FACULTAD DE

RECURSOS
NATURALES Y
MEDIO AMBIENTE
I

Docente:
Alejandro Canaza Jorges
Contacto:
canaza.a@gmail.com
70373261

BIOLOGA
MOLECULAR

PCR
Aplicaciones

Polymerase Chain Reaction (PCR):

Desarrollada por Kary Mullis
en 1980.

Revolucion la genetica
molecular.
PCR produce enorme
numero de copias de una
secuencia especifica de DNA
Descubrimiento de Taq
DNA polimerasa permite
automatizar la PCR

Elementos bsicos de
una reaccin de PCR

Muestra (que contiene ADN)!!

Buffer de reaccin
dNTPs
Primers!!
Enzimas
agua

Cul es nuestra muestra?

Un trozo de rgano
Un hisopado
Secreciones
Sangre
etc

Como tratar la muestra para

obtener el acido nucleico?
Materiales para la
extraccin de ac. nucleico
de la muestra
Pipetas
Buffers de lisis para
extraccion de ac. nucleico
Tubos eppendorf,
Kit de PCR

Componentes de la
reaccin
Puesta a punto de la reaccin
Muestra de ADN
101 106 molculas
Buffer 10x
suministrado con el kit
Cl2 Mg
1.5 mM
dNTPs
50uM c/u (2uM-50uM)
Primer
20pmol c/u
Taq
0.5-2 Unidades

Muestra de ADN (molde)

Debe calcularse cuidadosamente la concentracin inicial de ADN
molde aadido a la reaccin.
El exceso de ADN reduce el rendimiento de la PCR (inhibicin por
sustrato) y puede aumentar la cantidad de productos
inespecficos.
Como regla general se debe utilizar entre 102 y 104 copias del molde.
El rango de concentraciones debe estar entre:
0.01 -1 ng para ADN viral
0.1 -1 g para ADN genmico.
En un volumen total de reaccin de 100 l.

Muestra de ADN
Se pueden utilizar la mayora de mtodos habituales de
purificacin para la obtencin de ADN molde.

Cantidades mnimas, incluso traza, de los reactivos de

purificacin (por ejemplo, fenol) inhiben la actividad de la
DNA polimerasa.
La precipitacin con etanol y lavados con etanol al 70 %
suele ser eficaz en la eliminacin de estos inhibidores.
Los kits comerciales permiten la purificacin de altas
cantidades de ADN, con un alto grado de pureza y libre
de inhibidores.

Muestra de ADN
La cantidad por reaccin deber ser 101 106

molculas
1ug ADN humano
1 ul sangre humana
30ul semen
10ng levadura
1ng E. Coli ADN

1 x 105 molculas
7.5 x 104 molculas
3 x 105 molculas
3 x 105 molculas
1.5 x 105 molculas

Muestra de ADN
Muy poco

Demasiado

Concentracin de Magnesio
El Mg+2 es necesario para catalizar la elongacin
de las DNA polimerasas.
Una concentracin baja de iones Mg+2 disminuye el
rendimiento de amplificacin.
Una concentracin excesiva de iones Mg+2 puede
causar la obtencin de productos inespecficos y
disminuir la fidelidad del producto de PCR.
Por tanto, debe calcularse la concentracin ptima
de MgCl2 para cada PCR.

Concentracin de Magnesio
El Mg+2 forma complejos con los cidos nucleicos
(molde, producto y primers) disminuyendo la eficiencia.
La presencia de agentes quelantes en la solucin de ADN
molde (ej. EDTA) disminuye la concentracin de MgCl2.

Los dNTPs tambin quelan el MgCl2, ya que forman

complejos solubles con los iones Mg+2.
En el caso que las concentraciones recomendadas de
MgCl2 no den un rendimiento ptimo, se debe optimizar
la concentracin de forma emprica:
Comenzando desde 1 mM, y subiendo en pasos de 0.2
mM, hasta obtener un resultado satisfactorio.

Concentracin de Magnesio

Concentracin de Magnesio
PCR deber contener entre 0.5 y 2.5 mM

de Cl2 Mg
La concentracin de Mg puede influenciar
en:
ADN target
Annealing
Especificidad y cantidad del producto
Incremento de la sensibilidad
Actividad de la enzima

Deoxinucleotido trifosfatos
(dNTPs)
Habitualmente se emplea una concentracin final de 200
M de la mezcla de los dNTPs.
La concentracin de dNTPs depende indirectamente de la
concentracin de MgCl2.

Es fundamental tener una concentracin equimolar de los 4

dNTPs.
El desequilibrio en la concentraciones disminuye el
rendimiento y favorece la incorporacin errnea.

Deoxinucleotido fosfatos
(dNTPs)
Cuando se requiere mxima fidelidad de copia, la
concentracin final de dNTPs debe estar en el
rango de 10-50 M.
Tambin debe utilizarse enzimas con actividad exo 3'5' (proof-reading).

Bajas cantidades de dNTPs incrementan la

especificidad y fidelidad de la PCR

Deoxinucleotido fosfatos
(dNTPs)

Qu son los primers?

Son oligonucletidos de entre 18 y 24 bases
complementarios a los extremos del ADN a amplificar

PRIMERS
INS1:5CGTGAGGGCATCGAGGTGGC
INS2: 5 GCGTAGGCGTCGGTGACAAA

La eleccin de primers normalmente es el factor ms crtico

a la hora de disear una PCR.
Los primers suelen tener un tamao de 18 a 25 nt (aunque
pueden llegar a los 40 nt).
El contenido en GC debe estar alrededor del 40-60 % y
distribuido de forma regular.
Al menos 3 nucletidos conservados en el extremo 3'
Es beneficioso tener zonas ricas en GC localizadas en el
extremo 3'.
La temperatura de annealing del par de primers debe ser
similar (con un mximo de 5 C de diferencia).

Primers
La concentracin de primers deber ser de entre 0.1 y

0.5 uM. Concentraciones mayores favorecen el

mispriming..
en los extremos 3: evitar complementariedad (primerdimer) y tambin 3 o ms Cs o Gs juntas producen
mispriming en regiones ricas en GC
Evitar secuencias palindrmicas

Primers
Se pueden disear primers para que los extremos

5 pueden contener:
Sitios nicos para enzimas de restriccin
CCATGG para incrementar la traduccin
Secuencias promotoras o mismatches internos
para estudios de mutagnesis

Annealing del Primer

Temp de annealing se selecciona por 4-5 C

debajo de la verdadera TM
Para mejores resultados usar un rango de entre
55-72C
El annealing requiere solo unos pocos segundos
cuando se utilizan adecuada concentracin de
primers y T
Exigente T de annealing aumenta la
especificidad y reduce la misextension

Extensin del Primer

La extensin del amplicn depende de el largo

de la secuencia blanco y de la T de la
reaccin
T cercanas a los 72 son las ptimas para la
mayora de las polimerasas
% de incorporacin: 35-100 nuc/seg
1min/72= 2Kb
Un ltimo ciclo largo para asegurar que todos
los amplicones tienen el tamao adecuado

ADN polimerasa Termoestable

Llevan a cabo la sntesis de ADN dependiente del templado.
Las ms comunmente usadas son:
Taq (Thermus aquaticus)
Pfu (Pyrococcus furiosus)
Tli (Thermococcus littoralis)
Tfl (Thermus flavis)
Tth (Thermus thermophilus)
Estabilidad Taq: 9 min at 97C, Pwo >2 hr a 100C
Fidelidad Taq: baja, Pfu: alta
Algunas presentan actividad transferasa terminal en el
extremo 3(Pwo y Tli generan extremos romos)

ADN polimerasa Termoestable

Concentracin recomendada: 0.5-2 Unidades
Poca enzima resulta en poco o insuficiente

producto.
Mucha enzima resulta en producto no
especfico
Sin embargo, si hay inhibidores presentes en la
mezcla de reaccin puede ser necesario utilizar
hasta 4-5 unidades de enzima.

ADN polimerasa Termoestable

La BSA en concentraciones por encima de 0.8

g/l incrementa la eficiencia de la PCR
(captura iones que pueden ser inhibidores de la
polimerasa).
Glicerol: Aumenta estabilidad trmica de la Taq
pero disminuye la TM.
DMSO: Disminuye la TM y la estabilidad
trmica de la Taq.

La fidelidad de la Taq es influenciada por

mltiples
factores
incluyendo
la
tendencia de la polimerasa a insertar
nucletidos equivocados debido a la
falta de actividad de exonucleasa 3- 5

Nmero de
ciclos
Normalmente 25-35 ciclos son suficientes en

una reaccin tpica

Desnaturalizacin: 94 C 20 seg (para ADN
genmico un poco mas larga)
Primer annealing: 55 C 20 seg
Primer extensin: 72 C 1min
Extensin final 72 5 min
Demasiados ciclos incrementan el background
no especfico

Tiempo y T de
desnaturalizacin

94 C por 20 seg o 97 C por 15 seg

Largo de fragmento/tiempo de elongacin
6Kb/4min, 10Kb/8min, 20Kb/15min
Regiones ricas en GC requieren T + altas pues
la desnaturalizacin incompleta permite que el
ADN se vuelva a cerrar
Vida media de la Taq: 72hs a 92 C, 40 min a
95 C y 5 min a 97 C

Optimizar el nmero de ciclos de PCR es la

mejor forma de evitar la amplificacin
inespecfica de productos, ya que las bajas
concentraciones de productos cortos e
inespecficos en los primeros ciclos
competir preferencialmente con el
producto deseado

Misincorporacin, background
y poca cantidad de producto

La misincorporacin es promovida por:

Baja concentracin de dNTPs
Concentracin desbalanceada de dNTPs
Alta concentracin de dNTPs
Background
Mucho primer
Mucha enzima
Baja T de annealing

Baja cantidad de producto

T de annealing incorrecta
Tiempo de extensin muy corto
Cantidad limitada de enzima
Inadecuada [Cl2 Mg]

Fidelidad de la Taq
Tasa de error de la Taq es de 1 error en
400 bases luego de 25 ciclos

Reaccin bsica
Reactivo

Concentracin final

Buffer enzima 10X

10 mM dNTP Mix
Primer 1
Primer 2
DNA Polimerasa
50 mM MgCl2
DNA molde
Agua bidestilada estril

1X
0.2 mM
10 pmol
10 pmol
1U
1-4 mM
10 pg - 1 g
c.s.p. 50ml

Una vez preparada la mezcla se recomienda agitarla y

centrifugarla.

Para termocicladores sin tapa calefactora, se debe

aadir una gota de aceite mineral o parafina.

Desnaturalizacin
Como el ADN sintetizado de novo es habitualmente de
menor tamao que el ADN molde, es suficiente con 30
seg-2 min a 94-95 C de desnaturalizacin.
Para productos con alto contenido en GC, el tiempo de
desnaturalizacin puede ser de hasta 3-4 min.
La desnaturalizacin se puede favorecer agregando:
Glicerol (hasta 10-15 % volumen)
DMSO (hasta el 10 %)
Formamida (hasta 5 %).

Pero, estos aditivos modifican la temperatura de annealing

(debe ser optimizada nuevamente).
El DMSO y la formamida pueden llegar a inhibir la enzima
en un 50 %.

El Ciclador
El Termociclador es
programable.
Existen varios
modelos
El nmero de ciclos
vara entre 30 y 40

Pasos de la PCR:

Before
cycles
cycle
5
Before
cycle
43

Antes del ciclo 30

Visualizacin del
Producto
Consta de dos
procedimientos:
Electroforesis en geles
de Agarosa
Fotografiado o captura
digital

Fotografiado
Pelcula Polaroid o

Captura digital de Imgen

Interpretacin
Lnea 1: Marcador
Lnea 2: Control (-)
Lnea 3: Control (+)
Lnea 4 ,5, 6 y 7
Muestra 1, 2, 3 y 4.
Lnea 8: Marcador

1 2 3 4 5 6 7 8

Verificacin de la especificidad del producto

de PCR por
medio de electroforsis en gel de Agarosa

Otros:
RFLP
Sonda

Diferentes tecnicas de PCR :

Standard PCR
RT-PCR. Transcriptasa Reversa: amplificacion de
RNA
Nested PCR : Amplifica un segmento usando dos
pares de primers (externos e internos).
Long template PCR: Amplifica segmentos largos de
DNA. Usa una mezcla de Taq y Pwo DNA polimerasa
Hot start PCR: Reduce la amplificacion no especifica
desactivando la enzima.
PCR Cuantitativa : monitoreo de la reaccion en
tiempo real-Real-time

Aplicaciones de la PCR :

Detectar infeccin viral o bacteriana: FMD, HIV,

tuberculosis...
Secuenciar DNA (Human Genome Project)
Estudios de evolucin: PCR puede analizar genes
de DNA
Monitoreo de terapia del cancer : PCR puede
detectar 1 celula cancerosa en 10e+6 celulas normales
Detectar mutaciones: mutacion en oncogen RAS
para detectar cancer
Determinar el Sexo en celulas pre-natales :
machos poseen secuencia unica en el cromosoma Y

Aplicaciones de la PCR :
Medicina
forense:
Criminologia
Identif Cuerpo.
test de
Paternidad

Aplicaciones de la PCR :
Secuenciacion de DNA :

Sanger descubre un mtodo

basado en dideoxy (ddNTP), falta
un atomo de O requerido para
extender la cadena de DNA.
Metodos de Deteccion :
Metodo de Sanger
ddNTPs marcados Radioactiva//

ddNTPs marcados fluorescente//