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PRINCIPIO
Anlisis secuencial Inmunoenzimomtrico (TIPO 4)
Los reactivos esenciales requeridos para un anlisis inmunoenzimometrico incluyen
anticuerpos de alta afinidad y especificidad (enzima e inmovilizados), con diferentes y
distintos reconocimientos de epitopes, en exceso y antgeno nativo. En este
procedimiento, la inmovilizacin toma lugar durante el anlisis en la superficie de los
pozos de la microplaca a travs de la interaccin de estreptavidina que cubre el pozo con
el anticuerpo monoclonal anti-IgE marcado con biotina agregado exgenamente.
Despus de mezclar del anticuerpo monoclonal marcado con biotina y el suero que
contiene antgeno nativo, la reaccin resultante entre el antgeno nativo y el anticuerpo es
la formacin de un complejo antgeno-anticuerpo. La interaccin es ilustrada por la
siguiente ecuacin:
14. Adicionar 0.050 ml (50l) de solucin stop a cada pozo y mezclar ligeramente (por 1520 segundos).
15. Leer la absorbancia en cada pozo a 450nm (usando una referencia de longitud de
onda de 620-630nm para minimizar las imperfecciones de los pozos) en un lector de
microplacas.
Los resultados deben ser ledos dentro de los treinta (30) minutos despus de la
adicin la solucin de parada.
CALCULO DE RESULTADOS
Una curva de dosis respuesta es usada para asegurar la concentracin de
Inmunoglobulina E en muestras desconocidas.
1. Registrar la absorbancia obtenida de la impresin del lector de microplacas como se
delineo en el Ejemplo.
2. Graficar la absorbancia para cada suero de referencia por duplicado versus la
concentracin de IgE correspondiente en IU/ml sobre el papel de grafica lineal (no
promediar los duplicados de los sueros antes de graficar).
3. Trazar la mejor curva fija a travs de los puntos de la grfica.
4. Para determinar la concentracin de IgE de una muestra desconocida, localizar la
absorbancia promedio de los duplicados desconocidos en el eje vertical del grfico,
encontrar el punto de interseccin sobre la curva y leer la concentracin (en IU/ml) del eje
horizontal del grafico (los duplicados desconocidos pueden ser promediados como se
indica). En el siguiente ejemplo, la absorbancia promedio (1.323) intersecta la curva de
dosis respuesta en una concentracin de IgE de 142 IU/ml.