UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA

MEDIOS DE CULTIVO: CLASIFICACION Y PREPARACION

NUMERO DE LABORATORIO:

Practica N 2

ALUMNO:

Cabrera Espinoza, John

CURSO:

Microbiologa

PROFESORA:
ordinal

Ing. Nancy Martnez

FECHA DE EJECUCION:
agosto 2016

22 de

FECHA DE ENTREGA:
septiembre 2016

8 de

INTRODUCCION
Nos maravilla el conocimiento que hoy tenemos sobre la gran diversidad
microbiana. Sin embargo, poco se habla de ello, a pesar de su enorme
importancia. Abordar el tema de la microbiologa ambiental resulta largo
y complejo, pero seleccionando algunos ejemplos es posible dar una idea
clara de la importancia de conocer la interaccin entre los parmetros
ambientales y los microorganismos. CITADO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA, 10
ABRIL, 2016

Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros

microorganismos, razn por la cual es difcil aislarlas. Pero debemos
estar preparados para aislar, cultivar e identificar a la misma. Uno de los
sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales
preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los
microorganismos es el medio de cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el cultivo. CITADO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA, 10
ABRIL, 2016

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de

crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias
para el desarrollo de los microorganismos. Es decir, es un soporte que
proporciona sustancias nutritivas que permitan el desarrollo y
reproduccin de microorganismos. La diversidad metablica de los
microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo
tambin lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado
para todos ellos. CITADO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA, 10 ABRIL, 2016
Las condiciones que rene un medio de cultivo artificial para que los
microorganismos crezcan son: temperatura, grado de humedad y presin
de oxigeno adecuado, as como un grado correcto de acidez o
alcalinidad. CITADO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA, 10 ABRIL, 2016
El conocimiento de las necesidades nutritivas y fsicas de los
microorganismos es fundamental para la seleccionar un medio de cultivo
adecuado. Los requisitos que debe reunir el cultivo de unos
microorganismos tienden a reproducir el ambiente natural en el que se
desarrollan. CITADO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA, 10 ABRIL, 2016

La utilizacin de los medios de cultivo son necesarios para:

Separacin y aislamiento de las distintas especies microbiales

presentes en una muestra.
Estudios de identificacin de un microorganismo problema.

Estudios macroscpicos. Visualizar las caractersticas de las colonias

en medios slidos.
Para la conservacin de especies microbiales o muestras, etc.

REVISION BIBLIOGRAFICA

CALDO BRILA

Leer las indicaciones del recipiente de caldo Brila, este nos permite
manejar las cantidades apropiadas, para el Caldo Brila utilizar 40 g.
con 100 ml de agua; nosotros deseamos utilizar 400 ml de agua,
Que hacemos ? Mediante una regla de tres simple calculamos la
cantidad de Caldo Brila a utilizar; de la siguiente manera:
40 g ----- 100 ml
X g ----- 400 ml
>>> = 16 g (Caldo Brila)
Una vez calculada la cantidad requerida de Caldo Brila procedemos a
pesarla. Estos 16 g de Caldo Brila los vertimos en una fiola. Haciendo
uso de una pipeta adicionamos agua destilada a la misma. Con leves
movimientos circulatorios diluimos la solucin. Luego haciendo uso de
una cocina elctrica se calienta la solucin hasta que sta adquiera el
color verde (color caracterstico del Caldo Brila). Se deja enfriar por
unos minutos; luego se hace uso de una pipeta para verter la solucin
a los tubos de ensayo, aproximadamente hasta la parte superior de
un tubo o campana Durham que se encuentran dentro de estos.
Estos microtubos deben de ser llenados, para esto se inclina
levemente los tubos de ensayos. Hay que recordar que mientras
realizamos todo este trabajo, hacemos uso del calor de un mechero
para mantener estril nuestros instrumentos de trabajo.
Por ltimo se tapan los tubos de ensayo con porciones de algodn
para mantener estril nuestro preparado de Caldo Brila. Colocamos
los tubos de ensayo en un depsito forrado con papel blanco, el
depsito contiene algodn en el interior para no causar daos. Se
rotula y se coloca en la autoclave (121 x - 1 atm). Deben seguirse las
instrucciones en cuanto a tiempo y temperatura para asegurarse la
obtencin de medios de cultivo tiles. Debe tenerse en mente que la
presin vara de acuerdo con la altura y por tanto no es un factor

constante. De tal manera que son el tiempo y la temperatura los

parmetros que deben tomarse en consideracin en el proceso de
autoclavado.

TSI

Ahora cogemos el TSI, el cual est contenido en un matraz y se

encuentra solidificado. Para que esta sustancia se encuentre como
est ha tenido que seguir los pasos de la elaboracin del Caldo Brila.
Para fundirlo utilizaremos una cocina elctrica. Con la ayuda de una
pinza se coge el matraz con TSI, se coloca y se retira de la cocina sin
dejar de agitarlo levemente, con la finalidad de que el material no se
sobrecaliente y cause prejuicios. Al cabo de unos minutos se tendr el
TSI lquido.
Se deja enfriar el matraz por unos minutos, mientras eso se prepara
los tubos de ensayo en los cuales se depositar el TSI, tambin el
mechero con alcohol. Una vez que el matraz se encuentra
relativamente fro se procede a depositar el TSI en los tubos de
ensayo, pero para mantener nuestros materiales esterilizados y
mientras se realiza el intercambio de depsito del TSI se hace uso del
calor del mechero (calor seco-fuego directo). Luego raudamente se
tapan los tubos de ensayo con algodn de igual forma con el matraz,
y se titulan los tubos de ensayo.
Luego de verter el TSI en los tubos de ensayo se colocan con una leve
inclinacin. Una vez que estos se solidifican se colocan en la gradilla.
Los pasos realizados con el TSI tambin son aplicados al LIA
y al Citrato
Tambin tenemos las siguientes sustancias solidificadas en los
matraces con procedimientos de preparacin muy parecidos a los del
caldo brila: Mc. Conkey y extracto de levadura, pero con la nica
diferencia de que estos sern depositados en placas Petri. El
procedimiento es el mismo, se funde las sustancias Mc. Conkey y el
extracto de levadura, se deja enfriar, luego se vierte en las placas
Petri (1/3), se esparce de forma uniforme en toda la placa petri, se
tapa y se rotula. Para la esterilizacin de los materiales al verter se
utiliza el calor del mechero (calor seco- fuego directo).

RESULTADOS:
Los procedimientos anteriores nos permiten elaborar medios de
cultivo, conociendo su tremenda diversidad, para bacterias que sern
analizadas y estudiadas en nuestro proceso de aprendizaje. Las
diversas sustancias que se utilizan para la elaboracin de un medio
de cultivo nos permiten predecir el inmenso nmero de
microorganismo que podemos encontrar.

Hemos elaborado dos medios de cultivo segn su presentacin:

Medios slidos en placas Petri: estos ocupan una superficie lo

suficientemente grande como para poder visualizar perfectamente
las colonias microbianas. El sistema en placa es uno de los medios
que permite mejor el aislamiento de microorganismos que puedan
crecer en l. Estos medios de cultivo fueron: Mc. Conkey (color
rojizo) y Extracto de Levadura (color marrn).
Medios slidos en tubos: que corresponden a tubos con agar
inclinado y solidificado con el fin de aumentar la superficie donde
se va a producir el crecimiento microbiano una vez sembrado.
Estos fueron los siguientes: TSI (color anaranjado), LIA (color
purpura claro), Citrato (color verde) y Brila (verde brillante) CITADO:
CARLOS ALBERTO CASIANO INGA, 10 ABRIL, 2016

FUENTE: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA, 10 ABRIL, 2016

DISCUSIONES

Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los

nutrientes indispensables en la concentracin adecuada, cantidad necesaria
de sales y agua, que tenga la consistencia y el pH adecuados, que sea
estril y que no contenga sustancias inhibidoras. CITADO: CARLOS ALBERTO
CASIANO INGA, 10 ABRIL, 2016

Por ejemplo el TSI (Triple Sugar Iron) contiene tres azcares (lactosa,
sacarosa y glucosa), citrato frrico y tiosulfato de sodio, elevada
concentracin de aminocidos y rojo fenol como indicador. Este medio de
cultivo en clases futuras nos permitir determinar variedad de bacterias, su
composicin, etc. Y continuando con este ejemplo podemos citar que las
bacterias cultivadas se inoculan en picadura (microaerobiosis) y extensin
superficial. Las fermentadoras generan color amarillo por acidificacin y las
oxidativas rosa sobre la superficie (basificacin). Las bacterias sulfitoreductoras dan sulfuro de hierro que resulta en precipitados negros en la
zona anaerbica. CITADO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA, 10 ABRIL, 2016
Es importante porque nos permite seleccionar el medio de cultivo ms
adecuado del mismo. As un medio de cultivo rene los requisitos de los
microorganismos y reproduce el ambiente natural en el que se desarrollan.
CITADO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA, 10 ABRIL, 2016

En TSI se determina la capacidad de un microorganismo para atacar los

hidratos de carbono glucosa, lactosa y/o sacarosa, con produccin o no de
gases (CO2 y H2), junto con la produccin o no de cido sulfhdrico (H2S).
CITADO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA, 10 ABRIL, 2016

MATERIALES Y METODOS

Triptona 1 g

Glucosa 0.2 g

(Es un digerido pancretico de casena, se utiliza como fuente de nitrgeno en

los medios de cultivos. Es capaz de soportar
el crecimiento exigente y no exigente de
microorganismos )
(La glucosa es el combustible del que dependen muchas partes de nuestro

organismo)

Extracto de levadura 0.5 g

(Es rico en vitaminas especialmente del complejo B,

aminocidos y otros factores de crecimiento)

Agar 3 g (Se utiliza como agente gelificante para darle solidez a los medios de cultivo)
Agua destilada 200 ml (Es aquella que como todo tipo de agua su composicin se basa en
la unidad de H2O, solo que se eliminado las impurezas e iones mediante la destilacin)

Papel aluminio (Protege los alimentos alimentos)

Placas Petri ( Se emplean como recipientes de

medio de cultivo para el crecimiento de

microorganismos)

Matraz

(Sirve para la preparacin de medios de cultivo)

Probeta (Recipientes graduados de forma cilndrica y capacidad variable: 10, 25, 50, 100. 250. 500
ml, 1L etc.)

Vaso de precipitado

Aguja y asa de kolle (Varillas metlicas que llevan en un extremo un alambre de nicrom)
Mechero ( Sirve como fuente de calor, para esterilizar materiales)
Balanza (Balanza de precisin para el peso de pequeas cantidades)
Autoclave (Se emplea para esterilizar mediante calor hmedo medios de cultivo)

(Recipientes graduadas para la medicin de pH o de algunos en la

preparacin de medios de cultivo)

Bao mara

(Se utiliza en la preparacin de medios y para la incubacin de cultivos de

microorganismos)

CUESTIONARIO
MEDIOS DE CULTIVO:
1. Agar Manitol Salt
Ingredientes
Proteosa peptona

10.0 g

Extracto de carne

1,0 g

D-Manitol

10,0 g

Cloruro de sodio

75,0 g

Agar

15,0 g

Rojo fenol
Agua destilada

25,0 mg
c.s.p

1000 mL
Ph final 7,4 0,2

Preparacin
Suspender 111 g de medio deshidratado en un litro de agua destila- da.
Mezclar vigorosamente. Calentar agitando frecuentemente y de- jar
hervir durante 1 minuto para disolver completamente los ingre- dientes.
Esterilizar a 121C durante 15 minutos. Dejar enfriar hasta una
temperatura entre 40-45C y verte en placas estriles. Dejar solidificar a
temperatura ambiente antes de su utilizacin.
Colonias
La alta concentracin de cloruro de sodio resulta en una inhibicin total o
parcial de microorganismos no pertenecientes al gnero Staphylococcus.
La fermentacin del manitol es evidenciada por un cambio del indicador
rojo fenol, lo que permite la diferenciacin de las especies de este
gnero.

FUENTE: wikipedia

2. Agar Baird Parker

Digerido pancretico de casena

10,0 g

Extracto de carne

5,0 g

Extracto de levadura

1,0 g

Cloruro de litio

5,0 g

Agar

20,0 g

Glicina

12,0 g

Piruvato de sodio

10,0 g

Agua destilada

950 mL
Ph final 6,8 0,2

Preparacin
Suspender los ingredientes en el agua destilada. Calentar agitando
frecuentemente y dejar hervir durante 1 minuto para disolver
completamente. Esterilizar en autoclave a 121C (15 lb de presin)
durante 15 minutos. Enfriar entre 45C y 50C y agregar 10 mL de
solucin de telurito de potasio al 1% esterilizado por filtracin y 50 mL de

una emulsin de yema de huevo. Mezclar completa y suavemente,

colocar 20 mL de medio por cada placa y dejar solidificar.
Para preparar la emulsin de yema de huevo se debe desinfectar la
superficie de la cscara, romper la misma aspticamente y separar las
yemas intactas en un cilindro graduado estril y diluir al 50% en solucin
salina estril. Las placas preparadas deben ser utilizadas dentro de las
siguientes 24h.
Colonias

FUENTE: http://www.arkzoft.net

3. AGAR SALMONELLA SHIGELLA

Extracto de carne

5,0 g

Mezcla de peptonas

5,0 g

Lactosa

10,0 g

Mezcla de sales biliares

8,5 g

Verde Brillante

0,33 g

Citrato de sodio

8,5 g

Tiosulfato de sodio

8,5 g

Citrato frrico

1,0 g

Rojo Neutro

0,025 g

Agar bacteriolgico

13, 5 g

Preparacin
Suspender 60 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con
agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto.
Enfriar a una temperatura entre 45-50 C y vaciar en placas Petri
estriles. No esterilizar en autoclave.
1. Recolectar las muestras en contenedores estriles o con hisopos
estriles transportados en un medio de transporte.
2. Sembrar las muestras por el mtodo de la estra para obtener colonias
aisladas.
3. Incubar las placas a 35-37 C durante 24 a 48 horas y examinar el
crecimiento. Algunas cepas de Siguella spp. Son inhibidas en este medio
por lo que es recomendable utilizar medios adicionales.
Las enterobacterias pueden ser diferenciadas en base a su capacidad de
fermentar la lactosa. Las especies de Salmonella y Shigella son no
fermentadoras de la lactosa y forman colonias incoloras en el Agar SS.
Las especies de Salmonella que son productoras de sulfuro de hidrgeno
desarrollan colonias con centro obscuro. Los coloformes son parcialmente
inhibidos. E. Coli produce colonias de color rosa a rojo y pueden
presentar una zona de precipitado. Las colonias de Enterobacter
aerogenes son cremosas de color rosa. Citrobacter y Proteus spp. Pueden
crecer produciendo colonias con centros de color gris o negro debido a la
produccin de H2 S. Enterobacter faecalis es parcialmente inhibido
presentando colonias incoloras.

2.AGAR HIERRO TRES AZUCARES

Extracto de carne

3,0 g

Extracto de levadura

3,0 g

Peptona

15,0 g

Proteosa-peptona

5,0 g

Lactosa

10,0 g

Sacarosa

10,0 g

Glucosa

1,0 g

Sulfato ferroso

0,2 g

Cloruro de sodio

5,0 g

Tiosulfato de sodio
Rojo fenol
Agar
Agua destilada

5,0 g
0,024 g
12,0 g
1000,0 mL

Preparacin
Disuelva, caliente hasta ebullicin, reparta en tubos y esterilice en
autoclave por 15 minutos a 121C (15 libras de presin). En este medio
la concentracin de glucosa es la dcima parte de la concentracin de la
lactosa y la sacarosa, lo cual permite determinar cundo ste es el nico
glcido fermentado. La pequea cantidad de cido producido por la

fermentacin de la glucosa es rpidamente oxidado en el bisel donde

hay abundancia de oxgeno, quedando el color rojo correspondiente a un
medio alcalino; por el contrario, en el taco donde la tensin de oxgeno
es baja, la reaccin cida se mantiene. Para que las reacciones antes
indicadas ocurran, el medio tiene que estar en un tubo que permita un
fcil acceso del aire, por lo que debe estar pro- visto de un tapn de
algodn flojo.
PROCEDIMIENTO
Realice una puncin en el taco y una estra en el bisel. Incube a 35C.
Observar a las 18-24 horas, ni menos ni ms.
RESULTADOS
Taco cido (amarillo): Glucosa fermentada.
Bisel cido (amarillo): Lactosa y/o sacarosa fermentada.
Taco cido (amarillo): Glucosa fermentada.
Bisel alcalino (rojo): Lactosa y/o sacarosa no fermentada.
Taco alcalino (rojo) y bisel alcalino (rojo): Ninguno de los tres glcidos es
fermentado.
La aparicin de burbujas en el taco indica que la fermentacin se ha
efectuado con produccin de gas.
Un ennegrecimiento en el medio indica la produccin de cido
sulfhdrico.

FUENTE: ANA LAURA OCHOA ZEPEDA

3. AGAR LISINA HIERRO

Peptona de gelatina

5,0 g

Extracto de levadura

3,0 g

Dextrosa
Purpura de bromocresol
L-Lisina

1,0 g
0,02 g
10,0 g

Tiosulfato de sodio

0,04 g

Citrato de hierro y amonio

0,5 g

Agar bacteriolgico

1305 ml

Preparacin
Suspender 23 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con
agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto.
Dispensar en tubos de vidrio, tapar y esterilizar en autoclave a 121C (15
libras de presin) durante 15 minutos. Dejar enfriar en posicin
horizontal.

4. CALDO SELENITO
Peptona

5,0 g

Lactosa

4,0 g

Selenito de sodio

4,0 g

Fosfato de sodio

4,0 g

Ph final 7,0 0,2

Preparacin
Suspender 23 g del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar bien y
calentar ligeramente hasta su disolucin completa. Evite el
calentamiento excesivo. No esterilizar en autoclave. Distribuir en tubos
estriles un volumen no menor a 5 ml. Se recomienda guardar en
heladera si no se usa de inmediato.

5. AGAR BISMUTO SULFITO

Ingredientes: extracto de carne de res, mezcla de peptonas, glucosa,
fosfato disdico, sulfato ferroso, sulfato de bismuto, verde brillante,
agar, agua destilada.
Forma de preparacin: Suspender los ingredientes en un litro de
agua.
Calentar
hasta
su
disolucin
completa,
agitando
frecuentemente. Ajustar el pH. Enfriar a 45C y verter en cajas de

petri estriles, distribuyendo de manera homognea el precipitado

propio del medio. El aspecto de las placas es opaco, de color verde
plido y deben usarse el mismo da de su preparacin. Si la coloracin
es parda, no deben utilizarse. El medio no debe esterilizarse en
autoclave; el sobrecalentamiento afecta su selectividad.
Microorganismos que crecen en el medio: Salmonella typhi y otros
bacilos esfricos.
Agente inhibidor: Sulfito de bismuto y verde brillante, inhibidor de
contaminantes.

6. CALDO TETRATIONATO
Ingredientes: peptona, sales biliares, carbonato de calcio, tiosulfato
de sodio, iodo, ioduro de potasio, agua.
Forma de preparacin: Suspender 46 g del polvo en 1 litro de agua
destilada. Mezclar vigorosamente y llevar a ebullicin. Enfriar a 45C
o menos. Agregar 20 ml de solucin iodurada. Mezclar y distribuir 10
ml por tubo, en tubos estriles. No debe calentarse luego de agregar
la solucin iodada. El medio base puede mantenerse a 4C , dura
varios meses, pero una vez agregada la solucin iodada debe usarse
en el mismo da.
Microorganismos que crecen en el medio: Salmonella spp, es un
medio ideado para aislarla.
Agente inhibidor: Tiosulfato de sodio, tetrationato y sales biliares
los cuales inhiben el desarrollo de flora acompaante.

7. CALDO LACTOSA, VERDE BRILLANTE BILIS (CALDO BRILA)

Ingredientes: bilis de buey deshidratada, lactosa, peptosa, verde
brillante.
Forma de preparacin: Suspender 40 g del polvo deshidratado por
litro de agua destilada. Disolver y distribuir 10 ml por tubo con
campanita de Durham. Preparar adems, el medio a doble
concentracin. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.
Microorganismos que crecen en el medio: colifornios (totales y
fecales)
Agente inhibidor: bilis y verde brillante quienes inhiben las Gram
positivas y Gram negativas a excepcin de coliformes.

8.CALDO ESCHERICHIA COLI

Ingredientes: triptosa, lactosa, sales biliares, fosfato dipotsico,
fosfato monopotsico, cloruro sdico, agua destilada.
Forma de preparacin: Suspender 37 gr. En agua destilada, agitar
y calentar ligeramente en bao de agua mara hasta disolverlo
completamente, distribuir la cantidad requerida en tubos de ensayo y
colocar un tubo Durham dentro de cada tubo, tapar los tubos con
algodn o plstico, autoclavar durante 15 minutos a 15 libras de
presin, esperar que la temperatura baje a 75C antes de abrir el
autoclave para evitar la formacin de burbujas.
Microorganismos que crecen en el medio:

9. AGAR TIOSULFATO CITRATO BILIS SACAROS

Ingredientes: Peptona de casena 5,0; peptona de carne 5,0;
extracto de levadura 5,0; citrato sdico 10,0; tiosulfato sdico 10,0;
bilis de buey, desecada 5,0; solato sdico 3,0; sacarosa 20,0; cloruro
sdico 10,0; citrato de hierro (III) 1,0; azul de timol 0,04; azul de
bromotimol 0,04; Agar-agar 14,0.
Forma de preparacin: Disolver 88 g/L y verter en placas.
No esterilizar en autoclave!
pH: 8,6 +/- 0,2
Las placas con medio de cultivo son claras y de color azul-verdoso.
Microorganismos que crecen en el medio: Vibrio chorelae y
vibrios enteropatgenos.
Agente inhibidor: los citratos contribuyen a llevar el pH a 8.3 e
impedir el desarrollo de otras bacterias.

10. CALDO LAUREL SULFATO TRIPTOSA

Ingredientes: Triptosa, lactosa, cloruro de sodio, lauril solfato de
sodio, fosfato dipotsico, fosfato monopotsico.
Forma de preparacin: Suspender 35,6 g del polvo en 1 litro de
agua destilada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar a ebullicin hasta
la disolucin total. Distribuir en tubos conteniendo tubos de
fermentacin. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C.
Microorganismos que crecen en el medio: coliformes presentes
en aguas residuales y alimentos.
Agente inhibidor: Lauril solfato de sodio a la flora acompaante.

BIBLIOGRAFIA
Meat and Meat products-Detection and Enumeration of Presumptive coliform
Bacteria and Presumptive Escherichia coli. ISO 3811. (1975) .
MERCK, Manual de medios de cultivo.1994