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Importance du pranalytique dans

ltude de lhmostase primaire


NTHC 28 avril 2016
Phn Marc Chatelain
Dr Amandine Magnette
CHU UCL Namur
CHU | UCL Namur

Plan
 Point de vue clinique
 Anamnse
 Examen clinique

 Recommandations GFHT
 Point de vue diagnostic
 Tests de dpistage de premire intention
 Tests de dpistage de deuxime intention
 Tests spcialiss

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Anamnse
 Premier test de dpistage du risque hmorragique
 Mise en vidence de pathologies susceptibles d'entraner une
anomalie de l'hmostase primaire
 Antcdents
 Familiaux
 Personnels





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Chirurgicaux et obsttricaux
Anmie, supplmentation martiale
Hospitalisation ou transfusion sanguine
Prises mdicamenteuses

Examen clinique
 Rechercher des hmorragies de type cutano-muqueux






Purpura
Saignements prolongs la coupure
Epistaxis, gingivorragies
Mnomtrorragies
Hmorragies digestives

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Recommandations pr-analytiques du GFHT


Prlvement

Paramtres

Recommand

Garrot

<1min
Peu serr

 Hmoconcentration
 Activation de la fibrinolyse
 Fibrinogne, facteurs VII, VIII, XII
*Cattaneo M et al. J Thromb Haemost 2013; 11: 11839
**Lippi et al., Blood Coagul Fibrinolysis 2005; 16 : 453-9
***Lippi et al., Clin Lab Haematol 2006; 28 : 332-7
***Tpfer et al., J Lab Med 2000; 24 : 514-20
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Recommandations pr-analytiques du GFHT


Prlvement
Paramtres

Recommand

Site de ponction

Veineux

Calibre de l'aiguille

19 22 gauge

 Traiter l'chantillon dans les plus brefs dlais


 Il est indispensable que le prlvement soit ralis au sein
du laboratoire effectuant les analyses
 Contact avec le patient
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Recommandations pr-analytiques du GFHT


Prlvement

Remplissage incomplet et
hmolyse

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Recommandations pr-analytiques du GFHT


Prlvement
Paramtres

Recommand

Place du tube

2me tube aprs un tube de


purge (neutre sans additif) ou un
tube sec (sans gel et sans activateur
de l'hmostase) ou aprs des
hmocultures
Lors des prlvements avec une
aiguille picrnienne, le tube de
purge est recommand

 ! Numroter les tubes lors dun bilan

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Recommandations pr-analytiques du GFHT


Prlvement

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Recommandations pr-analytiques du GFHT

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Paramtres

Recommand

Remplissage

90%

Recommandations pr-analytiques du GFHT


Paramtres

Recommand

Homoginisation du tube
aprs le prlvement

Ds la fin du remplissage du tube,


par retournements lents et complets

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Hmolyse
 Causes







Diamtre de laiguille
Veines difficiles
Units ailettes, KT
Pose du garrot prolonge et garrot trop serr
Mauvaise homognisation du tube
Centrifugation > 1500 g

 Consquences
 Activation des autres lignes sanguines (leucocytes, PLT)
 Release des phospholipides membranaires, de nombreuses enzymes
intra-cellulaires, dADP
 Activation ou inhibition des composantes de lhmostase primaire et
de la coagulation
 Perturbation de la majorit des tests dhmostase
Loeffen R. et al, J Thromb Haemost. 2012 Dec;10(12):2544-54
Lippi G. et al, Quality standards for sample collection in coagulation testing. Semin Thromb Hemost. 2012 Sep;38(6):565-75
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Recommandations pr-analytiques du GFHT


Tube
Paramtres

Recommand

Tube

Tube sous vide , strile


Tube citrate : PET tanche
Tube CTAD : PET ou verre silicon
Volume d'air rsiduel 20%
! dates de premption

Anticoagulant

Citrate (109 mmol/L)


CTAD : dont citrate (109 mmol/L)
Le GFHT recommande une concentration de
citrate unique pour un LBM compte tenu des
possibles variations des valeurs de rfrence
des tests globaux en particulier (TQ/TCA)

pH plasma anticoagul

7,3 7,45

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Recommandations pr-analytiques du GFHT


Paramtres

Recommand

Transport sang total

Non rfrigr
15 25C
! Minimiser les chocs + vibrations
pour viter de dnaturer les
protines et limiter l'activation
plaquettaire
(CLSI 5me dition)

Conservation et Dlai avant


l'examen

Donnes en cours de rvision

 Transport des tubes en position verticale* et pas par tltube


 Transport sur glace ou conservation au frigo avant centrifugation**
 Activation plaquettaire + du facteur VII
 facteurs VIII et von Willebrand
*Dempfle C-E, Tpfer G., Pre-examination procedures in laboratory diagnostics, De Gruyter, 2015, 273-281
**Bohm M. et al, Blood Coagul Fibrinolysis, 2006;17:39-45

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Recommandations pr-analytiques du GFHT


Hmatocrite
Paramtres

Recommand

Hmatocrite

0,20 (20%) 0,55 (55%)

Ou formule pour ajuster le volume d'anticoagulant


:
Vcit = (1,85 x 10e-3)(100-Hct)(Vsang)
Vcit : volume de citrate conserver dans le tube
Vsang : Volume de sang ajouter

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Recommandations pr-analytiques du GFHT


Centrifugation
Paramtres

Recommand

Double centrifugation
L'objectif est d'obtenir un taux de
plaquettes rsiduelles
dans le plasma < 10000/L

Deux centrifugations standards


successives
(avec dcantation entre les 2
centrifugations)

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Dcantation

 La technique qui permet de dcanter le surnageant


impacte le taux de PLT rsiduelles
 Ex: Utilisation de pipette pasteur et automatique
 Pipette automatique aprs 1 centrifugation : 29.000/L
 Pipette pasteur aprs 1 centrifugation : 98.000/L

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Dcantation

Dcantation avec pipette en verre


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Dcantation avec pipette automatique

Dcantation
 Un exemple dans notre laboratoire
 Ralisation dun PPP
 Vrification du taux de PLT rsiduelles
 PPP = PRP sans plaquettes
 Pour les milieux sans GR et GB : discordance entre les mthodes
de mesures :
Hmatimtre (Sysmex XN sries)

Cytomtre en flux

Mthode Impdance

Immunocomptage
adapt

Mthode Optique
10.000

13.000

Mthode Fluorescence
14.000

14.200

 Pour les utilisateurs Sysmex, lutilisation de PLT-F est suggre

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Recommandations pr-analytiques du GFHT


Centrifugation
Paramtres

Recommand

Conditions standards

1500 2000g ET au moins 15 min


ou
2000 2500g ET au moins 10 min

Centrifugation rapide
(Limite aux TQ, TCA, fibrinogne
et D-dimres)*

3000g ET au moins 5 min


ou
4440g ET au moins 2 min

Temprature

Centrifugeuse temprature contrle


15 25C

*Suchsland J., Friedrich N., Grotevendt A., Kallner A., Ldemann J., Nauck M., Petersmann A., Optimizing centrifugation of coagulation
samples in laboratory automation. Clin Chem Lab Med 2014 Aug;52(8):1187-91

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Recommandations pr-analytiques du GFHT


Centrifugation
Paramtres

Recommand

Rotor

Rotor godets mobiles

Frein

Frein dsactiv

Contrles des centrifugeuses

1x/an
Critres de contrle des plasmas:
plaquettes < 10000/L sur au
moins 6 chantillons conscutifs
analyss

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Recommandations pr-analytiques du GFHT


Centrifugation

Pipette automatique
PLT-F

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Avec frein

Sans frein

30000

29000

29000

25000

15000

9000

18000

14000

Centrifugation

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Centrifugation

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Recommandations pr-analytiques du GFHT


Conglation
Paramtres

Recommand

Conglation

Rapide au moins -70C

Conservation des chantillons


congels

Au moins -70C
Tube non mouillable avec
bouchon vis
Capacit adapte au volume du
plasma

Transport d'chantillon congel

Carboglace. Il est recommand de


s'assurer de la conformit du
transport et du matriel la
rception.

Dconglation

Rapide 37C au bain-marie avec


immersion complte de l'aliquot et un
temps de dconglation adapt au
volume de plasma de l'aliquot

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Etapes diagnostiques des anomalies de


lhmostase primaire

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Numration plaquettaire
 Sur tube EDTA K2 (recommandations ICSH)
 EDTA provoque une dformation des plaquettes
 Modification du volume plaquettaire moyen (VPM/MPV)
 Dtermination du MPV temps bien dtermin aprs prlvement pour
permettre comparaison
 Problme MPV : interprtation difficile (manque de standardisation entre
les automates, volution dans le temps)

 Citrate en cas de pseudo-thrombopnie lEDTA


 Attention au facteur de dilution

 Valeurs de rfrence : 150 400 G/L


 Stabilit : 4 jours (EDTA, T ambiante)*

*Banfi G. et al, Pre-examination procedures in laboratory diagnostics, De Gruyter, 2015, 273-281


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Numration plaquettaire
par cytomtrie en flux
 = Technique de rfrence
 Obtention du taux de PLT en fonction du rapport entre le nombre de GR
et le nombre de PLT dtectes par CMF et le taux de GR mesurs par
lautomate de numration
 Lanalyse doit tre effectue sur chantillon sanguin EDTA K2
 PLT dtectes par le CD41 (AC spcifique)
 Test utile si automate en difficult lors de la mesure de la thrombocytose
 PLT gantes, schizocytes, dbris de GR ou de GB

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Evaluation des fonctions plaquettaires


 Conservation t ambiante
 Repos de 30 minutes aprs prlvement
 Analyse dans les 3-4 heures
 Attention la prsence
 Dun caillot
 Dune hmolyse
 Dun prcipit

Kitchen S, D. Olson J., Eric Preston G., Quality in Laboratory Hemostasis and Thrombosis, 2nd Edition, April 2013, Wiley-Blackwell.
Dempfle C-E., Tpfer G., Pre-examination procedures in laboratory diagnostics, De Gruyter, 2015, 273-281.

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Temps d'occlusion plaquettaire


 PFA (Platelet Function Analyzer)








Sang total citrat 109 mM/L (1 vol citrate/9 vol sang)


Sassurer que le taux de PLT > 100000/L
Sassurer que lHct du patient se situe entre 35 et 50%
Sassurer que le dlai entre PRV et analyse est bien respect (<4H)
! Transport (pas de tltube)
Utiliser le 1er tube citrat prlev aprs lamorce
Influence de la mthode de PRV
 Temps EPI et ADP significativement plus courts par aspiration manuelle par rapport
au vide
tablissement de valeurs de rfrence selon mthode de PRV*

 Influence de lhmolyse
 Obstruction du flux ou allongement significatif des temps docclusion suite
activation et fragmentation des PLTs**
*Lippi et al., Blood Coagul Fibrinolysis 2013; 24(6) : 666-9
** Lippi et al., Blood Coagul Fibrinolysis 2012; 23(1) : 82-6

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Exploration du facteur von Willebrand

 Effectuer Ag et activit cofacteur ristoctine frais pour confirmer le


diagnostic (CBA, multimres raliss sur plasma congel)
 Dcanter et envoyer le plasma sans conglation
 Si temprature ou temps de dconglation trop importants
 des taux d'antigne et d'activit vW*

 Attention la prsence d'un ventuel cryoprcipit


 Si prsent : sous-estimation du FvW, FVIII et fibrinogne

 Ag et activit cofacteur ristoctine restent stables 48 H**

*Kitchen S, D. Olson J., Eric Preston G., Quality in Laboratory Hemostasis and Thrombosis, 2nd Edition, April 2013, WileyBlackwell
**Dempfle C-E., Tpfer G., Pre-examination procedures in laboratory diagnostics, De Gruyter, 2015, 273-281

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Plaquettes
 Extrmement ractives
 Preuve : microscopie lectronique en transmission

 Prlvement laiguille libre directement dans un


fixateur (glutaraldhyde)
 Mesure de lactivation in vivo: prlvement
laiguille libre
 PF4 et -TG (-thromboglobuline) *
 PF4 : dure de vie courte
 Si  +++ PF4 et -TG : activation in vitro
 Si  +++ -TG : activation in vivo
*Kaplan KL et Owen J, Blood, 1981; 57 : 199 - 202

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Lagrgomtrie plaquettaire

Femia EA et al, Platelets 2012;23:7-10


Cattaneo M et al. J Thromb Haemost 2013; 11: 11839
Emmanuel J. Favaloro et al. Clin Chem Lab Med 2010;48(5):579598
Anna M. Dyszkiewicz-Korpanty et al. Clin Appl Thrombosis/Hemostasis 11(1):2535, 2005

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Test de consommation de la prothrombine


 = mesure de la prothrombine rsiduelle dans le srum
obtenu aprs coagulation du sang prlev dans un tube
sec
 Pranalytique







Piquer laiguille libre


Rcolter le sang dans un tube en verre sans gel ni acclrateur de coagulation
Tmoin normal
Conservation pendant 4 H exactement 37C (bain marie)
Pas dagitation !
Cause derreur : agitation excessive du sang coagul au cours du transport

 Test perturb en cas de thrombopnie, de dficit en


facteur ou d'anomalies plaquettaires
 Anomalie quantitative : dficit en phospholipides plaquettaires
 Anomalie qualitative : Syndrome de Bernard Soulier et Syndrome de Scott

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Cytomtrie en flux
 Plusieurs tudes (Yuana et al, Lacroix et al, ...) ont t ralises
concernant les tapes pr-analytiques
 Protocole standardis (ISTH) pour les microparticules







Prlvement jeun
Ponction ralise avec une aiguille de calibre > 21 gauge (ou +)
Restreindre lutilisation du garrot
Eliminer les 2-3 premiers mL prlevs
Tubes citrats (109 mM/L)
Les chantillons sont apports directement au laboratoire
 Si transport : pas dagitation et transport en position verticale

 Garder les tubes temprature ambiante


 Centrifugation
 Dlai avant centrifugation : < 1h
 1re centrifugation : 2500 g 15min (t ambiante, pas de frein)
 Rcuprer le surnageant avec une pipette, en laissant 1cm de plasma au-dessus de la couche
leucocytaire
 2me centrifugation : 2500 g 15 min (t ambiante, pas de frein)

 Conglation dans de lazote liquide


 Idalement, analyse ralise dans le laboratoire effectuant les prlvements
Mullier F. et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2013, 11: 14
Lacroix R. et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2015
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Cytomtrie en flux

 Anticoagulants
 ACD: Acid Citrate Dextrose
 CTAD: Citrate Theophylline
Adenosine Dipyrimidole
 Hparine
 Hirudine
 Citrate
 EDTA
 Conservation t ambiante
 Si 4C : internalisation/perte de
marqueurs cellulaires, moins de risque
d'agrgation plaquettaire mais
impossible pour tude fonctions PLT
Mullier F. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2013, 11: 14
Lacroix R. et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2015
LA Krueger et al. In: Current Protocols in Cytometry (2002) Unit 6.10

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Cytomtrie en flux

Lacroix R. Impact of pre-analytical parameters on the measurement of circulating microparticles : towards standardization of
protocol. J Thromb Haemost. 2012 Mar;10(3):437-46

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Cytomtrie en flux
Test la mpacrine
 Dcrit pour la 1re fois en 1995 par
 Wall et al.
 Gordon et al

 Mpacrine (ou quinacrine)


 Molcule fluorescente drive dacridine
 Forte affinit pour les nuclotides dadnine (ATP, ADP)
 Saccumule rapidement et slectivement dans les granules denses
plaquettaires
 Permet de mettre en vidence
 Absence ou la des granules denses plaquettaires (delta storage pool
disease)
 Dficit en granules denses plaquettaires qui peut tre congnital
(ex : Hermansky-Pudlak, Chediak-Higashi) ou + souvent acquis (SMD,
SMP,) ainsi quun dfaut de libration du contenu des granules denses
suite lactivation plaquettaire
Latger-Cannard et al. Seminars in Thrombosis and Hemostasis 2016

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Cytomtrie en flux
Test la mpacrine
 Test de capture
 Capture de la mpacrine par les granules denses plaquettaires
 Mesure de la fluorescence verte mise par les plaquettes incubes
avec mpacrine 37 C pendant 30 minutes

 Test de libration
 Activation des plaquettes avec le TRAP-6
 Mesurer la diminution de flurorescence et donc
la quantit de mpacrine relche
 Reflte la capacit des plaquettes librer le contenu
de leurs granules denses

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Cytomtrie en flux
Diagnostic des anomalies quantitatives des
glycoprotines plaquettaires
 Une perte dexpression ou un dfaut fonctionnel dun des complexes
glycoprotines majeurs, GpIIb/IIIa ou GpIb/IX/V, peut conduire des
syndromes hmorragiques svres
 Thrombasthnie de Glanzmann
 Syndrome de Bernard-Soulier

 Lexpression de la GMP140 (P-slectine, PADGEM) traduit quant elle


ltat dactivation plaquettaire
 Peu exprime par les plaquettes quiescentes et scrte suite une activation
 Le niveau dexpression de cette glycoprotine, aprs activation in vitro, est un bon
indicateur de la ractivit plaquettaire
 Lors de certaines dficiences des granules plaquettaires, lexpression de la GMP140
suite une activation est rduite

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Cytomtrie en flux

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Conclusions
 Le pranalytique en hmostase primaire
 Commence ds la prescription de lanalyse et comprend la
prparation du patient, la qualit du prlvement et les conditions de
transport, de centrifugation et de conservation jusquau moment de
lanalyse et la mise en route de lexamen
 Constitue un volet majeur dassurance de la fiabilit et de la validit
des rsultats en hmostase
 Constitue les sources les + importantes des rsultats errons ou
ininterprtables

 La matrise et les efforts de standardisation des conditions


pranalytiques sont primordiaux afin dassurer la qualit de
lexploration en hmostase

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Conclusions
 Si mise au point de nouvelles techniques / approches dans
ltude plaquettaire et afin dtre sensible  tre rigoureux :
plaquettes = TNT !

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Remerciements









Pr Bernard Chatelain
Pr Franois Mullier
Anas Bothy
Nicolas Bailly
Mat Guldenpfennig
Justine Baudar
Maryline Fagnaux
Benjamin Leyder

MERCI POUR VOTRE ATTENTION

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