Recebido em 15/11/05.

Aceito em 27/03/06

Principio activo citotoxico de Espeletia killipii Cuatr. sobre clulas

tumorales y su toxicidad frente a clulas normales humanas
Gustavo Jaimes1,2, Clemencia de Castro1, Fabio Ancizar Aristizaba2, Tulia Riveros de Murcia1,
Rubn Torrenegra3, Alba N. Tllez Alfonso3*

Artigo

Revista Brasileira de Farmacognosia

Brazilian Journal of Pharmacognosy
16(2): 140-145, Abr./Jun. 2006

Instituto Nacional de Cancerologa E.S.E., Grupo de Investigacin Nuevos Frmacos en Oncologa, Bogot,
Colombia,
2
Departamento de Farmacia, Universidad Nacional, Bogot, Colombia,
3
Departamento de Qumica, Universidad Javeriana, Grupo de Investigacin Fitoqumica, Bogot, Colombia

RESUMO: Princpio ativo citotxico de Espeletia killipii Cuatr. Sobre clulas tumorais e
sua toxicidade frente a clulas normais humanas. De Espeletia killipi Cuart. foi isolado uma
sesquiterpenlactona identificada como acetato de longipilina que mostrou atividade citotxica.
A citotoxidade foi avaliada em clulas normais obtidas de sangue perifrico, tiride, testculo e
epitlio da boca. Clulas da medula ssea de pacientes com leucemia crnica mielide, linfoma
de Hodking (do Instituto Nacional de Cncer de Bogot, Colmbia) e clulas K562 tambm foram
avaliadas. A citotoxidade foi determinada atravs do teste MTT (3-(4,5-dimethyldiazol-2-yl)-2,5
diphenyl Tetrazolium Bromid). Os ensaios mostraram que a substncia no txica para clulas
normais mas a 3 g/mL apresentou significante atividade em clulas tumorais e linhagem K562.
Conseqentemente, lavando-se em conta essa significante ao, novas investigaes podem ser
consideradas plausveis.
Unitermos: Espeletia killipii, sesquiterpenolactona, atividade citotxica.
ABSTRACT: The compound responsible for the citotoxic effect was identified as longipilin acetate,
a sesquiterpenelactone isolated from Espeletia killipi Cuatr. Citotoxicity was assessed by using
normal cells obtained from peripheral blood, thyroid, testicle and mouth epithelium. Bone marrow
cells from patients with chronic myeloid leukemia, Hodking lymphoma (from Cancer National
Institute, Bogot Colombia) and the cell line K562 were also assayed. Citotoxicity was determined
by the MTT cell viability test (3-(4,5-dimethyldiazol-2-yl)-2,5 diphenyl Tetrazolium Bromid]. The
assays revealed that the substance is risk-free on normal cells but at 3 g/mL has significant activity
on tumor cells and K562 cell line. Consequently, taken into account this significant action, new
research approaches can be foreseen.
Keywords: Espeletia killipii, sesquiterpenelactone, cytotoxic activity.

INTRODUCCIN
El descubrimiento de nuevos agentes con
actividad anticncer se ha convertido en una de las metas
de la investigacin cientfica moderna; la molcula ideal
para este fin debe eliminar incapacitar una variedad
importante de subpoblaciones celulares de un tumor sin
afectar en lo posible las del tejido normal (Huang; Oliff,
2001).
En trabajo anterior fue mostrado los efectos
citotoxicos in vitro de extractos y fracciones de
Espeletia killipii frente a lineas celulares tumorales
humanos (Alfonso et al., 2006). En este trabajo, una
sesquiterpenlactona aislada de la misma planta, present
un potencial citotxico importante sobre lneas celulares
tumorales con valores de Concentracin Citotxica
media (CC50 ) menor de 1 g/mL para las lneas celulares
colombianas CSC-1170, CSC-1595, CSC-3322 y CSC3325; CC50 = 1 g/mL para MDA MB 435 y NCI- H23;
* E-mail: ntellez@javeriana.edu.co, Fax 3208320 ext. 4034

para MCF-7 una CC50 = 2 g/mL y una CC50 superior a

16 g/mL para PC -3 y U-251. Es indispensable observar
la toxicidad del principio activo frente a clulas normales
y clulas obtenidas directamente de pacientes con cncer;
dentro del estudio de la molcula como posible agente
antitumoral.
MATERIAL Y METODOS
El principio activo fue caracterizado e
identificado por sus constantes fsicas y por mtodos
espectroscpicos. El punto de fusin se determin en un
fusimetro Melt Temp. Laboratory Devices; las rotaciones
especficas en un polarmetro Polartronic Schmidt; el
espectro infrarrojo tomados en un espectrofotmetro
infrarrojo Shimadzu 710B; los espectros de masas en
un espectrmetro de masas por impacto electrnico,
EIMS 902, de doble enfoque, con inyeccin directa a
70 eV. Los espectros RMN 1H, RMN 13C y RMN 2D,
ISSN 0102-695X

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Gustavo Jaimes, Clemencia de Castro, Fabio Ancizar Aristizaba, Tulia Riveros de Murcia, Rubn Torrenegra, Alba N. Tllez Alfonso

tanto homonucleares como heteronucleares, COSY 1H1

H (Correlation Spectroscopy), NOESY 1H-1H (Nuclear
Overhauser Effect Spectroscopy), HMBC (Heteronuclear
Multiple Quantum Coherence), HMQC (Heteronuclear
Multiple Quantum Coherence) y H-C COBI ) fueron
tomados en un espectrmetro Bruker AMX-400 (400
MHz). Los espectros fueron corridos en solucin en
CDCl3.
Se evalu la toxicidad sobre cultivos celulares
primarios de: clulas mononucleares de siete donantes,
clulas sanas de: tiroides, testculo y boca, clulas
mononucleares de mdula sea de dos pacientes con
leucemia mieloide crnica y dos de linfoma de Hodking
y la lnea celular tumoral K562. Todas las muestras y
lneas fueron suministradas por el Instituto Nacional de
Cancerologa E.S.E. de Bogot, Colombia.
Cultivos
Se establecieron cultivos de: clulas
mononucleares de sangre perifrica y cultivos de testculo,
tiroides y boca. Se realizaron curvas de crecimiento, en
todos los casos, con el fin de calibrar el nmero adecuado
de clulas a inocular en las cajas de 96 pozos para una
absorbancia apropiada.
Principio activo
El compuesto fue suministrado por el Grupo de
investigacin Fitoqumica de la Pontificia Universidad
Javeriana de Bogot Colombia. Se prepararon soluciones

seriadas de: 50 g/mL, 25 g/mL, 12.5 g/mL, 6.0 g/mL

y 3.0 g/mL; utilizando como solvente dimetil sulfxido
(DMSO) al 0.2%.
Bioensayos
Se utiliz el ensayo colorimtrico de
proliferacin celular de MTT (Sigma). Los cultivos
se efectuaron en cajas de 96 pozos, con medio L-15
(SIGMA) suplementado con: 10% de suero fetal bovino
(GIBCO) y 10 % de penicilina-estreptomicina. Como
control positivo se utiliz Doxorrubicina HCl a 0.07 g/
mL (Pharmaca & Uphjon).
Los
datos obtenidos se evaluaron
estadsticamente utilizando anlisis de varianza y la
prueba de Tuckey; las CC50 se estimaron utilizando el
logaritmo de la concentracin con el paquete estadstico
SAS con plataforma para windows.
RESULTADOS Y DISCUSIN
El espectro IR del compuesto activo, present
absorciones en 1780 cm-1, (lactona), en 1740 y 1240 cm-1
(grupo acetato) y en 1720 cm-1 (grupo C=O, de ster). El
espectro de RMN 1H confirma la presencia de la lactona
mediante las seales en 6.3 (d, J = 3.42 Hz), 5.9 (d,
J = 2.44 Hz), 2.7 (m). El grupo metil ster se evidencia
por la seal en 3.8 y el grupo angelato por las seales
en 1.7 (m), 1.9 y 1.7 (m) (Tabla 1). El espectro de RMN
13
C, DEPT/COM mostr seales correspondientes a 8
grupos CH, 3 grupos CH2, 4 grupos CH3, 8 carbonos

Tabla 1. Datos de RMN 1H, tomados de los espectros del compuesto acetato de longipilina (400 MHz) en CDCl3.

Hidrogeno
1
2
2b
3
3b
5
6
7
8
9
13a
13b
15
MeO
AcO
Ang O
3
2
3
a,b,c

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Seales intercambiables

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(H, ppm)
7.1(dd, J=9.9; 9.0 Hz)
3.05 (m)
2.4 (m)
1.25 (m)
2.6 (s)
2.7 (m)
4.25 (dd, J=9.5; 9.7 Hz)
2.9 (dq, J= 1.9 Hz)
6.8 (dd, J=0.98;1.2;9.7)
5.83 (d, J=8.5 Hz)
5.9 (d, J=2.4 Hz)
6.3 (d, J=3.42)
1.7
3.8 (s)
2.0 (s)
6.1 (d)
1.5 (d)
1.9 (m)

Principio activo citotoxico de Espeletia killipii Cuatr. sobre clulas tumorales y su toxicidad frente a clulas normales humanas

Tabla 2. Datos de RMN 13C, tomados de los espectros del compuesto acetato de longipilina.

C
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
MeO
AcO

Tipo de C
-CH=
CH2
CH2
C
CH-O
CH-O
CH
CH-O
CH-O Ac
C-C=O
-C=CH2
O-C=O
=CH2
-COOCH3
CH3-O-CO
C=O
CH3-COO
-COO-C=C
=CHCH3-CCH3-CH

1
2
3
Me
Me

C
149.2
24.4
35.1
59.2
62.5
76.0
45.3
70.4
69.4
126.4
133.4
165.3
122.5
165.7
17.2
52.1
170.0
20.10
168.0
129.0
139.7
20.4
15.4

Tabla 3. Datos de RMN bidimensional H-C directo y HMBC, tomados de los espectros del compuesto acetato de longipilina.

C
CH3
CH3
CH3
CH3
CH2

C
15.9
17.7
20.5
20.9
24.8

H H-C directo
1.92 dq
1.68 s
1.77 dq
1.98 s
2.95 m, 2.43 m

CH2
CH
CH3
C
CH
CH2
C
CH
CH
C
C
C
CH
CH
C
C
C
C

35.6
45.7
52.6
59.6
63.0
69.5
70.8
76.3
123.1
126.7
130.2
133.5
140.3
149.5
165.7
166.1
168.5
170.4

2.32 m, 1.20 m
2.98 m
3.81 s

HMBC
126.7, 140.3, 166.1 (dbil)
35.6, 59.6, 63.0
126.7, 140.3, 166.1
170.4
35.6, 59.6(dbil),130.2, 149.5,
17.7, 24.8, 59.6, 63.0, 76.3(dbil), 149.5
17.7, 24.8, 59.6, 149.5
123.1, 76.3, 59.6, 63.0
165.7

2.67 d
6.71 dd
5.84 d
4.26 t
5.90 d, 6.32 d

35.6, 45.7, 59.6, 76.3

45.7, 70.8, 76.3, 133.5, 166.1
69.5, 130.2, 149.5, 165.7, 170.4
45.7, 59.6, 63.0, 69.5
45.7, 133.5, 168.5

6.08 qq
7.14 dd

24.8, 70.8, 130.2, 165.7

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Gustavo Jaimes, Clemencia de Castro, Fabio Ancizar Aristizaba, Tulia Riveros de Murcia, Rubn Torrenegra, Alba N. Tllez Alfonso

Tabla 4. Porcentaje de viabilidad de las clulas mononucleares de sangre perifrica proveniente de donantes con relacin al
control (DMSO 0.2%)

Donantes
1
2
3
4
5
6
7

50g/ml
46
51
53
46
55
58
54

25 g/ml
70
64
72
62
69
74
77

Porcentaje de Viabilidad
12.5 g/ml
6.0 g/ml
81
91
72
87
83
95
76
90
85
93
89
97
84
99

3.0 g/ml
108
96
102
98
109
106
109

Tabla 5. Porcentaje de viabilidad en cultivos de clulas epiteliales sanas con relacin al control (DMSO 0.2%)

Cultivo Celular
Tiroides
Testiculo
Boca

Porcentaje de Viabilidad
3.0 g/ml
85
109
94

6.0 g/ml
78
89
79

12.5 g/ml
71
73
58

25 g/ml
69
32
35

50 g/ml
63
23
24

Tabla 6. Porcentaje de viabilidad de clulas mononucleares de sangre perifrica proveniente de pacientes con leucemia mieloide
crnica y linfoma de Hodking del INC E.S.E de Bogot Colombia, con relacin al control (DMSO 0.2%)

Cultivo Celular
LMC 1
LMC 2
LH 1
LH 2

3.0 g/ml
43
52
56
45

Porcentaje de Viabilidad
6.0 g/ml
12.5 g/ml
25 g/ml
33
32
30
38
36
34
48
35
28
35
32
31

50 g/ml
23
29
20
28

LMC: leucemia mieloide crnica

LH : linfoma de Hodking

cuaternarios; para un total de 23 tomos de carbono en la

estructura (Tabla 2). El espectro de masas presenta el ion
molecular en 448, lo cual permite establecer la frmula
C23H28O9 para el compuesto.
La elucidacin estructural del compuesto se
hizo con base en los anlisis de los espectros de RMN
bidimensionales HMQC y HMBC (Tabla 3). Las
constantes de acomplamiento del protn olefnico H-1 en
7.1 (dd, J = 9.9; 9.0 Hz), confirman la configuracin cis
del anillo ciclodecano del melampolido.
Con base en las constantes fsicas, los datos
espectroscpicos y por comparacin con los datos
reportados en la literatura, el compuesto se identific como
un germacranlido del tipo melamplido denominado
acetato de longipilina (Figura 1).
El compuesto del tipo melamplido: acetato
de longipilina fue previamente reportado por Seaman
and Fischer en 1978, como el derivado acetilado del
compuesto longipilina aislado de la especie Melampodium
longipilum, y por Bohlmann et al., 1980 de Smallanthus
fruticosus.
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Los resultados obtenidos a partir de cultivos de

clulas mononucleares provenientes de donantes sanos
se muestran en la tabla 4, Se consideran citotxicamente
activo los porcentajes de viabilidad inferiores a un 50 %;
lo que demuestra que no present un efecto citotxico
importante a concentraciones de 12.5 g/mL, por
presentar porcentajes de viabilidad superiores al 80%.
El principio activo acetato de longipilina frente
a los cultivos de clulas epiteliales de boca, testculo
y tiroides no present un efecto citotxico relevante
a concentraciones a 12.5 g/mL con porcentajes de
viabilidad superiores al 70% para tiroides y testculo
y a concentraciones a 6.0 g/mL con porcentajes de
viabilidad superiores al 78%, como se aprecia en la
Tabla 5.
Las clulas obtenidas de pacientes con
leucemia mieloide crnica y linfoma de Hodking fueron
sensibles al principio activo, dando como resultado un
efecto importante al presentar porcentajes de viabilidad
inferiores a un 50%; a la concentracin de 3.0 g /mL,
Tabla 6.

Principio activo citotoxico de Espeletia killipii Cuatr. sobre clulas tumorales y su toxicidad frente a clulas normales humanas

O
14

CO2 CH3 O

CH3
OAng

1
2
3

10
5
4

15

8
7

13

11

12

O
Figura 1. Principio activo citotxico.

Porcentaje de viabilidad

120
100
80
60
40
20
0
3,1ug/ml

6,2ug/ml

12,5ug/ml

25ug/ml

50ug/ml

concentraciones
GBSP

Leucemia

Hodking

K562

Figura 2. Efecto citotxico del principio activo. Cada punto representa el promedio de los ensayos en: cultivos
de sangre perifrica sanos (GBSP), leucemia mieloide crnica, Linfoma de Hodking y la lnea celular K562.

El compuesto acetato de longipilina afecta

principalmente a los grupos celulares indiferenciados y
aumenta cuando su potencial mittico es mayor como
se muestra en la figura 2. Esto concuerda con estudios
publicados con sesquiterpenlactonas similares como
acetato de ivalina con actividad antileucmica importante
y baja toxicidad sobre clulas mononucleares de sangre
perifrica (Quintero et al., 1999).
Los resultados de la valoracin del efecto del
acetato de longipilina sobre cultivos sanos de tiroides,
boca y testculo (Figura 3), revel que la molcula es poco
txica a concentraciones por debajo de 12.5 g/mL. Estos
resultados son importantes teniendo en cuenta que a estas
concentraciones el efecto sobre clulas de pacientes con
cncer y lneas celulares tumorales es txica.
En todos los casos se observ significancia
estadstica (nivel de 0.05). La visin en perspectiva de

este trabajo permite proponer que probablemente los

cultivos menos diferenciados y ms activos en trminos
de divisin celular son los ms afectados, lo que hara
suponer que el principio activo tiene blanco en alguna(s)
molcula indispensable para la supervivencia de la
clula tumoral. Otras sesquiterpenlactonas similares han
demostrado su actividad sobre vas relacionadas con ciclo
celular, sntesis del ADN, alteracin del metabolismo
celular y en la actividad del factor nuclear NF-B
inhibiendo su actividad transcripcional llevando la clula
a apoptosis (Lee et al. 1997 y Dirsch et al. 2001).
Finalmente, los resultados demostraron que es una
molcula promisoria que amerita ensayos bioqumicos
tendientes a revelar los mecanismos moleculares de
accin y pruebas sobre modelos animales que evidencien
su utilidad como potencial frmaco antitumoral.
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Porcentaje de viabilidad

Gustavo Jaimes, Clemencia de Castro, Fabio Ancizar Aristizaba, Tulia Riveros de Murcia, Rubn Torrenegra, Alba N. Tllez Alfonso

120
100
80
60
40
20
0
3,1ug/ml

6,2ug/ml

12,5ug/ml

25ug/ml

50ug/ml

Concentraciones
Tiroides

Testculo

Boca

Figura 3. Citotxicidad del principio activo en cultivos de clulas de tiroides, testculo y boca, cada punto
representa el promedio de los ensayos.

AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a COLCIENCIAS, La
Pontificia Universidad Javeriana y el Instituto Nacional
de Cancerologa por el apoyo financiero. Proyecto
Identificacin y efecto de posibles sustancias citotxicas
aisladas de especies vegetales colombianas: Col 120305-11460.
REFERENCIAS
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Efectos citotoxicos in vitro de extractos y fracciones
de Espeletia killipii Cuatr. frente a lineas celulares
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Bohlmann F, Ziesche J, King R, Robinson H 1980.
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Phytochemistry 19: 973-974.
Dirsch V, Stuppner H, Vollmar A 2001. Helenanin triggers a
CD95 death receptor-independent apoptosis that is not
affected by overexpression of Bcl-xl or Bcl-2. Cancer
Res 61: 5817-5823.
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potential targets for cancer therapy. Trends Cell Biol
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Lee K, Hall I, Mar E, Starnes C, Elgebaly S, Waddell T, Hadgraft
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inhibitors of cellular metabolism. Science 196 (4289):
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Quintero A, Pelcastre A, Dolores J 1999. Antitumoral activity
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Seaman F, Fischer N 1978. Longipin, a new melampolide from
Melampodium longipilum. Phytochemistry 17: 21312132.

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