GUA PARA LAS PRCTICAS DE LABORATORIO, TALLER O CAMPO

ASIGNATURA
:

Fitoqumica

PERIODO
LECTIVO:

201620

NIVEL:

5to

DOCENTE:

Dra. Blanca Naranjo

NRC:

1652, 1653, 1654

PRCTICA
N:

LABORATORIO DONDE SE DESARROLLAR LA

Laboratorio N3 de Docencia.
PRCTICA:
TEMA DE LA
SEPARACIN E IDENTIFICACIN DE ANTOCIANOS POR CROMATOGRAFA EN CAPA DELGADA (TLC) Y
ESPECTROFOTOMETRA UV-VIS.
PRCTICA:
INTRODUCCIN:
Las antocianinas son pigmentos hidrosolubles que se hallan en las vacuolas de las clulas vegetales y que otorgan el
color rojo, prpura o azul a las hojas, flores y frutos. (Wagner, 1999).Todas estas sustancias presentan un grado
diferente de solubilidad en disolventes apolares, lo que permite su separacin cuando una solucin de las mismas
desciende por a travs de una columna de cromatografa verticalmente sobre una pelcula de un disolvente orgnico, ya
que las ms solubles se desplazarn a mayor velocidad, pues acompaarn fcilmente al disolvente a medida que ste
desciende. Las menos solubles avanzarn menos en la columna. Aparecern, por tanto, varias bandas de diferentes
colores (hasta siete o ms, dependiendo del material utilizado) que estarn ms o menos alejados de la disolucin
alcohlica segn la mayor o menor solubilidad de los pigmentos (Martnez, 2003).
La espectroscopia UV-visible se utiliza para identificar algunos grupos funcionales de molculas, y adems, para
determinar el contenido y fuerza de una sustancia. Utiliza radiacin electromagntica (luz) de las regiones visible,
ultravioleta cercana (UV) e infrarroja cercana (NIR) del espectro electromagntico, es decir, una longitud de onda entre
380nm y 780nm. La radiacin absorbida por las molculas desde esta regin del espectro provoca transiciones
electrnicas que pueden ser cuantificadas (Wagner, 1999).
OBJETIVOS:
Extraer e identificar los antocianos de una matriz vegetal TLC.
Analizar los antocianos mediante mtodo espectrofotomtrico y observar sus mximos de absorcin.
MATERIALES:
INSUMOS:
REACTIVOS:
- Agua.
- cido Actico
- Butanol
- cido Frmico

- Acetato de Etilo

EQUIPOS:
Molino
Cmara cromatogrfica
Lmpara ultravioleta

1 refrigerante
1 baln de 1000 o 2000 mL
1 manta de calentamiento
2 pinzas universales
mangueras
1 Erlenmeyer de 25 mL
Tubos de ensayo
Gradilla
Pipetas, 5 mL y 10 mL
Micropipetas

 Espectrofotmetro.
Equipo soxhlet

MUESTRA:
Material vegetal como: cscara de lima, limn, naranja, toronja, mandarina, extractos de flores u hojas coloreadas.
INSTRUCCIONES:
Utilice ropa de proteccin: vestimenta apropiada, mandil, guantes, gafas de seguridad, cabello recogido.
Llegue puntual a la hora de la prctica.
No olvide su muestra, su franela y una prctica IMPRESA POR GRUPO.
ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:
CROMATOGRAFA EN CAPA FINA
La separacin e identificacin de los pigmentos antocianos se puede realizar por cromatografa en capa fina (TLC), utilizando como fase
estacionaria, slica gel G, que tiene la propiedad de separar exitosamente compuestos fenlicos, flavonoides, aminocidos y derivados,
entre otros. Este adsorbente, como otros, contiene indicadores fluorescentes inertes, como el silicato de zinc, que emite luz cuando se
ilumina la placa con luz UV de 254 nm, esto facilita la identificacin de las sustancias separadas.
Los extractos obtenidos en los diferentes solventes, se aplican con tubos capilares en los puntos de partida a una distancia de 2 cm
entre ellas, sobre placas de slica gel G con F254 (10x20). La fase mvil est formada de dos eluyentes diferentes: acetato de etilo,
cido frmico, cido actico, agua (50: 5,5: 5,5 13) y Butanol: cido actico: agua (50:10:20). Los eluyentes se colocan en las cmaras
cromatogrficas de vidrio con fondo plano y cierre hermtico, se satura con el eluyente por 30 min en reposo, para luego colocar las
placas individualmente en el interior de cada una de las cmaras observando que el borde inferior de las placas se encuentre sumergido
5 mm en el eluyente sin que ste toque las muestras aplicadas en las placas. Se desarrolla la cromatografa con el eluyente hasta dos
centmetros antes del borde superior de las placas.
Corridas las placas, se sacan de la cmara y se dejan secar a temperatura ambiente por 20 minutos. Se marca y mide las diferentes
manchas separadas y luego se observa en una cmara con lmpara con luz ultravioleta (254 nm-366 nm). Para visualizar las manchas
sobre las placas, y se marca los puntos que no se visualizaron de forma directa.
Anlisis de antocianinas por espectrofotometra UV-Vis.
Se preparan extractos metanlicos o etanlicos, acidificados con cido clorhdrico o tricloro o trifluoro actico con 0,05 g de muestra, se
deja en maceracin por 24 horas a temperatura ambiente, luego se centrifuga, se toma 1 mL en una celda de cuarzo y se realiza un
barrido en un rango de 400 a 700 nm en espectrofotmetro, para obtener los mximos de absorcin en la regin visible y ultravioleta. Y
se repite el procedimiento variando el pH del extracto de ptalos de geranio a pH = 1 y a pH = 4,5 utilizando soluciones tampn para
llegar al pH requerido.

RESULTADOS OBTENIDOS:
Calcule los factores de retardo Rf mediante la siguiente frmula para la identificacin por comparacin con los datos bibliogrficos:

Rf =

a
b

Dnde:
a = distancia desde el centro de la mancha hasta el punto de aplicacin en cm.
b = distancia desde el punto de aplicacin hasta el frente del solvente en cm.
Exprese los resultados en funcin del grado de similitud con los datos tericos de las diferentes molculas presentes.
Reporte adems el mximo de absorcin de los extractos observados en el espectrofotmetro Ultravioleta-Visible.

CONCLUSIONES:

Se comprobar la solubilidad de los flavonoides analizados en funcin del solvente usado.

Se evidenciar los mximos de absorcin segn el pH de los extractos analizados.
RECOMENDACIONES:
Preparar correctamente los solventes para el corrido de la cromatografa y utilizando mascarilla adecuada.
Utilice el espectrofotmetro segn las indicaciones de los responsables.
FIRMAS
F:

.
Nombre: Dra. Blanca Naranjo P.
DOCENTE

F:
.
Nombre: Dr. Francisco Flores F.
COORDINADOR DE REA DE
CONOCIMIENTO

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:

H. Wagner., S. Bladt, Plant drug analysis, 1999

Morelli, I., I Principi Attivi delle pliante Medicinali, 1981, 75-78.
Torssell K. B. G., Natural Product Chemestry, 1997, 261-275
Harbone. J. B. , Phytochemical Methods. 1997, 110-123
Luck, O., Investigacin Fitoqumica, 1988. 23-36.
Domnguez, X., Mtodos de Investigacin Fitoqumica, 1973
Martnez, A., Aceites esenciales, 2003, 1-34.

F:
..
Nombre: Dra. Patricia Jimnez A.
COORDINADOR DE LABORATORIOS