Reporte Final Equipo 5

Instituto Tecnolgico de Colima
Ingeniera Bioqumica
Materia: Microbiologa
Docente: Dr. Francisco Javier Delgado Virgen
Villa de lvarez, Colima. 25/07/2016
Contenido:
Objetivo.............................................................................................................................3
Introduccin......................................................................................................................3
Materiales y Mtodos..5
Protocolos generales de esterilidad..5
Siembra y preparacin de muestras5
Por picadura o puncin...5
Por estra por agotamiento..5
Recoleccin de muestras..6
Disolucin de muestras ....6
Tinciones...6
Tincin diferencial de Gram....6
Tincin de Schaeffer-Fulton.7
Medios ....7
Agar nutritivo.7
Agar MRS..8
Agar ELLIKER..9
Pruebas..10
Agar triple azcar hierro: TSI...10
Citrato de Simmons...12
Medio MIO14
Medio MR-VP ..17
Reduccin de nitratos 18
Prueba de ureasa..21
Agar base sangre.....22
Agar E.M.B. ...23
1
Agar Sal y Manitol.25

Agar MAC CONKEY. 26
Resultados....................................................................................................................28
Discusin......................................................................................................................39
Referencias..................................................................................................................45
OBJETIVO:
Aislar y caracterizar bacterias comprendidas dentro del grupo de las BAL.
INTRODUCCION:
Son ampliamente distribuidas en diferentes ecosistemas, adems de generarse a gran escala
procesos para la produccin comercial de alimentos fermentados, bebidas alcohlicas, ensilados,
levaduras para la produccin de cerveza, vinos y bacterias cido lcticas (BAL) para la utilizacin en
vegetales, fermentaciones crnicas, queso, mantequilla, yogurt, salchichas, ensilajes, olivos, uvas y
cereales como pan y cerveza, preservando y proporcionando propiedades sensoriales y nutricionales a
los productos alimenticios.
Las BAL desempean un papel importante en los procesos de fermentacin; ellas son muy
utilizadas en la industria alimentaria, no solamente por su habilidad para acidificar y por lo tanto
preservar alimentos de las esporas, sino tambin su implicacin en la textura, sabor, olor y desarrollo de
aroma de alimentos fermentados.
El conocimiento de cultivos lcticos se origin en el siglo XVIII, cuando agricultores de frica, Asia
y Europa observaron el comportamiento de la leche cruda en los meses clidos. La leche coagulaba y
bajo estas condiciones presentaba un sabor diferente, en ocasiones agradable, entonces los campesinos
fueron seleccionando las de mejor sabor para inocular la leche al da siguiente. Las BAL vivas pueden
estar contenidas en un grupo de microorganismos llamados cultivos lcticos o iniciadores, se emplean en
la industria lctea para la elaboracin de leches fermentadas, quesos, mantequilla y otros productos que
para su obtencin requieren ser fermentadas. Se distinguen tres clases de cultivos: el cultivo inicial, el
cultivo madre, y el cultivo usual. Los cultivos estrter son puros, a partir de estos, se prepara el cultivo
madre, luego del cultivo madre se desarrolla el cultivo usual para ser empleado directamente en
procesos fermentativos.
Son un grupo de bacterias relacionadas que producen cido lctico como el principal metabolito
o nico producto de fermentacin; son microorganismos nutricionalmente exigentes los cuales son
capaces de hidrolizar pptidos de la leche. La concentracin de aminocidos libres en leche son muy
limitados, as el crecimiento sostenido de BAL depende de la produccin de proteinasas, peptidasas y
sistema de transporte de aminocidos y pptidos especficos. Adems de producir el cido lctico, las
bacterias acidificantes, llamadas tambin bacterias iniciadoras, contribuyen al sabor, aroma, textura y el
valor nutricional de alimentos fermentados a travs de la produccin de exopolisacridos (EPS) y
modificacin protenas, lo anterior debido a su actividad metablica sobre protenas, azcares y lpidos,
3
contribuyendo a la digestibilidad de alimentos y preservacin del producto final. (Waldir E., Mojmir R., et
al, 2007)
Este grupo est compuesto de un nmero de gneros incluyendo lactococcus, lactobacillus,
enterococcus, streptococcus, leuconostoc, y pediococcus.
Para la presente investigacin se encontr con el gnero lactobacillus son bacilos Gram positivos,
estn ampliamente distribuidos en diversos mbitos tambin se encuentran en distintos alimentos (p.
ej., productos lcteos, granos, comidas) en gran parte debido a su amplia gama de capacidades
fermentativas. Algunas especies de Lactobacillus se agregan ahora a alimentos como prebiticos, tal vez
por sus efectos beneficiosos para la salud.
Las clulas individuales de especies de Lactobacillus a menudo son largas y delgadas, aunque
pueden observarse bacilos corineformes o cocobacilos ms pequeos. Algunas especies pueden
formar cadenas largas de bacilos. La mayora de las especies son inmviles; las raras especies mviles
tienen flagelos periticos. La mayora de las especies son aerobias facultativas, aunque algunas crecen
mejor en condiciones anaerobias o microaerofilas, sobre todo en el aislamiento primario.
Los lactobacilos se denominan as porque ms del 50% de los productos terminales de la
fermentacin de la glucosa es cido lctico; algunas especies pueden producir tambin cidos actico,
frmico y succnico, junto con CO2. Los lactobacilos son uniformemente catalasa negativos y oxidasa
negativos, no reducen nitrato, no producen indol ni H2S. No licuan la gelatina y no forman esporas
(koneman E, Winn W, et al, 2006).
MATERIALES Y MTODOS
Protocolos generales de esterilidad
Los materiales de cristal (cajas de Petri, pipetas, tubos de ensaye, etc.) y medios de cultivo deben
ser previamente esterilizados en la autoclave a 121C y una atmsfera durante 15 minutos.
Se deben mantener condiciones de asepsia y antisepsia en el lugar de trabajo, que ser en una
campana de flujo laminar, limpiando antes y despus de usar con alcohol etlico; se debe mantener un
mechero de bunsen encendido en el lugar mientras se est trabajando.
Siembra y preparacin de muestras
Por estra por agotamiento: Una vez listo el lugar de trabajo, el medio de cultivo
esterilizado se vuelca en caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada en el
mechero (hasta que tome un color rojo) el asa se enfra introducindola al medio de cultivo, se toma
material de un cultivo heterogneo y se descarga sobre la superficie del medio formando estras (cita)
(Figura 1).
Figura 1. Pasos de siembra por agotamiento en estra
Por picadura o puncin: Con una aguja se toma el material que se quiere sembrar y se lo
introduce en el tubo, con medio semislido. Introducir la aguja hasta el fondo, formando un canal de
puncin, trayecto por el cual la retiraremos luego.( Jimenez Diaz M., 2011)
Recoleccin de muestras
En la obtencin de la muestra a trabajar, esta se recolecto en la comunidad de La Esperanza en
Tonila Jalisco con ms exactitud del potrero Pea con coordenadas de 192321.1N 1033107.8w, el
material utilizado fue esterilizado previamente.
Disolucin de muestras
Las disoluciones se realizan en tubos de ensayo estriles.
Se pesa un mililitro de leche bronca y se mezcla con nueve mililitros de agua destilada
-1
(dilucin 10 ).
De la dilucin obtenida, se toma un mililitro que se pasa a otro tubo con nueve mililitros
de agua destilada (dilucin 10-2).
De esta segunda dilucin, se toma otro mililitro, el cual se vierte en un tercer tubo con
nueve mililitros de agua destilada (dilucin 10-3).
As se prosigue hasta conseguir una dilucin 10-4, 10-5 y 10-6. Y se hace lo mismo para la
muestra de suero de queso.

De cada una de las diluciones se toman 100 microlitros, los cuales se vierten en las placas de
Petri que contienen el medio (medio nutritivo) en el cual se realiza la siembra por extensin en placa,
posteriormente se rotulan las cajas y se colocan en la incubadora a 36C, hasta ver su crecimiento
microbiano (Rodrguez G, 2007).
Tinciones
Tincin diferencial de Gram:
Esta tincin se denomina as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en
1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos,
Gram-positivas y Gram-negativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver
con carga elctrica, sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias).
Descrita en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tie 1 min
con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada durante 1 - 2 min. Y se lava de nuevo
con agua, decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de
6
contraste) durante 1 2 min. Lavar y secar. Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tien de
forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares
(Santambrosio E. et al, 2009).
Tincin de Schaeffer-Fulton
Las esporas son formas de resistencia bacteriana. Tienen forma esfrica u oval. Al microscopio
las esporas sin teir se observan como grnulos brillantes. Segn su localizacin se distinguen tres tipos
de esporas: Centrales, Subterminales, Terminales.
Material Necesario:
*
Cultivo
Verde malaquita al 5 % en agua.
Safranina al 1% en agua.
portaobjetos.
Pasos:
Realizar el frotis
Cubrir el frotis con verde de malaquita
calentar 5 minutos a emisin de vapores
Enjuagar con agua de la llave
Cubrir con la Safranina dejar actuar 1 minuto
lavar con agua de la llave y dejar secar al aire.
Se observaran Esporas teidas de verde y clulas vegetativas teidas de rosa. Observar la forma,
tamao relativo y posicin de la espora en la clula vegetativa (Morales Garca L, 2014)
Medios
Agar nutritivo
Medio de cultivo utilizado para propsitos generales, para el aislamiento de microorganismos

poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos.
Su uso est descrito en muchos procedimientos para el anlisis de alimentos, aguas y otros
materiales de importancia sanitaria.
Fundamento:
7
Por las caractersticas de sus componentes es un medio usado para el cultivo de

microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del
desarrollo bacteriano. La pluripeptona es la fuente de carbono y nitrgeno para el desarrollo bacteriano.
El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras sustancias
para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes (Britania, lab).
Frmula (en gramos por litro ):
Instrucciones:
Pluripeptona
Extracto de carne
Suspender 31 g de polvo por litro de

agua destilada. Mezclar y dejar reposar 5
minutos. Calentar suavemente agitando y
Cloruro de sodio
Agar 15
hervir 10 2 minutos hasta su disolucin.

Distribuir y esterilizar a 121 C durante 15
minutos.
PH final: 7.3
Tabla 1. Agar Nutritivo
Incubacin:
En aerobiosis, a 35-37 C durante 24 horas.
Caractersticas del medio:
Medio preparado; mbar claro a medio ligeramente opalescente.
Agar MRS
Medio de cultivo apropiado para el aislamiento y recuento de lactobacilos y otras bacterias acido
lcticas a partir de muestras clnicas y alimentos (especialmente productos lcteos).
Fundamento: El Agar M.R.S fue desarrollado por Man, Rogosa y Sharpe, y por su formulacin
permite el adecuado desarrollo de lactobacilos y otras bacterias cido lcticas. La proteosa peptona, el
extracto de carne, el extracto de levadura y la glucosa constituyen la fuente nutritiva ya que aportan
nitrgeno, carbono, vitaminas, y minerales. El monoleato de sorbitn, las sales de sodio, magnesio y
manganeso proveen cofactores para el crecimiento bacteriano y pueden inhibir el desarrollo de algunos
microorganismos. El citrato de amonio acta como agente inhibitorio del crecimiento de bacterias Gram
negativas. El agar es el agente solidificante (Britania, lab).
8
Tabla 2. Agar MRS

Incubacin:
En Atmsfera con 5% de CO2, a 35-37 C durante 24-72 horas.
Medio de cultivo preparado; color mbar oscuro
Agar ELLIKER
Medio Elliker, tambin conocido como LactobacilliBroth, es un medio recomendado para el

cultivo general de estreptococos y lactobacilos.
Fundamento:
Prueba de productos lcteos para las bacterias del cido lctico facilita la
determinacin de los niveles de cido, la evaluacin de los fermentos lcticos y ayuda a controlar la
calidad de los quesos curados, leches cultivadas y no cultivada productos. El medio es preparado de
acuerdo con la frmula de Elliker, que tiene un pH ligeramente cido y contiene suficientes nutrientes
para mantener el crecimiento de estos microorganismos Gram- positivos. Gelatina, triptona y extracto
de levadura proporcionan los nutrientes esenciales para el crecimiento. Lactosa, sacarosa y dextrosa son
hidratos de carbono fermentables que proporcionan carbono y energa. El cido ascrbico proporciona
9
condiciones cidas adecuadas. El cloruro de sodio suministra electrolitos esenciales para el transporte y
el equilibrio osmtico y acetato de sodio es el agente selectivo, la inhibicin de bacterias Gramnegativas y tambin acta como un sistema tampn (Conda, s.f)
Frmula(en gramos por litro):

Triptona
20
Cloruro de sodio 4
Extracto de levadura 5
Gelatina
2.50
Dextrosa
Acetato de sodio 1.50
Lactosa
cido ascrbico .50
Sacarosa
PH final: 6.8
Tabla 3. Agar Elliker
Incubacin:
Inocular e incubar y 35 2 C durante 18 - 48 horas, a excepcin de Streptococcuscremoris que
se incuba a 30 2 C.
El medio deshidratado debe ser homogneo de color mbar, de flujo libre y de color plido.
Pruebas
Agar triple azcar hierro: TSI
Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la

fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico.
Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono especfico incorporado
en un medio de crecimiento bsico, con produccin o no de gases, junto con la determinacin de posible
cido sulfhdrico (Bailn, L.L et al, 2003).
10
Fundamento: en el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los

nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de
carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido
sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+, los cuales se combinan con el cido
sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el
cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que
se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El
tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro
proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro (Britania, lab).
Instrucciones:
Extracto de carne 3
Pluripeptona 20
Cloruro de sodio 5
Suspender 62.5 g de polvo por litro de

agua destilada. Mezclar bien y calentar con
agitacin frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta
Lactosa 10
disolucin total. Llenar hasta la tercera parte
sacarosa 10
de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121 C por
Glucosa 1
15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo.
Sulfato de hierro y amonio .2

Tiosulfato de sodio .2
Rojo de fenol .025
Agar 13
PH final: 7.3.2
Tabla 4. Agar TSI
11
Siembra:
A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie
del medio.
Incubacin:
A 35-37C durante 24 horas, en aerobiosis.
Resultados:
Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente
fermenta la glucosa.
Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta
glucosa, lactosa y/o sacarosa.
Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador
de azcares.
La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo
produce gas.
El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce cido sulfhdrico.

Medio preparado rojo
Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10-35 C
Medio preparado: a 2-8 C
Prueba de citrato: Citrato de Simmons

Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la capacidad de usar
citrato como nica fuente de carbono y energa.

Fundamento: en el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y
el citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo
bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro
de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color
12
azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de
utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con
la consiguiente produccin de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a
travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y
piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser
utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces
vira al azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa(Britania, lab).
Instrucciones:
Citrato de sodio
Cloruro de sodio
Fosfato dipotsico
Suspender
24.2
del
medio
deshidratado por litro de agua destilada. Dejar

reposar 5 minutos y mezclar calentando a
Fosfato monoamnico
ebullicin durante 1 o 2 minutos. Distribuir en
Sulfato de magnesio
.2
tubos y esterilizar en autoclave a 121 C
Azul de bromotimol
.08
Agar
15
durante 15 minutos. Enfriar en posicin

inclinada.
PH final: 69= .2
Tabla 5. Citrato de Simmons
Siembra:
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inculo ligero, usando un
ansa sin arrastrar el agar.
Incubacin:
A 35-37 C, durante 24-48 horas, en aerobiosis.
Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 das de incubacin.
Resultados:
13
Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.
Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano
y no hay cambio de color.

Limitaciones:
Si se usa un inculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede variar el color del
pico del verde al amarillo-amarronado. Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero
puede afectar la visualizacin azul de un resultado positivo.
Inculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos.
Cuando se siembra una serie de pruebas bioqumicas a partir del mismo cultivo, se debe
esterilizar la aguja de inoculacin antes de inocular la prueba del citrato o sino inocularla primero.
Cualquier arrastre de materia orgnica puede originar resultados falsos positivos.

Medio preparado: verde.
Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10-35 C.
Medio preparado: a 2-8 C.
Prueba de hidrolisis de almidn
Para observar la actividad enzimtica se utiliza el agar almidn que es fundamental por el
contenido de almidn que se encuentra disponible, el cloruro de sodio encontrado en este agar es de
vital importancia pues la alfa-amilasa al ser metaloenzimas requieren de calcio para su estabilidad y su
actividad (Benavides, r.,& Hermida,s,a.2008).
Medio MIO
Medio usado para la identificacin de Enterobacteriaceae en base a su movilidad, actividad de

ornitinadecarboxilasa y produccin de indol.
14
Fundamento: medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto

de levadura, peptona y triptena. Adems, la triptena aporta grandes cantidades de triptfano, sustrato
de la enzima triptofanasa, para la realizacin de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono
fermentable, la ornitina es el sustrato para la deteccin de la enzima ornitinadecarboxilasa, el prpura
de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color prpura y en medio cido es
amarillo. Por su composicin, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia
de ornitinadecarboxilasa e indol (Britania, lab).
La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde ms
all de la lnea de inoculacin. La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del
medio. Debido a la fermentacin de la glucosa se reduce el pH produciendo una condicin cida y
originando que el indicador de pH prpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez,
otorga condiciones ptimas para la actividad de la enzima ornitinadecarboxilasa, la cual decarboxila la
ornitina presente. Por decarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador
hacia el color prpura. El indol, es producido a partir del triptfano por los microorganismos que
contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo
de Kovacs o de Erlich, indica un resultado positivo (Britania, lab).
Instrucciones:
Dextrosa
Extracto de levadura
Peptona
10
Tripteina
10
Clorhidrato de L-ornitina
Agar
Purpura de bromocresol
.02
Suspender 31 g del polvo en un litro de

agua destilada calentar a ebullicin hasta
completar disolucin. Distribuir en tubos y
esterilizar 15 minutos a 121 C.
PH final: 6.5 .2
Tabla 6. Medio MIO

15
Siembra:
A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, inocular por puncin profunda con
ansa recta.
Incubacin:
En aerobiosis, durante 18-24 horas a 35-37 C.
Resultados:
1-Movilidad:
Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento ms all de la lnea de siembra.
Resultado negativo: crecimiento solamente en la lnea de siembra.
2-Ornitina decarboxilasa:
Resultado positivo: color prpura.
Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violceo en la
superficie del medio.

3-Prueba del indol:
La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina.
Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.
Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.

Medio preparado: prpura transparente a ligeramente opalescente.
Almacenamiento:
16
Medio MR-VP
Medio utilizado para la realizacin del ensayo de Rojo de Metilo y VogesProskauer. Es

particularmente til para la clasificacin de enterobacterias.
Fundamento:
En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo
bacteriano y la glucosa es el hidrato de carbono fermentable. La glucosa puede ser metabolizada por los
microorganismos, a travs de distintas vas metablicas. Segn la va utilizada, se originarn productos
finales cidos (cido lctico, cido actico, cido frmico), o productos finales neutros (acetil metil
carbinol). Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podra ser reconocida por la adicin de un
indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos cidos, y por la adicin de alfa
naftol e hidrxido de potasio para evidenciar la presencia de productos finales neutros.
Voges y Proskauer, describieron una coloracin rojiza que apareca despus de adicionar
hidrxido de potasio a los cultivos de ciertos microorganismos en medio con glucosa. Esta coloracin se
debe a la oxidacin del acetilmetil carbinol a diacetilo el cual reacciona con la peptona del medio para
dar un color rojo (Britania, lab).
Frmula (en gramos por litro):
Instrucciones:
Pluripeptona
Glucosa
Fosfato dipotsico

agua destilada. Calentar suavemente agitando
hasta disolver. Distribuir y esterilizar en
autoclave a 118-121 C durante 15 minutos.
PH final: 6.9.2
Tabla 7. Medio MR-VP
Siembra:
Por inoculacin directa, a partir del cultivo en estudio.
Incubacin:
17
En aerobiosis, a 35-37C por 3 das.

Revelado de pruebas bioqumicas:
a)
Prueba del rojo de metilo: Aadir unas gotas de una solucin de rojo de metilo al 0.04%,
observar el color del medio.

b)
Prueba del VogesProskauer: Aadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etlico absoluto
y 0.2 ml de hidrxido de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a
temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Observar el color de la superficie del medio.
Resultados:
a)
Prueba del rojo de metilo:
Positivo: color rojo.
Negativo: color amarillo.
b)
Prueba de VogesProskauer:
Positivo: desarrollo de un color rojo en pocos minutos despus de una completa
agitacin del tubo.
Negativo: ausencia de color rojo.
Limitaciones:
En algunas cepas positivas para la prueba VP, pueden no desarrollar el color rojo en la superficie
mediante el revelado por la metodologa descripta anteriormente. En estos casos, se recomienda
calentar el medio de cultivo para favorecer el desarrollo de color rojo.
Medio preparado: mbar claro, transparente sin precipitado.
Almacenamiento:
Reduccin de nitratos
Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo para reducir los
nitratos a nitritos o gas nitrgeno libre, una caracterstica que a menudo tiene valor diferencial. La
reduccin de nitrato en nitrito y en gas nitrgeno tiene lugar generalmente en condiciones anaerbicas,
18
en las cuales un organismo obtiene su oxigeno del nitrato. El oxgeno sirve como un aceptor de
hidrogeno.
Reduccin del nitrato en nitrito.

La reduccin de nitrato en nitrito est indicada por la aparicin de color cuando el nitrito
reacciona con los dos reactivos. La reaccin de color resultante se debe a la formacin de un compuesto
diazoico, p-sulfobenceno-azo-alfa-naftilamina (Bailn, Lira, L, et al 2003).
19
Instrucciones:
Extracto de carne
Peptona
Nitrato de potasio

agua destilada. Calentar suavemente agitando
hasta disolver. Distribuir y esterilizar en
autoclave a 118-121 C durante 15 minutos.
PH final: 7.0 .2
Tabla 8. Reduccin de Nitratos
Siembra:
Difusin, inoculo denso.
Incubacin:
18 24 horas
Lquido, color amarillento.
Almacenamiento:
35-37 C.
Reactivos adicionales, reactivo de griess: Adicionar directamente al tubo de reaccin en el
siguiente orden
SOLUCION A
cido Sulfanlico
8g
cido actico 5N
1000 ml
SOLUCION B
20
-Naftilamina
5g
cido actico 5N
1000 ml
Resultados: Se interpreta los resultados un minuto despus de adicionar los reactivos.
Positivo: rosa a rojo intenso
Negativo: amarillo
Precauciones:
Una prueba negativa indica que los nitratos, no han sido reducidos o que han sido reducidos a
otros productos, como amoniaco, nitrgeno molecular, xido ntrico u xido nitroso e hidroxilamina.
Dado que los reactivos de prueba detectan solo nitritos, este ltimo proceso llevara a una lectura falsanegativa. Por ende es necesario agregar una pequea cantidad de polvo de zinc a todas las reacciones
negativas. Los iones zinc reducen nitratos a nitritos y la aparicin de color rojo despus de agregado el
zinc indica una reaccin positiva (Bailn, Lira, L, et al 2003).
Reaccin de la ureasa
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de los microorganismos para hidrolizar la
urea, formando dos molculas de amonaco por la accin de la enzima ureasa produciendo un cambio de
color rojo en el medio. La ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la descomposicin
de los compuestos orgnicos (Bailn, Lira, L, et al 2003).
Instrucciones:
Extracto de levadura
0.1
Fosfato monopotsico
9.1
Suspender 3.87 del medio por cada 100

ml de agua destilada. Disolver sin calentar y
esterilizar por filtracin. Se sustituy el rojo
Fosfato monosdico
9.5
fenol por el azul de bromotimol y en vez de
Urea
20
fosfato disdico fue fosfato monosdico por lo

21
Azul de bromotimol
0.01
cual se ajusta el pH con KOH ya que el medio

queda muy acido.
PH final: 6.7 -6.9
Tabla 9. Prueba de ureasa

Siembra:
Sembrar un inculo denso a partir de un cultivo puro de 24 horas.
Incubacin:
A 35-37 C, en aerobiosis. Observar las reacciones a las 8, 12,24 y 48 horas de incubacin.
Para aquellos microorganismos que hidrolizan lentamente la urea, incubar hasta 72 horas.
Resultados:
Una reaccin positiva (hidrlisis de la urea) es indicada por un cambio de color del amarillo (pH
6,8) al rojo cereza (pH 8,1 o ms alcalino).
Agar base sangre
Medio para propsitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerosos microorganismos.

Con la adicin de sangre, el medio es til tanto para el aislamiento y cultivo de microorganismos
aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de muestras, como para
la observacin de reacciones de hemlisis.Tambin, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio
base para preparar el medio agar chocolate.
Fundamento:
La infusin de msculo de corazn otorga al medio un alto valor nutritivo, que permite el
crecimiento de una gran variedad de microorganismos, an de aquellos nutricionalmente exigentes. El
agregado de sangre al medio de cultivo, en concentracin final de 5-10 %, aporta nutrientes para el
crecimiento bacteriano, y permite detectar hemlisis (Britania, lab).
22
Frmula (en gramos por 100 ml ):

Infusin de musculo de corazn
Sangre
Instrucciones:
3.7
5ml (5%)
Suspender los gramos del medio

establecidos
por cada 100 ml de agua
destilada. Disolver y esterilizar el medio en la

Agar bacteriolgico
1.5
autoclave a 121 C por 20 minutos. En el medio

tibio agregar inmediatamente los 5ml de
sangre, y vaciar el medio en cajas previamente
esterilizadas.
PH final: 7.3
Tabla 10. Agar base sangre
Siembra:
Por inoculacin directa del material en estudio, sobre la superficie del medio de cultivo.
Incubacin:
El tiempo, temperatura y atmsfera de incubacin, dependern del microorganismo que se
quiera aislar. En nuestro caso de 35 a 37 C
Interpretacin de resultados:
Observar las caractersticas de las colonias. Para el medio de cultivo conteniendo sangre
observar las reacciones de hemolisis;
Hemolisis alfa: lisis parcial de los glbulos rojos. Se observa un halo de color verdoso
alrededor de la colonia en estudio es debido a la oxidacin de la hemoglobina a metahemoglobina

(compuesto de color verdoso) por el perxido de hidrogeno generado por los microorganismos.
Hemolisis beta: lisis total de los glbulos rojos. Se observa un halo claro brillante
alrededor de la colonia en estudio.
Hemolisis gamma: ausencia de lisis de los glbulos rojos. El medio de cultivo no presenta
modificaciones de color y aspecto alrededor de la colonia en estudio (sin hemolisis).
Agar E.M.B.
23
Este medio (tambin denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos
Gram negativos de rpido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las
especies de la familia Enterobacteriaceae.
Fundamento:
Este medio combina las frmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un
mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram
negativos. La diferenciacin entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que
son incapaces de hacerlo, est dada por los indicadores eosina y azul de metileno; stos ejercen un
efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichiacoli y
Citrobacterspp. presentan un caracterstico brillo metlico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen
centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio
permite el crecimiento de Candidaspp. Como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad
permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcusspp. Crece en este medio como
colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacterspp. y otras bacterias oxidativas
pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de
acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporacin de azul de metileno a sus
membranas. En este medio se obtiene adems, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella
(Britania, lab).
Instrucciones:
Peptona
10
Lactosa
Sacarosa
Fosfato dipotsico
Esterilizar en autoclave a no ms de 121C
Agar
13.5
durante 15 minutos. Enfriar a 45C y distribuir
Eosina
.4
Azul de metileno
.065
Suspender 36 g del polvo en un litro de

agua destilada. Reposar 5 minutos, mezclar
durante 1 o 2 minutos hasta su disolucin.
agitando suavemente.
PH final: 7.2 .2
Tabla 11. Agar E.M.B.
24
Siembra
En superficie, por estriado a partir de un inculo poco denso, para obtener colonias aisladas.
En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas.
Incubacin
De 24 a 48 horas a 35-37 C, en aerobiosis.
Placas preparadas: color prpura.La esterilizacin del medio de cultivo reduce el azul de
metileno al color naranja. El color prpura se restaura por agitacin. La presencia de un precipitado en el
medio esterilizado es normal y no debe ser removido, ya que es parte esencial del mismo.
Agar Sal y Manitol
Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciacin de

estafilococos.
Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patognicos a partir de muestras clnicas,
alimentos, productos cosmticos y otros materiales de importancia sanitaria. Tambin, este medio
puede utilizarse para el cultivo de especies halfilas de Vibrio, si no se dispone de medios apropiados
(TCBS Medio, Medio Marino, etc.), aunque algunas especies pueden no desarrollar.
Fundamento:
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina. Los estafilococos
coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una
zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona
roja o prpura. Las colonias sospechosas, se repicarn en un medio sin exceso de cloruro de sodio para
efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de carbono,
nitrgeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio
(que se encuentra en alta concentracin) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora
acompaante, y el rojo fenol es el indicador de pH. Las bacterias que crecen en un medio con alta
concentracin de sal y fermentan el manitol, producen cidos, con lo que se modifica el pH del medio y
vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal,
y pueden o no fermentar el manitol. Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se
visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color. Los estafilococos que no
25
fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o
prpura (Britania, lab).
Instrucciones:
Extracto de carne 1
Pluripeptona 10
d-manitol 10

agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar
durante 1 o 2 minutos. Esterilizar en autoclave
Cloruro de sodio 75
a 121 C durante 15 minutos.
Agar 15
Rojo de fenol .025
PH final: 7.4 .2
Tabla 12. Agar sal y manitol
Siembra:
Sembrar en superficie un inculo denso de la muestra por estra.
Incubacin:
De rutina: durante 18-24 horas a 35-37 C, en aerobiosis. La American PublicHealthAssociation (A.P.H.A)
recomienda la incubacin durante 3 das a 32 C, en aerobiosis.
Medio preparado rojo.
Resultados:
Microorganismos fermentadores de manitol colonias de color. Despus de la incubacin las
placas se examinan para detectar la presencia de colonias de estafilococos.
Las colonias que muestran una apariencia estndar de estafilococos deben ser sometidas a otras pruebas
de diferenciacin para confirmar su identidad (BectonDickinson, 2013).
Agar MAC CONKEY.
26
Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil desarrollo, aerobios y
anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de
agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.
Fundamento:
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo
bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal
violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva.
Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color
del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las colonias, y la precipitacin de las sales biliares.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.(Britania, lab)
Siembra:
Sembrar en superficie por estra.
Incubacin
Durante 18-48 horas, a 35-37 C, en atmsfera aerbica.
Interpretacin de resultados:
Microorganismos fermentadores de lactosa: colonias rosadas rojizas. Puede observarse
halo de precipitacin biliar.
Microorganismos no fermentadores de lactosa colonias del color del medio incoloras.
Tabla 13. Resultados en agar MAC CONKEY
27
RESULTADOS:
Toma de muestra
Se recolectaron muestras de leche bronca el 1 de julio de 2016 y suero de queso el 30 de junio
de 2016 de la comunidad de La Esperanza en Tonila Jalisco con ms exactitud del potrero Pea con
coordenadas de 192321.1N 1033107.8w.
Figura 2.Potrero pea

Las muestras fueron recolectadas en frascos de cristal previamente esterilizados y con el cuidado
adecuado, la muestra de leche (500ml) fue tomada el da del traslado mientras que la muestra de suero
(100ml) fue tomada un da antes pero se conserv en el refrigerador todo el tiempo, durante el traslado
al tecnolgico se conservaron a temperatura ambiente.
Aislamiento de los microorganismos de inters:
Se hicieron diluciones de la leche bronca desde 10-1 hasta 10-6 y se sembraron en agar nutritivo
por la tcnica extensin en placa las muestra de 10-3, 10-4, 10-5 y 10-6, para la muestra de suero se
hicieron nuevamente diluciones desde 10-1 hasta 10-6 y esta vez se sembraron todas las muestras por la
misma tcnica anterior, previamente todo el material utilizado estaba esterilizado. Pasadas 24 horas se
extrajeron las cajas de la incubadora a 36C donde permanecieron despus de la siembra, esto para
proseguir con la prueba de tincin Gram acompaado de la tcnica de frotis; para la tincin Gram se
utilizaron colonias de microorganismos que tomamos de la muestra 10-6 (Figura 3) para el suero de
queso y 10-4 (Figura 4), 10-5 (Figura 5) y 10-6 (Figura 6) para la leche bronca (Santambrosio E. et al, 2009).
28
Figura 3. Muestra de suero de queso de la

dilucin de 10-6 (Figura A, B, C)
Figura 5. Muestra de leche en la

disolucin de 10-5 (Figura F y G)
Figura 4. Muestra de leche en la disolucin de 10-4
Figura 6. Muestra de leche en la

disolucin de 10-6 (Figura D y E)
29
Figura 7. Tincin Gram
Todas las imgenes que se mencionaran se encuentran en la Figura 7. En las tinciones de las
colonias de suero de 10-6 (Imagen A, B y C) se observaron bacilos Gram positivos en la A los bacilos
observados eran muy pequeos sin embargo si se observaba su morfologa bacilar, en la B se pudieron
observar ms bacterias aglomeradas resaltando el color caracterstico de las Gram positivas y en la C se
observaron de manera ms dispersa.
En las tinciones de colonias de leche (Imagen C, D, E, F, G Y H) se observaron tambin en todas,
bacterias Gram positivas pero en la mayora de estas ya se pudieron observar de un tamao mayor como
en el caso de la E, F y G en la D se observaron de manera dispersa en la muestra y las de la G se
observaron aglomeraciones de bacterias pequeas en las que podra haber cocos o cocobacilos y bacilos;
tambin se observaron lo que se cree que pueden ser endosporas en algunas de las muestras de leche
para eso despus se proceder a hacer tincin de esporas.
30
Previamente se haban seleccionado 7 (B, C, D, E, F, G Y H; Figura 7) de las 8 muestras que se

haban tomado (antes descritas) se sembraron en agar nutritivo, en agar selectivo MRS (Britania lab) y
agar selectivo Elliker (CONDA lab.) esto con el fin de tener una preseleccin.
Figura 8. Cultivos en agar

MRS.
se revisaron los resultados para los cultivos en el agar MRS con un crecimiento positivo pero solo
para ciertos cultivos, bacteria 2 y 4 que presentaron crecimiento inmediato y abundante, en estas
colonias con forma redonda de color blanco, con aspecto cremoso de bordes enteros siendo estas
caractersticas generales de BAL (Garca Ibarra J., 2007).
31
Figura 9. Cultivos en agar Elliker
Se observ crecimiento bacteriano en todos los cultivos de nuevo con crecimiento abundante
para la bacteria 2 y 4, mientras que los cultivos restantes presentaron crecimiento ms lento.
Se hizo tincin de esporas (Morales G. L., 2014) (Figura 10) para las bacterias 2 y 4 del agar MRS
y, 3, 4, 5 y 6 del agar Elliker (CONDA lab.) con el objetivo de descartar la aparicin de estas en nuestra
muestras puesto que las bacterias acido lcticas no presentan esporas (Universidad pblica de navarra,
2008). Con resultados favorecedores ya que no observamos esporas en ninguna de nuestras muestras.
32
B2
B3
B4
B5
B6
B4M
Figura 10. Tincin de esporas
B2, y B4M: Bacteria de agar MRS, negativo a produccin de esporas.

B3, B4, B5 Y B6: Bacterias de agar Elliker, negativo a produccin de esporas.
La prueba de catalasa se realiz (Fung, 1997) para la bacteria B3, B4, B5, y B6 del agar Elliker y
B2 Y B4M para el agar MRS (Britania, lab). Todas las bacterias menos la B5 que dio negativo y B6 solo una
ligera reaccin, (Figura 11) estas procedentes del agar Elliker, dieron positivo siendo desfavorecedor ya
que las BAL no tienen un grupo porfirnico y por lo tanto estas bacterias no tienen la enzima catalasa
(Universidad pblica de navarra, 2008).
B5
B6
Figura 11. Prueba de catalasa

33
De acuerdo a los resultados anteriores elegimos la B5 y B6 para nuestra identificacin en

pruebas bioqumicas. Tincin Gram-positiva (Santambrosio E. et al, 2009) para la bacteria B5 y B6 (Figura
12).
B5
B6
Figura 12. Tincin Gram
Se aislaron las bacterias B5 y B6 EN agar elliker (CONDA lab.), para trabajar solo sobre ellas y
realizar las pruebas bioqumicas correspondientes.
El medio E.M.B. (Figura 13) resulto positivo para la bacteria B6 y negativo para la B5. La prueba
era para confirmar la tincin Gram ya que las BAL son Gram positivas (Ortiz B., 2006) y este medio es
utilizado para el aislamiento selectivo de bacterias Gram negativas (Britania, lab).
34
B6
B5
Figura 13. Medio E.M.B.
Para asegurar los resultados de la prueba de E.M.B. se sembr la bacteria B6 en el medio Mac
Conkey y el resultado fue positivo. Por lo que se descart la bacteria, y solo se trabaj con la B5.
Figura 14. En la figura se muestra crecimiento de la bacteria B6 por lo que se confirma que es
Gram-negativa, notando un color incoloro de la colonia por lo que no fermenta lactosa.
35
La prueba de hidrolisis de almidn (Benavides, r.,& Hermida,s,a.2008) para la bacteria resultado

negativo (Figura 15).
Figura 15. Prueba de hidrolisis de almidn.

En la prueba de Agar base sangre (figura16) resulto Hemolisis gamma: ausencia de lisis de los
glbulos rojos (Britania, lab). Ya que no se observ ningn halo alrededor de la colonia; es decir no
hemoltica. Y la prueba de agar sal y manitol dio negativa (figura17).
Figura 16.-Agar base sangre.
Figura 17.- agar sal y manitol. Negativo al

no presentar crecimiento de colonias.
36
Se realiz la prueba MIO (Britania, lab.) para la bacteria dio como resultado negativo para
movilidad e indol y negativo para ornitina (Figura 18).
La prueba del medio MR-VP (Rojo de Metilo y Voges-Proskauer) empleada para la presencia de
productos cidos, y evidenciar la presencia de productos finales neutros respectivamente (Britania lab).
Dio positivo para rojo de metilo, y negativo para Voges-Proskauer (Figura 19,20).
La prueba en el agra TSI, empleada para determina la capacidad de un organismo de atacar un
hidrato de carbono especfico incorporado en un medio decrecimiento bsico, con produccin o no de
gases, junto con la determinacin de posible cido sulfhdrico (Bailn, L.L et al, 2003), nos dio positivo
(Figura 21).
Figura 19.-Prueba de rojo de metilo

positivo, podemos observar que la bacteria
Figura 18.-Prueba de MIO.
tiene un color rojo.
Figura.Figura 20.-Prueba Voges-Proskauer. El

resultado fue negativo ya que no presento
cambio de color (Bailn, Lira, L, et al 2003).
Figura 21.- Prueba del medio TSI,

positiva para fermentacin de lactosa, pico37
A/A (Britania, lab).
La prueba de reaccin de la ureasa determina la capacidad de los microorganismos para

hidrolizar la urea, formando dos molculas de amonaco por la accin de la enzima ureasa produciendo
un cambio de color rojo en el medio (Bailn, Lira, L, et al 2003)(Figura22).
La Prueba de citrato: Citrato de Simmons, determina la capacidad de los microorganismos
capaces de utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de
nitrgeno, con la consiguiente produccin de alcalinidad (Britania, lab)( Figura 23).
La prueba de reduccin de nitratos una prueba realiza para determinar la capacidad de un
microorganismo para reducir los nitratos a nitritos o gas nitrgeno libre(Bailn, Lira, L, et al 2003). La
cual nos dio como resultado negativo (Figura 24).
Figura 22.-Reaccin de la ureasa

negativo
Figura 23.-Prueba de Citrato de

Simmons, negativa.
Figura 24.Prueba de reduccin de

nitratos, con resultado negativo ya que no
presento cambio de color al revelador de
amoniaco (Bailn, Lira, L, et al 2003).
38
DISCUSIN:
Para la identificacin del gnero de la bacteria aislada de las muestras se utiliz el mapa de
identificacin ABIS figura 25, en el que se busc segn la forma de las clulas que fueron bacillos y su
Gram que es positivo y con la tincin de Scheffer Fulton para la formacin de endosporas que se report
negativa o nula a la bacteria aislada, tambin con respecto a su respiracin celular son microaerfilos
porque son microorganismos que viven en presencia de niveles de oxgeno que estn bajo la
concentracin presente en el aire (<21 %) o tambin aerobios facultativos porque son microorganismos
que pueden vivir en ausencia de oxgeno o en su presencia (koneman E, Winn W, et al, 2006), con
respecto a la forma se observaron bacilos regulares y fueron catalasa negativo, no mviles segn los
resultados de las pruebas catalasa y movilidad, con lo cual nos lleva a los gneros Lactobacillus y
Erysipelothrix lo que llevo a basarse en la bibliografa para saber de qu nicho es aislado cada uno de los
gneros de estos microorganismos y segn las muestras de las que se obtuvo, pertenece al gnero
Lactobacillus (ABIS Encyclopedia, sf; Breed R, Murray E, Smith N, 1957).
Figura 25. Mapa de identificacin
39
Genero Lactobacillus.
Bacilos o cocobacilos Gram positivos-, no formadoras de endosporas; metabolismo fermentativo,
obligatoriamente de azucares, al menos la mitad de finales de carbono producto es lactato; anaerobio
facultativo; gelatina no licuada, ni produccin de indol y no produce H2S, catalasa y oxidasa negativo;
requerimientos nutricionales complejos para los aminocidos, pptidos, derivados de cidos nucleicos,
vitaminas, sales, cidos grasos y carbohidratos; el crecimiento rango de temperatura 2-53 C; 5.5 a 6.2
pH ptimo. Se encuentra en los productos lcteos, alimentos, cerveza, el vino, las frutas, el agua, el suelo
y las aguas residuales; que son una parte de la flora normal en la boca, el tracto intestinal, y la vagina de
los seres humanos y muchos animales. No es patgeno o est restringido a las personas con una
enfermedad subyacente.
Con las pruebas reportadas hasta ahora se elabor una tabla comparativa, tabla. Con la que se
busc en Bergeys Manual of Determinative Bacteriology y en ABIS Encyclopedia la especie de la
bacteria con respecto a las caractersticas microscpicas, macroscopicas y pruebas bioqumicas en
comn y se obtuvieron los siguientes resultados con las siguientes especies posibles:
Tabla
PRUEBA
FORMA
TAMAO
GRAM
ESPORAS
CATALASA
MOVILIDAD
INDOL
ORNITINA
ALMIDON
ROJO DE
METILO
CITRATO
VOGESPROSKAWER
REDUCCIN
NITRATOS
EOSINA Y AZUL
DE METILENO
TSI
MEDIO MAC
CONKEY
B5 (lactobacillus sp)
(+)
Lactobacillus
plantarum
Subespecie plantarum
Bacilo
0.9 a 1.2 1 a 2 micras
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(+)
(-)
(-)
(variable)
(-)
(-)
(-)
(+) glucosa y lactosa

fermentadas
(-)
(+) glucosa
(+) glucosa y lactosa
(-)
(-)
Bacilo
0.8 2.57 micras
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(+)
lactobacillus
leichmannii
Bacilo
0.6 2.0 a 4.0 micras
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
40
UREASA
AGAR SANGRE
SAL Y MANITOL
(-)
Hemolisis gamma
(-)
Tabla 14. Tabla comparativa
Lactobacillus leichmannii el que tiene unas de las caractersticas ms cercanas al aislado

obtenido; llamado as por el Prof. G. Leichmann, un bacterilogo alemn.
Morfologa:
Bacillos, 0,6 por 2,0 a 4,0 micras, que se producen individualmente y en cadenas cortas.
Las clulas muestran dos o ms grnulos de tincin, inmviles y Gram positivas.
Caractersticas:
Gelatina no licuada, colonias de agar: pequeas y claras con el blanco centros.
Agar inclinado: Limitado, raya de color grisceo.
Caractersticas bioqumicas:
Heterofermentativa.
cido a partir de glucosa, fructosa, maltosa, sacarosa y trehalosa; ligeras cantidades de
galactosa, manitol y a-metil-glucsido. La lactosa, rafinosa, arabinosa, ramnosa, dextrina y la inulina no
son fermentados.
Los nitritos no producidos a partir de los nitratos.
Microaerfila
Crecimiento ptimo a temperatura de: C, 36. Mximo, entre 40 y 46 C.
Relacin con otras especies: Esta especie es aparentemente similar a Lactobacillus delbrueckii
pero tiene una temperatura optima ms baja.
Fuente: Aislado de levadura comprimida y de la fermentacin de la leche.
Hbitat: Productos lcteos y productos vegetales. (Breed R, Murray E, Smith N, 1957).
Lactobacillus plantarum subespecie plantarum

(Orla-Jensen, 1919)
41
Morfologa:
Bacilos Gram positivos con los extremos redondeados, rectos (0.9-1.2 x 1-2 micras) que se
encuentran aislados en pares o en cadenas cortas, inmviles y no forman esporas.
Caractersticas:
Anaerobios facultativos, colonias en la superficie son de 3 mm de ancho, elevado, liso, blanco y
ocasionalmente claro o amarillo obscuro.
El crecimiento ptimo de temperatura es de 30-35 grados Celsius puede crecer a 15 grados pero
no a 45.
Factores de crecimiento: pantotenato de calcio y niacina requerida, riboflavina generalmente no
se requiere.
Caractersticas bioqumicas:
Heterofermentativa facultativa.
Resultados positivos para la acidificacin de la leche, fermentacin de: amigdalina, celobiosa,
esculina, fructosa, galactosa, beta-gentibiosa, N-acetilglucosamina, cido glucosa, la glucosa (sin
produccin de gas), gluconato (con gas), lactosa, maltosa, manitol, manosa, melezitosa, melibiosa,
rafinosa, ribosa, salicina, sacarosa y trehalosa.
Resultados negativos para la hidrlisis de arginina, catalasa (puede producir una pseudocatalasa)
fermentacin de: adonitol, D-arabinosa, L-arabitol, eritritol, fucosa, inositol, inulina, 2-cetogluconato, 5cetogluconato, ramnosa, L-sorbitol, sorbosa y xilosa.
Fuente: productos lcteos, ensilado, verduras encurtidas, estircol de vaca, boca humana y
tracto intestinal, aguas residuales, etc.
Hbitat: Ampliamente distribuido en la naturaleza, particularmente en la fermentacin de
productos de plantas y animales. (ABIS Encyclopedia, sf; Breed R, Murray E, Smith N, 1957)
En conclusin:
La bacteria asilada de la muestra de leche bronca fue lactobacillus plantarum subespecie
plantarum determinado por la fermentacin de carbohidratos puesto que fermento glucosa y lactosa y
esta es una caracterstica de lactobacillus heterofermentativos facultativos y anaerobios facultativos, en
42
el cual lactobacillus plantarum subespecie plantarum es afirmativa a estas caracteristicas (ABIS

Encyclopedia, sf), mientras que el lactobacillus leichmannii es heterofermentativa y microaerfila ya que
solo puede fermentar glucosa y no lactosa (Murray E, Smith N, 1957); en la reduccin de nitratos la
especie se mantiene variable en algunas cepas de esta, aproximadamente de 25 al 75 % es positivo y es
diferencial de otras subespecies de lactobacillus plantarum y precisamente entre esas especies tambin
se diferencia de los nichos en los cuales son aislados, siendo esta especie positiva para asilados en
productos lcteos (ABIS Encyclopedia, sf); tambin en caractersticas macroscpicas de las colonias se
observaron que estas pueden ser de color amarillo obscuro (ABIS Encyclopedia, sf), lo cual cumple con
las caractersticas de las colonias aisladas y con respecto al tamao microscpico se analiz y se observ
que tiene ms similitud con el tamao promedio de la bacteria aislada, as tambin con respecto a la
temperatura de incubacin la cual se mantuvo en un promedio de 36 y las temperaturas optimas de
crecimiento del lactobacillus plantarum es de 30 a 35 grados Celsius y ya no se obtiene su crecimiento a
45 grados Celsius por lo que es posible el crecimiento en la incubacin dada.
En la siguiente tabla se muestran caractersticas como la de reduccin de nitratos entre otras de
fermentacin de carbohidratos que no fueron realizadas.
Tabla 15. Tabla de caracterizacin

Adems en un software utilizado de ABIS Encyclopedia se encontr una concordancia con la
bacteria del 96% de confianza con los resultados, diferenciando tambin de las dems especies de
lactobacillus por el nicho de donde son extradas las bacterias.
43
Figura 26. Test de identificacin
44
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47

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Instituto Tecnolgico de Colima

Docente: Dr. Francisco Javier Delgado Virgen

Villa de lvarez, Colima. 25/07/2016

Agar Sal y Manitol.25

Figura 1. Pasos de siembra por agotamiento en estra

de agua destilada (dilucin 10-2).

nueve mililitros de agua destilada (dilucin 10-3).

muestra de suero de queso.

Tincin diferencial de Gram:

Verde malaquita al 5 % en agua.

Medio de cultivo utilizado para propsitos generales, para el aislamiento de microorganismos

Por las caractersticas de sus componentes es un medio usado para el cultivo de

Suspender 31 g de polvo por litro de

hervir 10 2 minutos hasta su disolucin.

Tabla 2. Agar MRS

Medio Elliker, tambin conocido como LactobacilliBroth, es un medio recomendado para el

Frmula(en gramos por litro):

Acetato de sodio 1.50

cido ascrbico .50

Agar triple azcar hierro: TSI

Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la

Fundamento: en el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los

Suspender 62.5 g de polvo por litro de

disolucin total. Llenar hasta la tercera parte

de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121 C por

15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo.

Sulfato de hierro y amonio .2

Tabla 4. Agar TSI

Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente

Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta

glucosa, lactosa y/o sacarosa.

Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador

La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo

El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce cido sulfhdrico.

Caractersticas del medio:

Medio deshidratado: a 10-35 C

Medio preparado: a 2-8 C

Prueba de citrato: Citrato de Simmons

citrato como nica fuente de carbono y energa.

Frmula(en gramos por litro):

deshidratado por litro de agua destilada. Dejar

ebullicin durante 1 o 2 minutos. Distribuir en

tubos y esterilizar en autoclave a 121 C

durante 15 minutos. Enfriar en posicin

Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.

y no hay cambio de color.

Inculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos.

Caractersticas del medio:

Prueba de hidrolisis de almidn

Medio usado para la identificacin de Enterobacteriaceae en base a su movilidad, actividad de

Fundamento: medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto

Frmula(en gramos por litro):

Suspender 31 g del polvo en un litro de

Tabla 6. Medio MIO

Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento ms all de la lnea de siembra.

Resultado negativo: crecimiento solamente en la lnea de siembra.

Resultado positivo: color prpura.

Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violceo en la

superficie del medio.

Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.

Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.

Caractersticas del medio:

Medio deshidratado: a 10-35 C.

Medio preparado: a 2-8 C.