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TD 3:

Techniques de fractionnement
cellulaire

Introduction

Pour analyser la structure et/ou la composition des constituants cellulaires il faut


dabord les sparer.
on va librer le contenu des cellules en dtruisant les membranes et les
parois
On obtient un homognat (mlange de tout les constituants)
La sparation des constituants de ce mlange est appele: le
fractionnement cellulaire.

Plan

La centrifugation

Llectrophorse

La chromatographie

1. La Centrifugation
Dfinition
Un procd de sparation des composs dun mlange dans une solution en
fonction de leur diffrence de densit
En biologie, la centrifugation est utilise pour sparer :
les constituants cellulaires: membrane, mitochondrie, plaste ,golgi.
Les molcules: protines, acides nucliques.

1. La Centrifugation
Principe
Les composs dans le fluide situs une distance r de l'axe de rotation sont
soumis diffrentes force
La sparation s'opre par l'action de la force centrifuge Fc sur les composs

1. La Centrifugation

Centrifugation diffrentielle

La centrifugation
Centrifugation par gradient

1. La Centrifugation

La centrifugeuse

1. La Centrifugation

1. La Centrifugation
Centrifugation diffrentielle
on centrifuge lhomognat diffrentes vitesses, chaque vitesse
diffrents constituants se dposent dans le culot.

Rotation angle fixe

1. La Centrifugation
Centrifugation diffrentielle du sang

1. La Centrifugation
Centrifugation par gradient
Lhomognat est centrifug travers des solutions dj prpares des concentrations
diffrentes (densits diffrentes).
Les diffrents constituants de lhomognat sdimentent des vitesses diffrentes sous
forme de bandes des niveaux diffrents correspondant leurs densits.

1. La Centrifugation
Ultracentrifugation

1. La Centrifugation
Ultracentrifugeuse

2. Llectrophorse
Dfinition
Electrophorse = Mthode de sparation et caractrisation de
molcules (protines et acides nucliques) laide dun champs
lectrique.
Electro : nergie lectrique
Phoresis : phoros (Grec) porter, avoir en soi

Principales applications:

Biochimie, mdecine et biologie molculaire

2. Llectrophorse
Principe de llectrophorse
Sous leffet dun champs lectrique une molcule avec une
charge donne va migrer vers llectrode de signe oppose sa
charge.
Gnrateur lectrique

+
-- ++

2. Llectrophorse
Principe de llectrophorse
Si on entoure toutes les molcules de la mme charge (par exemple charge ngative):
Elles vont toutes migrer dans un mme sens (vers llectrode positive)
Les molcules de petite taille migrent rapidement
Les molcules de grande taille migrent lentement
Ainsi les molcules vont se sparer les une des autres.
Gnrateur lectrique

2. Llectrophorse
Electrophorse, Catgories et types
Electrophorse sur veine liquide
Electrophorse sur support solide ou semi-solide
Sur papier
Sur Actate de cellulose
Sur Gels: la plus utilise
Electrophorse horizontale sur gel dagarose:

principalement pour sparer les molcules dacides nucliques


o Electrophorse simple (molcules de taille moyenne et petites)
o Electrophorse en champ puls (grandes molcules dacides nucliques)
Electrophorse verticale sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE: Sodium Dodecyl
Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis):

pour sparer les molcules dacides nucliques et les protines


o Electrophorse unidimensionnelle
o Electrophorse bi-dimensionnelle

2. Llectrophorse
Electrophorse sur papier
Sparation des petites molcules (acides amins ou petits peptides)
Aprs migration les molcules spares se prsentent sous forme de taches quon
peut rvler avec un colorant

Peu utilise de nos jours

2. Llectrophorse
Electrophorse horizontale sur gel dagarose
Le mlange tudier est dpos sur un gel plac horizontalement dans une cuve
(boite) remplie avec une solution tampon
La cuve est branche par 2 lectrodes (une cathode et une anode) un
gnrateur de courant.
Aprs migration les molcules spares se prsentent sous forme de bandes
quon peut visualiser avec un colorant

Coloration des bandes dacides nucliques


avec le Bromure dEthydium

2. Llectrophorse
Electrophorse verticale sur gel de polyacrylamide
(SDS-PAGE: PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)
Le mlange tudier est dpos sur un gel dacrylamide coul entre 2 plaques

de verres et plac verticalement dans une cuve


Aprs migration les molcules spares se prsentent sous forme de bandes
quon peut colorer

Coloration des bandes de protines avec le


bleu de Coomassie

2. Llectrophorse
Electrophorse bi-dimensionnelle

Dimension 1

1ere Sparation par la charge


sur un petit gel avec gradient de pH

Dimension 2
sparation par la
masse
Electrophorse SDSP.A.G.E

2me

On pose le petit gel sur un


grand gel

Coloration au Bleu de
Coomassie

2. Llectrophorse
Western blot (Immunoblot)

Aprs sparation par lectrophorse les protines peuvent tre:


transfres sur un filtre de nitrocellulose
Puis marques avec des anticorps

Gel avec protines


Filtre de nitrocellulose

Y
Y YY

Transfert des protines sur le filtre

Le filtre est plong dans


une solution avec des
anticorps

Marquage prcis
dune protine

2. Llectrophorse
Western blot, matriel

Cuve de transfert

Marquage prcis
dune protine

3. La chromatographie
Dfinition
Cest une mthode d'analyse physico-chimique qui spare les constituants
d'un mlange (les soluts) par entranement au moyen d'une phase
mobile (liquide ou gaz) le long d'une phase stationnaire (papier, glatine, silice,
polymre, silice greffe etc), grce la rpartition slective des soluts entre
ces deux phases

Une force de rtention (exerce


par la phase stationnaire)
Chaque solut est
donc soumis
Une force de mobilit (due la
phase mobile)

3. La chromatographie
Chromatographie sur papier

Solvant

3. La chromatographie

Les mthodes chromatographiques peuvent tre classes en


fonction de la nature physique des phases (mobile et stationnaire)

Parmi ces mthodes, les plus courantes sont:


La chromatographie liquide haute performance (HPLC)
La chromatographie en phase gazeuse (CPG)

3. La chromatographie
Chromatographie liquide haute performance (HPLC)

C'est une mthode de sparation des constituants d'un mlange


qui emploie:

Un solvant comme phase mobile


Un solide ou un liquide support par un solide comme phase
stationnaire

3. La chromatographie
Chromatographie liquide haute performance (HPLC)

Chromatographie ionique
Chromatographie d'adsorption
Chromatographie de partage
Chromatographie d'exclusion

3. La chromatographie
Chromatographie liquide haute performance (HPLC)
Exemples

Couche mince

3. La chromatographie
La chromatographie en phase gazeuse (CPG)
La chromatographie en phase gazeuse est une technique
de sparation des molcules
Lchantillon est plac dans un injecteur et chauff par une
flamme
Les lments volatils vont ensuite tre emports par un gaz

porteur (phase mobile) qui va les amener dans la phase


stationnaire pour qu'ils y soient spars et quantifis

3. La chromatographie
La chromatographie en phase gazeuse (CPG)

3. La chromatographie
La chromatographie en phase gazeuse (CPG)