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REP-4), cette double hlice dADN a subi une rplication semi-conservative par lenzyme

MECANISMES DE

REPLICATION DE

LADN

DNA polymrase.

Les analyses ralises au tout dbut des annes 60 sur des chromosomes en rplication
ont montr une rgion de rplication localise qui se dplaait progressivement le long de la
Tous les organismes doivent rpliquer leur ADN avec une fidlit extraordinaire avant

double hlice dADN parentale. En raison de sa structure en Y, cette rgion active a t

chaque division cellulaire. Dans ce chapitre, nous verrons comment une machinerie de

appele fourche de rplication (Figure REP-5). Au niveau dune fourche de rplication,

rplication assure cette fidlit alors quelle duplique lADN des taux pouvant atteindre

lADN de chacun des deux brins fils est synthtis par un complexe multi-enzymatique qui

1.000 nuclotides par seconde.

dont la DNA polymrase.

1.

Au dbut, le mcanisme le plus simple de rplication de lADN semblait tre le

Lappariement des bases est la base de la rplication et de la rparation de

dveloppement continu de chacun des deux brins, nuclotide par nuclotide, au niveau de la

lADN

fourche de rplication puisque cette dernire se dplace dune extrmit dune molcule
La squence nuclotidique dun brin dADN est copie appariement complmentaire

dADN lautre extrmit. Cependant, en raison de lorientation anti-parallle des deux brins

des bases (A avec T , G avec C) en une squence dADN complmentaire (Figure REP-1). Ce

dADN dans la double hlice dADN (voir Figure REP-1), ce mcanisme ncessiterait que

processus impose la reconnaissance de chaque nuclotide dans le brin dADN matrice par un

lun des brins fils soit polymris dans le sens 5 > 3 et lautre dans le sens 3 > 5. Une telle

nuclotide complmentaire libre (non polymris), et ncessite que les deux brins de lhlice

fourche de rplication ncessiterait deux enzymes DNA polymrases diffrentes. Lune

dADN soient spars. Cette sparation permet aux groupes donneur et accepteur des ponts

delles polymriserait dans le sens 5 > 3, o chaque nouveau doxyribonucloside

hydrogne sur chaque base dADN dtre exposs pour lappariement de bases avec le

triphosphate porterait le groupe triphosphate ncessaire sa propre incorporation. Lautre se

nouveau nuclotide libre appropri, permettant ainsi leur alignement pour leur polymrisation

dplacerait dans le sens 3 > 5 et se ferait par dplacement de tte, dans lequel lextrmit

enzyme-dpendante dans une nouvelle chane dADN.

de la chane dADN en croissance porterait le groupe triphosphate ncessaire pour laddition


de chaque nuclotide subsquent (Figure REP-6). Cependant, ce dernier type de

La premire enzyme polymrisant les nuclotides, la DNA polymrase, a t


dcouverte en 1957. Les nuclotides libres, substrats de cette enzyme, sont des

polymrisation ne survient pas lors de la synthse de lADN et, de plus, aucune DNA
polymrase synthtisant dans le sens 3 > 5 na jamais pu tre isole.

doxyribonuclosides triphosphates et leur polymrisation en ADN ncessite une matrice


dADN simple brin. Le mcanisme par tapes de cette raction est illustr en Figures REP-2

3.

Comment est donc synthtis la chane dADN 3 > 5 en totalit ?

et REP-3.
La rponse cette question a t pour la premire fois suggre par les rsultats
2.

dexpriences dans les 60, o de la 3H-thymidine radioactive a t rajoute des bactries en

La fourche de rplication de lADN est asymtrique

division pendant quelques secondes, de faon ce que seulement lADN le plus rcemment
Durant la rplication de lADN dans la cellule, chacun des deux anciens brins dADN

rpliqu - tout prs de la fourche de rplication - devienne radioactif. Cette exprience a

sert de matrice pour la formation dun nouveau brin entier. Puisque chacune des deux cellules

rvl lexistence transitoire de rgions dADN de 1.000-2.000 nuclotides, maintenant

filles hrite dune double hlice dADN forme dun ancien et dun nouveau brin (Figure

connus sous le nom de fragments dOkazaki, au niveau de la fourche de rplication en


croissance. Des intermdiaires de rplication similaires ont t plus tard identifis chez les

eucaryotes, bien quils naient quune taille de 100-200 nuclotides. Les fragments dOkazaki

La premire tape de correction derreur est ralise par la DNA polymrase, et elle

taient polymriss dans le sens 5 > 3 et ensuite joints ensemble aprs synthse pour

survient juste avant quun nouveau nuclotide ne soit rajout la chane en croissance. Le

produire de longues chanes dADN.

nuclotide correct a une plus haute affinit pour la polymrase que ne laurait le nuclotide
incorrect, car seul le nuclotide correct peut sapparier convenablement avec la matrice. En

Une fourche de rplication a donc une structure asymtrique (Figure REP-7). Le brin

outre, aprs liaison du nuclotide, mais avant que le nuclotide ne soit rajout de manire

dADN fils qui est synthtis de manire continue est appel leading strand. Sa synthse

covalente la chane en croissance, lenzyme doit subir un changement conformationnel. Un

prcde de peu la synthse du brin fils qui est synthtis des manire discontinue, appel

nuclotide incorrectement li se dissociera plus facilement pendant cette tape que celui

lagging strand. Pour le brin synthse discontinue, le sens de la polymrisation de

correct. Cette tape permet ainsi la polymrase de faire une sorte de double-check (double

nuclotides est oppos au sens global de croissance de la chane dADN. La synthse dADN

contrle) de lexacte gomtrie des paires de base avant de catalyser laddition du nuclotide.

pour ce brin est retarde car elle ncessite que le brin synthse continue expose le brin
matrice sur lequel chaque fragment dOkazaki est synthtis. La synthse du lagging strand

La raction de correction derreur suivante, appel exonucleolytic proofreading

par ce mcanisme veut dire que seule la DNA polymrase de type 5 > 3 est ncessaire pour

(correction derreur exonuclolytique) a lieu immdiatement aprs les rares cas o un

la rplication de lADN.

nuclotide incorrect est rajout de manire covalente la chane en croissance. Les enzymes
DNA polymrases ne peuvent pas dbuter une nouvelle chane polynuclotidique en liant

4.

La haute fidlit de la rplication de lADN ncessite plusieurs mcanismes de

deux nuclosides triphosphate ensemble. Elles ncessitent absolument une extrmit de base

correction derreurs

3-OH libre dun brin amorce sur laquelle elles rajoutent les nuclotides suivants (voir Figure
REP-3). Les molcules dADN ayant un nuclotide msappari lextrmit 3-OH du brin

La fidlit de copie de lADN pendant la rplication est telle que 1erreur est ralise
9

amorce ne sont pas efficaces comme matrices car la polymrase ne peut tendre un tel brin.

chaque 10 nuclotides copis. Cette fidlit est beaucoup plus leve que celle a tendue

Les DNA polymrases contournent un tel brin amorce msappari par le biais dun site

seulement sur la base de la prcision de complmentarit dans lappariement des bases. La

catalytique diffrent (soit dans une sous-unit diffrente ou dans un autre domaine de la

complmentarit standard des paires de base nest pas la seule possible. Par exemple, avec de

polymrase, selon la polymrase). Cette exonuclase correctrice derreur 3 > 5 dcroche tout

trs lgers changements dans la gomtrie de lhlice, deux ponts hydrogne peuvent se

rsidu mal appari lextrmit de lamorce, continuant jusqu ce que suffisamment de

former entre G et T dans lADN. De plus, des formes tautomriques rares des quatre bases de

nuclotides aient t retirs pour rgnrer une extrmit 3-OH correctement apparie qui

lADN surviennent transitoirement dans des ratios de 1 sur 10 10 . Ces formes se

peut alors servir damorce pour la synthse dADN. De cette manire, la DNA polymrase

msapparient sans changement dans la gomtrie de lhlice.

fonctionne comme une enzyme self-correctrice ou auto-correctrice qui retire ses propres
erreurs de polymrisation pendant quelle se dplace le long de lADN (Figures REP-8 et

Si la DNA polymrase ne fait rien de spcial lorsquun msappariement survient entre

REP-9).

un nouveau doxyribonucloside triphosphate et la matrice dADN, le mauvais nuclotide


sera souvent incorpor dans la nouvelle chane dADN, crant de frquentes mutations. La

La ncessit de disposer dune extrmit damorce parfaitement apparie est

haute fidlit de la rplication dADN, cependant, ne dpend pas seulement de la

essentielle pour les proprits auto-correctrices de la DNA polymrase. Il nest apparemment

complmentarit dappariement de bases, mais aussi de plusieurs mcanismes de correction

pas possible pour une telle enzyme de dbuter une synthse en absence complte dune

derreurs qui interviennent squentiellement pour corriger tout msappariement initial qui

amorce sans perdre son pouvoir de discrimination entre extrmits 3-OH de bases

pourrait tre survenu.

correctement et mal apparies. Par contraste, les enzymes RNA polymrases impliques dans
la transcription de gnes ne ncessitent pas une correction derreur exonuclolytique efficace :
3

les erreurs ralises dans la fabrication de lARN ne sont pas transmises la prochaine

6.

gnration, et la molcule dARN occasionnellement dfective qui pourrait tre produite na

Une enzyme de polymrisation des nuclotides particulire synthtise les courtes


amorces dARN sur le brin synthse discontinue

aucune incidence sur le long terme. Les RNA polymrases sont ainsi capables de dmarrer de
nouvelles chanes polynuclotidiques sans prsence damorces.

Pour le brin synthse continue, une amorce particulire est ncessaire, mais
seulement au dbut de la rplication : une fois quune fourche de rplication est tablie, la

Une frquence derreur denviron 1 sur 104 est trouve lors de la synthse dARN et

DNA polymrase est continuellement en prsence dune extrmit de chane apparie sur

dans le processus diffrent de traduction des squences dARNm en squences protiques. Ce

laquelle elle peut rajouter de nouveaux nuclotides. Pour le brin synthse discontinue,

niveau derreurs est 100.000 plus important que celui retrouv lors de la rplication de

cependant, chaque fois que la DNA polymrase complte un court fragment dADN

lADN, o une srie de processus de correction derreurs rendent le processus de rplication

dOkazaki (ce qui prend quelques secondes), elle doit dbuter la synthse dun fragment

remarquablement fidle (Tableau REP-1).

entirement nouveau en un site suivant le long du brin matrice (voir Figure REP-7). Un
mcanisme particulier est utilis pour produire le brin amorce appari ncessaire cette DNA

5.

Seule la rplication dADN dans le sens 5 > 3 permet une correction derreurs

polymrase. Ce mcanisme implique une enzyme appele DNA primase, qui utilise des

efficace

ribonuclosides triphosphate pour synthtiser de courtes amorces dARN sur le brin


synthse discontinue (Figure REP-11). Chez les eucaryotes, ces amorces ont une taille

La ncessit de prcision et de fidlit explique probablement pourquoi la rplication


de lADN survient seulement dans le sens 5 > 3. Sil existait une DNA polymrase qui

denviron 10 nuclotides et sont synthtises des intervalles de 100-200 nuclotides sur ce


brin.

rajoute des doxyribonuclosides triphosphate dans le sens 3 > 5, lextrmit 5 de la chane


en croissance, plutt que le nouveau mononuclotide, porterait le groupe activateur

LARN tant structuralement trs similaire lADN, il sapparie avec le brin dADN,

triphosphate. Dans ce cas, les erreurs de polymrisation ne pourraient pas tre simplement

gnrant une double hlice hybride ADN/ARN si les deux squences nuclotidiques sont

hydrolyses, car lextrmit 5 de la chane ainsi cre entranerait immdiatement la

complmentaires. La synthse des amorces dARN suit les mmes principes de matrice que

terminaison de la synthse dADN (Figure REP-10). Il est ainsi beaucoup plus facile de

ceux de la synthse dADN.

corriger une base msapparie qui vient juste dtre rajoute lextrmit 3 dune chane
dADN que si elle avait t rajoute lextrmit 5. Bien que le mcanisme de la rplication

Lamorce ARN contenant un nuclotide correctement appari, avec un groupement 3-

de lADN (voir Figure REP-7) semble premire vue beaucoup plus complexe que le

OH son extrmit, elle peut ainsi subir une longation par la DNA polymrase pour entamer

mcanisme incorrect reprsent en Figure REP-6, il est beaucoup plus prcis car toute la

un fragment dOkazaki. La synthse de chaque extrmit de fragment dOkazaki se termine

synthse dADN a lieu dans le sens 5 > 3.

lorsque la DNA polymrase arrive lamorce dARN attache lextrmit 5 du fragment


prcdent. Pour constituer une chane dADN continue partir de tous les fragments dADN

En dpit de ces sauvegardes contre les erreurs de rplication de lADN, les DNA

synthtiss sur le brin synthse discontinue, un systme particulier de rparation de lADN

polymrases font occasionnellement des erreurs. Cependant, les cellules ont un autre moyen

agit rapidement pour liminer lancienne amorce dARN et la remplacer par de lADN. Une

de corriger ces erreurs par un processus appel strand-directed mismatch repair (rparation

enzyme appele DNA ligase joint ensuite lextrmit 3 du nouveau fragment dADN

dappariement dirig sur un brin).

lextrmit 5 du prcdent pour complter le processus (Figures REP-12 et REP-13).

7.

Les DNA hlicases utilisent le principe que lhydrolyse de lATP peut modifier la

Pourquoi une amorce dARN liminable serait-elle prfrable une amorce

forme dune protine dune manire cyclique et lui permettre ainsi de raliser des travaux

dADN qui naurait alors pas tre limine ?

mcaniques, et ainsi davancer et de se propulser rapidement le long dun ADN simple brin.
Largument quune polymrase auto-correctrice ne peut pas dmarrer la synthse

Lorsquelles rencontrent une rgion de double hlice, elles continuent se dplacer le long du

dune chane de novo implique aussi son inverse : une enzyme qui dbuterait de nouvelles

brin, dcouvrant lhlice des taux pouvant atteindre 1.000 paires nuclotidiques par seconde

chanes ne peut pas tre efficace en auto-correction. Ainsi, toute enzyme qui amorcerait la

(Figures REP-14 et REP-15).

synthse des fragments dOkazaki ferait ncessairement une copie relativement infidle (au
moins 1 erreur sur 105). Mme si les copies retenues dans le produit final constituaient aussi

Le droulement de la double hlice au niveau de la fourche de rplication pourrait tre

peu que 5% du gnome total (par exemple 10 nuclotides par fragment dADN de 200

catalys par deux DNA hlicases qui agiraient de concert, lune se dplaant le long du brin

nuclotides), laugmentation consquente dans du taux global de mutation serait norme. Il

synthse continue et lautre sur celui synthse discontinue. Puisque ces deux brins ont des

semble donc probable que lvolution de lARN la place de lADN comme source

polarits opposes, ces hlicases auraient se dplacer dans des sens opposs le long dun

damorage a procur la cellule un puissant avantage : les ribonuclotides des amorces

simple brin dADN et seraient ainsi des enzymes diffrentes. Les deux types de DNA

marquent ainsi ces squences comme copies suspectes qui doivent alors tre efficacement

hlicases existent. Une hlicase agissant sur la matrice du brin synthse discontinue

limines et remplaces.

semblerait avoir un rle prdominant.

8.

Les Single-Strand DNA-Binding proteins (protines qui se lient lADN simple

Des protines particulires aident ouvrir la double hlice dADN au niveau de la

brin) ou protines SSB, galement appeles protines dstabilisatrices de lhlice, se lient

fourche de rplication

troitement et de manire cooprative aux brins dADN simple brins exposs sans couvrir les
Pour que la synthse dADN ait lieu, la double hlice dADN doit tre ouverte avant la

bases, qui demeurent ainsi disponibles pour servir de matrice. Ces protines sont incapables

fourche de rplication, de telle manire que les nouveaux doxyribonuclosides triphosphate

douvrir une longue hlice dADN directement, mais elles aident les hlicases en stabilisant la

puissent former des appariements de bases avec le brin matrice. Cependant, la double hlice

conformation simple brin droule. De plus, leur liaison caractre coopratif leur permet de

dADN est trs stable dans des conditions normales; les paires de bases sont mises en place

redresser les rgions dADN simple brin de la matrice synthse discontinue, vitant ainsi la

avec une telle force que des tempratures avoisinant celles de lbullition de leau sont

formation de courtes hlices en pingles cheveux qui se forment facilement dans lADN

ncessaires pour sparer les deux brins dans un tube en laboratoire. Pour cette raison, les

simple brin (Figures REP-16 et REP-17). Ces hlices en pingles cheveux peuvent

DNA polymrases et les DNA primases ne peuvent copier une double hlice dADN que si le

empcher et entraver la synthse dADN catalyse par la DNA polymrase.

brin matrice a dj t expos en le sparant de son brin complmentaire. Des protines de


rplication additionnelles sont aussi ncessaires pour aider ouvrir la double hlice et ainsi
prsenter la matrice dADN simple brin approprie pour que la DNA polymrase puisse la

9.

Une molcule de DNA polymrase en dplacement demeure connecte lADN


par un anneau coulissant

copier. Deux types de protines contribuent assurer ce processus : les DNA hlicases et les
Par elles-mmes, les molcules de DNA polymrase ne synthtisent quun court

single-strand DNA-binding proteins (protines qui se lient lADN simple brin).

cordon de nuclotides avant de se dtacher de lADN matrice. La tendance se dissocier


Les DNA hlicases ont t pour la premire fois isoles comme protines qui

rapidement dune molcule dADN permet la molcule de DNA polymrase qui vient
peine de finir de synthtiser un fragment dOkazaki sur le brin synthse discontinue dtre

hydrolysent lATP lorsquelles se lient des simples brins dADN.

rapidement recycle, de telle manire dbuter la synthse du prochain fragment dOkazaki


7

sur le mme brin. Cependant, cette rapide dissociation ne permettrait pas la polymrase de
synthtiser les longs brins dADN produits au niveau de la fourche de rplication sauf apport

Les fonctions des sous-units de la machinerie de rplication sont rsumes dans la

dune protine accessoire qui agirait comme une attache rgule. Cette attache fixerait

Figure REP-20. Deux molcules de DNA polymrase agissent la fourche de rplication,

fermement la polymrase lADN lors de son dplacement, mais la relcherait ds que la

lune sur le brin synthse continue et lautre sur celui synthse discontinue. Lhlice

polymrase se dirige vers une rgion double brin de DNA en avant.

dADN est ouverte par une molcule dADN polymrase attache sur el brin synthse
continue , agissant de concert avec une ou plusieurs molcules de DNA hlicase se dplaant

10.

Comment une attache pourrait-elle empcher la polymrase de se dissocier sans

le long des brins. Louverture de lhlice est facilite par les molcules de protines SSB lies

en mme temps empcher son rapide dplacement le long de la molcule dADN ?

de manire covalente. Alors que la molcule de DNA polymrase sur le brin synthse
continue peut agir de manire continue, la molcule de DNA polymrase sur le brin

La structure tridimensionnelle de la protine attache, dtermine par diffraction aux


rayons X, a rvl quelle forme un grand anneau autour de lhlice dADN. Une partie de

synthse discontinue doit redmarrer de courts intervalles, en utilisant une courte amorce
dARN produite par une molcule de DNA primase.

lanneau se lie au corps de la DNA polymrase,et lanneau en entier coulisse librement le long
de lADN pendant que la polymrase se dplace. Lassemblage de lanneau autour de lADN

Lefficacit de la rplication est grandement augmente par lassociation troite de

ncessite une hydrolyse dATP par une protine particulire, le chargeur dattache (pour

tous ces composants protiques. Chez les procaryotes, la molcule primase est lie

clamp loader), qui hydrolyse lATP pendant quil charge lattache sur une jonction amorce-

directement une DNA hlicase pour former une unit sur le brin synthse discontinue

matrice (Figure REP-18).

appel primosome. Fonctionnant avec la DNA hlicase, le primosome se dplace avec la


fourche de rplication, synthtisant lamorce dARN alors quil avance. De manire similaire,

Sur la matrice synthse continue, la DNA polymrase est troitement lie lattache,

la molcule de DNA polymrase qui synthtise lADN sur le brin synthse discontinue se

et les deux ensemble demeurent associes pendant une longue dure. Cependant, sur le brin

dplace en concert avec le reste des protines, synthtisant une succession de nouveaux

synthse discontinue, chaque fois que la polymrase atteint lextrmit 5 du fragment

fragments dOkazaki. Pour sadapter cet arrangement, le brin synthse discontinue

dOkazaki prcdent, la polymrase est relche; cette molcule de polymrase sassocie

semblerait tre repli dune certaine manire (Figure REP-21), ce qui faciliterait le

ensuite avec une nouvelle attache qui est assemble sur lamorce dARN du prochain

chargement de lattache de polymrase chaque fois quun fragment dOkazaki est synthtis :

fragment dOkazaki (Figure REP-19).

le chargeur dattache et la molcule de DNA polymrase sur le brin synthse discontinue


sont laisss en place comme une partie de la machinerie protique, mme lorsquils se

11.

Au niveau de la fourche de rplication, les protines cooprent pour former une

dtachent de lADN. Les protines de rplication sont ainsi lies ensemble en une grande

machinerie de rplication

unit unique (avec une masse molculaire totale > 106 daltons) qui se dplace rapidement le
long de lADN, permettant lADN dtre synthtis des deux cts de la fourche de

Bien que nous ayons parl de la rplication dADN comme si elle tait ralise par un

rplication de manire coordonne et efficace.

ensemble de protines agissant toutes indpendamment, en ralit, la plupart de ces protines


sont regroupes ensemble en un grand complexe multi-enzymatique qui se dplace

Sur le brin synthse discontinue, la machinerie de rplication de lADN laisse une

rapidement le long de lADN. Ce complexe peut tre compar une minuscule machine

srie de fragments dOkazaki non joints, qui contiennent encore lARN qui a servi damorce

coudre compose de protines et fonctionnant avec lnergie de lhydrolyse des nuclosides

leur synthse. LARN est retir et les trous rsultants remplis par les enzymes de rparation de

triphosphate. Bien que le complexe de rplication ait t le plus intensivement tudi chez E.

lADN qui agissent aprs la fourche de rplication (voir Figure REP-12).

coli et plusieurs de ses virus, un complexe trs similaire opre galement chez les eucaryotes.
9

10

12.

Le systme de rparation dappariement dirig sur un brin (strand-directed

slectivement enlevs. Le processus en trois tapes implique la reconnaissance dun

mismatch repair) limine les erreurs de rplication ayant chapp la vigilance

msappariement, lexcision du segment dADN contenant le msappariement partir du brin

de la machinerie de rplication

no-synthtis, et la re-synthse du segment excis en utilisant lancien brin comme matrice,


permettant ainsi dliminer le msappariement. Ce systme de rparation dappariement dirig

Les bactries, telles que E. coli, sont capables de se diviser chaque 30 minutes,
permettant assez facilement de cribler de grandes populations pour trouver une cellule

sur un brin rduit le nombre derreurs fates pendant la rplication dADN par un facteur
additionnel denviron102.

mutante rare qui serait altre dans un processus spcifique. Une classe intressante de
mutants porte des altrations dans des gnes dits mutateurs, ce qui augmente grandement le

Un systme similaire de correction derreurs de msappariement fonctionne dans les

taux de mutations spontanes lorsquils sont inactivs. Un tel mutant fabrique une forme

cellules humaines. Limportance de ce systme est souligne par le fait que les individus qui

dfective dexonuclase 3 > 5 correctrice derreur, qui fait partie de lenzyme DNA

hritent une copie dfective dun gne de rparation de msappariement (avec pourtant un

polymrase (voir Figures REP-8 et REP-9). Lorsque cette activit est dfective, la DNA

gne fonctionnel sur lautre copie de chromosome) ont une prdisposition marque pour

polymrase ne corrige pas efficacement les erreurs et plusieurs erreurs de rplication qui

certains types de cancers. Pour un type de cancers du clon, appel HNPCC, une mutation

auraient pu tre enleves saccumulent dans lADN.

spontane du gne fonctionnel restant produit un clone de cellules somatiques qui, en raison

Ltude dautres mutants E. coli montrant des taux de mutation anormalement levs a

de leur dficience en correction derreurs de msappariements, accumule les mutations avec

permis de dcouvrir un autre systme de correction derreurs qui enlve les erreurs de

une rapidit inhabituelle. La plupart des cancers surviennent des cellules qui ont accumul des

rplication fates par la DNA polymrase et qui ont t oublies par lexonuclase correctrice

mutations multiples, et les cellules dficientes en correction derreurs de msappariement ont

derreurs. Ce systme de rparation dappariement dirig sur un brin (strand-directed

alors un risque plus lev de devenir cancreuses. Heureusement, la plupart dentre nous

mismatch repair) dtecte le potentiel de distorsion dans lhlice dADN qui rsulte de la non

hritent deux copies normales de chaque gne codant pour une protine correctrice derreurs

complmentarit de paires de bases. Mais, si le systme de correction derreurs reconnaissait

de msappariements; cela a un effet protecteur car il est fortement improbable que les deux

simplement un msappariement dans lADN nouvellement rpliqu et corrigeait

copies soient mures dans la mme cellule.

alatoirement un des deux nuclotides mal appari, il corrigerait par erreur le brin matrice
original une fois sur deux, chouant ainsi faire diminuer le taux derreur global. Pour tre

Chez les eucaryotes, le mcanisme permettant de distinguer le brin no-synthtis du

efficace, un tel systme de correction derreurs devrait tre capable de distinguer et retirer le

brin matrice parental au niveau du site dun msappariement ne dpend pas de la mthylation

nuclotide mal appari seulement sur le brin no-synthtis, l o lerreur de rplication est

de lADN. En effet, quelques eucaryotes (incluant les levures et Drosophila) ne mthylent pas

survenue.

leur ADN. Les brins dADN nouvellement synthtiss seraient prfrentiellement entaills, et
des expriences biochimiques rvlent que de telles entailles ou nicks (appeles galement

Le mcanisme de distinction de brin utilis par le systme de correction derreurs de


msappariements chez E. coli repose sur la mthylation de rsidus A choisis dans lADN. Ces

cassures simple brin) fournirait un signal qui dirigerait le systme de correction derreurs de
msappariements vers le brin appropri dans la cellule eucaryote (Figure REP-22).

groupes mthyls sont rajouts tous les rsidus A dans la squence GATC, mais pas avant un
certain temps aprs que le A ait t incorpor dans une chane dADN nouvellement
synthtise. Ainsi, les seules squences GATC qui nauraient pas encore t mthyles sont
celles dans les brins no-synthtiss, juste aprs la fourche de rplication. La reconnaissance
de ces GATCs non mthyls permet aux brins dADN nouveaux dtre reconnus
distinctivement des anciens brins, particulirement si des msappariements auraient tre
11

12

13.

Les DNA topoisomrases empchent lenchevtrement de lADN pendant la

deux double hlices se croisent lune avec lautre. Une fois quune molcule de topoisomrase

rplication

II se lie un tel site de croisement, la protine utilise lhydrolyse dATP pour raliser la srie
de ractions suivantes de manire efficace : (1) elle casse une double hlice rversiblement

Lorsquune fourche de rplication se dplace le long dun ADN double brin, elle cre

pour crer une entre dans lADN, (2) elle ralise la deuxime cassure proximit de la

ce quon appelle un problme denchevtrement. Chaque 10 paires de bases rpliques au

double hlice pour passer travers cette cassure, et (3) elle ressoude les cassures et se dissocie

niveau de la fourche correspondent un tour complet autour de laxe de la double hlice

de lADN (Figure REP-25).

parentale. Ainsi, pour que la fourche de rplication se dplace, le chromosome en entier en


avant de la fourche devrait normalement tourner rapidement (Figure REP-23). Cela
ncessiterait de grandes quantits dnergie pour de grands chromosomes, et une stratgie

De cette manire, les DNA topoisomrases de type II peuvent efficacement sparer


deux molcules enchevtres (Figure REP-26).

alternative est utilise au lieu de cela : un pivot est form dans lhlice dADN par des
protines appeles DNA topoisomrases.

La mme raction empche ainsi les problmes denchevtrements importants dADN


qui pourraient survenir pendant la rplication.

Une DNA topoisomrase est une sorte de nuclase rversible qui se rajoute de manire
covalente la colonne vertbrale de phosphates de lADN, cassant de cette faon un pont

14.

La rplication dADN est similaire chez les eucaryotes et les bactries

phosphodiester dans le brin dADN. Cette raction est rversible, et le pont phosphodiester se
reforme lorsque la protine se dtache.

Beaucoup de ce que lon sait sur la rplication de lADN a t apport par les tudes
de systmes multi-enzymatiques purifis partir des bactries et des bactriophages, et

Un type de topoisomrases, appel topoisomrase I, cre une cassure (ou nick)

capables de rpliquer de lADN in vitro. Le dveloppement de ces systmes dans les annes

simple brin transitoire; cette cassure dans la colonne vertbrale de liaisons phosphodiesters

70 a t grandement facilit par lisolement de mutants dans une grande varit de gnes

permet aux deux sections de lhlice dADN de part et dautre de la cassure de tourner

impliqus dans la rplication; ces mutants ont t exploits pour identifier et purifier les

librement lune par rapport lautre, utilisant le pont phosphodiester dans le brin oppos la

protines de rplication correspondantes. Le premier systme de rplication chez les

cassure comme point pivot (Figure REP-24). Toute tension dans lhlice dADN va entraner

mammifres qui rpliquait fidlement de lADN in vitro a t dcrit dans les annes 80, et des

cette rotation dans le sens qui relche ou soulage cette tension. La rplication dADN peut

mutations dans les gnes codant presque tous les composants de la rplication ont maintenant

ainsi se faire avec la rotation de seulement une courte longueur dhlice (la partie juste en

t isols et analyss chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Enormment de connaissances

avant de la fourche). Le problme denchevtrement analogue qui survient pendant la

ont ainsi t accumules sur lenzymologie dtaille de la rplication de lADN chez les

transcription de de lADN est rsolu dune manire similaire. Etant donn que la liaison

eucaryotes, et il est clair que les traits fondamentaux de la rplication de lADN (incluant la

covalente entre la DNA topoisomrase et un phosphate de lADN retient lnergie du pont

gomtrie de la fourche de rplication et lutilisation dune machinerie de rplication multi-

phosphodiester cliv, la reformation du pont est rapide et ne ncessite pas lapport dnergie

protique) ont t conservs durant le long processus dvolution qui a permis la sparation

additionnelle. A cet gard, le mcanisme de re-jonction est diffrent de celui catalys par

des bactries et des eucaryotes.

lenzyme DNA ligase (voir Figure REP-13).


Il y a plus de composants protiques dans les machineries de rplication eucaryotes
Un deuxime type de DNA topoisomrases, la topoisomrase II, forme une liaison

compares leurs analogues bactriens, quoique les fonctions basiques restent les mmes.

covalente avec les deux brins de lhlice dADN en mme temps, crant une cassure double

Ainsi, par exemple, la protine SSB eucaryote est forme de trois sous-units, alors que seule

brin transitoire dans lhlice. Ces enzymes sont actives par des sites chromosomiques o

une seule sous-unit est trouve chez les bactries. Similairement, la DNA primase est

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incorpore lintrieur dune enzyme pluri-sous-unitaire appel DNA polymrase alpha. La


polymrase alpha dbute chaque fragment dOkazaki sur le brin synthse discontinue avec
de lARN et tend ensuite lamorce ARN avec une courte longueur dADN, avant de laisser

Figure REP-1. The DNA double helix acts as a template for its own duplication. Because
the nucleotide A will successfully pair only with T, and G only with C, each strand of DNA
can serve as a template to specify the sequence of nucleotides in its complementary strand by
DNA base-pairing. In this way, a double-helical DNA molecule can be copied precisely.

lextrmit 3 de cette amorce une seconde enzyme, la DNA polymrase delta. Cette
deuxime DNA polymrase synthtise ensuite le reste de chaque fragment dOkazaki avec
laide dune protine dattache (Figure REP-27).

La machinerie de rplication eucaryote a de plus une complication supplmentaire,


celle dassurer la rplication travers les nuclosomes, ces units structurales rptes des
chromosomes. Les nuclosomes sont espacs des intervalles denviron 200 paires
nuclotidiques le long de lADN, ce qui pourrait expliquer pourquoi les nouveaux fragments
dOkazaki sont synthtiss sur le brin synthse discontinue des intervalles de 100-200
nuclotides chez les eucaryotes, au lieu de 1.000-2.000 nuclotides comme chez les bactries.
Les nuclosomes pourraient aussi agir comme des barrires qui ralentiraient le dplacement
des molcules de DNA polymrases, ce qui pourrait expliquer que les fourches de rplication
eucaryotes se dplacent dix fois moins vite que les fourches de rplication chez les bactries.

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Figure REP-2. The chemistry of DNA synthesis. The addition of a deoxyribonucleotide to


the 3 end of a polynucleotide chain (the primer strand) is the fundamental reaction by which
DNA is synthesized. As shown, base-pairing between an incoming deoxyribonucleoside
triphosphate and an existing strand of DNA (the template strand) guides the formation of the
new strand of DNA and causes it to have a complementary nucleotide sequence.

Figure REP-3. DNA synthesis catalyzed by DNA polymerase. (A) As indicated, DNA
polymerase catalyzes the stepwise addition of a deoxyribonucleotide to the 3-OH end of a
polynucleotide chain, the primer strand, that is paired to a second template strand. The newly
synthesized DNA strand therefore polymerizes in the 5-to-3 direction as shown in the
previous figure. Because each incoming deoxyribonucleoside triphosphate must pair with the
template strand to be recognized by the DNA polymerase, this strand determines which of the
four possible deoxyribonucleotides (A, C, G, or T) will be added. The reaction is driven by a
large, favorable free-energy change, caused by the release of pyrophosphate and its
subsequent hydrolysis to two molecules of inorganic phosphate. (B) The structure of an E.
coli DNA polymerase molecule, as determined by x-ray crystallography. Roughly speaking, it
resembles a right hand in which the palm, fingers, and thumb grasp the DNA. This drawing
illustrates a DNA polymerase that functions during DNA repair, but the enzymes that
replicate DNA have similar features. (B, adapted from L.S. Beese, V. Derbyshire, and T.A.
Steitz, Science 260:352355, 1993.)

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Figure REP-4. The semiconservative nature of DNA replication. In a round of replication,


each of the two strands of DNA is used as a template for the formation of a complementary
DNA strand. The original strands therefore remain intact through many cell generations.

Figure REP-5. Two replication forks moving in opposite directions on a circular


chromosome. An active zone of DNA replication moves progressively along a replicating
DNA molecule, creating a Y-shaped DNA structure known as a replication fork: the two arms
of each Y are the two daughter DNA molecules, and the stem of the Y is the parental DNA
helix. In this diagram, parental strands are orange; newly synthesized strands are red.
(Micrograph courtesy of Jerome Vinograd.)

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Figure REP-6. An incorrect model for DNA replication. Although it might seem to be the
simplest possible model for DNA replication, the mechanism illustrated here is not the one
that cells use. In this scheme, both daughter DNA strands would grow continuously, using the
energy of hydrolysis of the two terminal phosphates (yellow circles highlighted by red rays)
to add the next nucleotide on each strand. This would require chain growth in both the 5-to3 direction (top) and the 3-to-5 direction (bottom). No enzyme that catalyzes 3-to-5
nucleotide polymerization has ever been found.

Figure REP-7. The structure of a DNA replication fork. Because both daughter DNA
strands are polymerized in the 5-to-3 direction, the DNA synthesized on the lagging strand
must be made initially as a series of short DNA molecules, called Okazaki fragments.

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Figure REP-8. Exonucleolytic proofreading by DNA polymerase during DNA


replication. In this example, the mismatch is due to the incorporation of a rare, transient
tautomeric form of C, indicated by an asterisk. But the same proofreading mechanism applies
to any misincorporation at the growing 3-OH end.

Figure REP-9. Editing by DNA polymerase. Outline of the structures of DNA polymerase
complexed with the DNA template in the polymerizing mode (left) and the editing mode
(right). The catalytic site for the exonucleolytic (E) and the polymerization (P) reactions are
indicated. To determine these structures by x-ray crystallography, researchers froze the
polymerases in these two states, by using either a mutant polymerase defective in the
exonucleolytic domain (right), or by withholding the Mg2+ required for polymerization (left).

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Tableau REP-1. The Three Steps That Give Rise to High-Fidelity DNA Synthesis
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Replication step
Errors per nucleotide polymerized
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------5 > 3 polymerization
1 x 105
3 > 5 exonucleolytic proofreading
1 x 102
Strand-directed mismatch repair
1 x 102
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Total
1 x 109
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

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Figure REP-10. An explanation for the 5-to-3 direction of DNA chain growth. Growth
in the 5-to-3 direction, shown on the right, allows the chain to continue to be elongated
when a mistake in polymerization has been removed by exonucleolytic proofreading (see
Figure REP-8). In contrast, exonucleolytic proofreading in the hypothetical 3-to-5
polymerization scheme, shown on the left, would block further chain elongation. For
convenience, only the primer strand of the DNA double helix is shown.

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Figure REP-11. RNA primer synthesis. A schematic view of the reaction catalyzed by DNA
primase, the enzyme that synthesizes the short RNA primers made on the lagging strand using
DNA as a template. Unlike DNA polymerase, this enzyme can start a new polynucleotide
chain by joining two nucleoside triphosphates together. The primase synthesizes a short
polynucleotide in the 5-to-3 direction and then stops, making the 3 end of this primer
available for the DNA polymerase.

Figure REP-12. The synthesis of one of the many DNA fragments on the lagging strand.
In eucaryotes, RNA primers are made at intervals spaced by about 200 nucleotides on the
lagging strand, and each RNA primer is approximately 10 nucleotides long. This primer is
erased by a special DNA repair enzyme (an RNAse H) that recognizes an RNA strand in an
RNA/DNA helix and fragments it; this leaves gaps that are filled in by DNA polymerase and
DNA ligase.

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Figure REP-13. The reaction catalyzed by DNA ligase. This enzyme seals a broken
phosphodiester bond. As shown, DNA ligase uses a molecule of ATP to activate the 5 end at
the nick (step 1) before forming the new bond (step 2). In this way, the energetically
unfavorable nick-sealing reaction is driven by being coupled to the energetically favorable
process of ATP hydrolysis.

Figure REP-14. An assay used to test for DNA helicase enzymes. A short DNA fragment
is annealed to a long DNA single strand to form a region of DNA double helix. The double
helix is melted as the helicase runs along the DNA single strand, releasing the short DNA
fragment in a reaction that requires the presence of both the helicase protein and ATP. The
rapid step-wise movement of the helicase is powered by its ATP hydrolysis.

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Figure REP-15. The structure of a DNA helicase. (A) A schematic diagram of the protein
as a hexameric ring. (B) Schematic diagram showing a DNA replication fork and helicase to
scale. (C) Detailed structure of the bacteriophage T7 replicative helicase, as determined by xray diffraction. Six identical subunits bind and hydrolyze ATP in an ordered fashion to propel
this molecule along a DNA single strand that passes through the central hole. Red indicates
bound ATP molecules in the structure. (B, courtesy of Edward H. Egelman; C, from M.R.
Singleton et al., Cell 101:589600, 2000. Elsevier.)

Figure REP-16. The effect of single-strand DNA-binding proteins (SSB proteins) on the
structure of single-stranded DNA. Because each protein molecule prefers to bind next to a
previously bound molecule, long rows of this protein form on a DNA single strand. This
cooperative binding straightens out the DNA template and facilitates the DNA polymerization
process. The hairpin helices shown in the bare, single-stranded DNA result from a chance
matching of short regions of complementary nucleotide sequence; they are similar to the short
helices that typically form in RNA molecules.

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Figure REP-17. The structure of the single-strand binding protein from humans bound
to DNA. (A) A front view of the two DNA binding domains of RPA protein, which cover a
total of eight nucleotides. Note that the DNA bases remain exposed in this proteinDNA
complex. (B) A diagram showing the three-dimensional structure, with the DNA strand (red)
viewed end-on. (B, from A. Bochkarev et al., Nature 385:176181, 1997. Macmillan
Magazines Ltd.)

Figure REP-18. The regulated sliding clamp that holds DNA polymerase on the DNA.
(A) The structure of the clamp protein from E. coli, as determined by x-ray crystallography,
with a DNA helix added to indicate how the protein fits around DNA. (B) A similar protein is
present in eucaryotes, as illustrated by this comparison of the E. coli sliding clamp (left) with
the PCNA protein from humans (right). (C) Schematic illustration showing how the clamp is
assembled to hold a moving DNA polymerase molecule on the DNA. In the simplified
reaction shown here, the clamp loader dissociates into solution once the clamp has been
assembled. At a true replication fork, the clamp loader remains close to the lagging-strand
polymerase, ready to assemble a new clamp at the start of each new Okazaki fragment (see
Figure REP-21). (A and B, from X.-P. Kong et al., Cell 69:425437, 1992. Elsevier.)

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Figure REP-19. A cycle of loading and unloading of DNA polymerase and the clamp
protein on the lagging strand. The association of the clamp loader with the lagging-strand
polymerase shown here is for illustrative purposes only; in reality, the clamp loader is carried
along with the replication fork in a complex that includes both the leading-strand and laggingstrand DNA polymerases (see Figure REP-21).

Figure REP-20. The proteins at a bacterial DNA replication fork. The major types of
proteins that act at a DNA replication fork are illustrated, showing their approximate positions
on the DNA.

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Figure REP-21. A moving replication fork. (A) This schematic diagram shows a current
view of the arrangement of replication proteins at a replication fork when the fork is moving.
The diagram in Figure REP-20 has been altered by folding the DNA on the lagging strand to
bring the lagging-strand DNA polymerase molecule into a complex with the leading-strand
DNA polymerase molecule. This folding process also brings the 3 end of each completed
Okazaki fragment close to the start site for the next Okazaki fragment (compare with Figure
REP-20). Because the lagging-strand DNA polymerase molecule remains bound to the rest of
the replication proteins, it can be reused to synthesize successive Okazaki fragments. In this
diagram, it is about to let go of its completed DNA fragment and move to the RNA primer
that will be synthesized nearby, as required to start the next DNA fragment. Note that one
daughter DNA helix extends toward the bottom right and the other toward the top left in this
diagram. Additional proteins help to hold the different protein components of the fork
together, enabling them to function as a well-coordinated protein machine. The actual protein
complex is more compact than indicated, and the clamp loader is held in place by interactions
not shown here. (B) An electron micrograph showing the replication machine from the
bacteriophage T4 as it moves along a template synthesizing DNA behind it. (C) An
interpretation of the micrograph is given in the sketch: note especially the DNA loop on the
lagging strand. Apparently, the replication proteins became partly detached from the very
front of the replication fork during the preparation of this sample for electron microscopy. (B,
courtesy of Jack Griffith.)

Figure REP-22. A model for strand-directed mismatch repair in eucaryotes. (A) The two
proteins shown are present in both bacteria and eucaryotic cells: MutS binds specifically to a
mismatched base pair, while MutL scans the nearby DNA for a nick. Once a nick is found,
MutL triggers the degradation of the nicked strand all the way back through the mismatch.
Because nicks are largely confined to newly replicated strands in eucaryotes, replication
errors are selectively removed. In bacteria, the mechanism is the same, except that an
additional protein in the complex (MutH) nicks unmethylated (and therefore newly replicated)
GATC sequences, thereby beginning the process illustrated here. (B) The structure of the
MutS protein bound to a DNA mismatch. This protein is a dimer, which grips the DNA
double helix as shown, kinking the DNA at the mismatched base pair. It seems that the MutS
protein scans the DNA for mismatches by testing for sites that can be readily kinked, which
are those without a normal complementary base pair. (B, from G. Obmolova et al., Nature
407:703710, 2000. Macmillan Magazines Ltd.)

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Figure REP-23. The winding problem that arises during DNA replication. For a
bacterial replication fork moving at 500 nucleotides per second, the parental DNA helix ahead
of the fork must rotate at 50 revolutions per second.

Figure REP-24. The reversible nicking reaction catalyzed by a eucaryotic DNA


topoisomerase I enzyme. As indicated, these enzymes transiently form a single covalent
bond with DNA; this allows free rotation of the DNA around the covalent backbone bonds
linked to the blue phosphate.

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Figure REP-25. A model for topoisomerase II action. As indicated, ATP binding to the two
ATPase domains causes them to dimerize and drives the reactions shown. Because a single
cycle of this reaction can occur in the presence of a non-hydrolyzable ATP analog, ATP
hydrolysis is thought to be needed only to reset the enzyme for each new reaction cycle. This
model is based on structural and mechanistic studies of the enzyme. (Modified from J.M.
Berger, Curr. Opin. Struct. Biol. 8:2632, 1998.)

Figure REP-26. The DNA-helix-passing reaction catalyzed by DNA topoisomerase II.


Identical reactions are used to untangle DNA inside the cell. Unlike type I topoisomerases,
type II enzymes use ATP hydrolysis and some of the bacterial versions can introduce
superhelical tension into DNA. Type II topoisomerases are largely confined to proliferating
cells in eucaryotes; partly for that reason, they have been popular targets for anticancer drugs.

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Figure REP-27. A mammalian replication fork. The fork is drawn to emphasize its
similarity to the bacterial replication fork depicted in Figure REP-20. Although both forks use
the same basic components, the mammalian fork differs in at least two important respects.
First, it uses two different DNA polymerases on the lagging strand. Second, the mammalian
DNA primase is a subunit of one of the lagging-strand DNA polymerases, DNA polymerase
alpha, while that of bacteria is associated with a DNA helicase in the primosome. The
polymerase apha (with its associated primase) begins chains with RNA, extends them with
DNA, and then hands the chains over to the second polymerase (delta), which elongates them.
It is not known why eucaryotic DNA replication requires two different polymerases on the
lagging strand. The major mammalian DNA helicase seems to be based on a ring formed from
six different Mcm proteins; this ring may move along the leading strand, rather than along the
lagging-strand template shown here.

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