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Identification morphologique et molculaire despces du

genre Trichoderma isoles de diffrents sols Tunisiens.


N. Sadfi-Zouaoui1*, M. Rouaissi2, B. Essghaier 1, M.R. Hajlaoui2, M.R. Hermosa3 et A. Boudabous1

. Laboratoire de Microorganismes et Biomolcules Actives, Facult des Sciences de Tunis, Campus universitaire, 2092 Tunisie ;
. Laboratoire de Protection des Vgtaux, Institut National de la Recherche Agronomique de Tunisie (INRAT) 2049 Ariana
Tunisie ;
3
. Dpartement de Microbiologie et de Gntique, Universit de Salamanque, 37002 Espagne.
2

RSUM
Le genre Trichoderma renferme des espces connues en tant quagents de lutte biologique contre les champignons
phytopathognes et comme source denzymes et de mtabolites d'intrts industriels. Dans le but dexploiter le potentiel
biologique des Trichoderma indignes, une tude a t entreprise pour tablir une large collection despces rsidentes
dans les sols du nord Tunisien. En se basant sur laspect des colonies et la morphologie des fructifications, une collection
de 150 isolats a t subdivise en 5 groupes phnotypiques. Cette identification morphologique a t confirme par des
analyses molculaires bases sur le squenage de la rgion ITS1 de lADN ribosomal. Le pouvoir antagoniste de ces
espces est en cours dvaluation contre les moisissures de post- rcolte des fruits et des lgumes.
Mots-cls : Trichoderma - sol phnotype analyse molculaire

ABSTRACT
Trichoderma is the most fungal strain used as biological control agent in agriculture, besides its production of enzymes
and secondary metabolites of biotechnological interest. With an aim of exploiting the biological potential of local
Trichoderma strains, a study was undertaken to establish a broad collection of species resident in north Tunisian soils.
Based on the aspect of colonies and morphology of fructifications, a collection of 150 isolates was subdivided into 5
phenotypic groups. This morphological characterization was confirmed by a molecular analysis based on the sequencing
of the ITS1 region of the ribosomal DNA. The antagonistic potential of these species is in the course of evaluation against
the post-harvest moulds of fruits and vegetables.
Key-Words: Trichoderma - soil phenotype molecular analysis

Microbiol. Hyg. Alim.-Vol 20, N 57 Mars 2008

Introduction
Les Trichoderma spp. sont des champignons
cosmopolites, caractriss par leur croissance
rapide, leur capacit dutiliser divers substrats et
leur rsistance des agents chimiques nocifs (Klein
et Eveleigh, 1998). Ils constituent les lments
prdominants de la mycoflore des sols de divers
cosystmes (forts, champs agricoles, prairies,
marcages, dserts, lacs sals ) (Danielson et
Davey, 1973 ; Roiger et al., 1991 ; Smith, 1995 ;
cellulose des vgtaux (Klein et Eveleigh, 1998). Le
genre Trichoderma renferme des espces les plus
utilises en tant quagents de lutte biologique
contre les phytopathognes et comme source
denzymes et de mtabolites secondaires d'intrts
biotechnologique (Kubicek et Penttil, 1998 ;
Sivasithamparam et Ghisalberti, 1998).

La majorit des espces de Trichoderma sont


morphologiquement trs semblables et difficiles
distinguer et elles ont t confondues pendant de
nombreuses annes lespce T. viride. Les
mthodes
molculaires,
bases
sur
le
polymorphismes des squences de lADN et les
amplifications par PCR, se sont montres trs utiles
dans la caractrisation des isolats de ce genre, tant
dans des tudes d'identification (Hjeljord et
Tronsmo, 1998) que dans l'laboration de
classifications phylogntiques (Kullnig-Gradinger
et al., 2002).
------------------------------------------------------------------------------------* Correspondance : Dr. Najla SADFI ZOUAOUI, Laboratoire de
Microorganismes et Biomolcules Actives, Facult des Sciences,
Campus universitaire, 2092 Tunis ; Tunisie, Tel : 216 -70-850
553 ; Fax: 216-71-885 480, E-mail: sadfi.najla@planet.tn

Les ADNr sont organiss en domaines d'units


invariables rptes en tandem. Une unit est
constitue des trois plus grands gnes d'ARNr (18S,
5.8S, 28S) spars par deux espaceurs internes
transcrits (ITS). Chaque unit est spare d'une
autre unit par un espaceur intergnique non
transcrit (IGS) (Bruns et al., 1991 ; Henson et
French, 1993) (Fig. 1). On retrouve de 60 200
copies des rptitions en tandem par gnome
haplode chez les champignons (Bruns et al., 1991,

Yao et al., 1992). De grandes variations gntiques


sont trouves dans les ITS car leur volution est plus
rapide que les portions gniques. Les ITS
permettent de diffrencier les espces l'intrieur
d'un genre ou parmi une population (Henson et
French, 1993; White et al., 1990). L'analyse des ITS
de plusieurs espces de champignons a permis de
conclure la validit ou non de l'emploi des critres
morphologiques utiliss dans lidentification des
espces et la classification des champignons.

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Fig. 1. Schma de lunit de transcription ribosomique de champignon.


A. Organisation en tandem des units ribosomiques, B. Structure dune unit ribosomique.

L'analyse des squences de lADNr, y compris les


squences des espaceurs internes transcrits (ITS),
ont t utiles dans des tudes taxonomiques de T.
longibrachiatum (Kuhls et al., 1997), T. harzianum
(Gams et Meyer, 1998), et de T. viride (Lieckfeldt et
al., 1999) ou de biotopes associs la colonisation
de champignons cultivs (Belle et al., 1999 ;
Samuels et al., 2002).
La plupart des espces connues de Trichoderma
ont t isoles dAmrique du Nord, dEurope
Centrale (Bissett, 1991 ; Wuczkowski et al., 2003),
de Sibrie et des Himalayas (Kulling et al., 2000),
dAsie du Sud-Est (Kubicek et al., 2003), de Chine,
dEgypte (Gherbaway et al., 2004), et dAmrique
Centrale et du Sud (Druzhinina et al., 2005). Aucune
tude rapportant la diversit des espces de
Trichoderma en Tunisie na t jusque l effectue.
Dans le but didentifier les espces de Trichoderma
rencontres en Tunisie, une collection de 150
isolats a t obtenue partir de diffrents sols du
Nord tunisien et classe en espces en se basant sur
des critres morphologiques et lanalyse des
squences ITS.
MATERIELS ET METHODES
10

Echantillonnage et isolement
Une centaine dchantillons ont t collects de
diffrents cosystmes de la Tunisie (sols forestiers,
sols agricoles, fruits darbres fruitiers et feuilles de
lgumineuses). Chaque chantillon de sol (10g) a
t vigoureusement brass avec 20 ml deau
distille strile afin de librer les conidies et les
hyphes adhrant aux particules de sol. Une srie de
dilution de 10-1 10-4 a t prpare pour chaque
suspension de sol. Une aliquote de 0.1 ml de
chaque dilution a t tale sur les milieux PDA
(Potato dextrose agar, Difco) et MEA (Malt extract
agar, Difco) additionns de 50 mg/l dantibiotique
(ampicilline et streptomycine, Sigma). Les boites ont
t incubes 25C pendant 7 10 jours. Les
colonies de Trichoderma ont t purifies suite
des repiquages successifs sur milieu PDA.
Culture monosporale de Trichoderma
Une suspension sporale de chaque culture pure
de Trichoderma a t prpare aprs raclage des
spores en prsence deau distille strile. Aprs une
srie de dilutions et talements sur milieu PDA puis
incubation pendant 48h 25C, les conidies

germes et visualises au microscope ont t


repiques individuellement, laide dune aiguille
sur milieu PDA et incubes pendant une semaine
25C. Un disque myclien de 10 mm de diamtre de
chaque culture, drivant dun clone monospore, a
t ensemenc, sous hte strile, dans 100 ml de
milieu PDB (Potato-Dextrose-Broth, Difco) contenu
dans un Erlenmeyer de 250 ml. La culture liquide a
t ensuite incube sous agitation 110 rpm et
25C pendant 7 10 j et le myclium a t rcupr
par filtration et conserv -20C avant sa
lyophilisation.

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Extraction de lADN gnomique


LADN total a t extrait selon la mthode CTAB
dveloppe par Doyle et Doyle (1987). avec
quelques modifications. Une quantit denviron 0, 1
g de myclium lyophilis a t broy en prsence de
lazote liquide. Le broyat a t mis dans un
Eppendorf de 1,5 ml, auquel 700 l de tampon de
lyse (CTAB, 2%) additionn de 0.2% (w/v) mercaptothanol ont t ajouts. Le mlange a t
mis en incubation pendant 40 min 65C au bainmarie. Un volume gal de chloroforme alcoolisoamylique (24 :1) a t ajout. Aprs
homognisation du mlange et centrifugation (10
min, 13000 rpm + 4C), le surnageant a t
rcupre (environ 500 l) dans un nouveau
Eppendorf strile. LADN a t prcipit
slectivement en prsence dun volume gal
disopropanol froid additionn de 10 % dactate
de sodium (3M, pH 8). Aprs incubation pendant 1
nuit + 4C et centrifugation (12000 rpm, 10 min
+ 4C), le surnagent a t jet et le culot dADN a
t rinc deux fois avec 500 l dthanol 70%. Aprs
centrifugation (12000 rpm, 2 min + 4C), le culot a
t dissout dans 100 l de tampon TE. LADN
dissout a t trait avec 3l de RNase (100 g/ml)
pendant 1h 37C.
LADN a t ensuite prcipit dans 600 l
dthanol absolu (conserv 20C) en prsence
de 30 l dactate de sodium (3M, pH 8). Le culot a
t ensuite rinc avec 300 l dthanol 70 % puis
sch sous la hotte pendant 2 h. LADN a t
ensuite repris dans 100 l de TE puis conserv 20C.
Amplification de lADN par PCR et squenage
La rgion ITS (Internal Transcribed Spacer) de
lADN ribosomique a t amplifie avec des
amorces universelles ITS1 et ITS4 (White et al.,
1990).
ITS1: 5-TCGGTAGGTGAACCTGCG G-3
ITS4: 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3
Protocole damplification

La raction damplification a t ralise dans un


volume ractionnel de 25 l contenant 5 l de
tampon color Taq DNA polymerase 10X (Promega),
1.5 l MgCl2 (25 mM), 1 l dNTP(20 mM), 2 l de
chacune des amorces (20 pmoles/l), 0.25 l de Taq
DNA polymerase (5U/l) (Promega) et 11.25 l de
H2O bidistille strile. Le mlange ou mix a t
ralis pour le nombre total des isolats, puis rparti
raison de 23 l/tube. Deux l dADN (50 ng/l) ont
t ajouts en dernier au mlange ractionnel.
La raction damplification a t ralise dans un
thermocycleur
(Biometra,
Allemagne).
Le
programme, de la PCR, tabli a t compos dune
pr-dnaturation 95C pendant 3 min suivie par
35 cycles conscutifs dune dnaturation 98C
pendant 15 sec, dune hybridation spcifique des
amorces 59C pendant 60 sec et dune longation
72C pendant 2 min. Enfin une post-longation
72C pendant 10 min.
Electrophorse sur gel dagarose
Un gel dagarose 1,5 % a t prpar avec un
tampon standard TBE 0,5 (4,5 mM Tris, 4,5 mM
dacide borique et 1mM EDTA, pH 8) contenant 0,5
mg/ml de bromure dthidium. Cinq l de
lchantillon PCR a t mlang avec 1 l de
tampon de charge sur une feuille de parafilm. Les
chantillons et un marqueur de poids molculaire
(100 pb) ont t chargs sparment dans les puits
du gel (moyen gel, cuve Eurogentec, Belgique).
Llectrophorse a t effectue 100 V dans du
tampon TBE 0,5 pendant 40 min. Les produits
damplification ont t visualiss sous lumire UV,
grce au bromure dthidium incorpor au part
avant dans le gel. Les photos ont t prises grce
un Gel doc de type Biorad.
Squenage des ITS amplifis
Les produits PCR (ITS amplifis) ont t purifis
TM
par centrifugation sur minicolonne (Wizard PCR
Preps DNA Purification System, Promega) selon le
protocole de la compagnie. Le squenage a t
ralis dans les deux directions avec les amorces
utilises pour leur amplification dans un ABI 377
Prism sequencer automate (Applied Biosystems).
Analyse des squences
Les squences ont t initialement analyses en
utilisant le programme MegAlign inclus dans le
paquet informatique DNASTAR ; et, les alignements
des squences ont t effectus en utilisant le
programme CLUSTALX 1.81 (Thompson et al., 1997).
Dans les alignements ont t incluses les
squences, dposes dans des bases de donnes,
espces ou gnotypes reprsentants des diffrentes
sections du genre Trichoderma. Les analyses
phylogntiques ont t effectues avec le
programme PAUP (Phylogenetic Analysis Using
Parsimony, Version 4.0, UTILISE).
11

Rsultats & Discussion

Tr. 1
Tr. 4

9,00

Tr. 2
Tr. 5

Tr. 3

Une collection de 150 isolats de Trichoderma


a t tablie essentiellement partir dchantillons
de sol collects de diffrents cosystmes de la
Tunisie. Une identification prliminaire du genre a
t effectue par lanalyse des caractres
morphologiques bass sur la vitesse de croissance
de la colonie (Fig. 2), la pigmentation et laspect du
conidiophore, des phialides et des conidies (Fig. 3,
4). Cette analyse a permis de subdiviser la collection
en 5 groupes phnotypiques.

Diamtre de la colonie (mm )

8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
18h

24h

38h

44h

48h

Temps

Fig.2. Mesure de la croissance des colonies fongiques de


Trichoderma durant 48 h de culture sur milieu PDA

Fig. 3 Aspect macroscopique des colonies des isolats reprsentant les cinq groupes phnotypiques de Trichoderma.
(a): T. citrinoviride, (b): T. atroviride, (c): T. hamatum, (d): T. harzianum, (e): T. longibrachiatum

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Fig. 4 Aspect microscopique du myclium (a), des spores (b) et des phialides (c) de Trichoderma spp.

Ces caractristiques morphologiques ntaient pas


suffisantes pour distinguer les espces de
Trichoderma en raison des ressemblances
morphologiques des colonies et des fructifications.
Les travaux pionniers de Rifai (1969) ont propos de
distribuer Trichoderma dans neuf ensembles
spcifiques alors que la rvision du genre
Trichoderma par Bisset (1991) avait inclus plusieurs
anamorphes dHypocrea tablissant ainsi cinq
nouvelles
sections,
parmi
lesquelles
correspondaient les ensembles dj dcris par Rifai.
Les donnes molculaires drivant de lADN et des
enzymes taient trs utiles pour une caractrisation
objective de Trichoderma comparativement aux
mthodes
classiques
(Lieckfeldt
et
Muthumeenakshi, 1998). Ltude molculaire que
nous avions mene a concern 48 souches de la
collection. Lamplification par PCR a montr une
12

seule bande denviron 600 pb pour tous les isolats


de Trichoderma (Fig. 5). Les Trichoderma isols ont
t identifis au niveau de lespce grce lanalyse
des squences ITS (ITS1). Lidentit des isolats est
prsente au Tableau 1. Sept isolats de sol forestier
ont t identifis comme appartenant lespce T.
harzianum. Nos rsultats sont en concordance avec
les travaux de Wuczkowski et al. (2003) montrant la
prdominance de T. harzianum en sol forestier.
Cette espce est largement exploite dans la lutte
biologique
contre
les
champignons
phytopathognes ct de Gliocladium virens et T.
viride (Papavizas, 1985 ; Samuels, 1996). T.
harzianum a t commercialis sous forme de
biofongicide (Trichodex) (Elad et al. 1995) et a
montr un grand pouvoir inhibiteur contre la
pourriture grise de la tomate (Utkhede et Mathur,
2002).

Tableau 1. Origine et identit des isolats de Trichoderma.


Origine

Isolat

Espce

Rhizosphre de sol forestier

TNS 1, 2, 3, 4, 16, 17, 18

T. harzianum

TNS 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15

T. longibrachiatum

TNS 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27


TNS 28, 29
TNS 30, 31, 32, 33, 34

T. atroviride
T. hamatum
Trichoderma spp.

TNS 35, 36
TNS 37, 38, 39, 40, 44, 41, 42, 43

T. hamatum
T. longibrachiatum

TNS 45, 47
TNS 46
TNS 48

T. citrinoviride
T. hamatum
T. viride

Rhizosphre de sol agricole

Arbres fruitiers
Fruits de citronnier
Fruits de pcher

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Lgumineuses
Feuilles de fve

Fig. 5. Sparation sur gel dagarose (1.5%) des produits damplification par PCR de lADN des isolats de Trichoderma en
utilisant les amorces ITS1 et ITS4.
M: marqueur de poids molculaire 100 pb, pistes 1-26 (isolats TNS1-TNS26); T: tmoin ngatif, pistes 27-48 (isolats
TNS27-TNS48).
TNS 1-18 (isolats de sol forestier); TNS 19-34 (isolats de sol agricole); TNS 35-44 (isols sur fruits de citronnier et de
pcher) et TNS 45-48 (isols sur feuilles de fve)

Lespce la plus dominante de la collection


appartient T. longibrachiatum (37,5 %), isole de
sol forestier et de fruits. Les souches issues de sol
agricole (vergers dAgrumes) appartiennent T.
atroviride et T. hamatum. Trois souches
appartenant T. citrinoviride, deux T. hamatum et
une T. viride ont t aussi isoles de feuilles et de
fruits pourris. Larbre phylogntique tabli partir
de lanalyse des squences des 48 souches a montr
que lensemble des isolats sont distribus dans les
trois grandes sections de Trichoderma. Des 48

souches squences, 14.58 % (7 isolats) sont


classes dans la section Pachybasium, 31.25 % (15
isolats) dans la section Trichoderma et 43.75 % (21
isolats) dans la section Longibrachiatum (Fig. 6). Sept
isolats classs dans la section Pachybasium sont
groups dans le complexe incluant T. inhamatum et
T. harzianum. Dans la section Trichoderma, 15
isolats sont inclus dans 3 groupes savoir T.
hamatum, T. atroviride et T. viride et 18 isolats de
la section Longibrachiatum sont inclus dans les
13

groupes T. longibrachiatum et T. citrinoviride


(Hermosa et al., 2004).
Cette tude a en effet montr une diversit
importante des espces de Trichoderma en Tunisie.
Les reprsentants des trois sections de Trichoderma
on t identifis partir de lanalyse de souches

issues essentiellement de sols forestiers et


agricoles. Lefficacit de ces souches contre des
pathognes de post-rcolte est en cours
dvaluation. La collection locale sera largie afin
dinclure des isolats provenant dautres niches
cologiques de plusieurs rgions de la Tunisie.

Fig. 6. Phylogramme bas sur les squences de la rgion ITS1 du gne ARNr dmontrant la position phylogntique des
48 isolats (TNS 1-46) lintrieur des sections tablies de Trichoderma (T.) (Hermosa et al., 2004).

Remerciements

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Ces travaux ont bnfici de fonds manant du


Projet de Coopration Tuniso-Espgnole (n
A/6826/06).

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