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Techniques de fractionnement
cellulaire
Introduction
Plan
La centrifugation
Llectrophorse
La chromatographie
1. La Centrifugation
Dfinition
Un procd de sparation des composs dun mlange dans une solution en
fonction de leur diffrence de densit
En biologie, la centrifugation est utilise pour sparer :
les constituants cellulaires: membrane, mitochondrie, plaste ,golgi.
Les molcules: protines, acides nucliques.
1. La Centrifugation
Principe
Les composs dans le fluide situs une distance r de l'axe de rotation sont
soumis diffrentes force
La sparation s'opre par l'action de la force centrifuge Fc sur les composs
1. La Centrifugation
Centrifugation diffrentielle
La centrifugation
Centrifugation par gradient
1. La Centrifugation
La centrifugeuse
1. La Centrifugation
1. La Centrifugation
Centrifugation diffrentielle
on centrifuge lhomognat diffrentes vitesses, chaque vitesse
diffrents constituants se dposent dans le culot.
1. La Centrifugation
Centrifugation diffrentielle du sang
1. La Centrifugation
Centrifugation par gradient
Lhomognat est centrifug travers des solutions dj prpares des concentrations
diffrentes (densits diffrentes).
Les diffrents constituants de lhomognat sdimentent des vitesses diffrentes sous
forme de bandes des niveaux diffrents correspondant leurs densits.
1. La Centrifugation
Ultracentrifugation
1. La Centrifugation
Ultracentrifugeuse
2. Llectrophorse
Dfinition
Electrophorse = Mthode de sparation et caractrisation de
molcules (protines et acides nucliques) laide dun champs
lectrique.
Electro : nergie lectrique
Phoresis : phoros (Grec) porter, avoir en soi
Principales applications:
2. Llectrophorse
Principe de llectrophorse
Sous leffet dun champs lectrique une molcule avec une
charge donne va migrer vers llectrode de signe oppose sa
charge.
Gnrateur lectrique
+
-- ++
2. Llectrophorse
Principe de llectrophorse
Si on entoure toutes les molcules de la mme charge (par exemple charge ngative):
Elles vont toutes migrer dans un mme sens (vers llectrode positive)
Les molcules de petite taille migrent rapidement
Les molcules de grande taille migrent lentement
Ainsi les molcules vont se sparer les une des autres.
Gnrateur lectrique
2. Llectrophorse
Electrophorse, Catgories et types
Electrophorse sur veine liquide
Electrophorse sur support solide ou semi-solide
Sur papier
Sur Actate de cellulose
Sur Gels: la plus utilise
Electrophorse horizontale sur gel dagarose:
2. Llectrophorse
Electrophorse sur papier
Sparation des petites molcules (acides amins ou petits peptides)
Aprs migration les molcules spares se prsentent sous forme de taches quon
peut rvler avec un colorant
2. Llectrophorse
Electrophorse horizontale sur gel dagarose
Le mlange tudier est dpos sur un gel plac horizontalement dans une cuve
(boite) remplie avec une solution tampon
La cuve est branche par 2 lectrodes (une cathode et une anode) un
gnrateur de courant.
Aprs migration les molcules spares se prsentent sous forme de bandes
quon peut visualiser avec un colorant
2. Llectrophorse
Electrophorse verticale sur gel de polyacrylamide
(SDS-PAGE: PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)
Le mlange tudier est dpos sur un gel dacrylamide coul entre 2 plaques
2. Llectrophorse
Electrophorse bi-dimensionnelle
Dimension 1
Dimension 2
sparation par la
masse
Electrophorse SDSP.A.G.E
2me
Coloration au Bleu de
Coomassie
2. Llectrophorse
Western blot (Immunoblot)
Y
Y YY
Marquage prcis
dune protine
2. Llectrophorse
Western blot, matriel
Cuve de transfert
Marquage prcis
dune protine
3. La chromatographie
Dfinition
Cest une mthode d'analyse physico-chimique qui spare les constituants
d'un mlange (les soluts) par entranement au moyen d'une phase
mobile (liquide ou gaz) le long d'une phase stationnaire (papier, glatine, silice,
polymre, silice greffe etc), grce la rpartition slective des soluts entre
ces deux phases
3. La chromatographie
Chromatographie sur papier
Solvant
3. La chromatographie
3. La chromatographie
Chromatographie liquide haute performance (HPLC)
3. La chromatographie
Chromatographie liquide haute performance (HPLC)
Chromatographie ionique
Chromatographie d'adsorption
Chromatographie de partage
Chromatographie d'exclusion
3. La chromatographie
Chromatographie liquide haute performance (HPLC)
Exemples
Couche mince
3. La chromatographie
La chromatographie en phase gazeuse (CPG)
La chromatographie en phase gazeuse est une technique
de sparation des molcules
Lchantillon est plac dans un injecteur et chauff par une
flamme
Les lments volatils vont ensuite tre emports par un gaz
3. La chromatographie
La chromatographie en phase gazeuse (CPG)
3. La chromatographie
La chromatographie en phase gazeuse (CPG)