço a solução GRAM I (cristal violeta) cobrindo-o completamente, deixando durante 1 minuto. Retirar o excesso com um filete de água corrente. Os microorganismos adquirem tonalidade azul escura ou púrpura. - Recolocar a lâmina sobre o suporte. Cobrir o esfregaço com solução GRAM II (iodoiodetada) por 1 minuto. Esta solução mordente fixa o cristal violeta produzindo um complexo violeta-iodo. Retirar o excesso com um filete de água corrente. - Aplicar a solução GRAM III (álcool etílico a 95% juntamente com acetona - 700 mL de álcool + 300 mL de acetona) por gotejamento até que não aja mais desprendimento do corante. As bactérias gram(+) sofrem desidratação dos carboidratos das paredes celulares promovendo a retenção dos corantes. As gram(-) pela dissolução dos lipídeos, tem a porosidade ou a permeabilidade da parede celular aumentada não retendo o corante. Retirar o excesso com um filete de água corrente. - Por fim, aplicar a solução GRAM IV (fucsina ou safranina), que é o corante secundário. Aplicar sobre o esfregaço por um período de 30 segundos. Após, retirar o excesso com um filete de água corrente. Se as células permitem o descoramento pelo álcool, elas fixam a fucsina nesta etapa e parecem vermelhas (gram-negativas), caso contrário, permanecem com a cor azul escura (gram-positivas). - Secar a lâmina próximo a chama do bico de Bunsen e observá-la no microscópio óptico com a objetiva de imersão. 28 Figura 1. Etapas da coloração de Gram (Tortora, Funke, Case, 2012). Leitura - Visualizar coloração: as Gram-positivas coram de violeta e as Gram-negativas coram de vermelho. - Visualizar morfologia: Cocos (Staphylococcus, Streptococcus, diplococos...), Bacilos (bacilos isolados, diplobacilos...). 29 AULA PRÁTICA 9: Coloração de Gram (amostras: oral, culturais, ar) Objetivo Diferenciar as bactérias encontradas em diferentes ambientes em gram-positivas e gramnegativas por meio da coloração de Gram. Introdução Os micro-organismos podem ser encontrados nos mais diversos ambientes. As espécies podem ser benéficas (inócuas) ou patogênicas ao ser humano, animais e plantas. Através de técnicas simples, é possível demonstrar a presença de micro-organismos em diversos locais do ambiente. Além disso, por meio da coloração de Gram, realizada conforme a aula anterior, poderemos diferenciar os micro-organismos presentes e discutir a sua presença nos diversos locais onde são encontrados. Procedimento Esfregaço da cultura bacteriana líquida • Amostra oral - Flambar uma alça e deixá-la esfriar, mantendo-a próximo a chama do bico de Bunsen. - Retirar uma porção da amostra oral da cavidade bucal (depositada em um pote estéril) com a alça bacteriológica e transferi-la para o centro da lâmina. - Espalhar o material com a alça em movimento circular, obtendo um esfregaço de forma oval, uniforme e fino. - Fixar o esfregaço, passando a lâmina na chama do bico de Bunsen, cortando a chama rapidamente e repetindo este procedimento em até 3 vezes, para que o material fique bem aderido. Esfregaço da cultura bacteriana sólida • Cultura padrão e de amostras ambientais coletadas em aulas práticas anteriores: microbiologia do ar e ambientes. 30 - Flambar uma alça e deixá-la esfriar, mantendo-a próximo a chama do bico de Bunsen. - Abrir o tubo contendo a água estéril, removendo a tampa com o dedo mínimo. - Passar rapidamente a boca do tubo no bico de Bunsen e retirar a suspensão com a alça. - Depositar esta gota contida na alça no centro da lâmina. - Flambar novamente a alça, esperar esfriar e transferir uma colônia da cultura sólida para a gota de água depositada sobre a lâmina. - Homogeneizar com movimentos circulares, para obter um esfregaço de forma oval, uniforme e fino. - Fixar o esfregaço, passando a lâmina na chama do bico de Bunsen, cortando a chama rapidamente e repetindo este procedimento em até 3 vezes, para que o material fique bem aderido. Coloração e Leitura: realizadas conforme aula anterior (Coloração de Gram). 31 AULA PRÁTICA 10: Microbiologia industrial (leite fermentado, iogurte, fermento biológico) Objetivo Identificar os micro-organismos presentes em alimentos fermentados. Introdução Um dos processos mais utilizados na microbiologia industrial é a fermentação. A fermentação é um processo anaeróbio em que ocorre a produção de ATP a partir de compostos orgânicos, numa série de reações redox, que não envolvem uma cadeia transportadora de eletróns. A fermentação envolve menores ganhos energéticos já que apenas se formam 2 moléculas de ATP por molécula de glicose, enquanto que na respiração aeróbia se formam 36 ATP. Existem vários tipos de fermentação, o que depende da molécula orgânica que é aceptora do hidrogênio na fase de redução do ácido pirúvico. A fermentação alcoólica é realizada por leveduras (ex. Saccharomyces cerevisiae), o ácido pirúvico é convertido em etanol e CO2 em duas etapas: a) ácido pirúvico é descarboxilado e forma-se acetaldeído e b) acetaldeído é reduzido pelo NADH a etanol. Exemplos de alimentos produzidos: vinho, cerveja, pão. Já na fermentação lática, o ácido pirúvico é diretamente reduzido a ácido lático pelo NADH, realizado por espécies de micro-organismos, tais como Lactobacillus lactis, L. thermophilus, L. bulgaricus. A fermentação homolática produz grandes quantidades de ácido lático e a fermentação heterolática leva à produção de outras substâncias além do ácido lático, como CO2, etanol e ácido acético. Exemplos de alimentos produzidos: queijo, iogurte. Por fim, a fermentação acética é chamada desta forma devido as características do produto obtido, no entanto, não é uma fermentação, mas uma oxidação. A sua produção compreende duas etapas: a) Fermentação do açúcar que é convertido em etanol: processo anaeróbio realizado por leveduras. b) Oxidação do etanol a ácido acético: reação aeróbia realizada por bactérias acéticas dos gêneros Acetobacter e Glucanobacter. Exemplo de alimento produzido: vinagre. Procedimento 32 - Preparar lâminas a fresco e coradas pelo método de Gram, a partir de fermento de pão, iogurte, leite fermentado, queijos. - Visualizar no microscópio óptico. - Identificar os micro-organismos presentes nos alimentos, diferenciando-os conforme morfologia e coloração. Observação A preparação de lâminas a fresco e a Coloração de Gram serão realizadas conforme descrito nas aulas anteriores. 33 AULA PRÁTICA 11: Contagem em placa Objetivo Avaliar a qualidade do leite em função do número de micro-organismos presentes. Introdução O leite pode ser um meio de cultura para o crescimento de micro-organismos devido aos vários nutrientes que possui. Ele pode conter uma microbiota normal proveniente do próprio animal que o produz e algumas vezes pode conter micro-organismos patogênicos, tais como Salmonella, Mycobacterium bovis, M. tuberculosis. Estes micro-organismos podem ser originados do próprio animal e pode continuar durante a ordenha, transporte e armazenamento. Além disso, estes patógenos podem ser transferidos durante a manipulação do produto, sendo que condições inadequadas de conservação, transporte e armazenamento também contribuem significativamente para sua multiplicação. Assim, a qualidade do leite pode ser avaliada em função da sua microbiota, fornecendo informações que refletem as condições higiênico-sanitárias deste alimento. Procedimento - Abrir o frasco contendo o leite próximo a chama do bico de Bunsen. - Abrir o tubo contendo 9 mL de solução salina, removendo a tampa com o dedo mínimo e passar a boca do tubo rapidamente na chama do bico de Bunsen. - Transferir 1 mL da amostra de leite para 9 mL de solução salina estéril, com auxílio de uma pipeta estéril. Desta forma, a diluição 10-1 será realizada. - Agitar o tubo contendo 10 mL (10-1) e transferir 1 mL deste tubo para o próximo tubo contendo 9 mL de solução salina estéril (10-2). - Agitar o tubo contendo 10 mL (10-2) e transferir 1 mL deste tubo para o próximo tubo contendo 9 mL de solução salina estéril (10-3). - Agitar o tubo contendo 10 mL (10-3) e transferir 1 mL deste tubo para o próximo tubo contendo 9 mL de solução salina estéril (10-4). - Agitar o tubo contendo 10 mL (10-4) e transferir 1 mL deste tubo para o próximo tubo contendo 9 mL de solução salina estéril (10-5). - Após finalizar as diluições, transferir 0,1 mL das diluições (10-3, 10-4, 10-5) para as placas contendo meio de cultura nutriente sólido (em duplicata), com auxílio de uma pipeta estéril. 34 - Espalhar por toda a superfície da placa de meio de cultura, com auxílio de uma alça de drigalski de vidro estéril. - Identificar as placas com nome da equipe, data, turma, número do laboratório e a diluição realizada. - Incubar as placas a 37ºC por 24 a 48 horas. Figura 1. Procedimento para contagem de bactérias no leite. Leitura - Após incubação, escolher as placas que tenham 30 a 300 colônias e realizar o seguinte cálculo. Nº de UFC/mL = média das contagens das placas x diluição escolhida 35 AULA PRÁTICA 12: Análise bacteriológica da água Objetivo Avaliar a qualidade da água pela pesquisa de coliformes totais e termotolerantes. Introdução No que diz respeito à potabilidade, o aspecto mais importante é o caráter qualitativo da população. A maioria das doenças veiculadas pelas águas tem sua origem na contaminação fecal, como é o caso da shigelose, hepatite A, rotavírus, giardíase, entre outras. Como a liberação dos micro-organismos algumas vezes pode ser em pequenas quantidades ou de forma descontínua, seria impossível avaliar a presença de todos eles em uma amostra de água. Por isso, para a análise da água utiliza-se um micro-organismo indicador, ou seja, com suspeita de ser patogênico por indicar a contaminação da água com fezes. Neste caso, o microrganismo escolhido é a Escherichia coli. Ela é constante no intestino humano e dos animais de sangue quente, é abundante nas fezes, cresce facilmente em meios de cultura e vive bastante tempo na água. No entanto, apresenta baixa resistência à cloração e menor viabilidade na água do mar. A E. coli faz parte do grupo de micro-organismos denominados coliformes, constituindo 95% dos coliformes nas fezes. Além da potabilidade, a qualidade microbiológica da água é que vai decidir sobre seus possíveis usos. Para avaliar a qualidade da água, é realizada a pesquisa de coliformes totais e termotolerantes. Pode-se utilizar vários métodos, entre eles, a técnica de tubos múltiplos e o filtro de membrana. No teste de tubos múltiplos, os coliformes totais e termotolerantes serão pesquisados através do crescimento, evidenciado por meio da produção de gás nos tubos, em meios de cultura líquidos, tais como, caldo lactosado, caldo verde brilhante e caldo EC (Escherichia coli). Procedimento Análise bacteriológica da água I 1. Coliformes totais: a pesquisa de coliformes totais é baseada nas características do grupo bastonete Gram-negativo, que produz ácido e gás através da lactose. 36 Teste presuntivo: neste teste, presume-se que os micro-organismos que crescem produzindo gás a partir de lactose sejam coliformes. - Próximo ao bico de Bunsen, abrir a amostra e o tubo contendo meio de cultura líquido, removendo a tampa com o dedo mínimo e não esquecendo de passar a boca de cada tubo rapidamente na chama do bico de Bunsen antes da inoculação. - Inocular com 10 mL da amostra, 3 tubos contendo 10 mL de caldo lactose concentrado e tubos de Durham invertidos. - Inocular com 1 mL da amostra, 3 tubos contendo 10 mL de caldo lactose e tubos de Durham invertidos. - Inocular com 0,1 mL da amostra, 3 tubos contendo 10 mL de caldo lactose e tubos de Durham invertidos. - Anotar nos tubos a quantidade que está sendo inoculada. Não misturar os tubos. - Além disso, anotar nome do grupo, data, turma, número do laboratório e quantidade de mL que está sendo inoculada. - Incubar os tubos a temperatura de 37º C por 24 horas. Leitura - Fazer a leitura considerando positivos os tubos com presença de gás. - Reincubar os tubos negativos por mais 24 horas. - Fazer nova leitura. - Usar a tabela para verificar o número mais provável (NMP) de coliformes por 100 mL. Análise bacteriológica da água II Teste confirmativo: os sais de bile deste meio tem a função de inibir o crescimento de bactérias não entéricas, já o verde brilhante de inibir as bactérias gram-positivas, selecionando o crescimento de coliformes. - Após o teste presuntivo, transferir através de uma alça bacteriológica uma alíquota de cada tubo positivo de caldo lactose para tubos contendo caldo lactosado bile verde brilhante e tubos de Durham invertidos, de forma asséptica e próximo ao bico de Bunsen. - Identificar os tubos com nome do grupo, data, turma, número do laboratório e quantidade de mL dos tubos em que foram anteriormente inoculados. - Incubar a temperatura de 37º C por até 48 horas. Leitura 37 - Fazer a leitura. Os positivos apresentam gás. - Usar a tabela para verificar o NMP de coliformes por 100 mL. Análise bacteriológica da água III 2. Coliformes termotolerantes: a pesquisa de coliformes termotolerantes é possível através do seu crescimento em meio EC (Escherichia coli) inoculado a partir do teste presuntivo. Estes coliformes tem em seu ambiente natural temperaturas mais elevadas e por isso, são capazes de crescer a 44,5ºC, possibilitando assim serem avaliados separados dos demais coliformes. - Após a leitura do teste presuntivo, transferir com a alça bacteriológica uma porção de cada tubo positivo do caldo lactose para tubos contendo caldo EC com tubos de Durham invertidos. - Identificar os tubos com nome do grupo, data, turma, número do laboratório e quantidade de mL dos tubos em que foram anteriormente inoculados. - Incubar a temperatura de 44,5ºC por 24 horas. Leitura - Fazer a leitura dos tubos de EC. Os tubos com presença de gás são positivos. - Usar a tabela para verificar o NMP de coliformes por 100 mL. 38 Tabela 1. Número mais provável por 100 mL de amostra, usando três tubos de diluição. Número de tubos positivos Número de tubos positivos NMP NMP /100 mL /100 mL 10 mL 1 mL 0,1 mL 10 mL 1 mL 0,1 mL 0 0 0 0 2 0 0 9,1 0 1 0 3 2 0 1 14 0 0 2 6 2 0 2 20 0 0 3 9 2 0 3 26 0 1 0 3 2 1 0 15 0 1 1 6,1 2 1 1 20 0 1 2 9,2 2 1 2 27 0 1 3 12 2 1 3 34 0 2 0 6,2 2 2 0 21 0 2 1 9,3 2 2 1 28 0 2 2 12 2 2 2 35 0 2 3 16 2 2 3 42 0 3 0 9,4 2 3 0 29 0 3 1 13 2 3 1 36 0 3 2 16 2 3 2 44 0 3 3 19 2 3 3 53 1 0 0 3,6 3 0 0 23 1 0 1 7,2 3 0 1 39 1 0 2 11 3 0 2 64 1 0 3 15 3 0 3 95 1 1 0 7,3 3 1 0 43 1 1 1 11 3 1 1 75 1 1 2 15 3 1 2 120 1 1 3 19 3 1 3 160 1 2 0 11 3 2 0 93 1 2 1 15 3 2 1 150 1 2 2 20 3 2 2 210 1 2 3 24 3 2 3 290 1 3 0 16 3 3 0 240 1 3 1 20 3 3 1 460 1 3 2 24 3 3 2 1100 1 3 3 29 Fonte: Seeley, H.R. Jr., Vandemark, P.J., Lee, J.J. (1991). Microbes in Action. 4th ed., W.H. Freeman &Company, New York: 450pp. 39 AULA PRÁTICA 13: Identificação bacteriana Objetivo Identificar as enterobactérias por meio de provas bioquímicas. Introdução A família Enterobacteriaceae compreende cerca de 80% de todos os bacilos gram-negativos isolados no laboratório clínico, sendo que os demais bacilos Gram-negativos isolados constituem o grupo das chamadas bactérias não-fermentadoras. Enterobactérias são bacilos gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, não esporulados, de crescimento rápido que formam colônias distintas em meio seletivo indicador, dependendo da sua capacidade metabólica e dos componentes do meio. Tem como hábitat o intestino grosso, mas também são encontradas causando infecções no trato urinário, pulmões, ouvidos, etc. Todas fermentam glicose, reduzem o nitrato a nitrito e são citocromo oxidase negativas. Alguns gêneros são sempre patogênicos, outros fazem parte da flora normal intestinal, porém se inoculadas em outros locais, tais como: líquor, peritônio e pulmões de imunodeprimidos, podem causar doenças. Procedimento Identificação bacteriana I - Distribuir as placas de meios de cultura SS (Salmonella-Shigella), MC (MacConkey) e Teague com crescimento de diferentes enterobactérias (as placas estarão numeradas, sendo cada número correspondente a uma enterobactéria). - Observar as colônias nos meios de cultura SS, MC e Teague, realizando a identificação conforme quadro abaixo: 40 Tabela 1. Interpretação do crescimento bacteriano nos meios de cultura. Meios MC SS Teague Agentes Inibidores - Cristal violeta - Sais biliares - Verde brilhante - Sais biliares - Eosina - Azul de metileno Agentes Indicadores Características culturais - Vermelho neutro Rosa Incolor - Vermelho neutro Rosa Incolor (com ou sem pigmentos pretos) - Azul de metileno Vinho Incolor 1. Meio Salmonella-Shigella (SS): meio diferencial empregado para isolar Salmonella e Shigella a partir de fezes, urina e alimentos frescos ou enlatados. - As bactérias Gram-positivas são inibidas por uma mistura de sais biliares. - Shigella e a maioria das enterobactérias formam colônias claras e incolores ou transparentes. - E. coli formam colônias pequenas, que vão de rosa a vermelho. - Algumas espécies de Salmonella formam colônias incolores e transparentes com centro negro (H2S). 2. Meio MacConkey (MC): meio amplamente utilizado para isolar e identificar seletivamente enterobactérias em amostras biológicas, água, esgoto e alimentos. - A mistura de sais biliares inibe Gram-positivas. - E. coli - colônias vermelhas ou rosadas, devido a fermentação da lactose a diminuição do pH pode fazer com que os meios fiquem rodeados por um precipitado de sais biliares. - Salmonella – colônias incolores, do transparente ao âmbar. - Shigella – colônias incolores, transparentes ou levemente rosadas. 3. Meio Teague (EAM): eosina azul de metileno: meio utilizado para isolamento e diferenciação de enterobactérias. Promove uma distinta diferenciação entre as colônias de micro-organismos fermentadores de lactose e os que não fermentam lactose. - O meio é ligeiramente inibidor para Gram-positivas. - E. coli – colônias elevadas de 2 a 3 mm de diâmetro. Apresentam um centro azul-negro com borda estreita e clara, e brilho azul metálico azul esverdeado à luz refletida (algumas linhagens podem não ter brilho). - Salmonella e Shigella – colônias ligeiramente elevadas de 1 a 2 mm de diâmetro, transparentes, desde incolor até âmbar. 41 Identificação bacteriana II Semeadura no TSI e provas bioquímicas - A partir de colônias características e isoladas dos meios de cultura acima, inocular no meio TSI (Tríplice Sugar Iron) com agulha de níquel cromo, por estria de esgotamento e em profundidade (escolher as colônias de um dos meios utilizados). - Identificar o tubo com data, nome da equipe, turma, número do laboratório e número da bactéria. - Incubar o tubo de TSI a temperatura de 37ºC por 24 a 48 horas. - Após a inoculação do meio TSI, inocular as colônias bacterianas crescidas nas placas de meio de cultura em tubos contendo as provas bioquímicas. - Identificar os tubos com data, nome da equipe, turma, número do laboratório e número da bactéria. - Incubar os tubos a temperatura de 37ºC por 24 a 48 horas. Identificação bacteriana III Leitura do TSI - Proceder a identificação do possível grupo de micro-organismos por meio do TSI, que é um meio de triagem. Meio TSI (ágar ferro tríplice açúcar – glicose, sacarose e lactose): é um meio diferencial, recomendado para identificação de bacilos entéricos, baseado na fermentação da glicose, lactose e sacarose e na produção de sulfeto hidrogênio (H2S). Tabela 2. Interpretação das cores no meio de cultura TSI. Local Ápice e/ou base Cor Vermelho forte Vermelho claro Amarelo Amarelo e bolhas Preta Significado Reação alcalina Reação neutra Reação ácida Reação ácida e gás Produção H2S Interpretação Ápice e base amarela = glicose (+); lactose e/ou sacarose (+). Ápice vermelho e base amarela = glicose (+); lactose e/ou sacarose (-). 42 Ápice e base vermelho = glicose, sacarose e lactose (-). Tabela 3. Identificação de bactérias por meio do TSI (Salmonella, Shigella e E.coli). TSI Lactose Sacarose Glicose Gás H2S Salmonella + + + Shigella + - E.coli + + + + - Tabela 4. Identificação de bactérias por meio do TSI (outros micro-organismos). Leitura Interpretação Base amarela Superfície amarela Gás Fermentação de glicose Fermentação de lactose e/ou sacarose Produção de gás Base amarela Superfície rosa Gás Pigmento negro Fermentação de glicose Ausência de fermentação de lactose e sacarose Produção de gás Produção de H2S Base amarela Superfície rosa Fermentação de glicose Ausência de fermentação de lactose e sacarose Base amarela Superfície amarela Gás Pigmento negro Fermentação de glicose Fermentação de lactose e/ou sacarose Produção de gás Produção de H2S Meio sem alteração ou Ausência de fermentação dos três Rosa carboidratos Diagnóstico presuntivo Escherichia Klebsiella Enterobacter Providencia Salmonella Arizona Citrobacter Edwardsiella Proteus Shigella Providencia Escherichia Salmonella Proteus Serratia Arizona Citrobacter Proteus Bactéria não fermentadora Leitura das provas bioquímicas - Proceder a identificação por meio de comparação das características dos micro-organismos em estudo. 43 Indol: verificar se a bactéria tem ou não a enzima triptofanase. Triptofanase Caldo triptofano -----------------------------------> indol + amônia + ácido pirúvico Interpretação: reativo de Erlich (na parede do tubo) em presença do indol forma um complexo de cor vermelha. vermelho (+) sem alteração na cor (-) Nitrato: verificar a presença da enzima nitrito redutase. Nitrito redutase. Nitrato (NO3) -------------------------------------------> Nitrito (NO2) Reativo de Gries Ilosvay Reativo A: ácido Sulfanílico Reativo B: ácido Naftilamina Interpretação: teste positivo - precipitado vermelho-tijolo teste negativo - sem alteração de cor Citrato: verificar se o citrato é utilizado como única fonte de carbono Interpretação: teste positivo - azul teste negativo - verde Malonato: verificar se o malonato é utilizado como única fonte de carbono Interpretação: teste positivo - azul teste negativo - verde Fenilalanina desaminase (FM): catalisa a desaminação do aminoácido fenilalanina formando ácido fenilpirúvico. Para evidenciar acrescentar HCL 0,1N ---------> pH --------> cor amarela Após adiciona-se cloreto férrico 10% + ácido --------> volta a ficar verde 44 Fenilalanina desaminase Fenilalanina -----------------> ácido fenilpirúvico Interpretação: teste positivo - verde teste negativo - amarelo Uréia: verificar a presença da enzima uréase Urease uréia -----------------------------> amônia Interpretação: teste positivo - vermelho ou rosa teste negativo - amarelo Fermentação de Carboidratos: determina a capacidade de um microrganismo de fermentar a glicose incorporada a um meio base, produzindo ácido ou ácido com gás. Glicose Lactose Sacarose ácidos ou ácidos com gás Maltose Manitol Lisina: verificar a presença da enzima lisina carboxilase enzimas Glicose --------------------> ácidos (baixa do pH – coloração amarela (-)) enzimas Lisina ---------------------> cadaverina (diamina) + CO2 (aumenta pH – coloração roxa(+)) Vermelho de Metila: testa a capacidade de um micro-organismo em produzir ácidos orgânicos relativamente estáveis, a partir da fermentação da glicose. enzimas ácido láctico Glicose ----------------------------> ácido acético ácido fórmico 45 Reagente: solução hidroalcóolica de vermelho de metila (5 gotas) Interpretação: teste positivo - vermelho teste negativo - amarelo Vogues Proskauer: determina a capacidade de um micro-organismo em produzir um composto nitrogenado neutro, o acetilmetilcarbinol (acetoína), a partir da fermentação da glicose. Glicose 2 ácido pirúvico Acetilmetilcarbinol (acetoína) 0,6 mL de alfa-naftol + 0,2 mL de KOH40% Diacetil + guanidina da peptona Composto vermelho Interpretação: teste positivo - rosa a vermelho teste negativo - cobre Produção de gás sulfídrico (SIM) H2S - gás sulfídrico (sulfeto de hidrogênio): é evidenciado nas culturas por reagir com metais pesados, formando sulfetos. A bactéria degrada compostos orgânicos contendo enxofre, como o tiossulfato de sódio (Na2S2O3) e libera H2S -------> reage com Fe. Interpretação: teste positivo - precipitado negro teste negativo - incolor 46 Tabela 5. Identificação das enterobactérias através das provas bioquímicas. Espécies Testes Glicose gás Glicose ácido Lactose Maltose Manitol Sacarose Citrato Malonato Hidrólise do amido VM VP Hidrólise de gelatina H2 S Indol Motilidade Lisina Fenilalanina Nitrato Urease Catalase/Peroxidase Escherichia coli Salmonella Shigella dysenteriae Shigella sonnei Klebsiella pneumoniae Enterobacter aerogenes + + + + + d + + +/+ + + + + D + + + D + D + + + + + + +/+ d + + + (+) +/+ (+) + + + + + + + + + + + + (d) d + + + + + + + + + + + (*) + + + (d) + D= diferentes reações em diferentes espécies de um gênero d= diferentes reações em diferentes isolados (d)= diferentes reações em diferentes isolados tardiamente (+)= reações tardias, mas sempre positivas (*)= liquefação muito lenta Hafnia spp. Serratia marcescens Proteus vulgaris Proteus mirabilis + d + + + + + + + + + + + + + (+) + + +/(+) +/+ + + D d d + + + + + + + + + + + + d d + + + + + + + + + + + + (Fonte: Manual BERGEY, 8ª edição) Referências Bibliográficas MURRAY, P.R.; ROSENTHAL, K.S.; PFALLER, M.A. Microbiologia médica. 6 edição. Rio de Janeiro: Elsevier, 2009. 948 p. KONEMAN, E.W.; ALLEN, S.D.; JANDA, W.M.; SCHRECKENBERGER, P.C.; WINN Jr., W.C. Dignóstico microbiológico. 5ª edição. Rio de Janeiro: editora médica e científica Ltda.2001. 1465 p. SILVA FILHO, G.N.; OLIVEIRA, V.L. Microbiologia: manual de aulas práticas. 2 edição, Florianópolis: Editora da UFSC, 2007. 157p. TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia. 10 edição. Porto Alegre: Artmed, 2012. 934 p. TRABULSI, L.R.; ALTERTHUM, F. Microbiologia. 5 edição. São Paulo: Atheneu, 2008. 760 p.