SELINA PAULA LOOR BOHORQUEZ

GRUPO 11

TIPOS DE LABORATORIO
Clasificacin de los laboratorios
Teniendo en cuenta el amplio espectro de laboratorios que existen, los podemos clasificar,
teniendo en cuenta su funcin, de la siguiente manera:
1. Laboratorios de metrologa: en ellos se efectan estudios tanto de las unidades y las
medidas de las magnitudes, como de las exigencias tcnicas de los mtodos e instrumentos
que se usan para la medicin. Los laboratorios de este tipo se clasifican jerrquicamente
teniendo en cuenta cul es la calidad de sus patrones:

NACIONAL: en estos laboratorios se encuentran el patrn primario as como

tambin los nacionales de transferencia.

INTERMEDIO: estos laboratorios se encuentran en los centros de investigacin o

incluso en ciertas universidades.

INDUSTRIALES: son aquellos laboratorios que se encuentran en compaas, que

los usan para realizar ensayos de control de calidad.
2. Laboratorios clnicos: en ellos se llevan adelante los denominados anlisis clnicos, que
se utilizan para prevenir, estudiar, diagnosticar y tratar ciertos problemas vinculados con la
salud.
Para llevar adelante estos estudios, los especialistas toman muestras biolgicas de sangre,
fluidos, orina o materia fecal. Estos estudios se concretan dentro de las reas de la
hematologa, bioqumica, endocrinologa, parasitologa, microbiologa, inmunologa.
Los laboratorios clnicos se pueden clasificar segn :
El nivel de complejidad del procesamiento de las diferentes muestras:

DE BAJA COMPLEJIDAD: en estos laboratorios se abordan los exmenes de

rutina, que son aquellos que no precisan de un equipo as como tampoco estructura
demasiado compleja, sino de un rea delimitada para poder procesar las muestras, un
lugar donde poder tomarlas, y un rea administrativa.

Tipos de exmenes de baja complejidad:

DE MEDIANA COMPLEJIDAD: en estos laboratorios se analizan los exmenes

tanto de inmunologa como de microbiologa. Cuentan con un equipamiento y
estructura superior, con un importante volumen de personal preparado y muestras para
garantizar la cobertura de las guardias.

Tipos de exmenes de mediana complejidad:

DE ALTA COMPLEJIDAD: por ltimo, en estos laboratorios se analizan la mayor

parte de los estudios. Su infraestructura requiere contar con distintas reas especficas.
Tipos de exmenes de alta complejidad:

De acuerdo a su dependencia:

De acuerdo con sus funciones, se pueden dividir en:

LABORATORIOS
DE
RUTINA
O
DE
Los laboratorios de rutina tienen cuatro departamento
bsicos: Hematologa, Inmunologa, Microbiologa y
Qumica Clnica (o Bioqumica).
Los laboratorios de rutina pueden encontrarse dentro
de un hospital o ser externos a ste. Los laboratorios
hospitalarios, con frecuencia tiene secciones
consideradas de urgencia, donde se realizan estudios
que servirn para tomar decisiones crticas en la
atencin de los pacientes graves. Estudios tales

SEGUIMIENTO.-

como citometra hemtica,

gases sanguneos.

tiempos

de coagulacin, glucemia, urea, creatinina y

LABORATORIOS DE ESPECIALIDAD.
En los laboratorios de pruebas especiales se realizan estudios ms sofisticados,
utilizando metodologas como amplificacin
de cidos nuclicos, estudios cromosmicos,
citometra de flujo y cromatografa de alta
resolucin, entre otros. Estas pruebas
requieren instalaciones y adiestramiento
especial del personal que las realiza. Con
frecuencia, estos laboratorios forman parte
de programas de investigacin.

3. Laboratorios cientficos: La mayor parte de las ciencias naturales pudieron progresar

gracias al trabajo que se realiza dentro de estos espacios:

DE QUMICA: en estos laboratorios se

abordan las propiedades de mezclas, compuestos,
sustancia, as como tambin elementos, que se
usan para llevar adelante ensayos qumicos.

DE FSICA:

donde se llevan a cabo experimentos en reas como

electricidad, electrnica, dinmica, ptica, entre otros,
que requiere de un gran nivel de seguridad industrial.

DE BIOLOGA: en estos laboratorios se trabaja con materiales biolgicos de todo

tipo: desde cultivos celulares, pasando por rganos y terminando por tejidos, para as
entender de la mejor manera posible cmo es la fisiologa de la especie estudiada.
Entre los equipos que se encuentran en estos laboratorios podemos mencionar:
microscopios, placas de petri, medios de cultivo y soluciones fisiolgicas.

Segn los niveles de seguridad el laboratorio cientfico de biologa se clasifica en:

LIMPIEZA, DESINFECCIN Y ESTERILIZACIN DE MATERIALES EN

EL LABORATORIO CLNICO

Durante la rutina de trabajo diario que se realizan en todas las secciones

del laboratorio clnico, se manipulan diferentes tipos de muestras, los cuales pueden
contener agentes infecciosos importantes, que requieren ser eliminados antes de descartar
los envases respectivos.
Por otro lado, existen materiales de laboratorio reusables que requieren posterior a su
utilizacin, de una limpieza y esterilizacin apropiada, tal que puedan ser utilizados
posteriormente.
En todas estas situaciones, el personal de limpieza, desinfeccin y esterilizacin del
laboratorio clnico, realiza calladamente una labor extraordinaria en beneficio de todo el
personal tcnico, el cual en muchos casos no es valorado en su justa medida.
Es importante recordar que al realizar cualquier procedimiento de limpieza y desinfeccin,
se deben tener presente las precauciones universales, los equipos de bioseguridad
requeridos y considerar todas las muestras como de alto riesgo. Concientes de la necesidad
de proporcionar una gua de limpieza, desinfeccin y esterilizacin para los compaeros
que realizan sta misin, ponemos a su disposicin el presente trabajo que rene una
revisin bibliogrfica de la literatura especializada y la opinin de expertos en la materia,
metodologas aplicadas en hospitales forneos y en otros casos recomendaciones
personales.
Factores que influyen en la velocidad de destruccin de los microorganismos
a) Temperatura:
Las temperaturas elevadas tienen efectos dainos sobre los microorganismos y se debe
tener en cuenta que cuando, adems de la temperatura, tambin se utiliza un agente
antimicrobiano, los incrementos en la temperatura aceleran la destruccin de los
microorganismos. Por ejemplo, la muerte de una suspensin bacteriana por fenol es mucho
ms rpida a 42C que a 30C.
b) Tipo de microorganismos:
Las especies de microorganismos difieren en su susceptibilidad a los agentes fsicos y
qumicos. En las especies formadoras de esporas, las clulas vegetativas son mucho
ms susceptibles que las formas esporuladas.
c) Estado fisiolgico de las clulas:
El estado fisiolgico de los microorganismos puede influenciar la susceptibilidad a un
agente antimicrobiano. Las clulas jvenes, metabolicamente activas, son ms fcilmente
destruidas que las clulas viejas cuando el agente acta interfiriendo con el metabolismo.
d) Ambiente.

Las propiedades fsicas y qumicas del medio o sustancia donde se encuentran los
microorganismos, tambin tienen una profunda influencia sobre la eficacia de la
destruccin microbiana, por ejemplo, el calor es mucho ms eficaz en materiales cidos que
en materiales alcalinos.
La consistencia del material influye notablemente en la penetracin del agente. La
presencia de material orgnico puede reducir significativamente la eficacia de un agente
qumico, ya sea inactivndolo o protegiendo de l a los microorganismos si estn presentes.
Limpieza de material reusable no contaminado
La limpieza se define como el proceso de remover, a travs de medios mecnicos y/o
fsicos, el polvo, la grasa y otros contaminantes de las superficies, equipos, materiales,
personal, etc. Este proceso, junto con un adecuado proceso de desinfeccin, es
indispensable para controlar la presencia de los microorganismos en el ambiente.
El primer paso del proceso de desinfeccin es la limpieza. La limpieza remueve restos de
tejido, moco, sangre, etc., que podran interferir con la accin del desinfectante.
Para realizar una limpieza adecuada se deben considerar el tipo de accin del agente
utilizado (remocin mecnica, disolucin o detergente), las condiciones requeridas para
aplicar la solucin limpiadora y el tiempo de contacto necesario para que sta ejerza su
efecto.
Los instrumentos con partes removibles debern desensamblarse de acuerdo con las
instrucciones del fabricante, para asegurarse que todas las superficies se expondrn al
procedimiento de limpieza.
Aproximadamente 99.8% del material orgnico puede ser removido con una limpieza
meticulosa. La limpieza puede ser acompaada de lavado manual o mecnico.
Cuatro tipos importantes de recipientes para productos potencialmente infectados :
Cestos o bolsas autoclavables de un solo uso para recibir cultivos y muestras.
Vasijas de un solo uso para recibir portaobjetos, pipetas Pasteur y pequeos artculos a
desechar.
Vasijas altas para pipetas graduadas (reusables).
Bolsas de plstico para materiales combustibles tales como cajas para muestras y
envoltorios que puedan estar contaminados.
Todos estos recipientes deben ir a la seccin de limpieza y esterilizacin para el tratamiento
final y esterilizacin de aquellos potencialmente contaminados.
Eleccin del recipiente :
Las vasijas de desechos deben ser fuertes y esterilizables por autoclave y los
recipientes ms adecuados son los bocales de 1 litro de polipropileno o los tarros del

mismo material con tapa a rosca. Son suficientemente profundos para mantener
sumergidas la mayora de las cosas que es probable se desechen, son irrompibles y
resisten muchas esterilizaciones por autoclave. Son mejores los tarros de
polipropileno con tapa a rosca, ya que pueden cerrarse despus de su uso, invertirse
para asegurar que el desinfectante est en contacto con el material.
Un recipiente de desecho de 1 litro debe contener 750 ml de desinfectante diluido,
dejando espacio para que ascienda el nivel sin que se derrame ni que gotee cuando
se traslade.
Nunca deben aadirse grandes volmenes de lquido a los desinfectantes diluidos.
Lquidos tales como los sobrenadantes de la centrifugacin, deben verterse en
vasijas de desecho, que contienen el volumen usual de desinfectante puro, a travs
de un embudo adaptado en la parte superior de la boca. Esta disposicin impide se
derramen gotas y se formen aerosoles.
No debe agregarse a los desinfectantes artculos que contengan grandes cantidades
de protena, sino que deben desinfectarse en el autoclave o incinerarse.
Ningn material debe dejarse en el desinfectante de la vasija de desecho durante
ms de 24 horas, ya que en caso contrario se desarrollarn las bacterias
supervivientes. Por tanto, todas las vasijas deben vaciarse una vez al da, aunque es
una cuestin particular s se hacen al final del da o a la maana siguiente.
Las vasijas para las pipetas recuperables deben estar hechas de polipropieno o de
goma. Son de mayor seguridad que el vidrio. Las vasijas deben ser suficientemente
altas para permitir que las pipetas se sumerjan totalmente sin que se derrame el
desinfectante. Debe aadirse al desinfectante un detergente compatible para facilitar
la limpieza de las pipetas en la fase final.

El agente seleccionado de limpieza deber:

1. Ser capaz de remover tejido orgnico.
2. Capaz de prevenir depsitos flotantes.
3. Con baja formacin de espuma.
4. Capaz de ser enjuagado completamente.
5. Compatible con los materiales que estn siendo limpiados.
Los detergentes enzimticos estn especficamente diseados para penetrar y desbaratar
las protenas y la materia orgnica..
Enjuague y secado:
Despus de la limpieza los instrumentos que se desinfectarn debern ser
enjuagados vigorosamente para remover cualquier residuo de detergente.
Hay que secar cuidadosamente cada instrumento usando aire para secar orificios y
ranuras pequeas para prevenir la dilucin del desinfectante.

 Desinfeccin
De acuerdo a su definicin, la desinfeccin se emplea cuando se tratan los
instrumentos de uso mdico, utensilios, paredes y pisos de las habitaciones de los
enfermos, etc., con el propsito de evitar una posible infeccin. Para realizar este
proceso se usan agentes qumicos (desinfectantes) o procesos fsicos como el calor.
Sanitarizacin usualmente se refiere al proceso empleado para reducir el contenido
de microorganismos viables remanentes en una superficie limpia. En la industria se
emplea este trmino cuando se tratan, con agentes qumicos o fsicos, las reas
de produccin y los equipos empleados en la elaboracin de productos, con el
propsito de reducir el contenido microbiano hasta niveles insignificantes.
Limpieza de Equipos : El personal de limpieza y desinfeccin tambin ser
responsable de la limpieza de los equipos de laboratorio, tales como las
refrigeradoras, autoclave ( reas no tcnicas ), hornos, etc , lo cual debe realizarse al
menos una vez al mes y en coordinacin con los jefes de cada seccin del
laboratorio.

FLUJOGRAMA DE TRABAJO EN LA DESINFECCIN Y ESTERILIZACIN DE

MATERIALES DE LABORATORIO

ESTERILIZACIN
Proceso mediante el cual se eliminan todas las formas de vida de los microorganismos de
un objeto o de una sustancia para evitar su reproduccin.
ASEPSIA: Libre de microorganismos.
MICROORGANISMOS
Microorganismo, ser vivo que slo se puede observar utilizando microscopios pticos o
electrnicos. Los microorganismos se clasifican en:
Las bacterias y cianobacterias (o algas verde azuladas) pertenecen al reino Mneras.
Son organismos con clulas procariticas y presentan una gran variedad de formas
de vida.
Los hongos y las levaduras, son microorganismos que pertenecen al reino Hongos.
Estos seres tienen una gran importancia econmica por el uso industrial en la
fabricacin de antibiticos y productos alimenticios como el pan o el vino, o por las
prdidas que producen al descomponer alimentos.
Los virus son un tipo de microorganismo peculiar. No tienen metabolismo y son
parsitos intracelulares que causan un gran nmero de enfermedades en las

personas, los animales y las plantas. Y por ltimo los parsitos, los cuales viven a
expensas de otros microorganismos.

MTODOS DE ESTERILIZACIN
Comprende todos los procedimientos fsicos, mecnicos y preferentemente qumicos, que
se emplean para destruir grmenes patgenos. A travs de esta, los materiales quirrgicos y
la piel del
enfermo
alcanzan
un
estado
de
desinfeccin
que
evita
la contaminacin operatoria. Hay varias formas de esterilizar como:
MTODOS QUMICOS
Estos mtodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos.
Hipoclorito de Sodio: Es el ms utilizado por su fcil adquisicin y por su
efectividad en la desinfeccin. Vida media 20 minutos.
xido de etileno: Destruye todos los microorganismos incluso virus.
Aldehdos: Son agentes alquilantes que actan sobre las protenas. Estos
compuestos destruyen las esporas.
Glutaraldehdo: Este mtodo tiene la ventaja de ser rpido y ser el nico
esterilizante efectivo fro.
Formaldehdo: Las pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36
horas.
Gas-plasma de Perxido de Hidrgeno: Es proceso de esterilizacin a baja
temperatura la cual consta en la transmisin de perxido de hidrgeno en fase
plasma.
Alcohol: Esteriliza superficies, pero se evapora fcilmente.
MTODOS FSICOS
Calor: La utilizacin de este mtodo y su eficacia depende de dos factores:
el tiempo de exposicin y la temperatura. Todos los microorganismos son
susceptibles, en distinto grado, a la accin del calor. El calor provoca
desnaturalizacin de protenas, fusin y desorganizacin de las membranas
y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos.
Calor Hmedo: El calor hmedo produce desnaturalizacin y coagulacin de
protenas.
-Autoclave
El Autoclave es el aparato ms comnmente utilizado en los laboratorios para
esterilizar cultivos y soluciones que no se desnaturalicen a temperaturas mayores a
100C. Una temperatura de 121 C ( 15 Lbs de presin) con un tiempo
de exposicin de 15 minutos sirve para destruir microorganismos, incluso los
formadores de esporas.

 Calor seco: El calor seco produce desecacin de la clula, es esto txico por niveles
elevados de electrolitos, fusin de membranas.
-Estufas
-Hornos
Doble cmara, el aire caliente generado por una resistencia, circula por la cavidad
principal y por el espacio entre ambas cmaras, a temperatura de 170 C para el
instrumental metlico y a 140 C para el contenido de los tambores.
Radiaciones: Su accin depende de:
o El tipo de radiacin
o El tiempo de exposicin
o La dosis
o
-Rayos Ultravioletas: Afectan a las molculas de DNA de los microorganismos. Son
escasamente penetrantes y se utilizan para superficies, se utilizan para la
esterilizacin en quirfanos.
-Rayos Gamma: Su empleo esta basado en los conocimientos sobre la energa
atmica. Filtracin: Se usan membranas filtrantes con poros de un tamao
determinado. El tamao del poro depender del uso al que se va a someter la
muestra.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS MTODOS

MTODOS FSICOS:
-Calor Hmedo:
Autoclave

Ventajas del calor hmedo:

Rpido calentamiento y penetracin.
Destruccin de bacterias y esporas en corto tiempo.
No deja residuos txicos.
Hay un bajo deterioro del material expuesto.
Econmico.

Desventajas del Calor Hmedo:

No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua.
Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metlicos.
Materiales que se pueden esterilizar con vapor:
- Material textil - Material de vidrio- Material de goma- Instrumental quirrgico de acero
inoxidable- Soluciones acuosas - Todo aquel material cuyo fabricante certifique pueda ser
esterilizado por vapor.
Materiales que no se pueden esterilizar con vapor:
- Sustancias oleosas- Sustancias grasas- Polvos- Instrumental quirrgico cromado o
niquelado- Artculos elctricos sin cobertura especial- Todo material que no tolera la
exposicin al calor y a la humedad.
-Calor seco:
Horno

Ventajas del Calor Seco:

-No es corrosivo para metales e instrumentos.
-Permite la esterilizacin de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no
voltiles.
Desventajas del Calor Seco:
Requiere mayor tiempo de esterilizacin, respecto al calor hmedo, debido a la baja
penetracin del calor.
Materiales que pueden esterilizarse por calor seco.
Instrumental quirrgico cromado- Materiales de vidrio, aluminio o porcelana- Aceites,
parafina, sustancias grasas, vaselina- Polvos (talco).
Materiales que NO se pueden esterilizar por calor seco
- Material textil (algodn, sedas, lino, etc.)
- Gomas - Materiales sintticos - Todo material que se altere a la temperatura trabajo.
Temperatura
La temperatura de esterilizacin por Calor Seco deber estar entre 160 C 170 C.
Tiempos

El tiempo de exposicin del material se determina mediante la correspondiente validacin

del ciclo.
El material a esterilizar se deber cargar con el esterilizador fro, teniendo en cuenta las
siguientes recomendaciones:
Cada unidad deber quedar separada de las vecinasLos materiales no debern estar en
contacto con las paredes, piso y techo del esterilizador. La carga del esterilizador ser
homognea y no deber superar el 80% de la capacidad total de la cmara
MTODOS QUMICOS:
La efectividad de estos agentes depende de las condiciones bajo las que actan:
-Concentracin: vara con el tipo de agente y de microorganismo, pues una misma
concentracin del agente puede producir un efecto diferente en distintos microorganismos.
-Tiempo: Los microorganismos no son susceptibles a un agente en la misma forma, por lo
que no todos los microorganismos mueren al mismo tiempo.
-pH: el pH determina el grado de disociacin y la efectividad del agente qumico, pues a
menor disociacin, mayor permeabilidad y mayor efectividad.
Listado de Desinfectantes (agrupados por su radical qumico)
Compuestos Fenlicos:
Colorantes:
Fenoles
Azul de metileno
Cresoles
Giemsa
Alcoholes:
Acridina
Etlico
Metales Pesados:
Isoproplico
Bicloruro de mercurio
Halgenos:
Nitrato de plata
Yodo
Vapores y Gases:
Cloro
Formaldehdo (2 5 %)
Oxidantes:
Ozono (O3)
Perxido de hidrgeno
Oxido de etileno
Permanganato de potasio
Glicol.

cidos:

Resumen de un ciclo esterilizacin en autoclaves:

cido actico (1%)

cido brico

1. Se abre la vlvula de admisin de vapor a la camisa precalentando la cmara.

2. Al terminar de salir el aire de la camisa, se abre la vlvula que comunica camisa y
cmara permitiendo la entrada de vapor a la cmara.
3. Cuando el vapor ocupa totalmente la cmara y el termmetro marca la temperatura
establecida empieza el ciclo de esterilizacin.
4. Al terminar el ciclo se expulsa el vapor de acuerdo a necesidades: lentamente si se
trata de lquidos para evitar una descompresin rpida o rpidamente si se trata de
otras cargas.
5. Una vez expulsado el vapor se abre la vlvula que comunica la camisa con
la atmsfera. Se produce presin negativa y se realiza el secado por medio de la
succin de aire en la cmara.
En los autoclaves de desplazamiento por gravedad que son los primeros modelos
fabricados, el tiempo de penetracin es prolongado por una incompleta penetracin de aire
y por lo tanto los tiempos de esterilizacin tambin son mayores. En la actualidad an
cuando funcionan con el mismo principio, facilitan su operacin y aumentan el nivel de
seguridad por medio de la incorporacin de controles automticos, bomba de vaco
y microprocesadores.

Etapas del ciclo de esterilizacin por calor seco :

1. Colocar el material dentro del Esterilizador
2. Encender el Esterilizador
3. Verificar que los instrumentos de control de ciclo, tiempo y temperatura se
encuentren en la posicin correcta
4. Esperar hasta que los instrumentos de medicin registren la temperatura
seleccionada para el ciclo
5. Cuando se alcance la temperatura seleccionada, se comenzar a descontar el tiempo
de esterilizacin
6. Cumplido el tiempo de exposicin se apagar el Esterilizador
7. La descarga del Esterilizador se efectuar una vez que el material se haya enfriado
Precauciones
Durante el ciclo de Esterilizacin no deber abrirse la puerta del Esterilizador porque ello
implicara abortar el ciclo, debiendo en este caso recomenzarlo.

DEFINICIONES
a) Esterilizacin : Proceso que destruye toda forma de vida microbiana. Un objeto estril
(en sentido microbiolgico) est libre de microorganismos vivos.

b) Desinfeccin : Es la destruccin, inactivacin o remocin de aquellos microorganismos

que pueden causar infeccin u ocasionar otros efectos indeseables; la desinfeccin no
implica necesariamente esterilizacin.
c) Desinfectante : Agente usualmente qumico, que mata las formas en crecimiento de los
microorganismos, pero no necesariamente las esporas. El trmino se refiere a sustancias
utilizadas sobre objetos inanimados.
d) Antisptico : Sustancia que impide el crecimiento o la accin de los microorganismos,
ya sea destruyndolos o inhibiendo su crecimiento y actividad. Se aplica sobre superficies
corporales.
e) Sanitarizante : Agente que reduce la poblacin microbiana a niveles seguros, segn los
requerimientos de salud pblica. Se aplica en objetos inanimados de uso diario, por ejemplo
utensilios y equipos para manipular alimentos, vasos, platos y otros objetos de uso similar.
f) Germicida : Agente que mata a los microorganismos, pero no necesariamente a sus
esporas.
g) Bactericida : Agente que mata a las bacterias.
h) Bacteriosttico : Agente que inhibe el crecimiento de las bacterias, mientras permanece
en contacto con ellas.
i) Fungicida : Agente que mata los hongos.
j) Fungisttico : Agente que inhibe el crecimiento de los hongos, mientras permanece en
contacto con ellos.
k) Virucida : Agente que destruye los virus.

TCNICAS DE TINCIN. FUNDAMENTOS

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver
con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la
clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la
utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos
diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes
celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de
actividad respiratoria, etc.

 Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de

teirlas, proceso llamado fijacin.
Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede
fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de
la fijacin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales
en el protoplasma.
La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el
contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que son realmente, de
manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden
realizarse con mucha precisin.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad
especfica por los materiales celulares.
Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada
con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se
denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido tnico. El mordiente se
combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr
atacar el colorante.Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas
para la microscopa, son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul
de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas
bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los
detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en
muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie.
La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se
dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por
tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un
material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que
simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de
particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en
agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las
clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la
presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas.
Preparacin de un frotis
Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a
teir o se hace rodar el hisopo con que se tom la muestra.. Puede usarse una aguja estril

para transferir una pequea cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del

portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o solucin salina
previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se trata de colonias muy pequeas que
pueden perderse en una gota de lquido se emplea una varilla delgada de madera estril con
la cual se toca la colonia obtenindose as una fraccin apreciable del desarrollo. El
material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad.
El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por
la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta que el vidrio est tan caliente que
moleste al tacto pero no queme.
Examen de muestras al microscopio
Segn la manipulacin que efectuemos sobre la muestra a observar y segn los colorantes que
empleemos durante el proceso, podemos hablar de diferentes modalidades de tincin.

Examen microscpico directo de las muestras clnicas - Sin Tincin

No se utiliza ningn tipo de colorante.
Es el montaje directo hmedo o examen en fresco: las muestras se extienden directamente
sobre la superficie de un portaobjetos para su observacin. El material que es demasiado
espeso para permitir la diferenciacin de sus elementos
puede diluirse con igual volumen de solucin salina
fisiolgica estril. Se deposita suavemente un
cubreobjetos sobre la superficie del material.
Este tipo de preparacin se emplea para detectar
trofozotos
mviles
de
parsitos
intestinales
como Giardia, Entamoeba, huevos y quistes de otros
parsitos, larvas y gusanos adultos, Trichomonas, hifas de hongos, etc
En la imagen: Candida sp en un examen en fresco.
Examen microscpico de las muestras clnicas levemente modificadas - Tincin Simple
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien con la misma
tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).
El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de KOH) permite ver elementos de hongos ya
que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la clula
husped, pero no acta sobre los polisacridos de las paredes celulares de los hongos. La
tinta china o Nigrosina permite observar clulas levaduriformes capsuladas (Cryptococcus),

sobre todo en LCR. Los polisacridos capsulares rechazan

la tinta china y la cpsula aparece como un halo claro
alrededor de los microorganismos.
En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tincin
con tinta china.

Examen microscpico de las muestras clnicas muy modificadas - Tincin Diferencial

Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en
funcin de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo
con su propia constitucin qumica.Los ejemplos clsicos
sera la tincin de GRAM o la de Ziehl-Neelsen
En la imagen: BGN y levaduras en una tincin GRAM
Examen de muestras al microscopio: la tincin GRAM
La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms
importantes en el laboratorio bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar
perfectamente familiarizado. Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo
microscpico de rutina del Laboratorio de Microbiologa las referencias a la morfologa
celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos,etc) se basan justamente en la
tincin de GRAM
Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis fijado con
calor se tie 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada
durante 1 min y se lava de nuevo con agua, decolorar con
mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y cubrir con
Safranina (color de contraste) durante 20 seg. Lavar y
secar.
Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las
bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y
gramnegativas (en este caso, los trminos positivo y
negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino
simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias).
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a
las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula

bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis
osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el
peptidoglicano. La pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas
interconectandas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%90% de la pared de la clula gram-positiva es peptidoglicano.
Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales
de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con algn detalle la tincin
de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqu de su
funcionamiento.
Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de
cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para
quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las grampositivas
como las gramnegativas, estn teidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente
activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I 2 en agua. El I2 entra en las clulas y
forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas
grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situacin.
Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus
de la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas, mientras que las
grampositivas permanecen azules.
Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:
1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s
solo tiene poca afinidad con las clulas.
2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las
clulas grampositivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo
preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios.
3) Cultivos ms viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal
violeta - yodo.

Tincin GRAM: Morfologa Bacteriana

Ya hemos visto que la tincin de GRAM aporta dos ideas bsicas para la deficinin
"taxonmica" de las bacterias: el color que adquieren tras la tincin y la forma que
presentan las clulas bacterianas.
Microorganismos Gram-positivos; cuando aparecen teidos de color azul-violeta y de Gram
negativos; cuando se visualizan de color rojo-rosado.
Formas bsicas en que se puede visualizar la morfologa bacteriana en una tincin GRAM:
-

for
ma
esf
rica
: se
lla
ma
Coc
o

Cocos: Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular.

Diplococos, aparecen por pares. Estreptococoss, tienden a unirse formando
cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran
tamao

Divisin a lo largo
del mismo plano,
formando cadenas
cortas
2
4 - 20 en
cocos
cadenas:
juntos: Estreptoco
Diploc
cos
ocos

Divisin a
lo largo de
2 planos
diferentes:
Ttradas

Divisin a lo largo de
3 planos

regularme
nte:
Sarcinas

irregular
mente:
Estafiloc
ocos

Bacilos :grandes variaciones morfolgicas: fusiformes, estreptobacilos,

Forma de
Dos bacilos
vara: se
juntos:
llaman
Diplobacilos
Bacilos
cocobacilos

Cadenas de
bacilos:
Estreptobacilos

Empalizadas,
Bacilos lado con
lado o en figuras
en X, V o Y

Espirales (Treponemas, Borrelias ...)

Forma espiral
rgida se llama:
Espirilo

Si la espiral es flexible y
ondulada se llama:
Espiroqueta

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Positivas

-

Cocos Gram-positivos

Racimos:
forma
tpica
Cadenas:
de Staphylococcus sp, como S. aureusforma
tpica
de Streptococcus sp,
como S.
pneumoniae, Strepto
Tetradas: forma coccus grupo B
tpica
de Micrococcus sp

Bacilos Gram-

Finos: forma tpica de Listeria sp

Gruesos: forma tpica de Clostridium sp,

como C. perfringens, C. septicum

positivos

Ramificados:
forma
de Actinomycetes y Nocardia,
israelii

tpica
como A.

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Negativas

-

Cocos Gram-negativos

Diplococos: forma usual de Neiseria sp,

como N. meningitidis
Tambin Moraxella
sp y Acinetobacter
sp aparecen con morfologa de diplococos.
Acinetobacter puede ser pleomrfico, y a veces
aparece como coco Gram-positivo.

Cocobacilos: forma usual de Haemophilus

sp, como H. influenzae

Bacilos
finos:
forma
usual
enterobacteriaceae, como E. Coli

Curvados: forma usual de Vibrio

como V. cholerae, y Campylobacter
como C. jejuni

de

sp,
sp,

Bacilos Gramnegativos

Otras tinciones de uso habitual

RODAMINA-AURAMINA
Los cidos miclicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los
fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen
de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio,
empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecfica. Todos los microorganismos
cido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parsitos, se tien con estos
colorantes.
Un aspecto importante de la coloracin rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden
ser reteidos con la coloracin de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tincin
con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersin. De esta forma, los resultados
positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que adems permiten
la diferenciacin morfolgica.
NARANJA DE ACRIDINA
El fluorocromo naranja de acridina se une al cido nucleico ya sea en su forma nativa o
desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la
fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentracin. El naranja de
acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el
microorganismo est vivo y roja si est muerto. De todos modos, como el colorante se
intercala en el cido nucleico, el germen viable se inactivar poco tiempo despus de la
tincin.
El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha
sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la
tincin de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego
para la deteccin inicial de hemocultivos positivos.
ZIEHL-NEELSEN (BAAR)
Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos
miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de
resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por

esto se denominan cido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M.

marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus
propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere
calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.
El frotis se tie durante unos 5 min con Carbolfucsina aplicando calor suave. Lavar con
agua. Decolorar con alcohol etlico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teir
durante 30-60 seg con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar
BLANCO DE CALCOFLOR
Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflor aumentando
considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Segn fue descrito por
Hageage y Harrington, este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen
inicial de los materiales clnicos. Tambin se emplea para aumentar la visualizacin de los
elementos morfolgicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratoros ha
suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz
blanco-azulada o verde manzana, segn la fuente luminosa que se utilice.
TINCIN DE ESPORAS (WIRTZ-CONKLIN)

Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su
interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las
condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas
extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose una espora por cada forma
vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la
espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una
nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. Algunas de las
bacterias productoras de endosporas son patgenas para el hombre, por lo que su estudio y
observacin son de enorme inters.

FUNDAMENTO
Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los
factores ambientales adversos. Adems, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en
el microscopio ptico como estructuras refringentes y de difcil tincin.
La tincin especfica de esporas requiere dos colorantes:
1.- Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente.
2.- Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas.
Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado
con agua, y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo
colorante.
REALIZACIN
Se emplearn cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan las
esporas. Esta tincin es delicada en su realizacin y para poder obtener unos resultados
satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las instrucciones.
1.

Preparar los frotis bacterianos indicados.

2.
Teir con verde malaquita.
Con unas pinzas de madera colocar
la muestra encima de la llama del
mechero de forma que el colorante
humee durante 5 min.
Nota: evitar que la
muestra hierva. Aadir ms
colorante si ste se evapora; es
importante que la muestra no se
seque.
3.
Lavar con abundante agua el
exceso de colorante.
4.

Teir con safranina 1 min.

5.
Lavar con abundante agua el
exceso de colorante.
6.

Secar la preparacin.

7.
Observar la preparacin al
microscopio. Anotar la disposicin y
la morfologa de las tres especies del gnero Bacillus.

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

La posicin y la morfologa de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un
carcter taxonmico til para diferenciar especies dentro de un mismo gnero.
Las tres bacterias empleadas en esta prctica difieren en la disposicin y morfologa de las
endosporas. B. sphaericus posee una endospora esfrica con localizacin terminal y
deformante de la clula vegetativa, por lo que suele ser denominada "en palillo de
tambor". B. thuringiensis tiene localizada la endospora elipsoidal en el centro de la clula

vegetativa, lo que provoca un abombamiento caracterstico denominado "en huso". B.

subtilis forma una espora cilndrica subterminal no deformante.