Abstrak

Restriksi endonuklease telah menjadi alat fundamental biologi molekuler dengan

banyak vendor komersial dan lini produk yang luas . Sementara sebagian besar telah
mempelajari tentang keragaman restriksi enzim, organisasi genom , dan mekanisme , ini terus
menjadi daerah aktif penelitian dan membantu dalam upaya pengklasifikasian. Baru-baru ini,
salah satu fokus mereka sudah menjadi spesifisitas sempurna untuk mengenali urutan yang tepat
dan pengenalan urutan antara enzim yang kurang homolog pada DNA yang sama. Beberapa
pertanyaan juga tetap mengenai fungsi in vivo. Mutagenesis dan fusi protein berdasarkan
pengetahuan endonuklease menunjukkan harapan untuk rancangan pembelahan yang lazim.
Pemahaman tentang enzim dan sifat mereka dapat meningkatkan aplikasi produktif dengan
mempertahankan parameter inti kritis dan meningkatkan atau menghindari kegiatan alternatif.
Entri indeks : endonuklease restriksi; Sistem R / M; star activity; pembelahan untai tunggal;
spesifik lokasi nickases.
1. Perkenalan
Restriksi Endonuklease, yang membelah kedua untaian DNA secara spesifik, adalah
alat mendasar biologi molekuler. Penemuan endonuklease dimulai pada tahun 1960 dan
menyebabkan ketersediaan komersil di awal 1970-an. Jumlah enzim tersebut terus berkembang
seperti halnya jumlah vendor dan ukuran produk mereka. Meskipun ada banyak kesamaan antara
endonuklease dalam hal struktur, mekanisme, dan penggunaan, perbedaan tetap penting.
Sekarang inti biologi molekuler, pembatasan endonuclease tetap area penelitian aktif mereka
mengenai mekanisme pembelahan, fungsi in vivo, asal evolusi, dan sebagai model untuk situs
pengenalan DNA yang tepat. Enzim asli yang baru terus ditemukan, enzim yang dikenal kloning,
dan kegiatan baru endonuklease dikembangkan dengan menggunakan protein teknik dan fusi
untuk menghasilkan polipeptida baru.
1.1 .Fungsi Keanekaragaman dan In Vivo
Meskipun pada awalnya ditemukan dalam genom bakteri dan plasmid, restriksi
endonuklease juga ada dalam archaea, virus, dan eukariota. Diperkirakan bahwa 1 dari 4 bakteri
diperiksa mengandung satu atau lebih (1). Neisseria dan Helicobacter pylori sumber yang kaya
untuk beberapa enzim dalam satu strain. Masing-masing, sebanyak 7 dan 14 endonuklease gen
telah ditemukan dalam strain individu, meskipun beberapa gen dinyatakan tidak aktif (2,3).
Termasuk semua jenis, lebih dari 3500 retriksi enzim yang dikenali bahwa 259 DNA yang
berbeda urutan sekarang sudah dikenal. Sebagian besar ini, kira-kira 3460 enzim dikenal 234
urutan DNA, diklasifikasikan sebagai ortodoks Type II atau subclass Tipe II. Ini adalah alat
umum biologi molekuler dengan lebih dari 500 enzim terdiri lebih dari 200 spesifisitas komersial
yang tersedia. Selain itu, 58 endonuklease homing, disebut demikian karena mereka dikodekan
oleh gen yang mobile, self-splicing introns atau inteins, masing-masing dengan situs pengenalan
yang unik, telah ditemukan. Sebanyak 16 lokasi nickase spesifik saat ini dikenal juga. Semua,
297 resriksi enzim telah diklon dan diurutkan. Database semua endonuclease yang dikenal
diperbarui bulanan oleh Dr Richard J. Roberts dan Dana Macelis dan tersedia di
http://www.neb.com/rebase. Sejumlah format yang tersedia, referensi diberikan,dan statistic
dipertahankan .

Restriksi Endonuklease yang awalnya bernama karena kemampuan mereka untuk

membatasi pertumbuhan fage dalam host sel bakteri dengan pembelahan DNA yang diserang.
Dengan cara ini, mereka dapat bertindak sebagai sistem perlindungan bakteri. DNA dari host
dilindungi dari restriksi oleh aktivitas suatu methylase (s),yang diketahui urutan yang sama
seperti restriksi enzim dan methylates nukleotida tertentu (4-methylcytosine, 5-methylcytosine,
5- hydroxymethylcytosine, atau 6-methyladenine) pada setiap untai dalam urutan ini. Setelah
alkohol, host DNA tidak lagi substrat untuk endonuklease tersebut. Karena kedua untai DNA
host termetilasi dan bahkan DNA hemi-alkohol dilindungi, DNA inang baru direplikasi tidak
dicerna oleh endonuklease
Peran restriksi endonuklease sebagai system perlindungan dapat disederhanakan namun
berbagai karakteristik menurunkan potensial enzim yang protektif. Tidak akan ada efek pada
fage tanpa setidaknya DNA untai ganda intermediate atau untuk DNA yang juga dimodifikasi
pada kondisi kritis. Sejumlah kecil fage dapat termetilasi oleh host sebelum restriksi dapat
terjadi, dan sehingga dapat menyebarkan protektif sendiri salinan yang termetilasi. Juga, situs
pengenalan enzim besar akan cenderung langka di fage kecil genom. Menghindari situs restriksi
tampaknya lebih penting dalam kelompok bakteri dari pada kelompok yang sesuai fage. Para
endonuklease umumnya memiliki paruh hidup lebih panjang dari pada methylase, yang
berpotensi mematikan masalah bagi host jika methylase tidak benar dipertahankan. Untuk alasan
ini, ia juga telah mengusulkan bahwa sistem restriksi-methylase mungkin mobile, unsur selfish
genetik yang menjadi penting untuk kelangsungan hidup host setelah diakui sisi (4, 5).
2. Nomenklatur dan Organisasi Genomic
Enzim individu diberi nama sesuai dengan usulan Smith dan Nathans (6). Secara
singkat, tiga huruf dalam huruf miring yang berasal dari huruf pertama dari genus dan dua huruf
pertama dari spesies mikroba darimana enzim itu berasal. Tambahan huruf tanpa italics mungkin
digunakan untuk menunjuk strain tertentu. Ini diikuti oleh angka romawi untuk menandakan
pertama, kedua ,dan sebagainya, enzim yang ditemukan dari organisme. Dapat disimpulkan dari
sejumlah besar enzim dan terbatasnya jumlah urutan DNA berbeda yang mereka akui, banyak
enzim dari sumber biologis yang berbeda dikenali dari urutan DNA yang sama dan disebut
isoschizomers. Sebuah subset dimana dua enzim dikenali urutan DNA yang sama tetapi
membelah pada posisi yang berbeda disebut sebagai neoschizomers. Poin penting untuk
menekankan sebagai hasil dari cloning dan urutan perbandingan adalah bahwa sedikit homolog
antara endonuklease dan methyltransferase urutan DNA yang sama. Selain itu, bahkan restriksi
isoschizomers dapat menunjukkan sedikit atau tidak ada homologi, termasuk asam amino yang
terlibat dalam pengenalan, dan dengan demikian kandidat baik untuk studi banding interaksi
protein-DNA. Sebagai contoh, enzim HhaII dan HinfI keduanya terisolasi dari strain
Haemophilus, mengenali GANTC, dan bersatu antara G dan A. Namun , mereka berbagi hanya
19 % identitas urutan asam amino (7). Endonuclease / sistem methylase mengakui urutan yang
sama juga menunjukkan pola metilasi yang berbeda dan sensitivitas restriksi. Hanya motif umum
terbatas asam amino, PD...D/EXK, telah dibuktikan oleh mutasi atau analisis struktur untuk
berpartisipasi dalam katalisis untuk 10 endonuklease. Namun, 10 enzim termasuk anggota yang
diklasifikasikan sebagai Endonuklease tipe II, IIe, IIs, IV, atau intron dikodekan (8). Sebaliknya,
motif umum telah ditemukan untuk 30 6-metiladenin, 4-metilcytosin, dan 5-metilcytosin
metilase (9).

Sebagai sistem / M R, restriksi endonuklease dan modifikasi methylase gen bekerja

dengan menempel satu sama lain pada bakteri DNA dan dapat berorientasi transcriptionally baik
secara konvergen, divergen, atau cara berurutan. Kedekatan gen ini tampaknya bersifat universal
dan digunakan dalam metode kloning umum yang disebut sebagai "Trick Hungaria" (10). Pada
dasarnya, endonuklease yang digunakan untuk mencerna DNA genomik dari bakteri yang berisi
sistem R/M yang kemudian menyatu membentuk duplikat/klon. Ekspresi vektor yang digunakan
harus mengandung sistem R/M. Plasmid yang sudah dimurnikan dari klon, maka kemudian
enzim yang menarik in vitro. Jika plasmid mengandung gen methylase, maka akan tahan
terhadap terjadinya pembelahan. Seringkali, endonuklease teraktifasi tanpa perlu terjadi
subcloning.
Hal ini diasumsikan bahwa metilasi harus terjadi sebelum aktivitas restriksi untuk
melindungi DNA inang. Salah satu bakteri digunakan untuk membatasi kemungkinan terjadinya
restriksi secara signifikan mengurangi jumlah genom mereka. Atau, ekspresi methylase mungkin
mendahului endonuklease tersebut. Salah satu cara yang dapat dicapai adalah melalui pembacaan
lebih dekat yang terletak di ujung gen endonuklease encoding "C" atau protein kontrol dalam
beberapa sistem R / M. Protein C ini positif mengatur endonuklease gen yang memungkinkan
untuk terjadinya aktivitas konstitutif methylase yang mendahului ekspresi endonuklease (11).
Gen C sering ditemukan dalam situasi di mana methylase dan endonuklease gen dalam orientasi
transkripsi divergen atau konvergen . Menggunakan sistem R / M cloning pada gen C yang
terganggu untuk BamHI, SmaI, PvuII, dan EcoRV R / M, berbagai gen C dengan plasmid yang
terpisah. BamHI gen C menstimulasi aktivitas restriksi PvuII juga sebagai gen PvuII C (12).
Alasan mengapa beberapa gen C merangsang ekspresi endonuklease alternatif tidak sepenuhnya
dipahami, tetapi fenomena mungkin memiliki implikasi evolusi untuk sistem R / M.
3. Struktur, Spesifitas dan Mekanisme
3.1. Klasifikasi dan Mekanisme Umum
Restriksi Endonuklease diklasifikasikan menurut struktur mereka, lokasi ditemukan, tempat
pembelahan, kofaktor (s), dan aktivator (s). Kriteria ini digunakan untuk menentukan jenis (I, II,
III, dan IV) dan subclass (IIe, IIF, IIs, dll), yang dijelaskan secara rinci pada Tabel 1. Beberapa
subunit dan holoenzyme majelis yang mungkin untuk mencapai diperlukan restriksi, methylase,
dan spesifisitas domain. Ketiga domain mungkin hadir pada tiga polipeptida terpisah, dua
polipeptida, atau polipeptida tunggal. Minimal, semua sistem R / M berbagi syarat mutlak Mg2+
untuk kegiatan endonuklease dan AdoMet (juga disebut sebagai S-adenosyl metionin) sebagai
donor metil untuk aktivitas methylase. Pada umumnya, restriksi Tipe I memerlukan Mg2+,
AdoMet, dan ATP (yang menjadi dihidrolisis). Restriksi tipe II hanya membutuhkan Mg2+,
meskipun lokasi ditemukan keduanya atau AdoMet dapat distimulasi. Restriksi tipe III
memerlukan Mg+ dan ATP (yang tidak dihidrolisis) dan dapat dirangsang oleh AdoMet dan
lokasi ditemukan kedua. Jenis Restriksi IV memerlukan Mg dan AdoMet, serta memiliki sifat
yang tidak biasa membelah kedua DNA helai di kedua sisi tempat yang dikenalinya.

Endonuklease homing adalah berbagai perbedaan dari Jenis I-IV. Perlu dicatat bahwa Eco57I dan
seperti enzim, sebelumnya diklasifikasikan sebagai Tipe IV (25,26), telah direklasifikasi sebagai
Tipe IIG (16). Selain itu, itu baru diusulkan dalam artikel ini bahwa enzim yang sebelumnya
diklasifikasikan Type IIb, termasuk BcgI, Bsp24I, BaeI, CjeI, dan CjePI, menjadi pindah ke Tipe
IV klasifikasi karena sifat unik mereka seperti disebutkan di atas. Sebagian besar site ke empat,
enam, atau delapan basis panjang dan palindromic. Beberapa enzim mengenali situs dengan
tingkat terbatas.