Practica

-Procedimiento de Tincin Gram

-Resultados
*Tincin de Gram
*Propiedades organolpticas
-*Fotos de cultivos (Levaduras y Bacterias)
-*Dibujo del conteo de bacterias y leucocitos
.-*Conclusiones de esta parte

Introduccin
Es de gran importancia la tincin de Gram porque permite diferenciar dos grandes grupos de
bacterias (Gram+ y Gram-), segn se comporten ante esta tincin. El principal impedimento en la
observacin de bacterias en microscopio ptico es la falta de contraste entre la clula en
observacin y el medio que la rodea, la manera ms simple de facilitar el contraste es la utilizacin
de colorantes, revelando la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos,
esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Para bacterias, el proceso
de fijacin por calor es lo ms habitual, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como
formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de esto se aade el colorante. La fijacin produce
habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas
parezcan mayores de lo que son realmente. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos
que tienen alguna afinidad por los materiales celulares.
Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra
sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un
mordiente habitual es el cido tnico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo
altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante.
Una tcnica de coloracin y la ms conocida es la tincin de Gram, denominada as por el
bacterilogo dans Christian Gram, quien desarrollo esta tcnica en 1844. Sobre la base de la
tincin de gran, las bacterias se clasifican en dos grupos: gran positivos y gran negativos.
En cuanto a la tincin de gran la secuencia es la siguiente: el frotis bacteriano se fija con calor se
tie con cristal violeta por min, se lava con agua, se la aplica un mordiente por 1 min y se lava
nuevamente con agua, despus se decolora con una mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y cubrir
con safranina (color de contraste) durante 1 min lavar y secar.
Las bacterias Gram positiva y Gram negativas tien de forma distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para
definir su tamao y su forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. La pared de la
clulas Gram positivas es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano
(cadenas lineales de un polisacrido formado por residuos alternativos de N-acetilglucosamina y Nacetilmurmico unidos mediante un enlace) y un poco de cido teicoico (forman parte de la gruesa
capa de peptidoglicano que rodea a la membrana plasmtica y estn directamente unidos a l
mediante un enlace fosfodister. De este modo pueden conectar varias capas de peptidoglicano) ,
mientras que las bacterias gram negativas se componen de una capa delgada de peptidoglicano y
est rodeada por una capa exterior de lipopolisacridos (forma parte de la pared de la pared celular
de las bacterias Gram-negativas. Tienen carcter anfiptico, presentan carga negativa, y repelen
molculas hidrofbicas. Son txicos para el hombre, y tambin se llaman endotoxinas) por lo cual
estas dos tipos de bacterias se tien de diferente color y es posible identificarlas como Gram
positiva o Gram negativa.

Objetivos
Utilizacin de tcnicas sencillas para la observacin de microorganismos
Conocer o manejo del microscopio ptico para la observacin de bacterias (importancia del
objetivo de inmersin)
Conocer y manejar las unidades de medida de las clulas y establecer comparaciones entre
tamaos de procariotas y de eucariotas
Reconocer los distintos modelos de pared bacteriana.
Equipo: Microscopio ptico
Materiales:
Mechero de Bunsen
Asa bacteriolgica
Portaobjetos
Varillas de vidrio (soporte)
Pizeta
Gasas
Reactivos:
Cristal violeta
Solucin de lugol
Alcohol acetona
Safranina
Aceite de inmersin

Procedimiento
I. Limpiar el portaobjetos con gasas y encender el mechero
II. Colocar una gota de solucin salina sobre el portaobjetos y luego esterilizar el asa
bacteriolgica.
III. Tomar una pequea muestra de la cepa y diluirla en el portaobjetos. Posteriormente
esterilizar el asa.
IV. Fijar la muestra al calor flamendola en el mechero, cuidando no quemar la muestra.
Colocar el portaobjetos sobre un soporte.
V. Cubrir la muestra con cristal violeta. Esperar que transcurra 1 minuto. Escurrir y enjuagar.
VI. Cubrir la muestra con solucin de lugol y esperar que transcurra 1 minuto. Escurrir y
enjuagar.
VII.
Cubrir la muestra con alcohol cetona. Esperar que transcurran 5 segundos. Escurrir
y enjuagar.
VIII.
Cubrir la muestra con safranina, y esperar que transcurra 1 minuto. Escurrir y
enjuagar.
IX. Dejar secar la muestra. Agregar una gota de aceite de inmersin y observar en el
microscopio a 100x.
Limpiar el portaobjetos con gasas y encender el mechero.