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TD : clonage/ADN recombinant

Dfinition du clonage:
Multiplication in vitro d'un organisme, d'une cellule souche ou
d'un gne, en grand nombre d'exemplaires identiques

Les techniques de lADN


recombinant
But: isoler des fragments dADN de gnomes
complexes et les recombiner dans des
gnomes plus petits et faciles manipuler et
analyser.
Des outils de bricolage: utilit des enzymes
Structure des vecteurs de clonage en
fonction de leurs htes
Comment dfinir un schma de clonage?

Couper: les enzymes de restriction

Enzymes de restriction
AluI
CfoI
EcoRV
EcoRI
EcoRII

AG/CT
GCG/C
GAT/ATC
G/AATTC
/CCWGG

Arthrobacter luteus
Clostridium formicoaceticum
Escherichia coli B946
Escherichia coli RY13
Escherichia coli R245

SfiI GGCCNNNN/NGGCC

Streptomyces fimbriatus

Coller: la ligase

Copier: les polymrases

Marquer: kinase

Eviter lauto-ligation:
phosphatase

Synthse partir dARN:


Reverse transcriptase

Les vecteurs de clonage


et leurs htes
Hte = bactrie
- une molcule capable
daccepter un ADN tranger
- une molcule capable de se
rpliquer dans un hte
- une molcule possdant des
marqueurs de slection

Hte = bactriophage

Hte = levure

Hte = cellule dinsecte


ou uf de Xnope

Exemple: Plasmide

Schma dune manipulation de


clonage type

Schma dune manipulation de


clonage type

Les stratgies de clonage:


1. Slectionner les clones recombinants

Insertion dans un autre gne de rsistance aux antibiotiques

Les stratgies de clonage:


1. Slectionner les clones recombinants

Complmentation dune souche


bactrienne possdant une mutation dans
le gne LacZ

Insertion dans la partie LacZa de lopron lactose

Les stratgies de clonage:


1. Slectionner les clones recombinants
Le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D
galactoside (X-Gal) est cliv par la galactosidase pour donner une substance
bleue insoluble et en prsence dIPTG
(colonies bleues)
Si on introduit un ADN tranger dans le
polylinker, on dtruit la grille de lecture:
pas de -galactosidase active
(colonies blanches)
Insertion dans la partie LacZa de lopron lactose

Les stratgies de clonage:


2. Eviter la recircularisation du vecteur

Clonage directionnel

Dphosphorylation du vecteur

Les stratgies de clonage:


3. Faire en fonction des possibilits
Bouts collants possibles
Clonage directionnel possible si 2 enzymes diffrentes
Possibilit dutiliser des enzymes extrmits
compatibles

Addition de bouts collants


Ajout de nuclotides en 3 par la terminal transfrase

Liaison de bouts francs


Digestion par la nuclase S1
Utilisation de lADN ligase de T4

Les stratgies de clonage:


4. Comment cloner un gne particulier?
1re mthode:
Clonage du gnome entier: banque de gnes
Dtection du gne par hybridation molculaire
ou PCR
Proba de trouver une squence donne dans une
collection de N transformants: P = 1 (1-f)N
f: fraction du gnome effectivement clone
dpend de la taille du fragment et de la complexit du gnome

Les stratgies de clonage:


4. Comment cloner un gne particulier?
2me mthode:
Reprer le gne par hybridation molculaire
(Southern)
Rcuprer le fragment repr sur le gel
dagarose et le cloner dans un vecteur