Un enfoque quimiomtrico para evaluar los compuestos fenlicos

abstract
Se determinaron los compuestos fenlicos y flavonoides, el color, el contenido mineral
y las propiedades antioxidantes de 37 muestras de miel pertenecientes a diferentes
floras (manzana, cereza, azafrn y arbusto silvestre) procedentes de Cachemira, India.
Entre los minerales, el potasio fue el mineral ms predominante seguido de calcio,
sodio y fsforo. El valor CIELAB indic que todos los tipos de miel eran de color
oscuro (L * 50) con componentes rojos y amarillos de color. Seis cidos fenlicos
(cido glico, cido cafeico, cido clorognico, cido p-cumrico, cido elgico y cido
ferlico) y siete flavonoides (myriceten, naringenin, kaempferol, pinocembrina, crisina,
apigenina y quercetina) se identificaron en cuatro tipos de miel unifloral. El resultado
para el contenido fenlico total (37 - 117 mg GAE / 100 g) y el contenido total de
flavonoides (8 - 17 mg QE / 100 g) revelaron que las mieles del valle de Cachemira
tienen una alta actividad antioxidante que las otras mieles disponibles en diferentes
partes del mundo. Los tres primeros componentes principales explicaron ms del 83%
de la varianza con minerales con mayor poder discriminante, mientras que el anlisis
de agrupamiento jerrquico (HCA) clasific con xito todas las muestras de miel
uniflorales

Introduction
La composicin de la miel depende principalmente de las especies de plantas
visitadas por las abejas y los factores ambientales, las condiciones de procesamiento
y almacenamiento (Nayik et al., 2014; Saxena, Gautam, & Sharma, 2010). La miel,
una solucin de azcar natural sobresaturada, se compone principalmente de fructosa
y glucosa, que constituye el 65-80% de los azcares totales de miel (Bogdanov,
Jurendic, Sieber & Gallmann, 2008; Gheldof, Xiao-Hong, & Engeseth, 2002) y Tambin
contiene ciertos componentes menores importantes a saber, enzimas (dia- stase e
invertasa), cidos orgnicos (cido glucnico, cido actico, etc.), vitaminas,
compuestos voltiles, compuestos fenlicos y minerales (Alvarez-Surez, Giampieri, &
Battino, 2013; Nayik & Nanda, 2015a).
La actividad antioxidante se debe principalmente a la presencia de polifenoles
principales en forma de cidos fenlicos (clorognico, ferlico, cafeico, elgico,
vanlico, benzoico, cinmico, cido cumrico, etc.) y flavonoides (pinocembrina,
apigenina, hesperitina, crisina, Quercetina, luteolina, miricetina, pinobanksina,
galangina, kaempferol, etc.) (Aljadi & Kamaruddin, 2004, Baltrusaityte, Venskutonis &
Ceksteryte, 2007, Gheldof et al., 2002, Nayik & Nanda, 2016a). Se ha sabido que tales
polifenoles presentan propiedades saludables como antialergnicas, anticancergenas,
antitrombticas y antiinflamatorias.
La variacin en las propiedades antioxidantes entre las mieles de diferentes fuentes se
debe a la diferencia en la composicin de los polifenoles (Andrade, Ferreres, Gil y
Tomas Barberan, 1997; Nayik, Dar, & Nanda, 2016b). El color de la miel vara de
amarillo plido a rojo oscuro a negro claro, ya que el grado de oscurecimiento
depende de la temperatura y duracin del almacenamiento (Holderna-Kedzia y
Kedzia, 2006). Las mieles de color oscuro tenan un contenido fenlico ms alto y, por
consiguiente, una mayor actividad antioxidante en comparacin con la miel de color
claro (Bertoncelj, Dobersek, Jamnik, & Golob, 2007; Holderna-Kedzia & Kedzia,
2006). Se ha reportado una correlacin signi fi cativa entre la actividad antioxidante y
el color de la miel.
Las plantas de hoja ancha y los cultivos frutales como la manzana (Produccin: 1,9
MT), la cereza (Produccin: 10 kT), el azafrn (Produccin:9.6 T) y Plectranthus
rugosus (datos no disponibles) en el valle de Cachemira actan como catalizador para
que los agricultores tomen la apicultura como un negocio secundario y los ha alentado
a producir miel de estos cultivos (Direccin de Horticultura Cachemira, 2015e16). Hay
alrededor de 1621 unidades productoras de miel en Jammu y Cachemira y la
produccin de miel es de unas 2000 toneladas mtricas (Oficina de Informacin de
Prensa, Gobierno de la India, 2013). La identidad y la autenticidad de la miel de
azafrn (Crocus sativus), de cerezo (Prunus avium) y de manzana (Malus domestica)
ya se ha establecido mediante la identificacin y cuantificacin de cuarenta y dos
compuestos voltiles diferentes utilizando SPME-GCMS (Nayik & Nanda, 2015a) . Por

lo tanto, el presente trabajo de investigacin se realiz con el objetivo de estudiar los

compuestos fenlicos, el color, las propiedades antioxidantes y el contenido mineral de
cuatro tipos de miel uniforme (azafrn, manzana, cereza y arbusto silvestre) con un
enfoque quimiomtrico y estudiar la correlacin entre estos Caractersticas fsicoqumicas

2. Materiales y mtodos

2.1. Sustancias qumicas y reactivos

Todos los productos qumicos, solventes y reactivos eran de calidad analtica. El cido
ascrbico, el cido elgico, el cido clorognico, el cido cafeico, el cido p-cumrico,
el cido glico, la naringenina, la quercetina, el kaempferol, la pinocembrina, la crisina
y el metanol de grado HPLC se compraron a Acros Organics New Jersey, EE.UU. El
reactivo de FolineCiocalteu, DPPH (1,1 - difenil - 2 - picrilhidracil), AlCl3 y carbonato de
sodio se adquirieron de Fluka Goldie, Mumbai, India.
2.2. Recoleccin de muestras de miel y anlisis de polen
El presente estudio se realiz con cuatro tipos diferentes de miel cruda y fresca (n
37) (Malus domestica), cerezo (Prunus avium), azafrn (Crocus sativus) y arbusto
silvestre (Plectranthus rugosus) recogidos entre marzo de 2013 y octubre de 2014 de
diferentes (Pulwama, Pampore, Budgam y Srinagar) del valle de Cachemira. Todas las
muestras de miel se empaquetaron y sellaron en botellas de vidrio recogidas de
apicultores locales y se almacenaron a 4C. Los orgenes de cada muestra de miel se
con fi rmaron mediante anlisis microscpico de polen. Las muestras de miel se
clasificaron segn su origen botnico utilizando el mtodo descrito por Von Der Ohe,
Oddo, Piana, Morlot y Martin (2004). Los siguientes trminos se utilizaron para las
clases de frecuencia: polen predominante (> 45%), polen secundario (16 - 45%), polen
menor importante (3- 15%) y polen menor (<3%).

2.3. Color
2.3.1. Medicin de color (L *, a *, b *)
Se utilizaron muestras de miel homogeneizadas sin ninguna dilucin y se
determinaron los parmetros de color (L *, a *, b *) usando un espectrofotmetro de
color (CM-3600d, Konica Minolta). L * es la luminosidad (L * 100 para blanco y 0
para negro), a * indica rojo para un valor positivo y verde para un valor negativo, b *
indica amarillo para un valor positivo y azul para un valor negativo (Gonzalez- Miret,
Terrab, Hernanz, Fernndez-Recamales, & Heredia, 2005).
2.3.2. Color (mm Pfund)
Las muestras de miel se calentaron a 40C para disolver cristales de azcar, y el color
se determin por medicin espectrofotomtrica de la absorbancia de una solucin de
miel de 500 g / l a 635 nm. Las mieles se clasificaron segn la escala de Pfund
despus de la conversin de los valores de absorbancia (Abs) (White, 1984):
Mm pfund = 38.70 + 371.9 x abs
Donde mm Pfund es la intensidad del color de la miel en la escala de Pfund, Abs es la
absorcin de la solucin de miel.
2.3.3. Intensidad del color: ABS450
La intensidad del color de las muestras de miel Mtodo de Beretta, Granata, Ferrero,
Orioli y Facino (2005). Las muestras de miel se diluyeron a 500 g / l con agua caliente
destilada (45 y 50 C) y la solucin se filtr despus a travs de un filtro de 0,45 mm.
La absorbancia se midi a 450 y 720 nm usando un espectrofotmetro (Hach Lange
DR6000 UV-VIS, Dusseldorf Alemania) y la diferencia en absorbancia se expres
como mAU..
2.3.4. Conductividad elctrica y contenido de cenizas
La conductividad elctrica mide la resistencia elctrica, que fue medida por un medidor
de conducto. Se prepararon 0,1 mol / L de 40 ml de solucin de cloruro de potasio en
un vaso de precipitados. La celda de conductividad se conect al medidor de
conductividad despus de enjuagar la clula completamente con la solucin de cloruro
de potasio. La clula se sumergi entonces en la solucin, junto con un termmetro.
La conductancia elctrica de la solucin de miel (200 g / l) se midi despus de que la
temperatura se equilibr a 20C. Los resultados se expresaron en mS / cm. (Comisin
Internacional de la Miel, 2009).

2.4. Anlisis de minerales

El contenido de cenizas obtenido se disolvi en 0,1 mol / L de HCl y despus se diluy
a 100 ml de agua destilada (Kamboj, Bera y Nanda,
2013). Se determinaron los elementos minerales (K, Ca, P, Na, Cu, Mn, Fe, Zn, Pb y
Cd) usando un espectrmetro de absorcin atmica de aire acetileno (Perkin Elmer
Analyst 700 Model, Singapur). La respuesta del equipo se verific peridicamente con
los estndares conocidos. Se construyeron curvas de calibracin para cada elemento
usando soluciones patrn apropiadas diluyendo soluciones madre de 1000 mg / L de
cada elemento suministrado por Fluka.
2.5. Anlisis de compuestos fenlicos
2.5.1. Extraccin de compuestos fenlicos
Se disolvi muestra de miel (5 g) en 50 ml de solucin volumtrica que contena 5 ml
de agua destilada acidificada (pH 2 por HCl). El matraz se coloc en bao de agua
durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las muestras de miel se
homogeneizaron y se filtraron a travs de un filtro de membrana de PTFE de 0,45 mm.
Los compuestos fenlicos presentes en la miel permanecieron en la columna,
mientras que los azcares y otros compuestos polares se eluyeron con el disolvente
acuoso. La columna se lav primero con agua cida seguida de agua destilada. Los
compuestos fenlicos se eluyeron con 250 ml de metanol. A continuacin, los
extractos de metanol se concentraron a vaco a 40C en un evaporador rotatorio. El
residuo disuelto en 5 ml de agua destilada se extrajo tres veces con 5 ml de ter
dietlico. El residuo seco redisuelto en 1 ml de metanol (grado HPLC) se filtr despus
a travs de un filtro de membrana con un tamao de poro de 0,45 mm..
2.5.2. Identificacin y cuantificacin de compuestos fenlicos
Los anlisis de los extractos se llevaron a cabo con el sistema HPLC isotctico de
Waters (Chandigarh, India) equipado con un detector de matriz de diodos (DAD). La
separacin se realiz mediante una columna HPLC Waters X-Bridge Amide, 5 mm
(250 4,66 mm) usando una fase mvil de agua con 50 ml de cido frmico (disolvente
A) y metanol (disolvente B) a una velocidad de flujo constante del disolvente de 1 ml /
Min. De acuerdo con el mtodo adoptado por Martos, Ferreres y Tomas-Barberan
(2000), se utiliz el siguiente programa de gradiente modificado: se dej que el
disolvente B al 30% fluyera a travs de la columna isocrticamente durante 15 min y
despus se aument a 40% de metanol al 20 min seguido por 45% de metanol a 30
min y 60% de metanol a 50 min. Finalmente, se realiz la elucin isotctica hasta 55
min con metanol al 80% (Yao, Jiang, Singanusong, Datta y Raymont, 2004). Se
inyectaron los extractos de miel (5 mL) y se detectaron compuestos fenlicos usando
un detector de matriz de fotodiodos para obtener los espectros UV de compuestos

fenlicos. Adems, los cromatogramas se controlaron a 290 y 340 nm, ya que la

mayora de los compuestos fenlicos de miel muestran su mxima absorcin UV
alrededor de estas longitudes de onda (Martos et al., 2000). La identificacin de cidos
fenlicos y flavonoides se realiz comparando su tiempo de retencin y las
caractersticas espectrales de los analitos desconocidos con los de los patrones de
referencia. El mtodo de deteccin HPLC de compuestos fenlicos demostr ser muy
sensible como se refleja en los valores de recuperacin media (94e98%), lmites de
deteccin (0.03e0.13 mg / 100 g) y lmites de cuantificacin (0.18e0.43 g / 100
gramos).
2.6. Determinacin del contenido total de fenoles y flonoides
El contenido total de fenoles presente en todas las muestras de miel se determin
usando el mtodo FolineCiocalteu (Noor, Sarfraz, & Shahid, 2014). Se aadi 1 ml de
solucin de miel (100 g / l en metanol) a 5 ml de reactivo Folin Ciocalteu 0,2 mol / L.
Despus de mezclar la solucin durante 10 min, se aadi carbonato de sodio 4 ml
(75 g / L) y se incub durante 2 h. La absorbancia de la mezcla de reaccin se midi a
760 nm frente a metanol en blanco utilizando el espectrofotmetro UV-VIS Hach
Lange DR6000 (Dusseldorf, Alemania). El contenido fenlico total se determin
comparando con la curva estndar usando cido glico (0e100 mg / ml). Los
resultados se expresaron en mg de equivalentes de cido glico (mg GAE) / 100 g de
miel. Para la determinacin total de flonoides, se utiliz el mtodo Dowd, modificado
por Arvouet-Grand, Vennat, Pourrat y Legret (1994). Se mezclaron 0,1 mg de miel
disuelta en 5 ml de metanol con 5 ml de cloruro de aluminio a 20 g / l y se incubaron
durante 10 min. La absorcin se midi a 415 nm (espectrofotmetro UV-VIS Hach
Lange DR6000) contra una muestra en blanco constituida por una disolucin de miel
de 5 ml con 5 ml de metanol sin (AlCl3). El contenido total de flonoides se determin
comparando con una curva estndar preparada usando quercetina (0e100 mg / mL).
Se calcul la media de tres lecturas y los resultados se expresaron en mg de
quercetina / 100 g de miel (mg QE / 100 g).
2.7. Actividad de eliminacin de radicales DPPH
Se disolvi muestra de miel (0,6 g) en 4 ml de metanol. Despus de esto se aadieron
1,5 ml de solucin de reactivo de DPPH (0,02 mg / ml) a 0,75 ml de solucin de miel y
las muestras se mantuvieron en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura
ambiente. La absorbancia de la mezcla se midi a 517 nm frente a metanol en blanco
utilizando el espectrofotmetro UV-VIS Hach Lange DR6000 (Dusseldorf Alemania). La
actividad de eliminacin de radicales del radical DPPH expresada como% de inhibicin
se calcul a partir de la siguiente ecuacin (Meda, Lamien, Romito, Millogo, &
Nacoulma, 2005)

%inhibicion=

|control||muestra|
x 100
|control|

Donde el control Abs es la absorbancia del control (1,5 ml de DPPH y 0,75 ml de

metanol) a 517 nm y la muestra Abs es la absorbancia de la muestra a 517 nm.
2.8. Contenido antioxidante del cido ascrbico equivalente
4 g de muestra de miel se disolvieron 100 ml de metanol, de los cuales 0,75 ml se
pipetearon y se mezclaron con 1,5 ml de un 0,02 mg / ml de DPPH en metanol. La
absorbancia de la solucin de muestra se midi frente a la muestra en blanco (0,75 ml
de una solucin de miel+ 1,5 ml de metanol) a 517 nm despus de que las mezclas se
dejaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. El total expresado en mg de
contenido de antioxidante equivalente al cido ascrbico por 100 g de miel (mg
AEAC / 100 g).

2.9. anlisis estadstico

Cada muestra de miel se analiz por triplicado. Las diferencias estadsticas
representadas por letras peque~nas se obtuvieron a travs del anlisis de varianza
unidireccional (ANOVA) seguido por la prueba de rango mltiple de Duncan a 95% del
nivel de confianza (P <0,05). El anlisis multivariado [anlisis de componentes
principales (PCA), anlisis de clster (CA) y anlisis de discriminacin lineal (LDA)] se
realiz utilizando Statistica. V.12. (StatSoft India Pvt. Ltd. Nueva Delhi, India) y
XLSTAT (Addinsoft, Nueva York, EE.UU.). Antes del anlisis multivariante, la matriz de
datos completa se escal automticamente para la columna, restando la mediana de
cada columna a cada muestra y dividindola para su desviacin estndar para
asegurar que todos los elementos tuvieran la misma ponderacin en los resultados.
CA se realiz en los datos estandarizados para clasificar las muestras sobre la base
de las similitudes de sus parmetros antioxidantes, color y minerales. Los clusters
fueron calculados usando la distancia Euclidiana. Los parmetros antioxidante, color y
minerales tambin fueron sometidos a LDA con el fin de evaluar el potencial de estos
parmetros para la clasificacin de las muestras.
3. Resultados y discusin
3.1. Anlisis del polen
Los porcentajes de espectros de polen se relacionaron con polen de plantas

productoras de nctar. La miel de manzana estaba dominada por los granos de polen
de las especies de Malus domestica (54e60%). El polen de otras especies de plantas
acompaantes, como Brassica campestris (17%), Pyrus communis (5e6%), Pyrus
pyrifolia (3e4%), apiroga americana (2e3%) estaban presentes en un porcentaje bajo
(Tabla 1). La miel de cereza contena granos de polen de Prunus avium dentro de un
intervalo porcentual de 46e57% por lo tanto; El polen de esta especie era dominante,
lo que sugiere su autenticidad como miel monofsica. Los granos de polen de Prunus
persica (3%), Prunus amygdalus (4%) estuvieron presentes en menor porcentaje,
mientras que Prunus domestica (1%) y Prunus armeniaca (0,7%) estaban presentes
en trazas. La miel de azafrn se seleccion como miel de un campo cultivado de
azafrn, que contena granos de polen de Crocus sativus en una cantidad del 47% al
49%, lo que sugiere que esta planta es la principal fuente de polen y nctar en la
alimentacin de abejas. La miel de monte silvestre estaba dominada por la alta
frecuencia de granos de polen (42e54%) de especies de Plectranthus. El anlisis de
polen de todas las muestras de miel revel que todos los tipos de miel podan
considerarse como Mieles uniflorales ya que el polen predominante (> 45%) se
origin a partir de especies vegetales respectivas. Las vistas microscpicas de los
granos de polen presentes en los tipos de miel de (a) Plectranthus rugosus (b) Prunus
avium (c) Malus domestica y (d) Crocus sativus se muestran en la Fig. 1.
Ilustracin 1 Vista microscpica de los granos de

3.2. Color y conductividad elctrica

La conductividad elctrica se consider como un criterio vlido para la diferenciacin
entre mieles de flores y mieles de melaza (Bogdanov, Ruoff, & Persano Oddo, 2004) y
segn la Directrices establecidas por el Codex Alimentarius (2001), la miel de nctar
debe poseer un valor de conductividad elctrica inferior a 0,8 mS / cm. En el presente
estudio, el valor de conductividad elctrica de la miel de azafrn (0,23 mS / cm), miel
de matorral silvestre (0,29 mS / cm), miel de cerezo (0,34 mS / cm) y miel de manzana
(0,69 mS / cm) indic el origen del nctar De los cuatro diferentes tipos de miel. El
color de la miel es uno de los factores que determinan su precio en el mercado y su
aceptabilidad por parte de los consumidores. Las caractersticas de color de la miel de
cuatro tipos diferentes se presentan en la Tabla 1. Aplicacin de los criterios de
clasificacin de la miel basada en el color establecido por USDA. (1985) mostr que la
variedad de manzana (135 mm Pfund) se clasific como mbar oscuro, miel de cereza
(110 mm Pfund) como mbar, miel de arbusto salvaje (76 mm Pfund) como mbar
claro y miel de azafrn mbar claro. Estos resultados fueron consistentes con los
resultados reportados en Malasia (76e113 mm Pfund) y miel argelina (111e150 mm
Pfund) (Khalil et al., 2012, Moniruzzaman, Khalil, Sulaiman, & Gan, 2013). Gheldorf,
Wang y Engeseth (2002) informaron que las mieles de color claro tenan bajos
contenidos de cenizas y actividad antioxidante en comparacin con las mieles de color
oscuro. El color de la miel estuvo estrechamente relacionado con la presencia de
pigmentos principalmente clorofila, carotenoides, flavonoides y polifenoles que lo
reflejaron como un ndice de actividad antioxidante (Lazaridou, Biliaderis,
Bacandritsos, & Sabatini, 2004). La intensidad del color se consider un ndice
confiable para confirmar la presencia de pigmentos con actividades antioxidantes
(Frankel, Robinson y Berenbaum, 1998). Los valores de intensidad de color de los
cuatro tipos analizados fueron mnimos (94 mAU) en miel de azafrn y mximo (795
mAU) en miel de manzana y se observ diferencia estadstica entre los cuatro tipos de
miel (P <0,05).
Las caractersticas de color (L *, a *, b *) de muestras de cuatro tipos diferentes se
presentan en la Tabla 1. Se inform que las muestras de miel se consideraron mieles
ligeras con valor L *> 50 y aquellas con valor L * < 50 Eran mieles oscuras (GonzalezMiret et al., 2005). Los valores L *, a * y b * de muestras de miel de cuatro diferentes
tipos de miel variaron de 17 a 28, 2 a 5 y 4 a 13, respectivamente (Tabla 1). Estos
valores con fi rmaron que todos los tipos eran de color oscuro y posean componentes
rojos y amarillos de color. Los valores de color (L *, a *, b *) de todas las muestras de
miel de diferentes fuentes tambin fueron significativamente diferentes (P <0,05). El
valor L * de la manzana (17) y de la miel de cereza (20) fue menor en comparacin
con los reportados por Kus, Jerkovic, Tuberoso y Sarolic (2013) y Kus, Jerkovic,
Tuberoso, Marijanovic y Sarolic (2013) en Malus Domestica Borkh (61.1e80.4) y
Prunus cerasus L. (66.9e73.9), respectivamente. La razn de tal variacin podra

deberse a la diferencia en las condiciones geogrficas, ambientales y climticas..

Los resultados se expresan como valores medios desviaciones estndar. Los medios en una fila con los
mismos sobrescritos no son signi fi cativamente diferentes (P <0.05), n = Nmero de muestras;
MAU = miliAbsorbancia; Mm Pfund = milmetro Pfund; MS / cm = milisegundos / centmetro.

3.3. Anlisis de minerales

El contenido medio de todos los minerales (mg / kg) encontrados en cuatro tipos de
miel analizados se muestra en la Tabla 1 y tambin se observaron diferencias
estadsticamente significativas (P <0,05) entre los cuatro tipos analizados. Los
minerales ms abundantes encontrados en cuatro tipos de miel analizados fueron el
potasio (K), el calcio (Ca), el sodio (Na) y el fsforo (P), que oscilaron entre 426 y 1137
mg / kg, 117e210 mg / kg, 17e122 Mg / kg y 19e74 mg / kg, respectivamente. Los
resultados para K y Ca en los tipos analizados fueron consistentes con la miel
espaola, portuguesa e italiana, en la que tres cuartos del contenido total de minerales
fueron ocupados por potasio (Conti, 2000; Silva, Videira, Monteiro, Valentao, Andrade,
2009). El calcio fue el segundo mineral ms abundante en los tipos analizados con
mayor concentracin en miel de manzana (210 mg / kg) y menor en azafrn (117 mg /
kg). Estas concordaban con las mieles checas, hindes, hngaras y croatas (Czipa,
Andrasi y Kovacs, 2015, Lachman et al., 2007, Nanda, Sarkar, Sharma y Bawa, 2003,
Ursulin-trstenjak et al., 2015) . Los resultados de sodio (17e122 mg / kg) y fsforo
(19e74 mg / kg) fueron bajos en comparacin con los resultados reportados por
Sulbara n de Ferrer, Ojeda de Rodrguez, Pena, Martnez y Moran (2004) en miel
venezolana (Na 353 mg / kg, P = 1642 mg / kg). Entre los oligoelementos

cuantificados en los cuatro tipos de miel, el contenido de cobre (Cu) se encontr ms

alto en manzana (0,34 mg / kg) y menor en miel de azafrn y cereza (0,14 mg / kg)
(Tabla 1). La concentracin de cobre en cuatro tipos de miel analizados fue baja en
comparacin con otros tipos de miel india (Cu 1,74e2,9 mg / kg) (Nanda et al.,
2003), pero el contenido de cobre similar se encontr en la miel brasilea (0,07e1. 29
mg / kg) y miel checa (0.11e0.88 mg / kg) (Lachman et al., 2007; Liberato et al., 2013).
La concentracin de manganeso (Mn) de todos los tipos analizados oscil entre 1,11
mg / kg y 1,31 mg / kg con concentracin mxima de 1,31 mg / kg en arbusto silvestre
y mnimo en miel de azafrn (1,11 mg / kg). En comparacin con todos los minerales
traza, la concentracin de hierro (Fe) se encontr en el mximo en miel de arbusto
salvaje (2,69 mg / kg) y mnimo en miel de cerezo (1,04 mg / kg). Los niveles de zinc
(Zn), plomo (Pb) y cadmio (Cd) estaban presentes en <1 mg / kg en los cuatro tipos de
miel analizados (Tabla 1). Los resultados para Mn, Fe, Zn, Pb y Cd estn de acuerdo
con los hallazgos de Liberato et al. (2013) en miel brasilea y Nayik y Nanda (2015b)
en miel de acacia. Pohl (2009) inform que el contenido mineral de la miel depende
del origen geogrfico, origen oral, condiciones climticas y tipo de suelo. Yatoo, Devi,
Kumar, Tiwari y Sharma (2011) informaron que el suelo en el valle de Cachemira era
pobre en minerales traza a saber. Cu, Fe y Zn que podra ser una de las razones de
baja concentracin de minerales traza en los tipos de miel estudiados.
3.4. Compuestos fenlicos
Se identificaron siete compuestos fenlicos en los cuatro tipos de miel analizados
como se muestra en la Tabla 2 y los compuestos identificados en la miel de manzana
se representan mediante cromatogramas HPLC tpicos (Fig. 2). La hesperetina,
luteolina, galangina, rutina, tricetina, isomarhamina, El cido abcsico, el cido vanlico
y el cido p-hidroxibenzoico no pudieron identificarse debido a la falta de disponibilidad
de compuestos estndar. Los compuestos fenlicos identi fi cados y cuanti fi cados en
los tipos de miel de cuatro tipos fueron cido glico (0,11e0,24 mg / 100 g), cido
cafeico (0,37e0,52 mg / 100 g), cido clorognico (0,32e0,43 mg / 100 G), cido pcumrico (0,17 e 0,25 mg / 100 g), cido ferlico (0,07 e 0,17 mg / 100 g) y cido
elgico (0,21 e 0,31 mg / 100 g). La concentracin media de cido cafeico y cido
clorognico cuantificada en los cuatro tipos analizados fue de acuerdo con los
hallazgos de Khalil, Alam, Moniruzzaman, Sulaiman y Gan (2011) en la miel tropical
Borneo de Malasia y Jasicka-Misiak, Poliwoda, Deren y Kafarski (2012) en las mieles
polacas. Se encontr la concentracin de cido p-cumrico y cido clorognico en las
mieles de ctricos, romero, castao y flor de sol de los Estados miembros de la Unin
Europea (Dimitrova, Gevrenova, & Anklam, 2007) en la misma concentracin que en el
presente estudio. Los flavonoides, naringenina (1.64e2.04 mg / 100 g) y kaempferol
(0.49e0.72 mg / 100 g) fueron los ms abundantes y seguidos por pinocembrina
(0.39e0.59 mg / 100 g), crisina (0.26e0. 42 mg / 100 g) y quercetina (0,21 e 0,40 mg /
100 g) en los cuatro tipos de miel analizados. Tambin se identificaron apigenina

(0.15e0.28 mg / 100 g) y miricetina (0.12e0.34 mg / 100 g) en bajas concentraciones

en los cuatro tipos de miel. El kaempferol, la pinocembrina y la quercetina han sido
reportados en la mayora de las mieles por muchos autores de diferentes pases
(Dimitrova et al., 2007; Jasicka- Misiak et al., 2012; Khalil et al., 2011). A partir de la
tabla 2, se observa que la miel de manzana posee una alta concentracin de
polifenoles (6,7 mg / 100 g) seguida de cereza (5,3 mg / 100 g), arbusto salvaje (5,1
mg / 100 g) y miel de azafrn (4,5 mg /100 gramos). Esta variacin de la
concentracin fenlica y flonoidea observada entre los cuatro tipos de miel podra
deberse a su diferente origen botnico (Kaskoniene & Venskutonis, 2011).
3.5. Propiedades antioxidantes
La actividad antioxidante de la miel vara ampliamente, dependiendo de la fuente fl
oral, el origen geogrfico, las condiciones climticas, el procesamiento y la produccin
de la miel. (Noor, Sarfraz, Ali, & Shahid, 2014, Khalil et al., 2012, Azeredo, Azeredo, de
Souza, & Dutra, 2003). El contenido fenlico total (TPC) fue mnimo en miel de azafrn
(37 mg GAE / 100 g) y mximo en miel de manzana (117 mg GAE / 100 g) (Tabla 2).
La miel con color oscuro tiene un contenido fenlico ms alto y por lo tanto una mayor
actividad antioxidante en comparacin con miel con color claro (Frankel et al., 1998).
Como se coment en la seccin 4.2, los cuatro tipos de miel analizados eran de color
oscuro (L * 50), por lo que todas las muestras de miel de cuatro tipos posean una alta
actividad antioxidante. El contenido fenlico de la miel de manzana y cereza fue mayor
en comparacin con los reportados por Kus, Jerkovic, Tuberoso y Sarolic (2013) y
Kus, Jerkovic, Tuberoso, Marijanovic, et al. (2013) en muestras de miel de Malus
domestica BORKH y Prunus cerasus L., respectivamente. La posible razn podra ser
la variacin en el origen de las especies, el origen geogrfico y los factores
ambientales. Los compuestos flavonoides son compuestos de bajo peso molecular,
presentes en la miel, que son demasiado responsables de la actividad antioxidante de
la miel. El contenido total de flavonoides (TFC) de cuatro tipos de miel analizados vari
de 8 a 17 mg QE / 100 g (Tabla 2). El contenido total de flavonoides de todos los tipos
analizados fue alto comparado con argelino (2,7e7,1 mg CEQ / 100 g) y miel malasia
(1,1e3,4 mg CEQ / 100 g) (Khalil et al., 2011; Khalil et al. Al., 2012). La actividad de
eliminacin de radicales DPPH (DPPH-RSA) de los cuatro tipos de miel analizados fue
bastante alta (55e84%) en comparacin con las mieles paquistanes (35,54%) (Noor et
al., 2014) y rumanas (35e64%) (Azeredo Et al., 2003). El contenido de antioxidantes
determinado en trminos de AEAC (contenido de cido ascrbico equivalente
antioxidante) oscil entre 19 y 51 mg de AEAC / 100 g de miel (Tabla 2). El AEAC de
mieles indias comerciales (15.1e29.5 mg AEAC / 100 g) (Saxena et al., 2010), Burkina
Fasan (10.2e37.8 mg AEAC / 100 g) (Meda et al. 24,2e32 mg de AEAC / 100 g) (Khalil
et al., 2011) y miel de Pa- istani (8,32 e 22,10 mg AEAC / 100 g) (Noor et al., 2014)
fueron bajas en comparacin con los tipos analizados en la presente estudiar. La miel

de manzana fue el color ms oscuro (L * 17; mm Pfund 135) entre los cuatro tipos
de miel analizados y tambin se encontr alta en TPC, TFC, DPPH-RSA y AEAC.
Tabla 2
Propiedades antioxidantes y compuestos fenlicos cuantificados en 37 muestras de
miel de cuatro fuentes diferentes.

Los resultados se expresan como valores medios desviaciones estndar. Los

medios en una fila con los mismos sobrescritos no son significativamente diferentes (P
<0.05),
.

Figura. 2. Representacin tpica de los cromatogramas de HPLC obtenidos para la

miel de manzana (1: cido glico, 2: cido cafeico, 3: cido clorognico, cido 4: pcumrico, 5: cido elgico, 6: cido ferlico, 7: naringenina, 8 : Myricetin, 9: Quercetin,
10: Pinocembrin, 11: Kaempferol, 12: Chrysin, 13: Apigenin). Columna utilizada:
Waters X-bridge Amide Columna de HPLC; Disolvente utilizado (disolvente A: agua:
solucin de cido frmico y disolvente B: metanol) Longitud de onda utilizada: 290 y
340 nm

3.6. La matriz de correlacin de Pearson entre los minerales totales, el color, la

conductividad elctrica y los parmetros antioxidantes
El coeficiente de correlacin de Pearson indic una fuerte correlacin positiva entre los
minerales y la conductividad elctrica (r = 0,92) (Tabla 3), que estableci la
dependencia De conductividad elctrica de la miel sobre contenido mineral. Se
encontr una correlacin signi fi cativa entre la intensidad del color (CI) y las
propiedades antioxidantes a saber, CI y TPC (r = 0.85), CI y TFC (r = 0.78), CI y AEAC
(r = 0.83), CI y DPPH-RSA (r = 0.86), lo que indica que los compuestos fenlicos
contribuyen al color de la miel. La correlacin signi fi cativa observada entre TPC y
DPPH-RSA (r = 0,89) indic que el contenido fenlico fue el factor que ms contribuy
a la actividad de barrido radical de los cuatro tipos de miel analizados. La correlacin
signi fi cativa entre TPC, TFC, AEAC y DPPH-RSA con el parmetro L * (medida de
ligereza) fue negativa, lo que indic la disminucin de las propiedades antioxidantes
con aumento de color claro y confirm que la miel de color claro posea propiedades
antioxidantes bajas Como comparar con mieles de color oscuro. Estos resultados
estuvieron de acuerdo con los hallazgos de Bertoncelj et al. (2007), que mostraba
mieles de color oscuro con altas propiedades antioxidantes. La correlacin signi fi
cativa entre las propiedades antioxidantes y el contenido mineral total (Tabla 3) indic
que los minerales tambin contribuyeron en la actividad antioxidante de los cuatro
tipos de miel. Correlacin similar fue observada por Escuredo, Miguez, FernndezGonzlez y Seijo, (2014), quienes informaron que las mieles de miel y miel de castaa
exhiban las mayores actividades antioxidantes debido al alto contenido de minerales.
La correlacin encontrada entre el contenido total de minerales y el valor de L * indic
que la miel ligera posea un bajo contenido de minerales,
Actividad antioxidante (Tabla 3).
Tabla 3
Pearson La matriz de correlacin mostr entre las variables (color y propiedades
antioxidantes) analizadas entre 37 muestras de miel de cuatro variedades de miel.

* Significativo (P <0,05).
L *:Intensidad de color ; CE: Conductividad elctrica; TM: minerales totales; TPC:
Contenido fenlico total; TFC: Contenido total de fluonoides; AEAC: Contenido de
cido ascrbico equivalente antioxidante; DPPH - RSA: actividad de barrido de
radicales 2, 2, difenil - 1 - picrilhidracil.

4. Anlisis multivariante
La prueba de ShapiroeWilk y la prueba de AndersoneDarling para la normalidad de la
distribucin de datos (Tabla 4) mostraron que hubo una desviacin significativa de la
distribucin normal para cada una de las variables estudiadas. Con el fin de detectar
posibles valores atpicos, identificar similitudes y confirmar si los parmetros color,
minerales y antioxidantes podan diferenciar las mieles segn su origen botnico, se
aplicaron anlisis de componentes principales (PCA) y anlisis discriminante lineal
(LDA) a los datos. Dado que el objetivo principal del anlisis multivariado era
demostrar qu parmetros (propiedades antioxidantes, minerales y color) podan
diferenciar la posicin de todas las muestras de miel uni fl oral pertenecientes a cuatro
tipos de miel, se aplic el PCA a los parmetros antioxidantes (TPC, TFC, DPPH,
AEAC ), Color (mm pfund y L *, a *, b *) y minerales (K, P, Ca, Na, Cu, Mn, Fe, Zn, Pb
y Cd) presentes en cuatro tipos de miel. Utilizando el criterio de Kaiser, se extrajeron
los tres primeros componentes principales (PC), con valores propios superiores a uno
(11,91, 2,55 y 1,32). Los tres primeros componentes principales representaron ms del
83% de la variacin en las muestras de miel analizadas. El primer componente (PC1),
segundo (PC2) y tercero (PC3) explicado 62,70%, 13,43% y 6,95% de la varianza,
respectivamente. El primer componente fue el ms dominado por minerales macro, a
saber. Potasio, calcio, sodio y fsforo, como se muestra en la Fig. 3. Fernndez Torres
y col. (2005) reportaron resultados similares para potasio, fsforo y calcio para PC1 en
cuatro diferentes mieles espaoles. El segundo componente estaba dominado por el
hierro y el cadmio, mientras que el color (a *) dominaba el tercer componente, por lo
que en el presente estudio la mayora de los minerales eran variables importantes que
eran capaces de discriminar las mieles individuales como color y propiedades
antioxidantes. Las parcelas de carga para la mayora de las variables coinciden con la
direccin PC1, por lo que las propiedades antioxidantes y el contenido mineral total
podran explicarse por PC1 (Figuras 3 y 4). Las Figs. 3 y 4 mostraron que todas las
muestras de miel de manzana en el upleft de PC1 estaban relacionadas con
propiedades antioxidantes y macro minerales, mientras que todas las muestras de
miel de arbusto salvaje colocadas en su posicin vertical estaban vinculadas a
minerales traza (Fe, Cd y Mn). Por lo tanto, las propiedades antioxidantes y minerales
se podran utilizar para distinguir la miel de manzana de la miel de monte silvestre. Las
Figs. 3 y 4 tambin muestran que las muestras de miel de azafrn tienen correlacin
negativa con PC1, lo que demuestra su bajo contenido de antioxidantes y minerales.
Para comparar la importancia relativa de las variables independientes, se utilizaron los
coeficientes discriminantes estandarizados. Cuanto ms alto es el valor absoluto de un
coe fi ciente estandarizado, ms significativa es la variable seleccionada relacionada.
La primera funcin discriminante representa el 96,9% de la varianza total y el segundo
2,6%, y ambos representaron el 99,5% de la varianza total (Cuadro 5). El potasio fue
el que ms contribuy a la primera variable cannica (coeficiente estandarizado

=1,096), lo que explica la mayor parte de la discriminacin entre las clases de miel
seguida de calcio y fsforo. La segunda variable cannica se relacion con el valor de
color (b *) (coeficiente estandarizado = 1,817), mientras que en la Tercera variable
cannica, la conductividad elctrica (coeficiente estandarizado = 1,079) fue la variable
en explicar la separacin entre las muestras de miel de acuerdo al origen botnico
(Tabla 5). El LDA, utilizado para predecir la pertenencia al grupo de mieles, mostr que
el 100% de las muestras se clasificaron correctamente en cada tipo de miel (en la
matriz diagonal) (Tabla 6). Observando la distribucin grfica de las muestras de miel
en el diagrama de dispersin reportado (Fig. 5), se obtuvo una separacin natural y
completa entre cuatro mieles de origen botnico diferente por las funciones
discriminantes DF1 y DF2. Todas las muestras correspondientes a la miel silvestre se
localizaron como un grupo compacto en la parte superior izquierda del diagrama de
dispersin. Tanto las muestras de cereza como de miel de manzana se colocaron en el
lado derecho formando dos grupos claramente definidos, mientras que en el lado
izquierdo inferior del diagrama de dispersin, todas las muestras de miel de azafrn
parecan ser ms densas y separadas (Figura 4) ). Para clasificar las 37 muestras de
miel segn su origen botnico, se aplic un anlisis de agrupamiento jerrquico (HCA)
a los datos. Se utilizaron distancias euclidianas para calcular las similitudes de
muestra. La figura 6 muestra los resultados de HCA como un dendrograma que
corresponde a grupos de las observaciones correspondientes a cada origen botnico
de las muestras de miel. Los cuatro grupos, cada uno correspondiente a un origen
botnico particular se poda ver de la izquierda se compone de muestras de miel de
azafrn y el segundo grupo compuesto de miel de arbusto salvaje. En el tercer grupo,
todas las muestras de miel de cereza fueron agregados, mientras que el ltimo grupo
fue formado por muestras de miel de manzana (Fig. 6). Similar anlisis de
conglomerados en cuatro diferentes mieles espaolas fue observado por FernandezTorres et al. (2005).

Cuadro 4
Resumen de Shapiro-Wilk y Anderson Darling prueba de minerales, color y
propiedades antioxidantes.

Figura. 3. Proyecciones de las variables (color, minerales y parmetros antioxidantes)

en el plano de los factores para las 37 muestras de miel pertenecientes a cuatro
variedades de miel (orgenes botnicos: A: Manzana, PR: P. rugosus, C: Cereza, S:
Azafrn ).

fig. 4. Anlisis de componentes principales de minerales, color y propiedades

antioxidantes. Distribucin de 37 muestras de miel en la parcela de puntuaciones.
(Orgenes botnicos: A: Apple, PR: P. rugosus, C: Cereza, S: Azafrn
Tabla 5
Coeficiente estandarizado para variables cannicas obtenido por anlisis discriminante
de minerales, color y propiedades antioxidantes.

Tabla 6 Clasificacin de la LDA de minerales, color y propiedades antioxidantes en

cuatro tipos de miel.

Figura. 5. Dispersin de las puntuaciones cannicas discriminantes de 37 muestras de

miel de cuatro variedades de miel utilizando LDA de minerales, color y propiedades
antioxidantes.

6. Dendrograma de racimos jerrquicos Anlisis de minerales, color y propiedades antioxidantes de 37

muestras de miel de cuatro variedades de miel (orgenes botnicos: S: Azafrn, PR: Bush silvestre (P.rugosus)
C: Cereza A: Manzana) .

5. Conclusion
Los cuatro tipos de miel unifloral del valle de Cachemira eran ricos en macro minerales
(K, Ca, Na y P) y compuestos polifenlicos. Adems, varias correlaciones positivas
significativas demostraron que la propiedad antioxidante podra atribuirse a los
contenidos fenlicos y flonoides. Entre los tipos de miel analizados, la miel de
manzana present la mayor actividad antioxidante seguida de cereza, arbusto silvestre
(P.rugosus) y miel de azafrn. Este trabajo demostr que es posible clasificar
eficazmente la miel mediante la aplicacin de tcnicas quimiomtricas (PCA, LDA y
HCA). El estudio tambin confirm que los minerales tienen un poder discriminante
mayor que el color y los parmetros antioxidantes. Este estudio tambin podra servir
de base de datos para el desarrollo de reglamentos internacionales especficos para la
miel de las Indias de gran altitud.

Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.
Expresiones de gratitud

El primer autor agradece a los apicultores locales del valle de Cachemira de la India
por proporcionar muestras de miel cruda ya la Comisin de Subvenciones
Universitarias de Nueva Delhi para el apoyo financiero en forma de MANF2013e14.