PRODUCCIN DE BIOETANOL A PARTIR DE JUGO DE CAA DE

AZUCAR MEDIANTE FERMENTACION CON Saccharomyces cerevisiae

Almanza Ortega Alejandro De Jess1, Guerra Palacios Luisa Fernanda2, Hernndez Fonseca
Yaneth Dayana3, Oate Arenga Sandi Yireth4, Romero Martnez Tatiana Carolina5
DOCENTE: Juan Guillermo Reales Alfaro*
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 Estudiantes de Ingeniera Agroindustrial
* Ingeniero Agroindustrial. Msc. Ciencias Farmacuticas.

RESUMEN
Un proceso de produccin de bioetanol a partir de jugo de caa de azcar filtrado
mediante la fermentacin alcohlica con Saccharomyces cerevisiae. Se dio un tratamiento
adecuado al jugo de caa de azcar estableciendo condiciones iniciales de pH, Brix y
concentracin de glucosa. Se
activ la levadura para posteriormente realizar la
fermentacin en el birreactor. Se determin la cantidad de azucares reductores a partir de
una curva patrn, cantidad de levadura a travs del tiempo y, por ltimo, se realiz la
cuantificacin de etanol por medio del mtodo de dicromato de potasio utilizando curva
patrn de concentraciones conocidas de etanol.
ABSTRACT
A process of producing bioethanol from sugar cane juice filtered by alcoholic fermentation
with Saccharomyces cerevisiae. Proper treatment to sugar cane juice gave establishing
initial conditions of pH, Brix and glucose concentration. Later to make yeast fermentation
in the bioreactor was activated. The amount of reducing sugars was determined from a
standard, amount of yeast curve over time and finally ethanol quantitation was performed
by the method using potassium dichromate standard curve of known concentrations of
ethanol.
Keywords: bioethanol, Saccharomyces cerevisiae, reducing sugars, cane juice, alcoholic
fermentation
Palabras Claves: bioetanol, Saccharomyces cerevisiae, azucares reductores, jugo de caa,
fermentacin alcohlica.
1. INTRODUCCIN
Para la produccin de azcar y alcohol de
caa (en menor escala), que son
bsicamente los nicos productos
actualmente usados de este recurso, se
requiere de la utilizacin de las melazas o
mieles C y de energa, que proviene
principalmente de la combustin (por lo
general, ineficiente) del bagazo y de

combustibles fsiles de baja calidad (con

altos contenidos de azufre), sin considerar
las opciones de la produccin flexible de
azcar y etanol mediante el uso
combinado de mieles A o B, jugo de caa
o biomasa de la caa (bagazo y residuos
agrcolas de cosecha).
Los biocombustibles basados en el etanol
ofrecen muchos beneficios; son buenos

para el medio ambiente porque agregan

menores emisiones a la atmsfera que los
combustibles fsiles y utilizan desechos
del proceso agroindustrial de la caa de
azcar que comnmente no tienen uso.
A diferencia del petrleo, que es un
recurso natural no renovable, los
biocombustibles (bioetanol y biodiesel)
son renovables y representan una fuente
inagotable de combustibles; aunque el
dixido de carbono es liberado cuando se
quema el etanol, ste es reciclado dentro
de tejido orgnico durante el desarrollo de
la planta; de hecho, el uso del etanol en la
gasolina puede resultar en una reduccin
neta de los niveles de dixido de carbono
atmosfrico [Guo, 2006]. El etanol
(EtOH) es el biocombustible ms
ampliamente utilizado hoy en da en los
Estados Unidos, Brasil, Japn, Colombia,
India y la Unin Europea; millones de
litros se agregan al ao a la gasolina para
mejorar el rendimiento de los vehculos y
reducir la contaminacin atmosfrica. El
etanol se utiliza para aumentar el octanaje
de la gasolina y mejorar la calidad de sus
emisiones, como la mezcla E10 (10% de
etanol y 90% de gasolina) pero puede ser
usado en concentraciones mayores, tal
como la mezcla E85 o en su forma pura.
Todos los fabricantes de automviles que
comercializan en el mundo aprueban el
uso de ciertas mezclas de etanol y
gasolina.
2. MATERIALES Y MTODOS
2.1.

Curva Patrn De Glucosa

Se elabor la solucin patrn de glucosa a

las siguientes concentraciones: 0.0, 0.04,
0.08, 0.12, 0.16, 0.20, 0.24, 0.28, 0.32,
0.36 y 0.40, luego se tom 1ml de cada
concentracin en un tubo diferente, a cada
tubo se le agrego 1ml de reactivo DNS
(cido 3,5 dinitrosaliclico), se agitaron

los tubos en el vortex, despus se llevaron

a bao mara a una temperatura de 90C
por 5 minutos seguidamente enfriamos y
transferimos el contenido de cada tubo a
una celdilla por separado, finalmente con
el espectrofotmetro lemos las
absorbancias de las muestras a 540 nm
(tabla 1)
2.2.

Tratamiento Del Jugo De Caa

De Azcar.

Se utiliz jugo de caa de azcar,

comercializado en la ciudad de
Valledupar con condiciones iniciales de
Brix 19.7, pH 6.0. Se filtr el jugo con
una bayetilla, repitiendo varias veces el
procedimiento para una excelente
filtracin.
Posteriormente se ajust pH a 4,5 con
H2SO4 al 10%, los Brix se mantuvieron,
luego se agreg el 10% (0,16L) del
volumen del jugo en un Erlenmeyer, para
enriquecerlo y activar la levadura. El 90%
restante (1.44 L) se pasteuriz a 70 C por
30 minutos, luego se enfri en un bao de
agua a temperatura ambiente.
2.3.

Activacin De La Levadura

Se desinfect el biorreactor con etanol.

Luego se tomaron 160 ml del jugo de
caa ya filtrado, se adicionaron al
biorreactor enriqueciendo el medio de
cultivo con:
MgSo4 -7H2 O = 0.1
KH2 PO4 = 0.2
(NH4)2 SO4 =0.3
Peptona = 0.36
Extracto de Levadura = 0.4
CALCULOS
211.2 x 0.1
=0.2112 gr
100

MgSo4 -7H2 O

211.2 x 0,2
=0.4224 gr
100
211.2 x 0.3
=0.6336 gr
100

celular (por cuenta directa en cmara de

Neubauer).

KH2 PO4

Por lapsos de 6 o 12 horas se extrajo con

una jeringa 1 ml de jugo de caa en
fermentacin adicionndose a 9 ml de
agua peptonada para hacer una dilucin
de 10-2. Se llev al vortex por siete

(NH4)2 SO4

211.2 x 0.36
=0.76032 gr Peptona
100
211.2 x 0.4
=0.8448 gr
100

Extracto

de

Levadura
Una vez enriquecido el cultivo se llev a
esterilizar con todos los ingredientes, en
la autoclave a 15 PSI y 121C por dos
horas.
Despus de esterilizado se llev a mezclar
todo el contenido en un agitador
magntico que controla temperatura y las
RPM durante 2 horas.
2.4.

Fermentacin

Lo primero que se llev a cabo para este

proceso fue la desinfeccin del lugar de
trabajo, utilizando hipoclorito de sodio a
25000 ppm, y previamente se esterilizo el
biorreactor con etanol. Luego se verti el
jugo de caa (1440ml) al Biorreactor
previamente esterilizado donde se le
adiciono el sustrato de 160 ml en donde
ya estaba activada la levadura, la reaccin
fermentativa se mantuvo a 32C, ya que
esta es la temperatura ptima para trabajar
con
la
levadura
Saccharomyces
cerevisiae. Y una agitacin de 200 rpm,
por un tiempo de 72 horas, en ausencia de
oxgeno.
2.5.

Cuantificacin De
Levadura Cmara Neubauer

Se
tomaron
muestras
para
la
determinacin de biomasa, concentracin

segundos para homogeneizar. Con la

ayuda de un micro pipeta se tom 1 l del
tubo 10-2 y se aplic en la zona de
conteo, colocndose un cubreobjetos para
ser observado en el microscopio con un
objetivo a 40X y se realiz el conteo
respectivo de clulas de la dilucin.
2.6.

Cuantificacin De Etanol Por

Dicromato De Potasio
Se mezclaron 2 ml de la solucin a con 2
ml de la solucin b en tubos de ensayos
homogenizndose en el agitador vrtex a
1500 rpm por 10 segundos.
Se calienta en bao mara a una
temperatura de 80-85C por 30 minutos.
Se deja reposar los tubos a temperatura
ambiente y se ley la absorbancia a 440
nm en el espectrofotmetro.
2.6.1.

2.6.1.1.

Preparacin de las soluciones

Solucin oxidante

Se mezclan 4.165 g de dicromato de

potasio y 250 ml de cido sulfrico
aforando con agua destilada hasta 1000
ml.
2.6.1.2.

Preparacin
de
la
solucin saturada de carbonato
de potasio

Se mezclan de 20 g de carbonato de
potasio en una probeta y se adicionan
17,8 ml de agua destilada.

2.6.1.3.

Solucin b

Se tomaron 14 ml de la solucin oxidante

y se le adicionaron 7 ml de carbonato de
potasio

12

f(x) =
R = 0

10
8

Concentracion

2.6.2. Curva Patrn

Se tom un tubo de ensayo para cada

concentracin, se le adicionaron 2 ml de
esta. Luego se le adicionaron 2 ml de la
solucin b.
3. ANALISIS Y DISCUSION DE
RESULTADOS

Curva patrn de glucosa

Vol.
Glucosa
en ml

0.0
0.1
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0

4
2

Se tom etanol al 96% y se hicieron

soluciones de 1, 2, 3, 4 y 5%, %V/V, para
realizar la curva patrn. En cada caso se
tomaran estas soluciones como solucin a
para la lectura de absorbancia.

3.1.

Vol.
H20

Con.
Estndar

Absorbancia
540nm

1.0
0.9
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0

0.00
0.04
0.12
0.16
0.20
0.24
0.28
0.32
0.36
0.40

0.00
0.263
0.379
0.712
0.933
1.324
1.537
1.749
1.986
2.327

Tabla 1.

Grafico 1. Curva Concentracin de

glucosa Vs Absorbancia

0
0 2 4 6 8 10 12

Absorbancia

Determinacin de Azucares Reductores

en la Fermentacin.
Se tomaron muestras en los siguientes
intervalos 0, 14, 24, 38, 48, 62 y 72
horas, a los que se les midieron
absorbancia con el espectrofotmetro a
540nm; para hacer la lectura se diluyo
cada una de las muestras, usando una
relacin 0.2: 100.
Utilizando la ecuacin de la recta
obtenida por la tendencia lineal de la
curva de calibracin observada en la
grfica y el valor de las absorbancias que
se encuentran en la Tabla 2 se llega a el
valor de la concentracin de azucares
reductores (g/l) de la muestra del jugo de
caa en la Tabla 3.
Tabla 2. Datos de absorbancia tomadas
para la muestra.
No de
Muestra
1
2

Tiempo
(Horas)
0
14

Absorbancia
540
0.22
2,495

3
4
5
6
7

24
38
48
62
72

2,446
3,196
1,929
0,155
-0,007

Donde, S0 = [ ] Inicial de azucares

reductores, g/l
S = [ ] final de azucares reductores, g/l
3.1.2. Rendimiento del producto
Y p=
s

Tabla 3. Datos de concentracin de

azucares reductores en g/l de las
muestras de jugo de caa de azcar.
No de
Muestra

Tiempo
(Horas)

Concentracin
de Azucares
Reductores en
gr/l

20.757

14

195.59075

24

191.8251

38

246.92655

48

152.09365

62

15.76175

72

3.31205

P
0,4647
1
1
gg =
=0.026 g g
20.7573.31
(SoS)

3.1.3. Productividad
Produc=

981,45
gr
=8,52
1,6 l72 h
Lh

3.1.4. Rendimiento biomasa

dN 131,6151667lev / ml
Y x=
=
=1124572,8 levad
dS 117,0357 gr /1000 ml
s
3.1.5. velocidad especifica
Y x 1124572,8 lev
gr
= s =
s
gr
3.31
l
339750,09lev / l

3.1.6. tiempo de duplicacin

ln 2
Td=
h

Grafico 2. Velocidad de consumo de

sustrato

ln 2
39750,09

300.000

lev
l

72h

111,46109 levh/l

250.000
200.000
150.000

3.2.

Cuantificacin de la levadura
Curva patrn

100.000
50.000
0.000

10 20 30 40 50 60 70 80

3.1.1. Conversin de sustrato

Cs=

SoS 20.7573.31
=
=84
So
20.757

Se contabilizaron las clulas que se

encontraron dentro de cada cuadro
subdividido en 16 recuadros pequeos,
contabilizndose seis cuadros en su
totalidad, contabilizndose con la
Ecuacin

CSC

X
=10000 ( )Fd
( celulas
)
ml
4

Curva de Crecimiento
300000

Donde:
CSC: Concentracin en la suspensin
celular

f(x)
= 4264.59x - 587.88
200000
R = 0.97
# Levadura/ml 100000
0
0 20 40 60 80

X: Nmero de clulas contadas en la

cmara Neubauer
10000= Volumen = 0,01 cm2 de
superficie 0,1 mm (profundidad)
0,01 cm = 0.0001 cm3
Fd: Factor de Dilucin
Finalmente se procedi a realizar la
respectiva curva de crecimiento para la
produccin de levadura en el proceso de
fermentacin.
Tabla 4.
levaduras
Tiempo
(hora)
0
14
24
38
48
62

Recuento

ponderado

de

# Levadura/ml
15280
62840
74646
158640
199520
278760

Grafica 3. Curva De Crecimiento

Microbiano Por El Mtodo De Conteo
Por Cmara Neubaur.

Tiempo (hora)

3.3.

Clculos de las concentraciones

para la curva patrn

Se tomaron 5 vasos de precipitado, a cada

uno se le adicion 1 ml de etanol al 96% y
se completa el volumen de la solucin con
agua destilada.
C1 V 1=C 2 V 2
V 2=

C1 V 1
C1

Concentracin y volumen de solucin para

cada vaso:
1. C2H5OH 1%
96 1 ml
V 2=
=96 ml
1
2. C2H5OH 2%
96 1 ml
V 2=
=48 ml
2
3. C2H5OH 3%
96 1 ml
V 2=
=32 ml
3
4. C2H5OH 4%
96 1 ml
V 2=
=24 ml
4

Se realizaron 2 muestras al finalizar la

fermentacin y otras 2 muestras 12 horas
despus de finalizada la fermentacin.

5. C2H5OH 5%
96 1 ml
V 2=
=19,2 ml
5
Tabla 5. Concentracin de etanol Vs
Absorbancia a 440 nm
Absorbancia
0
0,153
0,158
0,159
0,160
0,162

%C2H5OH
0
1
2
3
4
5

Horas
0
horas
12
horas

Grafico 4. Curva de calibracin de la

concentracin de alcohol.

Absorbancia Vs % Etanol
6
5
4

% Etanol

Las lecturas en el espectrofotmetro se

realizaron por duplicado para cada una de
las muestras obteniendo siguientes
lecturas de longitud de onda.

f(x) = 442.48x - 67.09

R = 0.88

Tubo
1
2
3
4

Absorbancia
1,773
1,773
1,772
1,772
1,773
1,773
1,773
1,773

Haciendo promedio ponderado de las

lecturas se toma una absorbancia de 1,773
Para estandarizacin de la ecuacin para
la determinacin del grado de alcohol a
partir de la curva patrn se estim el R2
(coeficiente de regresin), la pendiente de
la grfica, la recta de regresin. La
determinacin de etanol se realiz
mediante la siguiente ecuacin:
y=

4375
635
x
104
208

2
1
0
0.15

0.16

0.16

0.17

Absorbancia

3.3.1. Toma de muestra

Se tomaron 10 ml del jugo fermentado,
luego se agregaron 2 ml de la muestra a
un tubo de ensayo siendo esta la solucin
a y 2 ml de la solucin oxidante y se
realiz el proceso descrito anteriormente
obteniendo.

En el proceso de la produccin de
bioetanol, se obtuvo un % de etanol de
46,47%, cuyo valor est muy elevado.
Este porcentaje puede estar incidido por
la cantidad de levadura adicionada al
momento de activar la levadura
Saccharomyces Cerevisiae

4. CONCLUSIONES
En la realizacin de esta prctica se

tuvieron algunos errores en la elaboracin

del proceso para obtener bioetanol, el cual
se vio reflejado en el proceso de la
obtencin de bioetanol.

La concentracin de alcohol es muy

elevada por lo que se estiman errores al
momento de calcular levadura y/o utilizar
estadstica para el clculo de la
concentracin de este
Optimizar el proceso con cada una de las
variables que intervienes que ofrezcan
una mayor productividad.

azcares reductores totales en jugos

mezclados de caa de azcar utilizando
el
mtodo
del
cido
3,5
dinitrosaliclicoICIDCA. Sobre los
Derivados de la Caa de Azcar [en
linea] 2006, XL (Mayo-Agosto)
Aguilar-Rivera, N. Bioetanol de la caa
de azcar Avances en Investigacin
Agropecuaria, vol. 11, nm. 3,
septiembre-diciembre, 2007, pp. 25-39
Girard, P. & Fallot, A., 2006. Review of
existing and emerging technologies for
the production of biofuels in developing
countries. Energy for Sustainable
Development, 10 2, 98-108.
Miller, G. L. (1959). Use of
dinitrosalicylic
acid
reagent
for
determination of reducing sugar.
Analytical chemistry, 31(3), 426-428.

BIBLIOGRAFA
Gil, Daniel, Carrera Bocourt, Emilia,
Daz Maqueira, Yuset, Determinacin de

Agrawal, P. K. y Kumar, S. 1997. Los

subproductos de la destilera como
fuentes de energa. International Sugar
Journal, volumen XCIX, No. 1180.