LABORATORIO NO.

3: IDENTIFICACION MICROORGANISMO POR

MOROFOLOGIA
AUTORES

CODIGO

CRISTIAN FELIPE PORRAS CASTRO

JULIAN ANDRES VIVEROS RAYO
MAYRA DUARTE

1326612
1328656
1328577

INTRODUCCION
Nuestro planeta se encuentra conformado por innumerables formas de vida que van
desde seres tan pequeos que resultan invisibles y que han existido hace miles de
aos, a esta afirmacin llego la ciencia humana despus de muchas observaciones,
estudios y anlisis, con las cuales lograron descubrir que existen formas de vida muy
pequeos que son imposibles de captar solo con la resolucin del ojo humano, a
dichos seres se les designo con el nombre de microorganismos, termino que se
define como un ser vivo, o un sistema biolgico que puede visualizarse con la ayuda
del microscopio (Wikipedia, 2014), estos microorganismos o microbios como tambin
se les llama, los constituyen principalmente las bacterias definidas como seres
unicelulares o procariotas que pertenecen al grupo de los protistas, que se
caracterizan por tener un cromosoma y carecen de membrana nuclear y otras formas
de vida como hongos, algas, priones y virus. (Monografas, 2014).
Las bacterias poseen un tamao medio que oscila entre 2 y 10 um. Su citoplasma esta
repleto de ribosomas; el material gentico, constituido por acido desoxirribonucleico
(DNA), forma un conglomerado compacto (nucleoide) carente de membrana nuclear,
La membrana citoplasmtica est rodeada externamente por una pared dura y
elstica, de peptidoglicano (glicopeptido, mureina), que confiere la forma a la clula; su
reproduccin en la mayora es mediante un mecanismo asexual, el cual se le conoce
como fisin binaria, en el cual la clula crece, duplica su material gentico y luego se
divide por la mitad, formando as dos clulas, las cuales a su vez repiten el proceso;
otras se reproducen de forma sexual por medio de la conjugacin que permite el
intercambio gentico gracias a los pelos sexuales, a este proceso se le conoce como
conjugacin (Prats, 2005), en cuanto su morfologa las bacterias se clasifican en
cocos, cuando son redondas, bacilos cuando son alargadas, espirilos o espiroquetas,
rickettsias y mycoplasma, siendo estas dos ltimas clasificaciones menos comunes; de
igual forma se clasifican segn la estructura de su pared en dos grupos, el primero las
denominado grampositivas, que poseen solo peptidoglicano; el otro las llamadas
gramnegativos, que adems de tener peptidoglicano cuentan con una membrana rica
en lipopolisacridos.
A lo largo de la historia se han desarrollado un sin nmero de tcnicas y procesos en
la microbiologa, esto con el objetivo de simplificar procesos como la identificacin,
diferenciacin y clasificacin de los diferentes microorganismos de acuerdo a sus
estructuras celulares; dentro de esta serie tcnicas y procesos que se han
desarrollado, se encuentra una tcnica conocida como tincin la cual tiene como

objetivo el aumentar el contraste existente entre la clula y el medio que la rodea

(microinmuno, 2014), facilitando as la observacin del microorganismos en el
microscopio. Existen tres tipos de tcnicas de tincin: simples, diferenciales y
especficas o especiales (aualvirual, 2014), de las cuales un de las ms importantes es
la tincin diferencial desarrollada por el Doctor Christian Gram en 1884, la cual es una
de las ms utilizadas hoy en da en laboratorios de bacteriologa y permite de acuerdo
a la estructura y grosor de la pared bacteriana clasificarla como Gram negativa,
cuando la pared es delgada y con membrana externa, y Gram positiva cuando la
misma presenta una capa gruesa y sin membrana externa (Rodriguez, 2005). Algunas
bacterias poseen una capsula que rodea a la pared, tambin pueden tener flagelos
(apndices largos) que permiten su movilidad, fimbrias (pili) estructuras que permiten
su adherencia y virulencia, as como su reproduccin por conjugacin.

1. ANTECEDENTE
Con el fin de lograr un mayor detalle, anlisis y veracidad en el estudio de las
bacterias, Se desarroll hacia el ao de 1884 el mtodo de la tincin de Gram, llamado
as por su descubridor el Doctor Hans Christian Gram, dicho mtodo se define como
un tipo de tincin diferencial empleado en bacteriologa para la visualizacin de
bacterias, en particular en muestras clnicas, en el campo medico este estudio es
fundamental porque adems de permitir la identificacin de las bacterias, permite
conocer la morfologa de las mismas, ya sea que ests sean cocos, tengan forma de
esfera, estn en pares (diplococos), formen cadenas (estreptococos), formen racimos
(estafilococos); bacilos, sean alargados, estreptobacilos, formen cadenas o
empalizados; espirilos (ondulados) o vibriones (presenten curvas) (Wikipedia, 2014). El
mtodo de tincin fue creado con el objetivo de separar la mayora de las especies
bacterianas en dos grandes grupos, a saber, las que captan el colorante bsico, cristal
violeta (Bacterias Gram positivas), y las que pierden el colorante por lavado con el
decolorante alcohol o acetona (Bacterias Gram negativas) (Scott, 2009), de forma
especfica permiten la clasificacin segn los componentes estructurales de su pared
como Gram positivas cuando se tien de un color morado o violceo, o Gram
negativas cuando se visualizan de color rosa o fucsia. Como se mencion esta tcnica
se aplica para la clasificacin de las bacterias, esta se ha usado y sigue usando en el
laboratorio clnico en la bsqueda de bacterias con capsula como Streptococcus
pneumoniae y Klebsiella sp (Bacilo Gram negativo, de la familia Enterobacteriaceae);
y para anlisis morfolgico de bacterias como la Escherichia colli (Bacilo corto Gram
negativo) (Rodriguez, 2005), Staphylococus aureus, caracterizados por ser cocos
Gram positivos, anaerobios facultativos y patgenos (Tortora, 2007) ; Bacillus Cereus,
bacteria anaerobia facultativa, bacilos voluminosos, esporulados y Gram positivos
(Anderson, 2000); y Proteus, caracterizado porque sus colonias crecen de forma
similar a un enjambre, adems presentan un aspecto caracterstico de una serie de
anillos concntricos (Tortora, 2007).
Algunas bacterias se clasifican como Gram variables, pues simultneamente
presentan tincin de Gram positivas y de Gram negativas, aun bajo condiciones
ptimas de cultivo. Sin embargo, en su estructura estas bacterias poseen una pared
de Gram positivas, aunque la capa de peptidoglican es ms delgada que la mayora de

las bacterias Gram positivas. Adems de clasificar la tincin, correlaciona con otras
propiedades como endotoxinas, susceptibilidad a antibiticos, sensibilidad o
resistencia a sales biliares, punto isoelctrico y tensin superficial. Aunque existen
variaciones en esta tcnica, en trminos generales la tincin de Gram involucra los
siguientes pasos:

Tincin inicial: Las clulas se tien con cristal violeta, el cual es un colorante
primario. En esta paso las clulas se tien de morado
Mordente: Se adiciona lugol (yoduro) el cual reacciona con el cristal violeta y
forma un complejo cristal, en este fase an siguen moradas
Decoloracin: Se adiciona solvente universal (agua), el cual lava el cristal
violeta en las bacterias Gram negativas, por lo que se tornan incoloras;
mientras que en las Gram positivas conserva la pigmentacin morada.
Contratincion: Se emplea una sustancia denominada safranina que tie a las
bacterias Gram negativas incoloras de un color fucsia, mientras que las
bacterias moradas por su parte no se ven afectadas, lo cual es evidente porque
conservan su color (Rodriguez, 2005)
Cabe aadir que pueden existir factores que alteran el resultado normal que se debe
obtener al tincionar, entre ellos, edad de las bacterias, errores del operador, uso de
antibiticos, por tanto se debe valorar el estado de los medios de cultivo y la buena
realizacin de la tcnica. De ser posible implementar controles con bacterias Gram
positivas (Staphylococus Aureus) y Gram negativas (E. Colli).
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos generales
Lograr el reconocimiento e identificacin de diferentes tipos de bacterias mediante el
uso de una tincin diferencial conocida como tincin de Gram, para posteriormente
clasificar estas bacterias como Gram positivas o Gram negativas y adems
incrementar el contraste de la clula bacteriana para ver estructuras como esporas y
capsulas.
2.2 Objetivos especficos

Aprender y aplicar todo el procedimiento relacionado con la tincin de Gram.

Realizar el procedimiento de toma de la muestra de las diferentes bacterias
para realizar el extendido en la placa y posteriormente realizar la coloracin.
Observar al microscopio los diferentes tipos de bacterias.
Clasificar las bacterias como Gram positivas o Gram negativas.
Realizar la coloracin para capsula y para esporas, haciendo uso de cultivos
de Klebsiella spp y Bacillus.
Observar al microscopio la motilidad de las bacterias, haciendo uso de un
cultivo joven de Proteus.

3. MATERIALES Y METODOS
Se siguieron los procedimientos que se encuentran en la gua de laboratorio No. 3
(identificacin de microorganismos por morfologa), y adems se dividieron los
procedimientos en los siguientes grupos para el reporte de resultados:

Coloracin diferencial donde se encuentra la coloracin que se hizo a la

placa donde se extendi las bacterias de la muestra de orejas, y otra placa
donde se extendi las bacterias Bacillus Cereus, Escherichia coli, Klebsiella
spp y Staphylococus aureus (B-EK-S).
Coloracin especfica donde se encuentra la coloracin que se hizo a la placa
donde se extendi la bacteria Bacillus Cereus (para la coloracin de esporas),
y otra placa donde se extendi la bacteria Klebsiella spp (para la coloracin de
capsula).
Observacin de la motilidad donde se encuentra la placa en la cual se
extendi el cultivo joven de Proteus, para la observacin de la movilidad.
4. RESULTADOS

4.1 COLORACION DIFERENCIAL

4.1.1 Placa de la muestra de orejas
Al momento de iniciar el laboratorio, se nos otorg una caja de Petri en la cual se
encontraron diferentes colonias de bacterias las cuales presentan una gran diferencia
en el color de la colonia (ver figura 1. Colonias de bacterias).

Figura 1. Colonias de bacterias

Se procedi a tomar una muestra de los tres tipos de colonias (amarillo, rojo, naranja)
para posteriormente extenderlas en la placa y analizarlas al microscopio con un
objetivo de 100X, de lo cual se obtuvieron los siguientes resultados:
- Colonia de bacterias de pigmentacin amarilla:
En la muestra observada al microscopio con un objetivo de 100X se apreci que las
bacterias se tieron de color violeta (ver figura 2. Bacterias de pigmentacin amarilla),
despus de emplear el cristal violeta como reactivo, permitiendo asi clasificar estas
bacterias, como bacterias Gram positivas, esto debido a que estructuralmente su

pared es gruesa, resistente y con ms cantidad de peptidoglicano, lo cual facilita la

retencin del cristal violeta, y por ende las bacterias se tornan de ese color
caracterstico (violeta). Las bacterias presentan forma de cocos (forma esfrica) y se
presentan agrupaciones de tetra y octracocos (grupos formados por cuatro y ocho
unidades) por lo que se les clasifica como estafilococos (masas irregulares similares o
anlogos a racimos de uva) segn la clasificacin por patrn de ordenamiento; esta
ltima caracterstica es propia de bacterias como Staphylococcus aureus,
Staphylococcus saccharolyticus y Staphylococcus epidermis (Montoya, 2008).

Figura 2. Bacterias de pigmentacin amarilla 100X

- Colonias de Bacterias de pigmentacin roja:
En la muestra observada al microscopio con un objetivo de 100X se apreci que las
bacterias se tieron de color fucsia o rosado (ver figura 3. Bacterias de pigmentacin
roja) lo cual permite clasificar estas bacterias, como bacterias Gram negativas; su
coloracin se debe a su pared celular, ya que esta es muy delgada y fina, lo que no le
permiti retener el colorante y decolorarse a causa del solvente orgnico con el cual
entra en contacto (en este caso alcohol-acetona); de forma especfica esta bacteria es
Gram negativa porque carece en su membrana de los componentes estructurales que
le permiten conservar el complejo del cristal. Respecto a su forma, se aprecian
bacterias en forma de cocos y bacilos, los cuales no forman un patrn de
ordenamiento definido o especifico, es decir, no forman cadenas ni agrupaciones
irregulares.

Figura 3. Bacterias de pigmentacin roja 100X

- Colonia de Bacterias de pigmentacin naranja:

En la muestra observada al microscopio con un objetivo de 100X se apreci que las
bacterias se tieron de color fucsia o rosado (ver figura 4.Bacterias de pigmentacin
naranja), lo cual permite clasificar estas bacterias, como bacterias Gram negativas.
Respecto a su forma, se observaron agrupaciones irregulares de bacilos (bastones)
de forma corta y cocos con un patrn de ordenamiento correspondiente a tetra cocos o
ttradas (grupos formados cada uno por cuatro unidades). La agrupacin de los
bacilos es diferente a la de los cocos, pues al contrario de estos, aquellos casi nunca
se agrupan. Algunas especies, sin embargo, muestran tendencia a un ordenamiento
de sus clulas, que no obedece a un patrn gentico, sino que depende de las etapas
de desarrollo o condiciones de cultivo (Montoya, 2008).

Figura 4. Bacterias de pigmentacin naranja 100X

4.1.2 Placa de bacterias (B-EK-S)
En el laboratorio se nos otorg cuatro 4 cajas de Petri en donde se encontraban los
siguientes cultivos: Bacillus Cereus, Escherichia coli, Klebsiella spp y Staphylococus
aureus, de los cuales una vez extendidos en la placa, y realizado el proceso de tincin
de Gram para su posterior observacin al microscopio con un objetivo de 100X, se
obtuvieron los siguientes resultados:
- Staphylococus aureus:
En la muestra observada al microscopio con un objetivo de 100X se apreci que las
bacterias se tieron de color violeta (ver figura 5.Staphylococus aureus), lo cual
permite clasificar estas bacterias, como bacterias Gram positivas; respecto a su forma,
se observaron cocos inmviles, agrupados de forma semejante a racimos de uvas. De
una forma ms general, se tiene entonces que el estafilococo ureo o dorado es una
bacteria anaerobia facultativa Gram positiva productora de coagulasa y catalasa que
se encuentra ampliamente distribuida por todo el mundo (ecured, 2014).

Figura 5.Staphylococus aureus 100x

- Klebsiella spp:
En la muestra observada al microscopio con un objetivo de 100X se apreci que las
bacterias se tieron de color fucsia o rosado (ver figura 6.Klebsiella spp), lo cual
permite clasificar estas bacterias, como bacterias Gram negativas; respecto a su
forma, se observaron bacilos inmviles, capsulados, no esporulados (scribd, 2014). De
una forma ms general, se tiene entonces que la Klebsiella spp es una bacteria Gramnegativa, no mvil, generalmente encapsulados en forma de barra, que pertenecen a
la familia Enterobacteriaceae (phac, 2014).

Figura 6. Klebsiella spp 100X

-Escherichia coli:
En la muestra observada al microscopio con un objetivo de 100X se apreci que las
bacterias se tieron de color fucsia o rosado (ver figura 7.Escherichia coli), lo cual
permite clasificar estas bacterias, como bacterias Gram negativas; respecto a su
forma, se observaron bacilos inmviles. De una forma ms general, se tiene entonces
que la escherichia coli es una bacteria Gram negativa anaerbica facultativa no
esporulada (slideshare, 2014).

Figura 7. Escherichia coli 100X

- Bacillus Cereus:
En la muestra observada al microscopio con un objetivo de 100X se apreci que las
bacterias se tieron de color violeta (ver figura 8.Bacillus cereus), lo cual permite
clasificar estas bacterias, como bacterias Gram positivas; respecto a su forma, se
observaron bacterias con forma de bastn alargado. De una forma ms general, se
tiene entonces que la bacillus cereus es una bacteria Gram positiva aerbica
facultativa formadora de esporas, las cuales no son liberadas del esporangio (food,
2014); el bacillus cereus es un bacilo formador de esporas responsable de
intoxicaciones alimentarias, siendo su hbitat natural el suelo, contamina con
frecuencia cereales, leche, budines, cremas pasteurizadas y especias, entre otros
alimentos (bvsops, 2014).

Figura 8. Bacillus cereus 100X

4.2 COLORACION ESPECFICA
Mientras las tinciones diferenciales permiten distinguir entre distintos tipos de
microorganismos, las tinciones especficas incrementan el contraste en las clulas
microbianas y revelan estructuras particulares, entre las que se incluyen las
endosporas, flagelos y las cpsulas (aula virtual, 2014); teniendo en cuenta lo anterior,

en el laboratorio se nos otorg dos cajas de Petri que contiene un cultivo puro de
Klebsiella spp y Bacillus cereus, a los cuales se le hizo coloracin de capsula y de
esporas respectivamente, a continuacin se presentan los resultados.
4.2.1 Coloracin de capsula
Una vez tomada la muestra de Klebsiella spp con el asa de argolla, extendida sobre la
placa, y hecha la coloracin, se procedi a analizar la placa en el microscopio con un
objetivo de 100X, de lo cual se obtuvo el siguiente resultado (ver figura 9. Coloracin
de capsula):

Figura 9. Coloracin de capsula 100X

Se observa entonces que el bacilo se tie de violeta, y la capsula es incolora. De una
forma ms general se tiene entonces que la capsula es una capa de material viscoso o
mucoide, cuyo tamao se ve influenciado por el medio en el que crece la bacteria; esta
capsula es muy importante para la bacteria ya que le proporciona una cubierta
protectora, la cual tiene una propiedad antifagocitaria y brinda adems una proteccin
frente a fagos. Otra caracterstica importante de la capsula, es que esta aumenta la
capacidad infectiva de las bacterias productoras de enfermedades, tenindose asi, que
si la bacteria pierde totalmente su capsula, puede perder su virulencia
(microbiologiaaulat, 2013).
4.2.2 Coloracin de espora
Una vez tomada la muestra de Bacillus cereus con el asa de argolla, extendida sobre
la placa, y hecha la coloracin, se procedi a analizar la placa en el microscopio con
un objetivo de 100X, de lo cual se obtuvo el siguiente resultado (ver figura 10.
Coloracin de espora):

Figura 10. Coloracin de espora 100X

Se observa entonces que las esporas toman un color verde manzana, y la parte
vegetativa toma un color naranja. De una forma ms general algunas bacterias pueden
transformarse en pequeos ovoides o esferas, que son formas celulares muy
resistentes, denominadas esporas, o endosporas, porque se producen
intracelularmente. Todos los organismos de los gneros Bacillus y Clostridium se
caracterizan, en parte, por su propiedad de producir esporas. Las bacterias capaces
de esporular pueden crecer y reproducirse en forma de clulas vegetativas durante
muchas generaciones; sin embargo, en cierto perodo del desarrollo del cultivo en
medio nutritivo apropiado, se produce, dentro del citoplasma, la sntesis de nuevo
protoplasma destinado a transformarse en espora (microinmuno, 2014).
4.3 OBSERVACION DE LA MOTILIDAD

6. CUESTIONARIO
1. Qu tipo de clulas son las que se utilizaron en este laboratorio?
En el laboratorio se utilizaron clulas procariotas (unicelulares), ya que los
microorganismo que se analizaron fueron las bacterias, las cuales pertenecen al reino
protista y que se caracterizan por ser organismo procariotas o procariontes (una nica
clula).
2. Cul es la estructura celular que permite la diferenciacin de las bacterias
Gram positivas o negativas?
La estructura que permite la diferenciacin entre estos dos tipos de bacteria es la
pared celular. La pared celular de las bacterias Gram positivas est compuesta por
varias capas de peptidoglicano (grandes polmeros, es decir, molculas grandes
formadas por unidades que se repiten un sin nmero de veces y que se componen de
dos aminoazucares la N-acetil glucosamina y N- acetil muramico que se unen por
enlaces glucosidicos) (Montoya, 2008) que conforman una estructura gruesa y rgida,
en cambio la pared celular de las clulas Gram negativas est compuesta por una o
por muy pocas capas de peptidoglucano y una membrana externa. La pared celular de
las Gram positivas tiene una gran capa de peptidoglucano o mureina que poseen un
grosor de 10 a 20 nm, solo estas bacterias tienen cidos teicoicos los cuales son los
responsables de la carga externa de las bacterias Gram positivos, por otro lado en las
Gram negativas la pared se ubica desde el exterior al interior, de tal forma que el
peptidoglicano se encuentra inmerso en el espacio periplasmico, en cuanto a la
composicin de la pared es bastante similar a las Gram positivas, sin embargo su
espesor es menor y predomina protenas, fosfolpidos y lipopolisacridos (Montoya,
2008).

Figura. Estructura bacterias Gram positivas y negativas (Vera, 2004)

Por qu el alcohol acetona decolora las bacterias Gram negativas y no las Gram
positivas?
Las bacterias resistentes a la decoloracin con alcohol acetona, retienen el color
porque la carbol-fucsina es ms soluble en lpidos de la pared celular, a diferencia de
las bacterias Gram positivas, las Gram negativas carecen de componentes lipdicos y
el colorante se elimina con facilidad. Al tratar las bacterias ya teidas con alcohol, las
Gram positivas no se decoloran ya que su pared es gruesa y contiene pocos lpidos lo
que dificulta la penetracin del alcohol que pudiera extraer o arrastrar el colorante, por
el contrario las Gram negativas tienen una pared de peptidoglucano ms delgada, la
cual se recubre por una envoltura fundamentalmente lipdica, razn por la cual, el
alcohol o acetona, al disolver fcilmente la envoltura lipdica, incrementa la porosidad
de la pared y por ende arrastra el colorante del interior de la clula teida causando
que la bacteria se decolore. cabe aadir que las que se decoloran posteriormente
pueden teirse con safranina la cual las torna de un color fucsia (Macarulla, 1994)
3. Cul es la composicin de la cpsula
En general la cpsula se compone de macromolculas asimtricas, que consta de una
serie de unidades repetitivas: polisacridos o pelipptidos.
La capsula o capa mucosa es un elemento inconstante, no esencial para la fisiologa
bacteriana presente en algunas bacterias tanto grampositivas como gramnegativos.
Est constituida por polmeros orgnicos sintetizados por la propia bacteria, que se
segregan y depositan por fuera de la pared bacteriana. En cuanto a su composicin
qumica es compleja y difiere segn la especie, los principales componentes son
polisacridos, pero en ocasiones estn formados por pelipptidos (Slo encontradas
en el gnero Bacillus, estn formados por glutamil-polipptidos).
Capsulas glucosidicas
Habitualmente se tratan de polisacridos complejos que se forman por una mezcla de
monosacridos y cidos uronicos. Entre las ms representativas del grupo estn S.

pneunomiae, K. pneumoniae y Haemophilus influenzae.

Capsulas peptdicas
Propias del genero Bacillus formadas por pelipptidos de un solo aminocido, el Dglutamico (Elsevier, 1987).
4. Correlacione la presencia de cpsula y virulencia.
Algunas bacterias utilizan material de la glucolisis para formar cpsula alrededor de la
pared celular; esta propiedad aumenta la virulencia de la especie porque protege a la
bacteria de la fagocitosis y de los anticuerpos. La capsula protege la mayora de las
bacterias de la fagocitosis, favoreciendo su multiplicacin y facilitando la invasin del
organismo infectado. La virulencia desaparece en el momento en que se pierde la
capsula (Elsevier, 1987).
5.

MICROORGANISMO
Proteus
Clostridium
Rhizobium
Salmonella,
Shigella
Lactobacillus
Klebsiella
Bacillus
Acinetobacter
Aeromonas
Pseudomonas
Staphylococcus
Streptococcus
Escherichia coli
Candida albicans
Nitrobacter
Nitrosomas

GRAM(-)
X

GRAM (+)
X

X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X

6. BIBLIOGRAFIA
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