Tesis. Trabajo

AO DE LA DIVERSIFICACIN PRODUCTIVA Y DEL
FORTALECIMIENTO DE LA EDUCACIN
UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONA PERUANA
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO

HIDROALCOHLICO Y ETANLICO DE LA HOJA DE Mansoa alliacea
Ajo Sacha, SOBRE Escherichia coli y Staphylococcus aureus,
IQUITOS- PER
Presentado por:
BACH. FLORES METZGER, TANIA AILEEN.
BACH. SANGAMA ROMANI, ROSA YESENIA.
Asesores:
Q.F. SOSA AMAY, FRIDA ENRIQUETA
BLGO. ADRIANZEN JULCA, PEDRO MARCELINO.
Iquitos-Per
2015
DEDICATORIA
A DIOS, porque est conmigo en cada paso que doy, guindome y dndome
fortaleza, sabidura y humildad para continuar. A mis padres DINA DEL
ROCIO y JUAN HUMBERTO porque son quienes a lo largo de mi vida
trabajaron muy duro para darme lo mejor y hacer de m una mujer de bien, y porque
han depositado en todo momento su entera confianza en cada reto que se me
presentaba sin dudar ni un solo momento de mi inteligencia y capacidad. A mis
hermanitos JOHNNY ABDEL Y GIANELLA NORUSKA porque son mi
compaa y motivo de seguir adelante. A mi esposito JORGE LEANDRO que
siempre me acompa y me dio fuerzas de seguir a pesar de los obstculos que se
presentaban en el camino. Los amo con toda mi alma.
Tania Aileen Flores Metzger
Le agradezco a DIOS por haberme acompaado y guiado a lo largo de mi Carrera,

por ser mi fortaleza en los momentos de debilidad y por brindarme una vida llena de
aprendizaje, experiencias y sobre todo felicidad. A mis padres FELIX IVAN y
ROSA BALVINA por apoyarme en todo momento, por los valores que me han
inculcado, y por haberme dado La oportunidad de tener una excelente educacin en
el transcurso de mi vida. Sobre todo por ser un excelente ejemplo de vida a seguir. A
mis hermanos JUAN IVAN y a CARLOS IVAN por ser parte importante de mi
vida y representar La unidad familiar. A mi sobrinito FFELIX ROUNALDO y mi
precioso bebe MATIAS NASSER por llenar mi vida de alegrias y amor
incondicional. A mi novio VICTOR HUGO, por ser parte importante de mi vida,
por haberme apoyado en las buenas y em ls malas, sobre todo por su paciencia y
amor incondicional.
Rosa Yesenia Sangama Romani
AGRADECIMIENTOS
Brindamos nuestro ms sincero agradecimiento a todas las personas que hicieron posible
la realizacin y culminacin de este Proyecto de Tesis.
En primer lugar agradecerte a ti Dios por bendecirnos y hacer realidad este sueo
anhelado.
A la Universidad Nacional de La Amazonia Peruana y a la Facultad de Farmacia y

Bioqumica, encaminado por la Direccin de Escuela de la misma, a cargo del Q.F. Luis
Vlchez Alcal por
la oportunidad de estudiar y ser un profesional Qumico
Farmacutico.
A nuestros Asesores de Tesis, Q.F. Frida Enriqueta Sosa Amay y el Blgo. Pedro
Marcelino Adrianzen Julca por su esfuerzo y dedicacin, quienes con sus conocimientos,
su experiencia, su paciencia y su motivacin han logrado que nosotros podamos terminar
nuestro proyecto de tesis con xito.
Al Instituto de Medicina Tradicional (IMET-ESSALUD), por habernos prestado sus

instalaciones, para recoleccin de nuestra muestra a estudiar, asimismo
brindarle
nuestra especial gratitud al Ing. Villacres, por darnos la informacin necesaria a cerca de
esta planta.
Tambin, a todos nuestros profesores que durante toda nuestra carrera profesional han
aportado sus conocimientos para nuestra formacin, con sus consejos, sus enseanzas y
ms que toda su amistad. De igual manera agradecer a nuestros Jurados de Tesis por la
visin crtica de muchos aspectos cientficos, por su rectitud en su profesin como
docentes, por sus consejos que ayudan a formarnos como persona e investigadores.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO HIDROALCOHLICO Y ETANLICO

DE LA HOJA DE Mansoa alliacea Ajo Sacha, SOBRE Escherichia coli y Staphylococcus aureus,
IQUITOS- PER
Bach. FLORES MEZGER, TANIA AILEEN

Bach. SANGAMA ROMANI, ROSA YESENIA
RESUMEN
En la presente investigacin se determin la actividad antimicrobiana de los extractos:

hidroalcohlico y etanlico de Mansoa alliacea ajo sacha (familia Bignoniaceae)
frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus. La especie fue recolectada en el
Jardn Botnico del Instituto de Medicina Tradicional (IMET-ESSALUD), Distrito de
San Juan Bautista-Iquitos, Se probaron diferentes concentraciones de los extractos en
estudio por el Mtodo de Macrodilucin, usando caldo Mueller Hinton. Los resultados
de no actividad por el crecimiento de las bacterias en todas las diluciones de los
extractos evaluados determinaron que se aceptan las hiptesis nulas y se rechazan las
alternativas. Se concluy que la planta Mansoa alliacea ajo sacha no presenta
actividad antibacteriana.
Palabras claves: Actividad antibacteriana, Mtodo de tubos mltiples, Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Mansoa alliacea.
ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF HYDROALCOHOLIC EXTRACT AND ETHANOLIC

LEAF Mansoa alliacea Ajo Sacha ON Escherichia coli AND Staphylococcus aureus,
IQUITOS - PERU
Bach. FLORES MEZGER, TANIA AILEEN

Bach. SANGAMA ROMANI, ROSA YESENIA
ABSTRACT
Hydroalcoholic and ethanolic Mansoa alliacea "ajo sacha" (family Bignoniaceae) against
Escherichia coli and Staphylococcus aureus: In this research the antimicrobial activity of
the extracts was determined. The species was collected in the Botanical Garden of the
Institute of Traditional Medicine (IMET-ESSALUD), District of San Juan BautistaIquitos, different concentrations of the extracts were tested in the study by macrodilution
method using Mueller Hinton results no activity for the growth of bacteria in all
dilutions of the extracts evaluated determined that the null hypothesis is accepted and
alternatives are rejected. It was concluded that Mansoa alliacea "ajo sacha" plant no
antibacterial activity.
Key words: Antibacterial activity, Method of multiple tubes, Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Mansoa alliacea.
INDICE
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTO
RESUMEN
ABSTRACT
INTRODUCCIN
OBJETIVOS
11
General
11
Especficos
11
CAPITULO I
MARCO TERICO
12
1.1. ANTECEDENTES
13
1.2. MARCO CONCEPTUAL
17
1.2.1. ESPECIE BOTANICA: Mansoa alliacea ajo sacha
17
A. Clasificacin Taxonmica de Mansoa alliacea (Ajo sacha)
17
B. Distribucin Geogrfica y Hbitat
18
C. Descripcin Botnica
18
D. Distribucin
18
E. Usos
19
F. Composicin Fitoqumica
19
1.2.2. RESISTENCIA BACTERIANA A LOS ANTIBITICOS
19
1.2.3. MTODO DE DETERMINACIN DE
20
SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA
1.2.4. MTODOS DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA
A. Mtodos de Difusin
A.1. Mtodo del Antibiograma Disco-Placa (INS - 2002)
A.1.1. Indicaciones y Limitaciones
20
20
20
21
6
A.1.2. Materiales
22
A.1.3. Procedimiento
23
A.1.3.1. Preparacin del inculo
23
A.1.3.2. Inoculacin de las placas
24
A.1.3.3. Dispensacin de los discos
24
A.1.3.4. Lectura de los resultados
25
A.1.4. Antimicrobianos seleccionados
26
A.1.5. Control de calidad
26
A.1.6. Resultados
27
A.2. Mtodo del Epsilon Test
29
29
A.2.2. Materiales
30
30
A.2.3.1. Preparacin del inoculo.
30
A.2.3.2. Inoculacin de las placas.
31
A.2.3.3. Dispensacin de las tiras.
31
A.2.3.4. Incubacin.
31
A.2.3.5. Lectura de los resultados.
31
33
A.2.5. Interpretacin de Resultados
33
B. Mtodos de Dilucin
33
B.1. Dilucin en agar
37
B.2. Dilucin en caldo
40
B.2.1. Mtodo de Macrodilucin.
40
B.2.2. Mtodo de Microdilucin.
41
B.3. Correlacin de los resultados.
44
B.4. Control de calidad.
44
B.5. Informe de Resultados
44
1.2.5. CEPAS DE REFERENCIA
45
1.2.5.1. Escherichia coli
46
1.2.5.2. Staphylococcus aureus
49
7
1.3. DEFINICIONES
50
1.4. HIPOTESIS
51
1.5. VARIABLES
51
1.5.1. Variable independiente
51
1.5.2. Variable dependiente
51
CAPITULO II
METODOLOGIA
52
2.1. TIPO DE INVESTIGACIN
52
2.2. DISEO DE INVESTIGACIN
52
2.3. POBLACIN Y MUESTRA
53
2.4. MATERIALES
53
2.5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
54
CAPITULO III
RESULTADOS
60
DISCUSIN DE RESULTADOS
63
CONCLUSIONES
65
RECOMENDACIONES
66
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
67
ANEXOS
72
INTRODUCCIN
Hay una relacin establecida, pero compleja, entre el consumo humano de agentes
antimicrobianos y la prevalencia de la resistencia a las drogas en los patgenos. Varios
factores influyen en la frecuencia variable de la resistencia en diferentes ecosistemas,
tales como: notable plasticidad gentica de los microorganismos, reservorios humanos o
ambientales donde pueden persistir o ser transmitidos genes de resistencia u organismos
resistentes, presiones selectivas por el uso aumentado e inapropiado de antibiticos, as
como cambios sociales y tecnolgicos que afectan la transmisin de los organismos. Si a
esto se suma el aumento de pacientes inmuno comprometidos y de tratamientos con
drogas inmunosupresoras, es entendible el incremento y emergencia de infecciones
bacterianas y fngicas (1).
Las infecciones es un problema de salud pblica en los pases en va de desarrollo de

Amrica Latina, donde las condiciones de vida son precarias, de manera que, dichas
enfermedades son favorecidas por muchos factores: ambientales como el clima,
deficiente saneamiento ambiental, hacinamiento y desnutricin, los cuales dependen de
las condiciones socioeconmicas y culturales de la poblacin(2).
En el perfil de salud pblica, la resistencia bacteriana es un tema de importancia; pues

dada la presencia en patgenos relacionados con enfermedades prevalentes, como son, la
enfermedad diarreica aguda (EDA), las infecciones respiratorias agudas (IRA) y las
infecciones intrahospitalarias, le dan un carcter de problema prioritario por la alta
resistencia de uso y abuso de los frmacos, por lo que es necesario la bsqueda de
nuevos principios activos con actividad antimicrobiana.
En la prctica de la medicina moderna es alarmante la resistencia de los

microorganismos a distintos antibiticos, esto crea la necesidad de encontrar nuevos
compuestos que puedan actuar de forma directa sobre la actividad microbiana,
inhibiendo los mecanismos de resistencia.
9
En las poblaciones rurales donde la accesibilidad o disponibilidad de antimicrobianos es

limitada, las personas suelen usar preparados caseros a partir de plantas medicinales. Las
plantas producen compuestos llamados metabolitos secundarios que poseen actividad
biolgica, entre las que se encuentra la actividad antimicrobiana.
El Per es un pas de extraordinaria variedad de recursos vivos y ecosistemas, que hoy
se conoce como diversidad biolgica o biodiversidad. La diversidad de recursos
genticos es un logro de los grupos humanos aborgenes, que durante un proceso de al
menos 10 000 aos han domesticado especies de la fauna y plantas nativas que han sido
seleccionados y adaptado a los pisos ecolgicos. El Per es uno de los mayores centros
mundiales de recursos genticos, con unas 182 especies de plantas domesticadas, y es
reconocido como uno de los centros de origen de la agricultura. De la flora se calculan
que existen unas 25 000 especies (10% del total mundial), de las cuales un 30% son
endmicas.
La Amazona Peruana cuenta con una riqueza cultural, referida a los conocimientos
sobre el uso etno-tradicional de plantas de uso teraputico. Promisorias especies por su
contenido de metabolitos primarios y secundarios de uso difundido en enfermedades
agudas y crnicas, como Mansoa alliacea ajo sacha, que se usa en infecciones
urinarias, respiratorias y diarreicas que aquejan a la poblacin de acuerdo a los reportes
etnobotnicos (3).
Por ello, el conocimiento de los perfiles de susceptibilidad antimicrobiana de Mansoa

alliacea permitir validar su uso y posteriormente orientar a la elaboracin de
esquemas de tratamientos dentro de su uso popular, siendo la poblacin de la Amazona
los principales beneficiarios con los resultados, los mismos que sern socializados por
los comercializadores de recursos naturales teraputicos tradicionales.
Por lo que en el presente trabajo se determin la actividad antibacteriana del extracto

hidroalcohlico y etanlico de la hoja de Mansoa alliacea
ajo sacha, sobre
Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

10
OBJETIVOS
General:
Determinar
la
actividad
antibacteriana
de
los
extractos:
hidroalcohlico y etanlico de Mansoa alliacea ajo sacha, sobre

Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
Especficos:
Obtener extracto hidroalcohlico y etanlico de Mansoa alliacea ajo
sacha
Evaluar la actividad antibacteriana de los extractos hidroalcohlico y
etanlico de la hoja de Mansoa alliacea ajo sacha frente a
Escherichia coli y determinar la concentracin mnima inhibitoria.
Evaluar la actividad antibacteriana de los extractos hidroalcohlico y
etanlico de la hoja de Mansoa alliacea ajo sacha frente a
Staphylococcus aureus y determinar la concentracin mnima
inhibitoria.
11
CAPITULO I
MARCO TERICO
La regin amaznica posee una gran biodiversidad y alberga varias especies de plantas
y muchas de ellas son utilizadas por la poblacin amaznica como plantas medicinales.
Las enfermedades ocasionadas por diversos agentes patgenos e inadecuados estilos de

vida del hombre moderno, est creando la necesidad de buscar nuevas alternativas de
tratamiento con una tendencia de volver a las costumbres ancestrales del uso de plantas,
para la cura de sus enfermedades, debido a las mltiples ventajas que aporta al aspecto
medicinal.
Al respecto, la Organizacin Mundial de la Salud estima que ms de la mitad de los
4000 millones de habitantes de la tierra, confa en la medicina tradicional para resolver
sus principales necesidades de salud y se puede decir que gran parte de las terapias
tradicionales entraan el uso de extractos de plantas o de sus metabolitos secundarios
que ayudar a determinar la utilidad en la industria farmacutica en beneficio de la
salud. (4)
Adems, la aparicin de cepas resistentes a los frmacos tradicionales ha dado origen a

una corriente competitiva por la fabricacin de nuevos fitofrmacos que sean eficaces en
el tratamiento de numerosas enfermedades que aquejan a la poblacin mundial.
Debido a la necesidad de conocer las propiedades medicinales de las plantas y existiendo
poca informacin sobre los efectos antimicrobianos que tiene Mansoa alliacea ajo
sacha sobre los microorganismos como: Escherichia coli y Staphylococcus aureus que
son causantes de enfermedades infecciosas, en diferentes rganos y sistemas en nuestro
cuerpo, se considera importante la realizacin de este estudio de investigacin, por lo
que se estudiar el mtodo de macrodilucin
para el beneficio de la poblacin y la
comunidad cientfica.
12
1.1. ANTECEDENTES
Olivera M .et al. (2013), evaluaron las propiedades fisicoqumicas y bioactivas in vitro
del aceite esencial de Mansoa alliacea (Lam.) A. Gentry, componente al cual se le
atribuye propiedades antioxidantes y bacterianas; el rendimiento del aceite esencial fue
de 0,64 % en 100 gramos de hojas frescas obtenido por hidrodestilacin, de densidad
relativa de 0,85g/m, acidez expresado en cido oleico es 9,71%; en la caracterizacin
qumica mediante cromatografa de gases, identificaron compuestos sulfurados siendo el
compuesto mayoritario aliltrisulfito con 67,94%. El aceite esencial present actividad
antibacteriana, frente a Staphylococcus aureus ATCC 6535 y Bacillus subtilis ATCC
6638 en las concentraciones de 10 y 20mg/mL respectivamente. (5)
Rev. La Insignia (2004), indica a nivel popular, que basta muchas veces con extraer los
principios activos de la manera ms sencilla, como puede ser por medio de una infusin
o decoccin. En cambio para analizar propiedades medicinales de una droga vegetal, en
muchos casos debe recurrirse a mtodos de extraccin ms complejos que permitan
obtener mtodos reproducibles, con cuantificacin de principios en lo posible. (6)
ESSALUD (2004), identifico en Mansoa alliacea ajo sacha; allina, allicina,
estigmasterol, alcaloides, saponinas, flavones, pigmentos flavnicos, alil-disulfxido,
sulfuro de di-metilo, sulfuro de di-vinilo, disulfuro propylalilo, 2-metoxilo-alfalapachona y la hydroxy-alfa-lapachona. Adems triterpenos esteroides, cumarinas,
fenoles, saponinas y taninos. (7)
Atayala (2004), al evaluar el efecto de los extractos de ajo sacha (Mansoa alliacea),
vaca chucho (Solanum mammosum) y salvea (Cornutia odorata) al 0.3 % en el control
preventivo del hongo Colletotrichum sp. Inductor de la Antracnosis del tumbo
(Pasiflora cuadrangularis) el extracto de Ajo sacha result ser el ms efectivo (82.97),
resultando inclusive similar al fungicida dithiocarbamato (89.76) (8).
13
Villacres (2003), al evaluar el efecto de los extractos de ajo sacha y vaca chucho en el
control de Colletotrichum phomoides, inductor de la Antracnosis de los frutos del
tomate, encontr que el tratamiento de ajo sacha al 0.3 % manifest una mejor eficacia
de control (69.8) y un mayor rendimiento (17.95 tn/ha) en comparacin al testigo, como
consecuencia del posible accionar de sus compuestos principalmente azufrados como la
allina y la allicina sobre las estructuras propagativas del patgeno. (9)
OMS (2002), refiri que la medicina tradicional suele utilizarse para tratar o prevenir
dolencias y enfermedades crnicas y para mejorar la calidad de vida. Algunos datos
auguran resultados prometedores, mientras que los estudios realizados en todo el mundo
han demostrado que en muchos pases, y con altos porcentajes, las poblaciones hacen
uso de esta medicina tradicional, como tratamiento de primera lnea, usndola sola o
combinada con otras medicinas, para diversos sntomas o afecciones. Aun cuando la
mayor parte de la poblacin emplee las diferentes plantas de manera artesanal, por no
considerar de esta forma de consumo una cuestin mayor: la toxicidad inherente, es
importante conocer cientficamente los riesgos y beneficios que estn implcitos. (10)
Rosales (2002), indica que a la luz de los modernos avances en botnica, fitoqumica,
farmacologa, farmacocintica y toxicologa, el conocimiento tradicional y popular sobre
las propiedades medicinales de las plantas debe ser constatado y validado para garantizar
una terapia adecuada, eficaz y con menor incidencia de ocasionar riesgos para el
paciente. (11)
Mostacero et al. (2002), indican que Mansoa alliacea (Lam) A. Gentry, llamado ajo
sacha, Boens, Niaboens, es una especie arbustiva frecuente en zonas no inundadas,
bosques primarios y tambin es cultivada. Las hojas y cortezas tienen marcado olor a
ajo. (12)
Mont (2002), hace referencia que el ajo Allium sativum tiene accin contra
fitopatgenos, debindose la accin al antibitico Allicina; siendo el precursor de dicho
antibitico el aminocido Allina que es convertida por enzimas a Allicina, que es la
14
sustancia plaguicida primaria. Tambin informa que el extracto acuoso de polvo de

bulbos de ajo, tiene la capacidad de inhibir a fitopatgenos como Erwinia, Botritis,
Gloeosporium, Colletotrichum, Puccinia y otros, los cuales han sido probados en frijol,
pepinillo, rabanito, espinaca, almendras, cerezas, y albaricoques en pruebas de
invernadero. Asimismo una solucin acuosa de polvo de ajo al 10 20 % control el
mildi de pepinillo (Pseudoperonos poracubensis), la sarna del pepinillo (Cladosporium
cucumerinum), antracnosis del frijol (Colletotrichum lindemutianum), alternariosis en
girasol (Alternaria alternata), oidiosis en cucurbitceas (Eryasiphecichora cearum) y
manchas en tomate y algodn (Fusarium sp. y Macrophomina phaseolina). (13)
Villacres (2001), registr como informacin etnobotnica a las especies Ajo sacha
(Mansoa alliacea), Sacha culantro (Eryngium foetidum), Vaca chucho (Solanum
mammonsum), Salvea (Cornutiao dorata), Pampa organo (Lippia alba), Albaquilla
(Hyptisre curvata), Papaya (Carica papaya), Albaca (Ocinum basilicum), Anona (Anona
squamosa) como especies antifngica. (14)
Staufferet al. (2000), reportaron que extractos de 98 especies vegetales pertenecientes a

46 familias botnicas monocotiledneas; 46 dicotiledneas; 1 confera; y 2 pteridfitas
fueron probadas para determinar su posible efecto fungicida y/o bactericida con la
factibilidad de ser utilizados en el control de enfermedades en vegetales. Los extractos
han sido obtenidos mediante la coccin durante 20 minutos de 150 gramos de tejido
vegetal fresco, o 50 gramos de material seco en 400 ml de agua, y probados contra 9
especies de hongos y una bacteria por el mtodo del disco de papel impregnado con el
extracto y colocado en Cajas de Petri sembradas con hongos o bacterias sobre medio de
cultivo Papa Dextrosa Agar
(15)
. Este mismo autor indica que las evaluaciones fueron
realizadas a partir de las 48 horas, determinando la zona de inhibicin en mm. De los 98

extractos vegetales probados, 9 de ellos demostraron inhibicin de crecimiento de la
bacteria Xanthomonas campestri sp y campestris. Ellos son: Ajo, Cebolla, Quebracho
Colorado, Agrial, Palo Santo, Chirca, Guayaba, Eucalipto y Pino. Inhibicin del
crecimiento fungoso, slo se ha obtenido con el Ajo y la Cebolla (utilizados como
referencia), as como con el extracto de Mamn contra Colletotrichum sp. (15)
15
Ramos (2000), trabaj con Cercospora longissimma Sacc de la lechuga y con extractos
de Ajo Sacha, demostr la efectividad de varias concentraciones de extractos de
Mansoa alliacea Ajo Sacha en el cual comprob su eficacia en el control de la
cercosporiosis, as mismo verific que los mejores resultados los obtuvo utilizando una
frecuencia de aplicacin de 6 das. (16)
Meja (2000), indic que la Medicina Tradicional, es una de las expresiones ms

importantes de la memoria ancestral de los pueblos amaznicos, hacen uso, entre otras
prcticas de un gran nmero de especies vegetales para curar sus enfermedades y
sntomas; y el conocimiento de las propiedades medicinales de las plantas est basado en
la observacin, la experiencia y el conocimiento profundo del entorno. (17)
IPSS (1995), registr que la hojas del Ajo Sacha presenta: alildisulfxido, alcaloides,
allina, allicina, disulfuro propylalilo, estigmasterol, flavonas, pigmentos flavnicos,
saponinas,
sulfuro
de
dialil,
sulfuro
de
dimetilo,
sulfuro
de
divinilo,
Naftaquinonascitotxicas: la 9-metoxi- a lapachona y la 4 hyddroxy 9 metoxy a

lapachona. (18 y 19)
Brack (1999), mencion que Mansoa alliacea Ajo Sacha es una alternativa a ser
aprovechada en la investigacin biomdica, siendo popularmente reconocida por poseer
muchas aplicaciones medicinales, entre ellas analgsicas, antipirtica, antiespasmdica y
antiinflamatoria. (20)
Hoss (1999), mencion que la allicina es una sustancia de bajo peso molecular con 2
tomos de azufre dentro de la cadena aliftica, extrada del ajo y de la cebolla, su efecto
inhibidor ha sido comprobado en una serie de enzimas que contienen el grupo funcional
SH, a concentraciones de 5 x 10-4M, se ha usado contra Phytophthora infestans, pero
el fuerte olor inhibe la difusin amplia de productos con este principio activo. (21)
Ahmed et al. (1985), registran ms de 2000 especies botnicas con actividad biolgica
con organismos nocivos, entre ellas 1053 con efecto insecticida, 100 con actividad
16
antifngica y solo cuatro antibiticos. Asimismo cita algunos ejemplos de compuestos

investigados: La allicina, pterocarpanes, vaticaffinol y canaliculatol. Tambin otras
sustancias pertenecientes a las cumarinas, alcaloides, triterpenos, flavonoides y
quinonas. (22)
1.2. MARCO CONCEPTUAL

1.2.1. ESPECIE BOTANICA: Mansoa alliacea ajo sacha
A. Clasificacin Taxonmica de Mansoa alliacea (ajo sacha)

La planta fue identificada por comparacin con patrones que obran en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de la Amazona Peruana y corresponde a la
taxonoma siguiente:
Reino
: Plantae
Sub Reino
: Tracheobionta
Divisin
: Magnoliophyta
Clase
: Magnoliopsida
Orden
: Lamiales
Familia
: Bignoniaceae
Tribu
: Bignonieae
Gnero
: Mansoa
Especie
: M.alliacea
Nombre Cientfico: Mansoa alliacea

Nombre Comn : Ajo Sacha
17
B. Distribucin Geogrfica y Hbitat

Se encuentra en Sudamrica tropical, donde puede ser encontrado creciendo silvestre
en las pluviselvas tropicales de Brasil, Ecuador, Per, las Guayanas, as como en
Costa Rica. Es especialmente abundante en los bosques al lado del Amazonas, en
Ucayali y en el Amazonas peruano.
Clima: Zonas tropicales con precipitacin pluvial de 1 800 a 3 500 mm/ao,

temperaturas entre 20 a 26C. Suelo: Arenoso o arcilloso con abundante materia
orgnica. Biotopo de poblaciones naturales: Habita en faldas de altura, alejada de
cuerpos de agua, chacras nuevas, reas sombreadas o poco sombreadas tanto de
purmas como de bosque primario. No es resistente a la inundacin. Comparte su
hbitat con las siguientes especies: aguaje, algodn, bijao, caa agria, carahuasca,
castaa, cedro, cetico, cordoncillo, charichuelo, chiricsanango, chuchuhuasi,
espintana, huacap, huamansamana, huito, limn, patiquina, pijuayo, poma rosa,
pona, sangre de grado, sapohuasca, shapaja, ubos, umar, ua de gato, uvilla, yarina,
zapote.
C. Descripcin Botnica
Es una planta trepadora tropical de hoja perenne de que es originaria de la pluviselva
del Amazonas. Puede ser descrito como un arbusto o una liana dado que produce
numerosas vides leosas desde la raz que alcanza un tamao de slo 2-3 m altura.
El gnero Mansoa, consta de 6 especies para el Per y a nivel de Amrica Tropical 15
especies.
Las especies del gnero Mansoa segn Gentry (1993), presentan como caractersticas
olor a ajos, usualmente con glndulas en el peciolo y zarcillos trfidos o simples.
D. Distribucin
La Mansoa alliacea se encuentra en el Per desde 0-500 m.s.n.m. y est distribuida
en los departamentos de Amazonas, Hunuco, Loreto y San Martn es de hbito
lianescente y con olor a ajos en todas sus partes.
18
E. Usos
La Mansoa alliacea conocida vulgarmente como ajo sacha dentro de la medicina
tradicional se le atribuye propiedad analgsica, antirreumtica, antiartrtica,
antipirtica, antitusgena; habindose observado su actividad antimalrica en personas
con reinfecciones frecuentes.
F.
Composicin Fitoqumica
Los estudios fitoqumicos del ajo sacha reportan presencia de alildisulfxido,

alcaloides, allina, allicina, disulfuropropilalilo, estigmasterol, flavonas, sulfuro de
dialil, sulfuro de dimetilo, sulfuro de divinilo y dos naftaquinonascitotxicas: 9matoxy&-lapachona y 4-hidroxy-9-metoxi.&-lapachona. (23)
1.2.2. RESISTENCIA BACTERIANA A LOS ANTIBITICOS

Con la deteccin cada vez de ms casos de resistencia bacteriana a los antibiticos, en
teraputica humana y animal debido al uso indiscriminado de antibiticos, muchos
pases y especialmente los integrantes de la Unin Europea, han ido normando el uso de
los antibiticos, los mismos que se deben dispensar bajo receta mdica, a fin de evitar su
mal uso.
Las bacterias de la microbiota endgena de los animales de consumo pueden colonizar y

transferir genes de resistencia a la microbiota endgena humana, incrementando con una
carga adicional al reservorio de resistencia ya presente en el hombre. A raz de estos
problemas de transferencia de resistencia de antibiticos se han ido planteando diversas
alternativas a los ya clsicos promotores de crecimiento de naturaleza antibitica,
resurgiendo algunos como los cidos orgnicos que venan siendo utilizados como
antifngicos, como es el caso del cido propinico. Otra alternativa es el empleo de
aditivos naturales, pero en general, se utilizan en menor escala que los cidos orgnicos.
(23)
19
1.2.3. MTODO DE DETERMINACIN DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA

El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos es una de las
funciones ms importantes de los laboratorios de microbiologa. Su realizacin se
desarrolla mediante las pruebas de sensibilidad o antibiograma, cuyo principal objetivo
es evaluar en el laboratorio la respuesta de un microorganismo a uno o varios
antimicrobianos, traduciendo, en una primera aproximacin, su resultado como factor
predictivo de la eficacia.
La farmacologa del antimicrobiano, en particular en el lugar de la infeccin, y los

aspectos clnicos del paciente y de su infeccin, sustentan la eleccin de los
antimicrobianos en el tratamiento de las enfermedades infecciosas. Asimismo, ofrece, en
su conjunto, elementos objetivos de actuacin en los tratamientos empricos.
El panorama actual de las resistencias de los microorganismos a los antimicrobianos

hace ineludible su determinacin, incluso en aquellos casos en los que la sensibilidad se
considera universal y no se han descrito, por el momento, mecanismos de resistencia.
Los ensayos de sensibilidad han de estar convenientemente normalizados y sujetos a

procesos de control que aseguren su reproducibilidad. Por el momento no existe un
mtodo universal que reproduzca las condiciones en las que se encuentra un
microorganismo produciendo una infeccin y, por tanto, la situacin ideal en las que
deben desarrollarse las pruebas de sensibilidad.
1.2.4. MTODOS DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA

A. Mtodos de Difusin
A.1. Mtodo del Antibiograma Disco-Placa (INS - 2002)
El antibiograma disco-placa basado en el trabajo de Bauer, Kirby et at., es uno de los
mtodos que el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)
recomienda para la determinacin de la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos.
20
El antibiograma disco-placa consiste en depositar, en la superficie de agar de una

placa de petri previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel secante
impregnados con los diferentes antibiticos. Tan pronto el disco impregnado de
antibitico se pone en contacto con la superficie hmeda del agar, el filtro absorbe
agua y el antibitico difunde al agar. El antibitico difunde radialmente a travs del
espesor del agar a partir del disco formndose un gradiente de concentracin.
Transcurridas 18-24 horas de incubacin los discos aparecen rodeados por una zona
de inhibicin. La concentracin de antibitico en la interfase entre bacterias en
crecimiento y bacterias inhibidas se conoce como concentracin crtica y se aproxima
a la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) obtenida por mtodos de dilucin. Sin
embargo, los mtodos disco-placa no permiten una lectura directa del valor de la
CMI. Para cuantificarla, basta con haber contrastado previamente el sistema discoplaca con un gran nmero de cepas de CMI conocidas que han estado previamente
determinadas por otros mtodos de determinacin de la sensibilidad a los
antimicrobianos (Ej. Mtodo de Dilucin). Esta determinacin se realiza con cientos
de bacterias para minimizar errores. Se mide el dimetro de la 5ta zona de inhibicin
obtenida por cada una de tales cepas y se grafica dicha medida frente a la CMI,
obtenindose la lnea de regresin o "recta de concordancia" que proporciona la
correspondencia entre las CMI y los dimetros de inhibicin. Para determinar la CMI
de una cepa se procede a medir el dimetro de la zona de inhibicin y luego
extrapolarlo en el grfico para obtener la CMI. Existen, por tanto, unos dimetros de
inhibicin, expresados en mm, estandarizados para cada antimicrobiano. La lectura
de los halos de inhibicin debe interpretarse como sensible (S), intermedia (I) o
resistente (R) segn las categoras establecidas por el NCCLS (Tablas 1-4).
El antibiograma est indicado cuando se asla una bacteria responsable de un
proceso infeccioso y no puede predecirse su sensibilidad, especialmente si se sabe
que este tipo de bacteria puede presentar resistencia a los antimicrobianos ms
habituales.
21
Estas pruebas de sensibilidad tambin son tiles en estudios epidemiolgicos ya

que el resultado del antibiograma puede ser considerado como el primer marcador
epidemiolgico de que se dispone. El mtodo de disco-placa es fcil de realizar,
rpido y barato. Es una metodologa aplicable a una amplia variedad de bacterias,
fundamentalmente bacterias aerobias no exigentes de crecimiento rpido como
Enterobacteriaceae,
Burkholderia
Pseudomonas
cepacia,
spp.,
Acinetobacter
Stenotrophomonas
spp.,
Staphylococcus
maltophilia,
spp.
Enterococcusspp. Adems, con ligeras modificaciones, puede ser aplicado a

Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae y
Streptococcus spp.
A.1.2. Materiales
Tubos de ensayo con suero fisiolgico (0,85 g de NaCl en 100 ml de agua
destilada estril).
Escobillones estriles.
Medio de cultivo. Generalmente se utiliza agar Mueller-Hinton, regulado en su
concentracin de iones divalentes, aunque existen excepciones que se describen
ms adelante. El medio Mueller Hinton posee una concentracin baja de iones
divalentes y debe ser suplementado para obtener concentraciones fisiolgicas
(20 a 35 g/litro de Mg2+ y 50 a 100 g/litro Ca2+). Este medio es el
recomendado por la NCCLS porque en l crecen bien la mayor parte de las
bacterias patgenas, hay muy pocas diferencias entre los distintos lotes
comercializados, lo que ayuda a una estandarizacin entre laboratorios, y
adems no contiene timina o timidina, que son inhibidores de sulfamidas y del
trimetoprim.
El pH del medio debe ajustarse entre 7,2-7,4, debe almacenarse a 2-8C y

utilizarse dentro de los 7 das siguientes a su preparacin. El medio debe dejarse a
temperatura ambiente unas dos horas antes de utilizarlo. Si existe agua en la
superficie del agar, las placas pueden colocarse en la incubadora a 35C durante
unos 30 minutos con la tapa ligeramente entreabierta.
22
Discos de antibiticos. Se deben guardar a 4C y dejarlos a temperatura ambiente

una hora antes de utilizarlos. Los discos se congelarn si son antimicrobianos betalactmicos y ha de transcurrir ms de una semana hasta su utilizacin. Por regla
general, se recomienda reemplazar los discos de beta-lactmicos que estn
refrigerados con aquellos que se encuentran congelados. El deterioro de los discos
ocurre si son sometidos a humedad o a frecuentes fluctuaciones de temperatura. En
el caso de utilizar dispensador, ste debe tener una tapa muy ajustada y un
desecante, que ser substituido cuando por exceso de humedad cambie de color el
indicador.
El dispensador debe mantenerse refrigerado cuando no se vaya a utilizar.

Para la determinacin del antibiograma disco-placa en estafilococos, enterococos,
enterobacterias y bacilos Gram-negativos no fermentadores utilizamos el siguiente
procedimiento:
A.1.3.1. Preparacin del inculo
Mtodo del medio de cultivo lquido: Coger de 3 a 5 colonias iguales de la
placa de cultivo de 18 a 24 horas y sembrarlas en 5 ml de un medio lquido
(Brain-Heart, Todd Hewitt, Tripticasa soja, etc.) e incubar en la estufa a 35C
durante 2 a 6 horas hasta conseguir o superar una turbidez del 0.5 de la escala
de McFarland. Si la turbidez es superior se realiza el ajuste necesario con suero
salino estril.
Mtodo de suspensin directa de colonias: A partir de una placa de cultivo de

18 a 24 horas coger varias colonias con un asa y ajustar el inculo a una
turbidez equivalente al 0.5 de la escala de McFarland 0.5 en suero fisiolgico.
Agitar en un agitador "vortex" durante 15-20 segundos.
23
Se recomienda utilizar el primer mtodo si el cultivo tiene ms de 24 horas de

incubacin. El segundo mtodo es el ms adecuado para microorganismos de
crecimiento difcil en medios lquidos (Haemophilus spp., Neisseira
gonorrhoeae, Staphylococcus pneumoniae, estrepococos no enterococos,
Listeria, Moraxella y Corynebacterium spp.) y para estafilococos en los que se
quiera detectar la resistencia a oxacilina.
A.1.3.2. Inoculacin de las placas
Antes de que transcurran 15 minutos de haber ajustado el inculo, introducir un
escobilln dentro de la suspensin y al retirarlo rotar varias veces contra la
pared del tubo por encima del nivel del lquido con la finalidad de eliminar el
exceso de inculo.
Inocular las placas de Mueller-Hinton completamente, sin dejar ninguna zona

libre. Esto se consigue deslizando el escobilln por la superficie del agar tres
veces, rotando la placa unos 60 cada vez y pasndola por ltimo por la
periferia del agar para conseguir una siembra uniforme. Dejar secar de 3 a 5
minutos antes de depositar los discos.
A.1.3.3. Dispensacin de los discos

Colocar los discos con los dispensadores o manualmente con pinzas estriles.
Debe asegurase que contacten perfectamente con la superficie del agar, por lo
que deben presionarse ligeramente sobre la superficie del agar. No deben
situarse a menos de 15 mm del borde de la placa, y han de estar distribuidos de
forma que no se produzca superposicin de los halos de inhibicin. Para placas
de 150 mm no se emplearn ms de 12 discos y para las de 100 mm no ms de
6.
Incubar las placas invertidas (agar en la parte superior), en grupos no superiores
a 5 placas, a 35C en atmsfera aerbica antes de que transcurran 15 minutos.
Las placas se incubarn 16-18 horas (con estafilococos sensibles a meticilina
24
debe prolongarse la incubacin hasta 24 horas para confirmar la ausencia de

resistencia a la meticilina).
A.1.3.4. Lectura de los resultados

Despus de 18 horas de incubacin, leer el dimetro de las zonas de completa
inhibicin con un pie de rey o regla. Si el microorganismo es un estafilococo o
un enterococo debemos esperar 24 horas para asegurar la sensibilidad a la
oxacilina y vancomicina. Las zonas de los medios transparentes se miden sobre
el reverso de la placa y los medios que contienen sangre sobre la superficie del
agar. En las pruebas de sensibilidad a meticilina en estafilococos el halo
alrededor de la oxacilina debe observarse utilizando luz transmitida para
visualizar las colonias diminutas.
Cuando aparecen colonias dentro del halo de inhibicin, puede tratarse de

mutantes resistentes, contaminaciones, poblaciones heterogneas o cultivos
mixtos y conviene volver a identificarlas y realizar otra vez el ensayo de
sensibilidad antimicrobiana.
Como regla general, no debe considerarse aquellas colonias diminutas que

aparecen en el halo de inhibicin y que han sido visualizadas mediante luz
transmitida o con ayuda de una lupa, a excepcin de estafilococos resistentes a
oxacilina o enterococos resistentes a vancomicina. La interpretacin de los
resultados puede realizarse en funcin de las normas del NCCLS (Ver Tablas 15).
25
A.1.4. Antimicrobianos seleccionados

Es evidente la imposibilidad de ensayar un gran nmero de antimicrobianos frente
a un microorganismo determinado. La seleccin final de qu antibiticos deben ser
estudiados depender del Laboratorio de Microbiologa en sintona con las
decisiones del Comit de Infecciones de cada hospital. En las Tablas 1 a 5 se
muestran los antimicrobianos recomendados por la NCCLS, agrupados en cuatro
grupos segn el trabajo de Washington. En el grupo A se encuentran aquellos
antimicrobianos que se han de ensayar y que deben ser informados de forma
rutinaria. El grupo B est constituido por antimicrobianos que pueden ser
valorados de forma rutinaria, pero cuya informacin se efectuar de forma
selectiva; es decir, solamente se informarn si los del grupo A no son activos, no
son apropiados para un lugar determinado de la infeccin, o si se constata un fallo
teraputico con el grupo A. En el grupo C estn incluidos los antibiticos que
sern estudiados cuando aparezcan problemas especficos de resistencia, por
ejemplo, brotes epidmicos, en pacientes con alergia a otros antibiticos o en
infecciones inusuales. Finalmente, el grupo D, se destina a antimicrobianos
utilizados en infecciones del tracto urinario. El NCCLS y grupo MENSURA
(Mesa Espaola de Normalizacin de la Sensibilidad y Resistencia a los
Antimicrobianos) tambin establecen recomendaciones segn el tipo de
microorganismo e infeccin.

Es necesario emplear cepas control para supervisar la exactitud y fiabilidad de la
metodologa, debido tambin al gran nmero de variables que pueden afectar los
resultados y que se han descrito anteriormente. Las cepas que se utilizan para el
control de calidad son las mencionadas en las Tablas 1-4. El NCCLS ha
establecido unos lmites en los dimetros de las zonas de inhibicin que son
aceptables para las cepas utilizadas en el control de calidad. Los problemas que
podamos encontrar en la determinacin del halo de inhibicin de las cepas de
control de calidad y su resolucin se detallan en la Tabla 5.
26
Las cepas de control se mantienen en el congelador a 70C en alguno de los

medios descritos para la conservacin de cepas, con el fin de preservar su
viabilidad y minimizar posibles modificaciones. Para resembrarlas debe utilizarse
un escobilln o asa con el que se rascar la superficie del material congelado (no
hace falta descongelar) y sembrar en una placa de agar sangre. Incubar a 35C, de
18 a 20 horas, realizar una nueva siembra que ya podr emplearse para el ensayo.
Debe realizarse controles cada nuevo lote de medio de cultivo y cada nuevo lote de
antibiticos. La cepa ATCC 29212 sirve para detectar que el Mueller-Hinton
contiene los niveles correctos de inhibidores al ensayar el trimetoprim y/o
sulfametoxazol.
Control del inculo: Se utiliza un McFarland 0.5. Para prepararlo se emplea 0.5 ml
de 0.048 M de BaCl2 (1,175% BaCl2+2H2O) en 99,5 ml de 0.18 M H2SO4 (1%
v/v) con agitacin constante.
La absorcin a 625 nm ha de estar entre 0.08 y 0.10 (comprobar cada mes).

Alcuotas de 4 a 6 ml se distribuyen en tubos con tapn de rosca y se guardan en la
oscuridad a temperatura ambiente.
A.1.6. Resultados
Interpretacin: Comparando los dimetros del halo de inhibicin con las
Concentraciones
Mnimas
Inhibitorias
(CMIs),
estableciendo
las
correspondientes rectas de regresin, se han fijado unos criterios para clasificar las
cepas estudiadas. De esta forma se han fijado tres categoras: sensible (S),
intermedia (I) y resistentes (R). Anteriormente se aada la categora
moderadamente sensible (MS) que tiende a eliminarse y los resultados
correspondientes a la misma se han situado en la categora de intermedia.
Las interpretaciones seguirn las normas establecidas por el NCCLS (Tabla 1 a 5)
pero, por regla general, un dimetro de inhibicin de 30 a 35mm es indicativo de
una cepa altamente sensible, mientras que dimetros de zona de inhibicin
inferiores a 15 mm son los que presentan las cepas resistentes.
27
El trmino sensible indica que la infeccin ocasionada por la cepa para la que se
ha determinado la CMI o su correspondiente halo de inhibicin puede tratarse de
forma adecuada empleando las dosis habituales de antimicrobiano, en funcin del
tipo de infeccin y de la especie considerada.
El trmino intermedio indica que el halo de inhibicin traducido en valores de

CMI se aproxima a las concentraciones de antimicrobiano alcanzables en sangre o
tejidos y que puede esperarse eficacia clnica en aquellas localizaciones en las que
se alcanzan altas concentraciones de antimicrobiano (Ej. orina) o cuando se
emplean dosis ms elevadas de lo habitual. El NCCLS tambin incluye en esta
categora aquellos casos de antimicrobianos con mrgenes de toxicidad estrechos
en los que pequeos errores tcnicos podran suponer cambios de interpretacin en
la categora clnica.
El trmino resistente se refiere a aquellos microorganismos que no se inhiben por

las
concentraciones
habitualmente
alcanzadas
en
sangre/tejidos
del
correspondiente antimicrobiano, o aquellos microorganismos en los que existen

mecanismos de resistencias especficos para el agente estudiado en los que no ha
habido una adecuada respuesta clnica cuando se ha usado como tratamiento el
correspondiente antimicrobiano.
Reproducibilidad: el medio Mueller-Hinton, regulado en su concentracin de

iones divalentes, presenta una buena reproducibilidad entre fabricantes. La
reproducibilidad est condicionada a la correcta estandarizacin de la metodologa
y a la utilizacin de controles de calidad.
Comunicacin: Como se ha mencionado anteriormente los resultados se

expresarn como sensible, intermedio o resistente. Como reglas importantes se
debe considerar las cepas de estafilococos resistentes a oxacilina como resistentes
a todos los beta-lactmicos, incluyendo la combinacin beta-lactmico ms
28
inhibidor de betalactamasas, todas las cefalosporinas, penicilinas y los

carbapenems.
A.2. Mtodo del Epsilon Test

Es una expansin de la tcnica de difusin en disco. En el mtodo E-test (AB
Biodisk, Suecia) podemos, mediante lectura directa, determinar la concentracin
inhibitoria mnima (CMI).
Consiste en una tira de plstico no poroso de 6 cm de largo por 5 mm de ancho que

incorpora un gradiente predefinido de antimicrobiano equivalente a 15 diluciones. El
protocolo para preparar el inculo es el mismo que para la difusin en disco.
Siguiendo el mtodo de difusin, una vez inoculado la placa de agar con el
microorganismo, se coloca la tira de Epsilon test sobre su superficie, producindose
de forma inmediata una difusin del antibitico desde el soporte hasta el agar,
crendose de este modo a lo largo de la tira un gradiente exponencial de las
concentraciones del antimicrobiano. Tras la incubacin de las placas, se puede
observar una zona de inhibicin elipsoidal y simtrica.
Despus de la incubacin la CMI ser el valor obtenido en el punto en el que el

extremo de inhibicin intersecciona con la tira.
En contra de lo que ocurre en la difusin en disco donde la orientacin del disco no

importa, si colocamos la tira al revs no se observa elipse de inhibicin ya que el
gradiente de concentraciones se sita solo sobre una de las caras de la tira. El
Epsilon test se ha utilizado para determinar la CMI de diversos antibiticos en una
amplia gama de bacterias, incluyendo Helicobacter pylori, Corynebacterium spp.,
estreptococos nutricionalmente deficientes, enterococos con resistencia elevada a
aminoglicsidos.
29
En algunos casos el antibitico de vancomicina en el microorganismo

Staphylococcus pneumoniae, la CMI es ms alta utilizando el Epsilon test que la
obtenida por los mtodos de microdilucin, produciendo resultados que se
encuentran en el rango superior de aislamientos susceptibles y con resultados de
control de calidad por encima de los lmites aceptables.
El Epsilon test se considera como un mtodo alternativo para el estudio cuantitativo

de la sensibilidad antimicrobiana del que cabe destacar su sencillez y buena
correlacin con la tcnica estndar de dilucin en agar para el estudio de la CMI.
A.2.2. Materiales
Tubos de ensayo con suero fisiolgico (0.85 g de NaCl en 100 ml de agua
destilada estril).
Escobillones estriles.
Medio de cultivo. Generalmente se utiliza agar Mueller-Hinton o el apropiado
para la especie bacteriana que se desee ensayar. Los factores del medio de
cultivo que pueden condicionar la CMI son los mismos que se describieron
para la tcnica del antibiograma disco-placa.
Tiras de Epsilon test. Deben almacenarse a -20C. Es importante tener en
cuenta la fecha de caducidad. En todo momento las tiras de E-test deben estar
protegidas de la humedad. Antes de utilizar se deben atemperar a temperatura
ambiente durante por lo menos 30 minutos.
A.2.3.1. Preparacin del inoculo.

Utilizar la misma metodologa descrita en el apartado 4.1 de la tcnica discoplaca.
30
A.2.3.2. Inoculacin de las placas.

Utilizar tambin la misma metodologa descrita en la tcnica disco-placa. Dejar
absorber el inculo de 10 a 15 minutos para asegurarse que la superficie del agar
est completamente seca antes de aplicar las tiras. Este punto es crtico para
optimizar la realizacin del Epsilon test.
A.2.3.3. Dispensacin de las tiras.

Tanto si se utiliza el aplicador de las tiras como las pinzas, debemos asegurar que
la escala de CMI est orientada hacia arriba y que la concentracin mxima est
cercana al extremo de la placa de petri. Asegurarse que la tira contacta
completamente con la superficie del agar. Si es necesario, eliminar las gotas de
aire que puedan encontrarse por debajo de la tira presionndola ligeramente con
las pinzas.
Es importante no mover las tiras una vez que han sido colocadas en la superficie
del agar ya que el antibitico empieza a difundir rpidamente. Cuando se utiliza
una placa de petri de 100 mm depositar solo una tira por placa y poner la tira en
el centro de la placa, mientras que cuando se utiliza una placa de 150 mm no se
deben colocar ms de 6 tiras y siempre en la disposicin que muestra la Figura 1.
A.2.3.4. Incubacin.
Por regla general las placas son incubadas inmediatamente aunque pueden
permanecer varias horas sin incubacin sin que ello afecte significativamente en
la determinacin de la CMI. Sin embargo, los organismos exigentes deben ser
incubados inmediatamente. La temperatura de incubacin y la atmsfera
utilizadas deben ser ptimas para el crecimiento de la especie bacteriana.
A.2.3.5. Lectura de los resultados.

Despus del perodo de incubacin, leer la CMI en el punto de interseccin entre
el extremo de inhibicin de la elipse 10 y la tira de E-test. Cuando el crecimiento
tiene lugar a lo largo de toda la tira y no se observa formacin de la elipse de
31
inhibicin, la CMI se informar como superior al valor mximo de la escala de

lectura y, por el contrario, cuando la elipse de inhibicin se encuentre por debajo
de la tira debe ser informado como inferior al valor mnimo de la escala de
lectura.
Con ciertas combinaciones de bacterias-antibiticos, el extremo de la elipse de

inhibicin puede ser difuso.
Debemos mencionar una serie de consideraciones sobre la lectura de los
resultados, a saber:
Cuando la CMI coincide entre dos marcas de la tira se informar el
resultado correspondiente al valor superior.
Si se observan intersecciones diferentes del crecimiento bacteriano en
ambas partes de la tira, debemos informar el valor de CMI ms alto si la
diferencia entre los dos valores no es superior a la mitad de un paso de
dilucin doble.
Por ejemplo, si la CMI en un lado de la tira es 8 y en el otro es 12,
deberemos informar 12. Sin embargo, si en un lado es 8 y en otro lado 16
debemos repetir la determinacin.
Para Stenotrophomonas maltophilia, Enterococcus spp., pueden aparecer
colonias pequeas en la zona de inhibicin, por lo que se debe considerar
como resistente.
Cuando se lea la interseccin de la elipse con las tiras de sulfamidas,
trimetoprim o cotrimoxazol, deberemos leer la interseccin en la zona de
crecimiento denso y no considerar la existencia de crecimiento en la zona
poco densa.
Si se observan colonias grandes en la zona de inhibicin puede
representar un cultivo mixto o variantes resistentes. Debemos repetir el
test a partir de colonias del cultivo primario. Si volvemos a observar el
mismo patrn, se tienen que sub-cultivar las colonias que crecen en la
zona de inhibicin, identificarlas y volver a realizar el E-test.
32
Si obtenemos el mismo resultado y el cultivo es puro, debemos informar

como resistente.
Utilizando los puntos de corte actuales para Staphylococcus pneumoniae
y penicilina una cepa que es resistente por el mtodo de dilucin en agar
(CMI>2 g/ml) puede ser categorizada comointermedia (CMI = 0,25 a
1,0 g/ml) por Epsilon test. En estos casos cuando encontramos una cepa
con CMI de 1 g/ml por el mtodo Epsilon test, se recomienda confirmar
la CMI por un mtodo alternativo.

Las cepas de control utilizadas sern las recomendadas por la NCCLS para la
determinacin de la CMI por mtodos de dilucin. Los valores de CMI esperados
debern estar comprendidos entre los rangos mencionados para cada antibitico
(Tabla 1-4).
A.2.5. Interpretacin de Resultados

Como se ha observado una relacin directamente proporcional entre los valores de
Epsilon test y los valores de referencia de la NCCLS obtenidos por dilucin en agar,
los puntos de corte de la CMIs sern apropiados para categorizar la bacteria
estudiada como sensible, intermedia o resistente.
Informacin. Si los resultados con la(s) cepa(s) utilizadas como control de calidad
se encuentran dentro del rango aceptable, se realizar la informacin segn los
criterios aplicados a los valores de CMI obtenidos por los mtodos de dilucin.
B. Mtodos de Dilucin
La cuantificacin de la actividad in vitro de los antimicrobianos se evala habitualmente
mediante alguna de las variantes de los mtodos de dilucin. Estos mtodos se basan en
la determinacin del crecimiento del microorganismo en presencia de concentraciones
crecientes del antimicrobiano, que se encuentra diluido en el medio de cultivo (caldo o
agar).
33
Las primeras determinaciones se realizaron empleando bateras de tubos con caldo de

cultivo con un rango determinado de antimicrobiano (macrodilucin). Esta
metodologa es muy engorrosa, por la cantidad de material y de manipulaciones
necesarias para su realizacin. La aparicin de un sistema de inoculacin mltiple para
placas de agar populariz el mtodo de dilucin en agar, en el que cada placa, con una
cierta concentracin de antimicrobiano, permite inocular simultneamente un gran
nmero de microorganismos. La utilizacin de micropipetas y de placas de
microtitulacin facilit la utilizacin del mtodo de microdilucin con caldo; en la
actualidad se han popularizado los mtodos automatizados comerciales de
microdilucin en caldo, fcilmente integrables en sistemas semi-automticos de lectura
e interpretacin de resultados, pero con el grave inconveniente del incremento en el
coste.
Tradicionalmente estos mtodos se han venido usando para la determinacin de la CMI

y la concentracin mnima bactericida (CMB) de los antimicrobianos. En la mayora de
los casos se preparan diluciones del antimicrobiano en progresin geomtrica en base 2
utilizando un medio de cultivo adecuado; posteriormente se inocula dicho medio y tras
la correspondiente incubacin para permitir el crecimiento del microorganismo se
realiza la lectura, determinando qu concentracin causa la inhibicin del crecimiento
del microorganismo. Si se realiza un sub-cultivo en medio sin antimicrobiano de los
medios sembrados previamente puede determinarse tambin la actividad bactericida.
Indicaciones y Limitaciones:
Se detallan los aspectos bsicos y metodolgicos de los mtodos de dilucin para su
aplicacin a microorganismos de crecimiento no exigente (Staphylococcus spp,
Enterococcus spp, Listeria spp., enterobacterias, Pseudomonas spp., Acinetobacter
spp., Stenotrophomonas maltophilia.). Aun cuando muchos de estos aspectos son
aplicables tambin a los organismos fastidiosos (Haemophilus spp., Neisseria spp.,
Streptococcus spp.), ms adelante se revisarn las particularidades propias de estos
otros microorganismos.
34
Los mtodos de dilucin se consideran de referencia para la determinacin

cuantitativa de la actividad de los antimicrobianos. Son los mtodos indicados
cuando, adems de la actividad inhibitoria, se quiere determinar tambin la actividad
bactericida.
La gran cantidad de variables (dependientes del microorganismo, del medio de

cultivo, del inoculo) que influyen en estos mtodos son responsables de oscilaciones
en el resultado finalmente obtenido, por lo que para su correcta evaluacin es
necesario que se realicen de forma estandarizada.
La determinacin de la actividad antimicrobiana mediante tcnicas de dilucin se
realiza utilizando una escala discontinua (habitualmente concentraciones crecientes
en base 2) en vez de una escala continua (como sucede en el mtodo de difusin), por
lo que los valores de CMI reales de un determinado antimicrobiano se encontrarn en
algn valor situado entre la CMI experimentalmente obtenida y la concentracin
inmediatamente inferior. Desde el punto de vista clnico la diferencia entre los
valores real y experimental de CMI no suelen ser trascendentes cuando se trata de
concentraciones bajas, pero pueden tener importancia para las CMIs altas que se
acerquen a las concentraciones alcanzables in vivo.
En comparacin con los mtodos de difusin, los mtodos de dilucin son

tcnicamente ms complejos y casi siempre ms caros, en particular cuando se
utilizan paneles comerciales de microdilucin.
Preparacin del antimicrobiano

Los antimicrobianos a usar en las tcnicas de dilucin pueden obtenerse de los
correspondientes fabricantes, o comprarse directamente a ciertas compaas
comerciales. Para los estudios in vitro no es adecuado utilizar las preparaciones de
uso clnico, sino que deben emplearse sustancias valoradas de las que se conozcan la
potencia (mg de sustancia pura por cada mg de sustancia valorada), la fecha de
caducidad y el lote de preparacin. Las sustancias valoradas deben conservarse
35
siguiendo estrictamente las indicaciones del proveedor, por lo general en un

desecador que se mantiene en frigorfico o en congelador. En el caso de usar
desecadores para la conservacin, hay que evitar la formacin de agua de
condensacin por lo que, tras sacarlos del frigorfico/congelador, se deben abrir slo
cuando hayan alcanzado la temperatura ambiente.
La sustancia valorada debe pesarse en una balanza de precisin. Para conseguir una
determinada concentracin, lo ms sencillo es pesar con un ligero exceso una
cantidad de sustancia valorada y, posteriormente, aadir el volumen de diluyente
necesario. Como resulta obvio, para calcular una determinada concentracin de
antimicrobiano hemos de considerar la pureza de la sustancia que se est empleando
(que en la mayora de casos no es del 100%). Las concentraciones de antimicrobianos
deben prepararse al menos 10 veces ms concentradas que la concentracin ms alta
que se vaya a evaluar, y en todo caso superior a 1000 mg/l. En la Tabla 6 se indican
los diluyentes y solventes necesarios para la preparacin de los antimicrobianos ms
habituales. No es necesario esterilizar las soluciones de antimicrobianos porque la
contaminacin de estas soluciones es muy infrecuente.
Las soluciones de antimicrobianos se deben emplear el mismo da de su preparacin.
Alternativamente, se pueden congelar en alcuotas (usando tubos estriles de vidrio o
plstico). La temperatura ideal para la conservacin de estas soluciones es de al
menos -60C, y en todo caso nunca superior a los -20C. Se acepta que a temperaturas
de -60C las soluciones madres de antimicrobianos son estables, con muy contadas
excepciones, durante al menos 6 meses. En la Tabla 7 se indica la estabilidad de
diluciones de antimicrobianos a otras temperaturas. En las Tablas 8a y 8b se recogen
esquemas de preparacin de diluciones de antimicrobianos para usar en los mtodos
de dilucin en agar y de dilucin en caldo, respectivamente.
El nmero de antimicrobianos a evaluar depender de las directrices de cada

laboratorio.
36
Debe recordarse que el antibiograma adems de ofrecer
informacin
de
inters
clnico puede tambin tener inters epidemiolgico y para la identificacin de

microorganismos, por lo que puede considerarse necesario incluir antimicrobianos
que no se utilizan habitualmente en clnica. En la Tabla 9 se recogen los
antimicrobianos que sera aconsejable evaluar para diferentes grupos de
microorganismos segn el grupo MENSURA, y en la Tabla 10 los rangos de dilucin
aconsejables desde un punto de vista clnico.
Algunos laboratorios han de estudiar la actividad de nuevos antimicrobianos o

realizar estudios comparativos sobre miembros de grupos/familias estrechamente
relacionados, pero en general, y teniendo en cuenta que el nmero de antimicrobianos
(de uso clnico) es enorme, no todos ellos se pueden estudiar de forma rutinaria. En
general, se escoge un representante de un grupo y se asume que la actividad de otros
antimicrobianos del mismo grupo, con igual mecanismo de accin y frente a los que
los mecanismos de resistencia bacteriana son similares, tendr una actividad igual o
muy similar. Por otro lado, aun cuando el laboratorio estudie un amplio grupo de
antimicrobianos de forma rutinaria, muchos autores consideran innecesario informar
de todos ellos al clnico.
B.1. Dilucin en agar
En estos mtodos se incorpora el antimicrobiano a evaluar a un medio con agar. El

antimicrobiano se aade cuando el medio an est fundido. Para lograr el rango de
dilucin deseado se prepara una serie de placas, cada una con una determinada
concentracin de antimicrobiano. Las placas se inoculan con un replicador una vez
que se haya solidificado el medio de cultivo. El nmero de placas de cada
concentracin a preparar vendr dado por el nmero de microorganismos que se vaya
a estudiar, teniendo en cuenta que la mayora de los replicadores permiten inocular
entre 32 y 36 organismos.
37
Medio de cultivo: En la mayora de los casos, el medio de cultivo a emplear es agar

Mueller-Hinton, pero en funcin de los microorganismos y de sus necesidades
nutritivas puede ser adecuado o necesario aadir algn suplemento a este medio, o
emplear un medio diferente. El medio se obtiene habitualmente de distribuidores
comerciales, que indican las condiciones para su preparacin. Una vez esterilizado
debe dejarse enfriar a unos 50C antes de aadir suplementos (si es necesario) y las
soluciones con antimicrobiano. El pH del medio, una vez slido y con los
suplementos que se requieran, ha de estar entre 7.2 y 7.4. El medio con
antimicrobiano se vierte cuanto antes (para evitar que el agar se solidifique) en placas
petri estriles, evitando la formacin de burbujas que dificultaran la posterior
inoculacin de las placas.
Para placas circulares de 90 mm de dimetro son necesarios 20 ml de medio con

antimicrobiano (habitualmente en la proporcin 19 ml de medio por 1 ml de solucin
de la correspondiente concentracin de antimicrobiano).
Posteriormente se dejan solidificar las placas, que se usarn inmediatamente o se
almacenarn en frigorfico en bolsas de plstico. Para trabajos de referencia las placas
no se deben almacenar ms de cinco das, sin olvidar que algunos antimicrobianos
(como ampicilina, meticilina, imipenem, cido clavulnico, etc.) son poco estables a
4-8C y, por ello, las placas que los contienen se deben usar el mismo da de su
preparacin. Tras sacar las placas del frigorfico, se deben dejar a temperatura
ambiente unos 30 minutos antes de proceder a su inoculacin, comprobando que no
exista agua de condensacin en la superficie de las mismas. Las placas hmedas se
pueden secar en estufa dejando las tapas entreabiertas. En cualquier caso, la
evaluacin de los resultados obtenidos con placas almacenadas segn las condiciones
indicadas slo debe realizarse cuando los resultados con las cepas de control estn
dentro de los mrgenes indicados.
Para cada serie de concentraciones se debe incluir al comienzo y al final de las

mismas sendas placas de medio sin antimicrobiano que servirn para controlar el
crecimiento y la posibilidad de contaminacin durante el proceso de inoculacin.
38
Preparacin del inculo.

Los replicadores suelen dispensar gotas (de aproximadamente 5 mm de dimetro) con
un volumen de 1 a 2 L. El inculo que debe contener cada una de estas gotas debe
ser de aproximadamente 104 UFC, por lo que la suspensin original a usar con el
replicador debe tener 107 UFC/mL Esta suspensin produce una turbidez difcil de
medir, por lo que habitualmente se prepara una suspensin de 108 CFU/mL que
posteriormente se diluye 1:10. En la mayora de los laboratorios esta turbidez se
prepara por comparacin visual (o espectrofotomtrica) con la que corresponde al
estndar 0.5 de la escala de McFarland (densidad ptica de 0.08-0.10 a 625 nm,
equivalente a 1-2 x 108 CFU/ml para la mayora de los microorganismos no
exigentes).
Una vez preparado, debe usarse antes de 15 minutos. Se pondr una alcuota de cada
uno de los inculos en los correspondientes pocillos del replicador. Para la
inoculacin se deben preparar las series de placas de modo que se comience
inoculando un control sin antimicrobiano, se contina inoculando a partir de la placa
con menor concentracin de antimicrobiano y se finaliza sembrando una nueva placa
de control sin antimicrobiano. Cada uno de los inculos se debe sembrar en
aislamiento en una placa sin antimicrobiano para comprobar posteriormente la pureza
de los mismos, y si fuera necesario disponer de un cultivo fresco tras la
correspondiente incubacin. Las placas inoculadas se dejarn a temperatura ambiente
hasta que las gotas de inculo estn secas. Posteriormente se incuban a 35C durante
16 a 20 horas y se procede a su lectura. La CMI es la menor concentracin de
antimicrobiano que inhibe completamente el crecimiento bacteriano (no se considera
crecimiento la aparicin de una colonia aislada o de un halo tenue debido al propio
inculo). Ocasionalmente pueden verse algunas colonias o franco crecimiento en
concentraciones superiores a la CMI aparente; en estos casos se debe comprobar la
pureza del inculo para descartar una contaminacin; si esta ltima se confirma
deber repetirse el estudio.
39
B.2. Dilucin en caldo

El NCCLS recomienda para la mayora de los microorganismos utilizar caldo
Mueller-Hinton, al que se aadirn los suplementos necesarios para asegurar el
crecimiento de organismos exigentes. El medio debe tener un pH de 7.2 a 7.4 y estar
ajustado con Ca2+ (20-25 mg/l) y Mg2+ (10-12.5 mg/l). Esta cantidad de iones
divalentes asegura la reproducibilidad de los valores de CMI de aminoglucsidos
frente a Pseudomona aeruginosa y de tetraciclinas frente a la gran mayora de
microorganismos, al compararlos con los que se obtienen con agar Mueller-Hinton.
El ajuste de cationes del caldo Mueller-Hinton se har en funcin de la cantidad basal

que contenga el mismo, habitualmente proporcionada por los fabricantes del medio.
Por cada 1 mg/l de incremento que sea necesario ajustar se aaden, al medio ya estril
y a 4C, 0.1ml de una solucin esterilizada por filtracin que contiene 10mg de
Mg2+/ml (8.26 gramos de Cl2Mg.6H20 en 100 ml de agua desionizada) y 0.1ml de
solucin estril de 10 mg de Ca2+/ml (3.68 g de Cl2Ca.2H2O en 100 ml de agua
desionizada). Si el fabricante ofrece ya un medio con las cantidades suficientes de
cationes divalentes no es necesario ajuste alguno.
Existen dos modalidades de los mtodos de dilucin, en las que se utilizan tubos
(macromtodo) o placas de microtitulacin (micromtodo).
B.2.1. Mtodo de Macrodilucin.

Se emplea por cada combinacin microorganismo/antimicrobiano una batera de
tubos. Habitualmente se prepara la batera de tubos con 1ml de medio estril sin
antimicrobiano.
Al primero de ellos se aade 1 ml de la solucin inicial del tubo de antimicrobiano

hasta conseguir la concentracin ms alta a estudiar (teniendo en cuenta que este
primer paso supone la dilucin a la mitad de la solucin madre, y que una vez
inoculados los tubos, con 1 ml de inoculo, se diluir nuevamente la concentracin
de antimicrobiano a la mitad). Tras mezclar adecuadamente, se pasa 1 ml al
40
siguiente tubo; el proceso se repite tantas veces como diluciones se quieran

estudiar, eliminando del ltimo tubo de la serie 1 mL de medio con
antimicrobiano, con objeto de mantener el volumen final de 1 mL.
Para cada paso de dilucin se debe emplear una pipeta diferente. La serie de tubos
se completa con uno de control sin antimicrobiano que solamente tiene 1 mL de
caldo.
B.2.2. Mtodo de Microdilucin.

En el mtodo de microdilucin cada una de los pocillos de la placa de
microtitulacin con pocillos de fondo en U representa uno de los tubos del
mtodo de macrodilucin. Las placas de microdilucin con diferentes
concentraciones de antimicrobianos se pueden preparar en el propio laboratorio o
bien se pueden comprar a diferentes compaas que los suministran congelados,
deshidratados o liofilizados.
En muchos laboratorios el empleo de paneles comerciales se basa en la utilizacin

de sistemas semiautomticos de incubacin lectura-interpretacin; esto facilita su
uso, pero tiene el inconveniente del incremento del gasto. Algunas compaas han
introducido en el mercado paneles en los que el medio de cultivo incluye un
indicador fluorescente que permite la obtencin rpida (menos de 8 horas) de los
resultados; sin embargo, no existen an datos suficientes que permitan aconsejar el
uso rutinario de este tipo de paneles. Varias compaas comerciales estn
evaluando, tambin, sistemas expertos (programas informticos) que facilitan la
interpretacin clnica de los resultados obtenidos; es presumible que su uso se
generalizar en un futuro. No se discutir el uso de estos sistemas comerciales; se
remite al lector a la informacin proporcionada por los propios fabricantes. En lo
sucesivo nos referiremos al mtodo de microdilucin preparando las placas en el
propio laboratorio.
41
Teniendo en cuenta que la mayora de placas disponibles tienen 96 pocillos

(12x8), podemos estudiar con cada una de ellas, y para el mismo microorganismo
8 antimicrobianos y 11 diluciones (la ltima columna se suele utilizar como
control de crecimiento) o viceversa. En ocasiones se preparan placas con 12
diluciones de antimicrobiano y se utiliza una placa adicional para realizar los
controles. El volumen final de cada pocillo es habitualmente de 100 L, por lo que
antes de la inoculacin de la placa, cada pocillo debe contener 100 L de caldo
con antimicrobiano (volumen de inculo menor de 10 L) o 50 L (si se van a
usar tambin 50 L para inocular la placa). En este ltimo caso debe tenerse en
cuenta, a la hora de calcular la concentracin inicial ms alta, que tras aadir el
inculo la concentracin de antimicrobiano se diluir a la mitad. Dependiendo,
pues, del volumen de inculo final, las placas se rellenan utilizando una pipeta
multicanal con 100 200L de la solucin ms alta de antimicrobiano.
Posteriormente se aade un volumen de 50 o 100L de caldo sin antimicrobiano
en los pocillos de las columnas 2 a 11 y se realiza la dilucin en la forma habitual
empleando la pipeta multicanal, dejando los pocillos de la ltima columna como
controles (positivos - no antimicrobiano y negativos no inoculo).
Inoculacin
Si se van a aadir suplementos a los pocillos de las placas de microtitulacin se
producir una dilucin del volumen final; en el caso de que el volumen aadido no
supere el 10% del volumen total no es necesario tener en cuenta este efecto.
El inculo en los mtodos de dilucin en caldo se prepara a partir de suspensiones

del 0.5 de la escala de McFarland, empleando cualquiera de los dos mtodos
(crecimiento o suspensin directa) indicados anteriormente. El inoculo final ser
de 5 (se acepta de 3 a 7) x 105 CFU/mL, 5 x 104 CFU/pocillo en la tcnica de
microdilucin. En funcin de ello la suspensin inicial se diluir en caldo MuellerHinton dependiendo del mtodo elegido. En el mtodo de macrodilucin se har
una dilucin 1:100 de forma que al aadir 1 ml a los tubos con 1 ml de medio con
antimicrobiano queden 106 CFU en 2 ml, es decir 5 x105 CFU/ml.
42
De forma anloga, en el caso de la microdilucin se har una dilucin 1:10 (en el

caso de emplear un inculo de 5 L) o 1:100 (en el caso de emplear un inoculo de
50l). El inculo ya diluido debe usarse antes de 15 minutos tras su preparacin.
Las placas de microdilucin deben taparse o sellarse con adhesivo para evitar la
evaporacin del medio de cultivo cuando se incuben. Es necesario controlar el
inculo as preparado, sembrando alcuotas diluidas en medio slido que, una vez
incubadas, permitan el recuento del inculo realmente usado. Una forma sencilla
de realizar este recuento es diluir 10 L del tubo o del pocillo de control positivo
en 10 ml de suero salino, sembrando posteriormente 100 L de esta dilucin. Para
un inoculo de 5 x 105 UFC/mL deben crecer 50 colonias en la placa de medio
slido.
Los tubos de ensayo o placas petri se incubarn a 35C durante 16 a 20 horas, o en

las condiciones necesarias que se detallan posteriormente para casos especiales.
Para evitar diferencias de temperatura en la incubacin de bloques de placas de
microtitulacin no se deben apilar ms de cuatro o cinco placas.
Tras la incubacin se procede a la lectura de los resultados. La CMI se define

como la menos concentracin de antimicrobiano que a simple vista inhibe
completamente (o el 80% en el caso de las sulfamidas) el crecimiento del
microorganismo estudiado. La interpretacin de los resultados, que a veces resulta
compleja, se facilita tomando como referencia el crecimiento observado en los
tubos o pocillos usados como control positivo. En el caso de las placas de
microdilucin dichos controles positivos deben presentar una clara turbidez o un
botn de al menos 2 mm de dimetro. Para observar el crecimiento de los pocillos,
a veces resulta necesario limpiar la parte inferior de la placa de microtitulacin, lo
que puede realizarse con papel absorbente. La lectura es ms sencilla utilizando un
lector con espejo (tambin usado en las tcnicas de diagnstico serolgico) en el
que se refleja la parte inferior de la placa de microtitulacin.
43
B.3. Correlacin de los resultados.

En general, los valores de CMI obtenidos mediante microdilucin son iguales o una
dilucin menor a los que se obtienen por macrodilucin.
B.4. Control de calidad.

Medio de cultivo: Cada lote de Mueller-Hinton se debe evaluar utilizando una serie
de cepas de control de calidad.
Uno de los problemas que pueden plantearse con el caldo de Mueller-Hinton es el

contenido en timidina que puede inducir a errores en la determinacin de la CMI de
sulfamidas y de trimetoprim. Con la cepa control de Enterococcus faecalis ATCC
29212 los valores de CMI deben ser, respectivamente, 0.5 y 9.5 mg/l. La CMI de
gentamicina de Pseudomona aeruginosa ATCC 27853 puede ser menor de la
esperada si el caldo Mueller-Hinton no contiene una cantidad adecuada de cationes.
B.5. Informe de Resultados

Cuando la determinacin de la CMI tiene una finalidad clnica, no es aconsejable
presentar simplemente los valores absolutos obtenidos con cualquiera de los mtodos
expuestos. Resulta ms til traducir, mediante una categorizacin cualitativa, estos
valores de CMI. La interpretacin de estos resultados debe considerar tambin
aspectos farmacocinticas, posibles mecanismos de resistencia y datos de eficacia
clnica. De esta forma se pueden distinguir tres categoras clnicas: sensible,
intermedio y resistente.
En la actualidad existen varios grupos de estudio que han establecido puntos de corte
que permiten establecer las tres categoras citadas, pero estos valores varan de unos
grupos a otros. En Espaa, el grupo MENSURA ha establecido recientemente los
puntos de corte que definen las categoras de sensibilidad y resistencia y se recogen,
de forma comparativa, los puntos de corte establecidos por este grupo, NCCLS, CA-
44
SFM (Sociedad Francesa de Microbiologa) y BSAC (Sociedad Britnica de

Quimioterapia).
1.2.5. CEPAS DE REFERENCIA
Las cepas de referencia en mtodos de dilucin aconsejadas por el NCCLS son:
Staphylococcus aureus ATCC 29213: Control para antimicrobianos usados frente
a bacterias Gram-positivas.
Enterococcus faecalis ATCC 29212: Control para antimicrobianos usados frente a
bacterias Gram-positivas, y para control de trimetoprim/sulfametoxazol.
Escherichia coli ATCC 25922: Control de antimicrobianos usados frente a
bacterias Gram-negativas.
Escherichia coli ATCC 35218: Control para las combinaciones de betalactmicos
con inhibidores de betalactamasas.
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853: Control de antimicrobianos usados frente
a bacterias Gram-negativas y particularmente con aminoglucsidos.
Los valores aceptables para cada una de estas cepas se recogen en la Tabla 11.
Pseudomona aeruginosa ATCC 27853 desarrolla resistencia a carbenicilina cuando se
subcultiva sucesivamente. Si se observa este problema debe comenzar a usarse un nuevo
cultivo de la coleccin que se mantenga liofilizado o congelado.
Para el trabajo rutinario, las cepas se pueden mantener durante 2-4 semanas a 4-8C en
tubos con agar de soja tripticasa en lengeta. Para almacenamiento a largo plazo se
deben mantener liofilizadas o congeladas al menos a -20C (o menos) utilizando un
agente estabilizante adecuado (ej. caldo de soja tripticasa con glicerol al 10-15%, caldo
con suero bovino fetal al 50%, sangre de oveja desfibrinada, o leche descremada).
Las cepas de referencia deben usarse para controlar cada lote de tubos, placas de agar, o
placas de microdilucin. En caso de que los valores de CMI no se encuentren dentro de
los rangos recogidos en la Tabla 11 el lote se debe descartar. Este control se debe
45
realizar durante 30 das consecutivos sin que, para cada antimicrobiano, se obtengan ms
de tres valores fuera de los rangos recogidos en la tabla 11.
Cuando se haya satisfecho este requisito el control ser semanal. Si con esta
periodicidad se observa un error (no obvio) se har una reevaluacin durante 5 das y si
con ello no se llega a determinar la fuente del error se har un control diario
nuevamente, durante 30 das, antes de volver al control semanal.
Tabla 12: Mtodos de anlisis de la sensibilidad antimicrobiana

Metodo
Cualitativo
Semi-cuantitativo
Cuantitativo
Tcnica
Informacin
Antibiograma Difusin de Micro

discos
(Kirby-Bauer)
Resistencia
Valor Intermedio
Sensibilidad
Gradiente Antibitico
(E-Test)
Aproximacin a la
Concentracin
Mnima Inhibitoria
(CMI)
Determinacin de la
CMI
1. Dilucin de Caldo:
Macrodilucin
en Tubo.
Microdilucin
en Placa
2. Dilucin en Agar
3. Sistemas Automatizados
(Vitek.)
1.2.5.1. Escherichia coli.

Es una bacteria cuyo hbitat natural es el tracto entrico del hombre y de los animales de
sangre caliente, por ello, la presencia de este microorganismo en un producto indica
generalmente una contaminacin directa o indirecta de origen fecal, pudiendo estar
presentes patgenos entricos.
Hoy en da, Escherichia coli es el indicador de contaminacin fecal ms utilizado, pero

la presencia de Escherichia coli en un producto no constituye una connotacin directa de
la presencia de algn patgeno, sino que implica nicamente un cierto riesgo de que
pudiera estar presente.
46
La no deteccin de Escherichia coli no garantiza la presencia de patgenos entricos. Se

destruye a temperatura de Pasteurizacin y tambin durante su almacenamiento en fro,
por eso, la presencia de Escherichia coli en un producto tratado por calor, significa que o
bien ha ocurrido un fallo en el proceso o ms frecuentemente ha ocurrido una
contaminacin despus del tratamiento trmico, a partir del equipo, empleados o de
producto no procesados (malas prcticas de fabricacin).
La mayora de cepas de Escherichia coli son comensales entricos inocuos, pero algunas
pueden producir enfermedad. Las Escherichia coli patgenas intestinales se definen
como aquellas cepas capaces de causar una enfermedad diarreica en hombres y
animales. Las cepas de Escherichia coli importantes como posibles patgenos se
encuentran en las heces y pueden pasar a los productos de consumo, bien por prcticas
antihiginicas o por materias primas contaminadas como el uso de aguas fecales.
Las cepas de Escherichia coli implicadas en enfermedades pueden incluirse en 6 grupos

basados en su virulencia y serologa:
Escheria coli Enteropatognica (ECEP): Son enteropatgenas, porque no producen
enterotoxinas, aunque pueden producir diarrea grave puesto que son capaces de
invadir clulas epiteliales. Las personas son un reservorio importante.
Escheria coli Enterotoxignica (ECET): Cepas que son enterotoxignicas, son la
causa principal de la diarrea infantil en los pases en desarrollo y son los agentes
ms tpicos de la diarrea del viajero. Colonizan el intestino delgado y producen
toxinas que atraen la acumulacin de lquido y una respuesta diarreica.
Escheria coli Enteroinvasiva (ECEI): Enteroinvasoras, porque no producen
toxinas, pero invaden y se multiplican en el interior de las clulas epiteliales del
colon.
47
Escheria coli Enterohemorrgica (ECEH): Enterohemorrgicas, producen toxinas

y factores citotxicos que causan colitis hemorrgica. Destaca la cepa Escherichia
coli 0157:H7, produce una toxina denominada verotoxina, esta se identifica como
causa de colitis hemorrgica, que se asocia con la ingestin de carne picada vacuna
poco cocinada.
Escheria coli Enteroagresiva (ECEA): Solo encontrada en humanos, producen

hemolisina y una entorotoxina ST similar a la de las enterotoxignicas, se le
asocian dos toxinas: toxina termoestable enteroagregante (EEAST); toxina
codificada por plasmidos (PET).
Escheria coli Adherencia Difusa (ECAD): Se adhiere a la totalidad de la superficie

de las clulas epiteliales y habitualmente causa enfermedad en nios
inmunolgicamente no desarrollados o malnutridos.
Existen cepas de Escherichia coli de referencia en mtodos de dilucin aconsejadas por

el NCCLS:
Escherichia coli ATCC 25922: Control de antimicrobianos usados frente a
bacterias Gram negativas.
Escherichia coli ATCC 35218: Control para las combinaciones de beta-lactmicos
con inhibidores de betalactamasas.
Deteccin e identificacin: Existen 3 mtodos para la deteccin y recuento de
Enterobacterias
Mtodo del NMP: usando caldos lactosados y posterior confirmacin por siembra
en placa y en medio EMP.
Recuento por siembra en placa, usando el medio VRBG (agar bilis rojo violeta
con glucosa) o medio ENDO para coliformes totales, incubando a 37C.El medio
mFc (microfiltracin para coliformes) para coliformes fecales cuando lo
48
incubamos a 44C. Muy usado es el VRBG que usa como agente selectivo las sales
biliares y el colorante cristal violeta. Otro medio es el Mac Conkey, que se puede
hacer en lquido (caldo) o placa.
Deteccin de enzimas presentes en este grupo mediante reacciones cromognicas
o fluorognicas, por ejemplo el reactivo MUG (4-metil- umbeliferil /J-Dglucurnico), especfico para E. coli, dando un componente fluorescente.
Para identificar Escherichia coli se realizan pruebas bioqumicas y/o fisiolgicas. El

mtodo ms general de identificacin y confirmacin de enterobacterias, incluyendo a
Escherichia coli, es el que utiliza las pruebas bioqumicas IMV: C y la tincin Gram,
aunque hoy en da existen pruebas mucho ms rpidas y completas como son las
famosas tiras API (Analytical Profile Index) y tambin hay pruebas serolgicas, que son
importantes para la determinacin de las cepas patgenas, como por ejemplo de
Escherichia coli, que no poseen las caractersticas tpicas de las cepas de Escherichia
coli.
1.2.5.2. Staphylococcus aureus

Los miembros del genero Staphylococcus son cocos gran positivos, anaerobios
facultativos, inmviles, que habitualmente forman agrupaciones irregulares. Son catalasa
positiva, oxidasa negativa, fermentan la glucosa de forma anaerobia, poseen cido
teitoico en sus paredes celulares, un DNA con un contenido mucho ms bajo en G+C
(30 a 39%). Los estafilococos residen normalmente en la piel, las glndulas cutneas y
las mucosas de animales de sangre caliente.
La importancia de esta bacteria radica en su capacidad de producir enterotoxinas, las

cuales son resistentes a las proteasas del intestino y termoestables. Al ser ingeridas
producen gastroenteritis con nauseas, vmitos, diarreas y debilidad general,
constituyendo una intoxicacin, ya que no requiere una multiplicacin de la bacteria.
49
Descripcin: Staphylococcus aureus es un coco Gram +, que forma agrupaciones

irregulares como consecuencia de la divisin celular en ms de un plano, son catalasa +,
oxidasa - y anaerobios facultativos. Crece en medios slidos, dando colonias de color
dorado o amarillo, destaca su capacidad para crecer en medios con elevado contenido de
sal (5-7'5%), de ah que se emplee esta caracterstica para su aislamiento. Su hbitat
principal es la piel, sus glndulas anejas y las mucosas de los animales de sangre
caliente. Por eso, cuando se encuentra un gran nmero de estas bacterias en un producto,
significa por lo general que las prcticas higinicas de limpieza y desinfeccin y el
control de temperatura no han sido adecuados.
Existen cepas de Staphylococcus aureus de referencia en mtodos de dilucin

aconsejadas por el NCCLS: Staphylococcus aureus ATCC 29213: Control para
antimicrobianos usados frente a bacterias Gram positivas.
Deteccin
e identificacin: Staphylococcus
aureus
se detecta
por anlisis
microbiolgicos clsicos, siembra en medios selectivos como los medios manitol salado
y o el Baird - Parker, luego se hace aislamiento e identificacin. Para la identificacin
existen pruebas comerciales como los API para estafilococos y para la deteccin de la
toxina se emplean anticuerpos especficos. El procedimiento de confirmacin ms
frecuente es el test de la coagulasa.
1.3. DEFINICIONES
Antibiograma, Se define a la actividad in vitro de un antibitico frente a un

microorganismo determinado y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de una
bacteria o poblacin bacteriana.
50
1.4. HIPOTESIS
Ho. Las diferentes concentraciones del extracto hidroalcohlico de la hoja Mansoa

alliacea (ajo sacha) no presenta actividad antibacteriana frente a
Staphylococcus
aureus y Escherchia coli.
Ho. Las diferentes concentraciones del extracto etanlico de la hoja de Mansoa alliacea
(ajo sacha) no presenta actividad antibacteriana frente a
Staphylococcus aureus y
Escherichia coli.
Ha. Las diferentes concentraciones del extracto hidroalcohlico de la hoja de Mansoa

alliacea (ajo sacha) presenta actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus y
Escherichia coli.
Ha. Las diferentes concentraciones del extracto etanlico de la hoja Mansoa alliacea
(ajo sacha) presenta actividad antibacteriana frente a
Staphylococcus aureus y
Escherichia coli.
1.5. VARIABLES
1.5.1. Variable independiente

Extractos hidroalcohlico y etanlico de la hoja de Mansoa alliacea.
1.5.2. Variable dependiente

Actividad antibacteriana frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
51
CAPITULO II
METODOLOGIA
El estudio consisti en indagar la presencia de actividad antimicrobiana en las hojas de
Mansoa alliacea ajo sacha, especie vegetal de la familia Bignoniaceae. La
literatura cientfica no reporta ninguna informacin acerca de su actividad
antimicrobiana. Se trat de una investigacin experimental donde se
combina el trabajo de campo para la recoleccin de la muestra, trabajo de
gabinete para la identificacin botnica, para autentificar la especie vegetal,
procedimientos fitoqumicos y pruebas de sensibilidad microbiana para la
determinacin bacteriana.
2.1. TIPO DE INVESTIGACIN
Tipo de estudio: El estudio es Prospectivo - Experimental. Prospectivo porque en

el registro de informacin se tom en cuenta los hechos a partir del inicio de la
fecha de estudio. Experimental porque se emple diferentes concentraciones de los
extractos hidroalcohlico y etanlico para ver la influencia de la actividad
antibacteriana.
2.2. DISEO DE INVESTIGACIN

El diseo de investigacin Experimental fue de enfoque cualitativo, porque se
obtuvo datos para medir el efecto de los extractos de 3 repeticiones de las plantas
sobre los microorganismos.
El estudio se realiz aplicando los ensayos de Sensibilidad Antimicrobiana

establecidas por la Farmacopea Britnica (BP).
52
2.3. POBLACIN Y MUESTRA

Poblacin:
Constituida por arboles de la Especie de Mansoa alliacea ajo sacha.
Muestra:
Arboles de la especie Mansoa alliacea ajo sacha que crecen en el jardn
botnico del Instituto de Medicina Tradicional (IMET- EsSalud), los cuales se
recolect 3Kg de hoja.
La poblacin bacteriana para evaluar la actividad estuvo conformada por 02

microorganismos: Staphylococcus aureus ATCC 29213, y Escherichia coli
ATCC 35218 los mismos que fueron ensayados frente a diferentes
concentraciones del extracto hidroalcohlico y etanlico.
Criterios de seleccin
Criterios de inclusin de la muestra
Hojas enteras que no recibieron dao de depredadores (insectos).
Se recogi la muestra 2 horas despus de la salida del sol (8 a.m.).
Criterios de exclusin de la muestra

Se descart hojas malogradas.
No se recogi hojas del suelo.
Individuos de la especie Mansoa alliacea ajo sacha, que crecen en otras
zonas.
2.4. MATERIALES
Materiales de laboratorio: Matraz de 250 mL, matraz de 100 mL, Probeta
graduada de 100mL, Tubos de ensayo con tapa rosca (150x15mm), Tubos de
ensayo con tapa rosca (75x10mm), Placas Petri, Pipetas lineales (10, 5 y 1mL),
Baln de destilacin (500, 100 y 50 mL), Frascos con tapa rosca de 100 y 250 mL,
Vaso de precipitado de 100 mL, Gotero color mbar, Varilla de vidrio.Gradilla, Asa
bacteriolgica de punta, Asa bacteriolgica de aro, Esptula de metal.
53
Reactivos y Medios de cultivos:Cloruro de Bario (BaCl2), cido Sulfrico

(H2SO4), Agar Mueller Hinton, Caldo Mueller Hinton, Agar Tripticasa soja.
Equipos: Balanza digital, Autoclave, Bao Mara, Mechero de bunsen, Agitador de

tubos, Cocina elctrica, Incubadora, Refrigeradora.
2.5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

Etapas:
Recoleccin de la Muestra:
Se recolect las hojas en el Jardn Botnico del Instituto de Medicina Tradicional
(IMET-EsSaalud), se eligi un rbol de abundante follaje. .Se tom 3 kg de hojas frescas
para el trabajo experimental y se recogi una rama con hojas, flores y frutos para su
identificacin en el Herbarium Amazonense de la UNAP.
Identificacin de la Muestra:
Se realiz en el Herbarium Amazonense de la UNAP.
Procesamiento de la Muestra
Secado:
3 kg de muestra se sec al aire libre en el laboratorio y se obtuvo 1.2 kg de muestra seca.
Molienda:
Las hojas molidas pasaron por tamiz 80 ASTM y se obtuvo 400 gramos, luego por tamiz
100 ASTM y se obtuvo 100 gr.
Obtencin del extracto hidroalcohlico: El extracto hidroalcohlico se obtuvo por
maceracin de la muestra por 10 veces consecutivas con etanol/agua durante 7 das cada
vez.
Para cada extraccin se puso a maceracin 1200 g de materia prima, la muestra vegetal
de Mansoa alliacea ajo sacha, en 3000 ml de etanol/agua, durante 7 das. La
concentracin del extracto se realiz por eliminacin del disolvente a presin reducida
en un rotavapor, a una temperatura de 600 C y a una presin de 690 mmHg. por espacio
54
de 3 horas aproximadamente, posteriormente se dej secar a temperatura ambiente por 3

das.
Obtencin del extracto etanlico: El extracto etanlico se obtuvo por maceracin de la

muestra por 10 veces consecutivas con etanol durante 7 das cada vez.
Para cada extraccin se puso a maceracin 50 g de materia prima, la muestra vegetal de

Mansoa alliacea ajo sacha, en 700 ml de etanol, durante 7 das. La concentracin del
extracto se realiz por eliminacin del disolvente a presin reducida en un rotavapor, a
una temperatura de 600 C y a una presin de 690 mmHg. por espacio de 3 horas
aproximadamente, posteriormente se dej secar a temperatura ambiente por 3 das.
Preparacin de Medios de Cultivo y Reactivos
a) Caldo Mueller Hinton
Se verti 22 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Se dej reposar 5 minutos. Se
calent con agitacin frecuente y hervir durante 1 minuto para disolucin total; luego se
distribuy en tubos apropiados y esterilizados en autoclave a 121C por 15 minutos pH
FINAL: 7.3 0.1.
Ajuste de cationes:
Preparacin de la solucin stock de cloruro de calcio: disolver 3,68 g de Ca Cl2. 2
H2O en 100 ml de agua desionizada. Concentracin de Ca2+: 10 mg /ml.
Preparacin de la solucin stock de cloruro de magnesio: disolver 8,36 g de Mg
Cl2.6 H2O en 100 ml de agua desionizada. Concentracin de Mg2+: 10 mg/ml.
Esterilizacin de las soluciones stock: mediante la tcnica de filtracin por
membrana. Conservar a 4C hasta su uso.
Se suplement el caldo Mueller Hinton preparado, esterilizado y a temperatura 4 C con

las soluciones stock. Agregado con agitacin constante 0.1 ml de cada solucin stock
por litro de caldo. As se increment en 1 mg /l la concentracin final de estos cationes.
55
b) Agar Tripticasa Soja (TSA)

Se aadi 40g en 1000ml de agua destilada, se llev a ebullicin, en autoclavar a 121C
durante 15 minutos; luego se enfri a 45 50C y distribuy en placas petri estriles.
Prueba de susceptibilidad y accin antimicrobiana de los extractos por el mtodo
de Macrodilucin.
Preparacin del inoculo.

Para estandarizar la densidad del inculo se us una suspensin de sulfato de bario (0,5
de la escala de Mc Farland) como estndar.
El inoculo estndar, para Macrodilucin en caldo, se puede obtener por crecimiento del
microorganismo hasta turbidez equivalente al tubo 0.5 de la escala de Mc Farland o por
suspensin directa de colonias, en caldo o solucin fisiolgica, hasta alcanzar dicha
turbidez. Una vez obtenido el inoculo de turbidez comparable al 0.5 Mc Farland, se
diluy en caldo (Macromtodo) para ajustar el inoculo de manera tal, que luego de
colocado, cada tubo de ensayo para que contenga aproximadamente 5 x 105 UFC/ml. La
inoculacin con la suspensin estandarizada se hizo dentro de los 15 minutos de
preparada la misma, para evitar que el nmero de microorganismos aumente por
duplicacin. La concentracin del inoculo ajustado puede variar dependiendo del
mtodo de inoculacin utilizado y del microorganismo en estudio, por lo tanto se debe
calcular para cada situacin. Para realizar este clculo decidi el volumen exacto y se
realiz la inoculacin.
Colocacin del inoculo en los tubos de ensayo.

Macrodilucin en caldo (tubos de ensayo). Procedimiento
Se agreg 1 ml del inoculo estandarizado a cada tubo de ensayo de dilucin de muestra y
al tubo de ensayo control de crecimiento y se homogeniz la mezcla. No transcurri ms
de 15 minutos entre la preparacin del inoculo y su colocacin en el tubo de ensayo. Se
tuvo en cuenta que tanto la muestra, como el inoculo sufrieron una dilucin al medio.
Por ello es aconsejable realizar un control de pureza del inoculo sub-cultivando una
alcuota en un medio solido no selectivo.
56
El tiempo de incubacin para la mayora de los microorganismos es de 16 a 20 horas,

para la tcnica de Macrodilucin.
Lectura e interpretacin de la CIM.

La CIM corresponde a la mnima concentracin de antibitico en donde no se observa
desarrollo (turbidez). La CIM se expresa en g/ml.
PREPARACIN Y CONTROL DE EXTRACTOS.
A. Mtodo de Macrodilucin en Caldo.

Figura 1. Diluciones en caldo para los extractos.
57
Se pesaran 640 mg del extracto en viales tipo Spendorff estriles, diluidos

en 1 mL de disolucin metanol/agua (1:1) para alcanzar una concentracin
de prueba de 640 mg/ml (solucin madre o stock).
De la solucin madre se sacaran 0.2 mL y ser aadido al tubo de ensayo

N0 01 que contendr 1.8 mL de caldo MuellerHinton.
Del tubo de ensayo N0 01 se sacara 1 mL para ser aadido al tubo de

ensayo N0 02 y as sucesivamente hasta llegar al tubo de ensayo N0 08.
Del tubo de ensayo N0 08 se sacara 1 mL que ser desechado.
Despus de este procedimiento se aadir a todos los tubos de ensayos 1

mL de la suspensin bacteriana.
El volumen final mnimo, en cada tubo de ensayo, ser de 2 mL.
Las concentraciones estarn comprendidas entre los rangos de 32 mg/mL a

0.25 mg/mL.
Los extractos que no se disolvieron por agitacin sern mantenidos por

algunos minutos en bao mara (temperatura de 400C) y colocados
nuevamente en el vortex.
PREPARACIN DE CONTROLES.
Figura 2. Diluciones en caldo para el control
58
El control positivo empleado en la prueba ser el antibitico gentamicina

(160 mg/2 mL), del cual se utilizara 0.64 mL y se enrasara hasta 5 mL en
un tubo de ensayo estril para obtener una solucin madre o stock de 10
240 g/mL.
De la solucin madre se sacaran 0.2 mL y ser aadido al tubo de ensayo

N0 01 que contendr 1.8 mL de caldo Mueller Hinton.
Del tubo de ensayo N0 01 se sacara 1 mL para ser aadido al tubo de

ensayo N0 02 y as sucesivamente hasta llegar al tubo de ensayo N0 09.
Del tubo de ensayo N0 09 se sacara 1 mL que ser desechado.
Despus de este proceso se aadir a todos los tubos de ensayo 1 mL de la

suspensin bacteriana.
Las concentraciones estarn comprendidas entre los rangos de 5120 g/mL

a 20 g/mL.
PLAN DE ANLISIS E INTERPRETACIN

Los resultados obtenidos en los diferentes ensayos se expresaran en trminos de valores
resultantes de cumplimiento para ensayos de dilucin en tubos de ensayo de
Staphylococcus aureus y Escherichia coli.
Tabla 13.Clasificacin de la actividad antimicrobiana segn la concentracin inhibitoria mnima
(CIM).
Actividad antimicrobiana
Concentracin Inhibitoria Mnima
16mg/mL
Inactivo
6-15mg/mL
Poco activo
1-5mg/mL
Moderado activo
<1mg/mL
Buena actividad
Fuente: Protocolo de estudio de la actividad antimicrobiana IMET ESSALUD 2007 75
59
CAPITULO III
RESULTADOS
Los resultados de no actividad por el crecimiento de las bacterias en todas las diluciones
de los extractos evaluados determinan que se acepta las hiptesis nulas y se rechazan las
alternativas.
Foto N 01: Grupos de ensayo de la actividad antimicrobiana por el mtodo de los tubos
mltiples del extracto hidroalcohlico y etanlico de hojas de Mansoa alliacea (Lam.)
A. Gentry Ajo Sacha frente a Staphylococcus aureus y Escherichia coli.
60
Foto N 02: Resultados en placa obtenidos en el ensayo de actividad antimicrobiana por

el mtodo de los tubos mltiples del extracto hidroalcohlico y etanlico de hojas de
Mansoa alliacea (Lam.) A. Gentry ajo sacha frente a Escherichia coli.
Foto N 03: Resultados en placa de los ensayo de actividad antimicrobiana por el

mtodo de los tubos mltiples del extracto hidroalcohlico y etanlico de hojas de
Mansoa alliacea (Lam.) A. Gentry Ajo Sacha frente a Staphylococcus aureus.
61
Tabla14: Resultados del desarrollo bacteriano obtenidos en el ensayo de actividad

antimicrobiana por el mtodo de los tubos mltiples del extracto hidroalcohlico y
etanlicode hojas de Mansoa alliacea (Lam.) A. Gentry ajo sachafueron los mismos.
Tubo
Escherichia coli
Conc (mg/mL)
Desarrollo bacteriano
Staphylococcus aureus
Conc (mg/mL)
Desarrollo bacteriano
512
Positivo
512
positivo
256
Positivo
256
positivo
128
Positivo
128
positivo
64
Positivo
64
positivo
32
Positivo
32
positivo
16
Positivo
16
positivo
Positivo
positivo
Positivo
positivo
Positivo
positivo
10
Positivo
positivo
Las fotos 2 y 3 muestras que al sembrar una asada de cada dilucin de los tubos
mltiples luego de 24 hrs de incubacin a 37C muestran colonias, lo que indica que las
diferentes diluciones del extracto hidroalcohlico y etanlico no inhibieron el desarrollo
de Escherichia coli ni de Staphylococcus aureus.
De acuerdo a la tabla 14 el extracto hidroalcohlico y etanlico de hojas de Mansoa

alliacea (Lam.) A. Gentry Ajo Sacha no inhibi el desarrollo de Escherichia coli ni de
Staphylococcus aureus en ninguna de las diluciones lo que indica que el extracto
hidroalcohlico y etanlico es inactivo.
62
DISCUSIN DE RESULTADOS
Las hojas de Mansoa alliacea (Lam.) A. Gentry ajo sacha de popular muy difundido
en la etnomedicina en la Amazonia Peruana por sus diversas aplicaciones medicinales
atribuidas empricamente dentro de las cuales esta su uso en enfermedades infecciosas.
Olivera M .et al. (2013) evalu la actividad antibacteriana del aceite esencial de la
especie en estudio y encontr que era poco activo frente a Staphylococcus aureus ATCC
6535.Esta diferencia de resultados de actividad antibacteriana con el encontrado frente a
los extractos hidroalcohlico y etanlico en el presente estudio se debera a la diferencia
de componentes presentes. Por otro lado, Atayala y Villacres en el 2004 reportaron en
estudios similares que el extracto liofilizado de ajo sacha al 3% que present actividad
antifngica, sin embargo en este estudio no se prob esta actividad.
Probablemente la contribucin del ajo sacha al ser consumido para aliviar o recuperar
los problemas de salud se deba a otras actividades farmacolgicas, como lo reporta
Brack 1999 que encontr que popularmente a la especie tambin se le reportan muchas
otras aplicaciones medicinales, entre ellas analgsicas, antipirtica, antiespasmdica y
antiinflamatoria. (20) Sin embargo es necesario encontrar la verdadera actividad biolgica
de Mansoa alliacea ajo sacha, que justifique su uso popular tan difundido sobre todo
entre los pobladores rurales de la Regin Loreto y de otras partes de Amrica.
Al Allium sativum Ajo se le atribuye la actividad antibacteriana y plaguicida a su

contenido de Allina que es convertida por enzimas a Allicina. En el IMET Es Salud
2004 identifico estos metabolitos secundarios en Mansoa alliacea ajo sacha, sin
embargo no se reporte el rendimiento por lo que la diferencia porcentual de contenido
entre ambas especies del gnero Mansoa pueda ser la causa de que el extracto en prueba
no presente efecto antimicrobiano. Tambin podra ser que, por el contenido de fenoles y
taninos pueda presentar actividad antisptica.
63
Los resultados hallados en el presente estudio no coinciden con los reportados por otros
investigadores es probable que la especie Mansoa alliacea ajo sacha presente
variaciones en sus componentes y en el porcentaje de los mismos segn el suelos donde
se desarrolla y tambin podra deberse al desarrollo del individuo muestreado.
Es importante evaluar la actividad antibacteriana empleados extractos de diferente
polaridad y evaluar los diferentes mtodos que miden la actividad antibacteriana, que
permita comparar los resultados obtenidos por los diferentes mtodos.
64
CONCLUSIONES
En el presente estudio se encontr que los extractos etanlicos y acuoso de las hojas de
Mansoa alliacea ajo sacha no presentaron la esperada actividad antibacteriana frente a
la cepa referencial de Escherichia coli ATCC 35218 y Staphylococcus aureus ATCC
29213.
Los resultados mostraron una diferencia de resultados en la actividad con otros extractos
probados de la especie Mansoa alliacea ajo sacha recolectada tambin en la Amazonia
Peruana pero de Madre de Dios,frente a bacterias referenciadas reportadas por otros
investigadores, quienes encontraron que el aceite esencial presentaba actividad
antibacteriana, sin embargo comparando la CM reportado para Staphylococcus aureus
ATCC 6535 (10mg/mL) con la clasificacin de la actividad antimicrobiana segn la
concentracin inhibitoria mnima, sera poco activo. Esta diferencia mnima de
resultados se debera a la diferente composicin de los extractos.
Dentro de las diferentes actividades reportadas por los resultados obtenidos en la

presente investigacin no se puede concluir que la actividad antibacteriana sea la
justificacin de su uso tan difundido en la medicina tradicional.
65
RECOMENDACIONES
Por la diferencia de resultados en la actividad antibacteriana es importante realizar otros

estudios de actividad frente a otros microorganismos, no solo del extracto crudo
hidroalcohlico y etanlico, sino que se debe incluir extractos con otros solventes de
diferente polaridad, as como de fracciones sobretodo del aceite esencial.
Evaluacin otros rganos de la especie Mansoa alliacea ajo sacha y por diferentes
mtodos para obtener una informacin ms precisa sobre la verdadera actividad.
66
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Concepcin Garca L. 2006. Actividad antimicrobiana de extractos
vegetales en cepas hospitalarias de Staphylococcus aureus con
Resistencia Mltiple. Tesis de Doctorado. Torren. Coahuila. Mxico.
Universidad Autnomona Agraria Antonio Narra. 5pp.
2. Lansing M. Prescott, John P. Harly y Donald A. Kleiin (2000).
Microbiologa. Ed 5ta, Editorial Mc Graw Hill Interamericana de
Espaa SAV. Espaa. 456-486 pp
3. Shiva Romayna C. 2007. Estudio de la actividad antimicrobiana de
extractos naturales y cidos orgnicos. Posible alternativa a los
antibiticos
promotores
de
crecimiento.
Barcelona.
Universitat
Autnoma de Barcelona. 1pp

4. Mori T., Ruiz E., Bardales J., Garca M., Tresierra A., Arvalo L.,
Bendayan M., Dvila C., Espinoza F., Reategui R., Angulo J., Quevedo
C., Zapata E. Efecto Antimicrobiano de Myrciaria dubia camu camu
y Cyperus luzulae piripiri sobre microorganismos patgenos. Iquitos
Per (Internet). 2010. (Citado el 30 de abril del 2014); 4.
Disponible en:
http://www.unapiquitos.edu.pe/oficinas/iiunap/archivos/2009/biologia/
ARTICULO-TERESAMORI.pdf
5. Olivera M, Flores J., Vsquez T, Ocsa E. 2013. Propiedades fisicoqumicas y
bioactivas in vitro del aceite esencial de Mansoa alliacea (LAM.) A. Gentry. El
Ceprosimad. 2(1): 96-102pp
67
6. LA INSIGNIA, Rev. 2004. Tcnicas de Comprobacin de Actividad

Teraputica. Buenos Aires Argentina. (Citado el 30 de noviembre de
2013)
Disponible en: http://www.lainsignia.org/2004/julio/soc022.htm
7. Seguro Social de Salud ESSALUD. 2004. Instituto de Medicina
Tradicional IMET. Estudios Pre Clnicos de Mansoa alliacea Ajo
sacha. 65pp
8. Atalaya E. 2004. Extractos vegetales y su influencia en la eficacia y
control preventive del hongo Colletotrichum sp. Inductor de la
Antracnosis del fruto de tumbo (Pasiflora quadrangularis l.) en
Iquitos. Tesis para optar el ttulo de Ing. Agrnomo. FA UNAP.
9. Villacres J. 2003. Eficacia de extractos vegetales en el control de
Colletotrichum spp. Inductor de la Antracnosis en cultivos hortcolas,

Iquitos-Per. Informe Final proyecto de Investigacin. FA UNAP.
19pp.
10.
OMS. 2002. Estrategia de la OMS sobre medicina tradicional. 56
ASAMBLEA MUNDIAL DE LA SALUD (Citado el 20 de enero de 2014)

Disponible en:
http://www.who.int/iris/bitstream/10665/95008/1/9789243506098_spa.pd
apps.who.int/gb/archive/pdf_files/WHA56/sa5618.pdf
11. Rosales C., V. et al. 2002. Evaluacin farmacolgica de Pluchea
carolinensis. Jacq. (Salvia de playa) en animales de experimentacin.

Instituto Superior de Ciencias Mdicas de Santiago de Cuba. (Citado
el 20 de enero de 2014)
Disponible en:
68
http://www.scielo.sld.cu/scielo.php.?pid=S102847861999000200004&Script=sci_arttext%ting=es
12. Mostacero LJ, Meja CF y Gamarra O. 2002. Taxonoma de las
Fanergamas tiles del Per. Volumen II. CONCEYTEC. Trujillo
Per. Pp
13. Mont R. 2002. Manejo integrado de enfermedades de las plantas.
Ministerio de Agricultura Servicio Nacional de Sanidad Agraria.
Lima Per. 210pp.
14. Villacres J. 2001. Recursos botnicos de la Amazona Peruana con
potencial biocida. Congreso de Botnica, Iquitos, Per.
15. Stauffer B.A., Rrego FA. Aquino J. A. 2000. Seleccin de extractos
vegetales con efecto fungicida y/o bactericida. Revista de ciencia y
Tecnologa de la Direccin de Investigaciones de la UNA Vol. 1, N. 2.
Facultad de Ciencias Agrarias. Departamento de Proteccin Vegetal.
Div. Fitopatologa. (Citado el 20 de enero de 2014)
Disponible en: Diuna@sce.ene.una.py
16. Ramos
L.
2000.
Control
de
la
Cercosporiosis
(Cercospora
longissimma Sacc) de la lechuga con extractos de ajo sacha. Tesis Ing.

Agrnomo. UNAP. Iquitos Per. 110 pp.
17. Meja, K.; Rengifo, E. 2000. Plantas Medicinales de uso popular en la
Amazona Peruana. Agencia Espaola de Cooperacin Internacional
(AECI). 2da. Edicin. Lima Per. 284 pp.
18. Instituto Peruano de Seguridad Social. IPSS. 1995. Plantas
Medicinales de la Amazona Peruana. Instituto de Medicina
Tradicional. Iquitos Per. Pp. 34, 35.
69
19. Brack. E. A. 1999. Diccionario enciclopdico de Plantas tiles del

Per. Programa de las Naciones Unidas para el Desarrollo. Centro de
Estudios Regionales Andinos Bartolom de las Casas. Cusco Per.
Pp 463, 464.
20. Brack. E. A. 1999. Diccionario enciclopdico de Plantas tiles del
Per. Programa de las Naciones Unidas para el Desarrollo. Centro de
Estudios Regionales Andinos Bartolom de las Casas. Cusco Per.
550 pp.
21. Hoss R. 1999. Recursos botnicos con potencial biocida: conceptos
bsicos y mtodos de anlisis. Editorial RAAA. Lima Per 70 pp.
22. Ahmed S, Grainge M, Hilin JW, Michael WC y Litsinger JA. 1985.
Some promising plant species for use as pest control agents under
tradition al farming systems. Natural pesticides from the Neem tree
(Azadirachta indica A Juss) and other tropical plants. GTZ. 565 pp.
23. Shiva Ramayoni C. Estudio de la Actividad Antimicrobiana de
extractos naturales y cidos orgnicos. Posible alternativa a los
antibiticos promotores de crecimiento. Tesis de Doctorado. Barcelona,
Espaa. Universitat Autnoma de Barcelona. 2007. 13pp.
24. Citado el 05 de Junio del 2014
Disponible en:
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/muellerhintoncaldo.h
tm.
Disponible en:
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/tripteinasoyagar.ht
m
70

Disponible en:
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/muellerhintonagar.
htm
Disponible en:
http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_sulf%C3%BArico
71
ANEXOS
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
ESQUEMA GENERAL DEL TRABAJO
1. Recoleccin.- Identificacin Taxonmica

2. Acondicionamiento Seleccin Secado
3. Maceracin de planta seca en diferentes solventes:
Hidroalcohlico y etanlico.
Filtrado y obtencin de extracto hidroalcohlico y

etanlico seco (rota vapor)
Mtodo de Macrodilucin en
Caldo Mueller - Hinton
RESULTADOS
86

Tesis. Trabajo

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AO DE LA DIVERSIFICACIN PRODUCTIVA Y DEL

ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO

Le agradezco a DIOS por haberme acompaado y guiado a lo largo de mi Carrera,

A la Universidad Nacional de La Amazonia Peruana y a la Facultad de Farmacia y

la oportunidad de estudiar y ser un profesional Qumico

Al Instituto de Medicina Tradicional (IMET-ESSALUD), por habernos prestado sus

ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO HIDROALCOHLICO Y ETANLICO

Bach. FLORES MEZGER, TANIA AILEEN

En la presente investigacin se determin la actividad antimicrobiana de los extractos:

Palabras claves: Actividad antibacteriana, Mtodo de tubos mltiples, Escherichia coli,

ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF HYDROALCOHOLIC EXTRACT AND ETHANOLIC

Bach. FLORES MEZGER, TANIA AILEEN

Key words: Antibacterial activity, Method of multiple tubes, Escherichia coli,

1.2. MARCO CONCEPTUAL

1.2.1. ESPECIE BOTANICA: Mansoa alliacea ajo sacha

A. Clasificacin Taxonmica de Mansoa alliacea (Ajo sacha)

B. Distribucin Geogrfica y Hbitat

1.2.2. RESISTENCIA BACTERIANA A LOS ANTIBITICOS

1.2.3. MTODO DE DETERMINACIN DE

A.1.3.1. Preparacin del inculo

A.1.3.2. Inoculacin de las placas

A.1.3.3. Dispensacin de los discos

A.1.3.4. Lectura de los resultados

A.1.4. Antimicrobianos seleccionados

A.1.5. Control de calidad

A.2. Mtodo del Epsilon Test

A.2.1. Indicaciones y Limitaciones

A.2.3.1. Preparacin del inoculo.

A.2.3.2. Inoculacin de las placas.

A.2.3.3. Dispensacin de las tiras.

A.2.3.5. Lectura de los resultados.

A.2.4. Control de calidad

A.2.5. Interpretacin de Resultados

B.1. Dilucin en agar

B.2. Dilucin en caldo

B.2.1. Mtodo de Macrodilucin.

B.2.2. Mtodo de Microdilucin.

B.3. Correlacin de los resultados.

B.4. Control de calidad.

B.5. Informe de Resultados

1.2.5. CEPAS DE REFERENCIA

1.2.5.1. Escherichia coli

1.2.5.2. Staphylococcus aureus

1.5.1. Variable independiente

1.5.2. Variable dependiente

2.1. TIPO DE INVESTIGACIN

2.2. DISEO DE INVESTIGACIN

2.3. POBLACIN Y MUESTRA

2.5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Las infecciones es un problema de salud pblica en los pases en va de desarrollo de

En el perfil de salud pblica, la resistencia bacteriana es un tema de importancia; pues

En la prctica de la medicina moderna es alarmante la resistencia de los

En las poblaciones rurales donde la accesibilidad o disponibilidad de antimicrobianos es

Por ello, el conocimiento de los perfiles de susceptibilidad antimicrobiana de Mansoa

Por lo que en el presente trabajo se determin la actividad antibacteriana del extracto

ajo sacha, sobre

Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

hidroalcohlico y etanlico de Mansoa alliacea ajo sacha, sobre

Las enfermedades ocasionadas por diversos agentes patgenos e inadecuados estilos de

Adems, la aparicin de cepas resistentes a los frmacos tradicionales ha dado origen a

para el beneficio de la poblacin y la

sustancia plaguicida primaria. Tambin informa que el extracto acuoso de polvo de

Staufferet al. (2000), reportaron que extractos de 98 especies vegetales pertenecientes a

. Este mismo autor indica que las evaluaciones fueron