Manual 2014 Bioquimica General Medicina

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ
INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO BIOLGICAS
ACADEMIA DE BIOQUMICA
MANUAL DE PRCTICAS DE BIOQUMICA GENERAL PARA

MEDICINA (PLAN 2014).
Documento modificado, actualizado y revisado por:

M. en C. Leny Judith lvarez Araujo
M. en I. Edith Enrquez Gallosa
Docentes y Tcnicos Acadmicos de la Academia de Bioqumica
Vo.Bo.:
Dra. Laura Alejandra de la Rosa Carrillo
Coordinador de la Academia de Bioqumica
Autorizado por:
Ph.D. Alejandro Martnez Martnez
Jefe del Departamento de Ciencias Qumico Biolgicas
Cd. Jurez Chihuahaua

Revisin Enero del 2015
Manual de Prcticas de Laboratorio de Bioqumica General 1997
Instituto de Ciencias Biomdicas
Universidad Autnoma de Ciudad Jurez
Semestre regular Enero Mayo 20XX

Semestre regular Agosto Noviembre 20XX
Curso de Verano Junio Julio 20XX
NOMBRE DEL ALUMNO____________________________________

MATRICULA
____________________
HORARIO DE TEORIA
____________________
HORARIO DE LABORATORIO_______________
GRUPO DE LABORATORIO _________________
NUMERO Y/O NOMBRE DEL EQUIPO ______________________
INDICE
PROLOGO................................................................................................................................... I
PRESENTACIN......................................................................................................................... II
REGLAS PARA LOS ALUMNOS QUE ASISTEN A LOS LABORATORIOS DE BIOQUMICA....III
INSTRUCCIONES PARA EL USO DE ESTE MANUAL...............................................................V
PRCTICA # 1............................................................................................................................. 1
BIOSEGURIDAD Y MANEJO INTEGRAL DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA.......................1
PRCTICA # 2............................................................................................................................. 8
ESTRUCTURA Y CLASIFICACIN DE AMINOCIDOS Y PROTENAS....................................8
PRCTICA # 3........................................................................................................................... 18
ANLISIS ENZIMTICO CUALITATIVO....................................................................................18
PRCTICA # 4........................................................................................................................... 23
CINTICA ENZIMTICA 1: EFECTO DE LA CONCENTRACIN DEL SUSTRATO.................23
SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA.......................................................................................23
PRCTICA # 5........................................................................................................................... 28
CINTICA ENZIMTICA 2: EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA............................................28
PRCTICA # 6........................................................................................................................... 33
DETERMINACIN DE UREA Y CREATININA SRICA.............................................................33
PRCTICA # 7........................................................................................................................... 39
EXTRACCIN DE GLUCGENO Y REACCIONES DE IDENTIFICACIN DE
CARBOHIDRATOS.................................................................................................................... 39
PRCTICA #. 8.......................................................................................................................... 45
CUANTIFICACIN DE COLESTEROL SRICO.......................................................................45
PROLOGO
El siguiente manual ha sido modificado de acuerdo a las necesidades de la nueva Curricula 2014 de la
carrera de Medicina, por lo que se espera que el alumno aproveche en su totalidad la informacin aqu
presentada.
El curso de Bioqumica General se imparte en el Instituto de Ciencias Biomdicas como parte del
programa integral del Departamento de Ciencias Qumico Biolgicas y se requiere del curso de
Fisicoqumica como materia antecedente.
En este curso se presenta una completa orientacin hacia el rea Mdica en donde se correlacionan
aspectos del metabolismo integral con las funciones especficas de los rganos y sistemas con un
carcter muy fundamental teniendo en cuenta que dichas funciones se tratarn con mayor detalle en las
nosologas y las clnicas respectivas.
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PRESENTACIN
Uno de los aspectos fundamentales de la enseanza de materias correspondientes al rea de las
Ciencias Bsicas, es que el estudiante debe de comprender los elementos tericos revisados. Con el fin
de reafirmar dichos conocimientos es necesario que los practique en el Laboratorio y como consecuencia
reciba los refuerzos apropiados y al final de dicho curso este compenetrado con la materia analizada.
En la Academia de Bioqumica siempre ha existido el inters de que los alumnos que cursen dichas
materias tengan la capacidad de comprender los fenmenos moleculares tanto a nivel celular como del
organismo.
El individuo que se dedique a la investigacin y/o a la enseanza de la Bioqumica, debe de estar
convencido de que el ensayo de formas ms eficientes de involucrar al alumno en el estudio de sta
interesante rea, es la nica manera de evolucionar positivamente en la investigacin y en la excelencia
acadmica.
Este manual de prcticas es el resultado del esfuerzo comn de la Academia de Bioqumica, con el nico
fin de fomentar la interrelacin de los conocimientos tericos con la actividad prctica, de una manera
ms organizada, en aras de un mayor aprovechamiento de la enseanza Bioqumica. En base a este
pensamiento, nos comprometimos a elaborar el "Manual de Prcticas de Laboratorio de Bioqumica
general" el cual esperamos sea til durante los cursos de Bioqumica.
En este Manual se pretende dar al alumno una informacin bsica, que lo motive a desarrollar un diseo
experimental predeterminado y a deducir por medio del anlisis objetivo de los resultados, las posibles
implicaciones que se tengan para demostrar un hecho que fue discutido previamente en la clase terica.
Agradecemos la cooperacin y el apoyo recibido por parte de las autoridades Universitarias para lograr la
publicacin de este Manual.
Atentamente Comisin Elaboradora

Academia de Bioqumica
M.C. Hctor Reyes Leal

Q.F.B. Gilberto Reyes Leal
Q.F.B. Graciela Manjarrez G.
Q.B.P. J. ngel Araujo
Biol. Hctor Esparza Valencia

Biol. Daniel Chvez Licn
Q.B.P Jorge Bayln Monrrez
Dr. David Reyes Ruvalcaba.
Q.B.P. Oscar Barrozo
1997
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REGLAS PARA LOS ALUMNOS QUE ASISTEN A LOS LABORATORIOS DE

BIOQUMICA.
1. - Al inscribirse en la materia queda automticamente inscrito en un grupo de Laboratorio. El maestro
no est facultado para realizar cambios de grupo y/o permutas.
1. - La asistencia a los laboratorios es obligatoria y debern presentarse con un
retardo no mayor
de 10 min. de la hora de entrada.

2. - Para tener derecho a calificacin final del laboratorio se requiere un 80 % de
asistencias.
3. - Toda falta a la prctica equivale a cero en su reporte.

4. - Es obligatorio presentarse con bata blanca de manga larga a las sesiones de laboratorio.
5. - Durante las sesiones de laboratorio queda estrictamente prohibido fumar e ingerir alimentos.
7.- En caso de reprobar el laboratorio, automticamente queda reprobado en la clase de teora.
8.- La calificacin final de laboratorio corresponde al promedio obtenido en las prcticas, exmenes y
trabajo en el laboratorio.
9.- Los reportes de la semana se entregarn obligatoriamente en el horario establecido por el maestro.
La aceptacin extempornea de reportes queda a consideracin del docente. El Reporte es individual.
10.- Los reportes ya calificados, se devolvern a la semana siguiente.
11.- El material que sea daado por el alumno, deber reponerse antes de finalizar el curso acompaado
con la factura de compra. De no ser as no se condicionar la calificacin del alumno.
12.- Si parte del material es daado o se pierde y se desconoce al responsable, el material ser
repuesto por el grupo asistente a la prctica.
13.- Se realizarn los exmenes de laboratorio pertinentes en las fechas indicadas en la calendarizacin
de la academia.
14.- Es obligacin del alumno entregar el material limpio cada vez que termine su prctica.
15.- Se recomienda mantener limpia su mesa de trabajo y guardar el mayor orden posible.
16.- El alumno se deber comprometer a regresar el material en las mismas condiciones en que lo
recibieron.
17.- Los reportes o bitcora se calificarn en base a los acuerdos de la academia, teniendo mayor peso
los siguientes apartados:
A)
Resultados
B)
Discusin
C)
Conclusiones
D)
Cuestionario
E)
Bibliografa
El maestro detallar la forma de reportar dentro del encuadre, el da de la recepcin del grupo.
Incluyendo el trabajo experimental y la discusin y participacin en la prctica.

18.- Es obligacin del alumno investigar sobre el tema de la prctica previa realizacin de sta, en caso
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de presentarse sin haber estudiado se considerar como falta de inters, afectando la calificacin de la
participacin de la misma.
19.- De igual manera, para aqul alumno que no se prepare para la discusin de las prcticas, se ver
afectado en la parte de su calificacin de correspondiente a la misma.
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INSTRUCCIONES PARA EL USO DE ESTE MANUAL

Con la idea de que el alumno pueda manejar de manera ms eficiente este Manual se hacen las
siguientes recomendaciones:
1.- Al principio del Manual se incluye un ndice de las prcticas a realizar, que permite su rpida
localizacin.
2.- La secuencia de prcticas, est en funcin de los programas de teora y cabe aclarar que en la
primera sesin se les indicar cuales prcticas se van a realizar durante el semestre.
3.- Todas las prcticas estn subdivididas en dos partes:
a) Incluye la descripcin metodolgica de la prctica, que a su vez se subdivide en:
- Ttulo de la prctica
- Objetivo de la prctica
- Prerrequisitos
- Introduccin
- Material y Mtodos
b) Contiene los elementos correspondientes al reporte de la prctica y se subdivide en:
- Resultados
- Discusin
- Conclusiones
- Cuestionario
- Bibliografa consultada
4.- A continuacin se mencionan algunos aspectos significativos de cada uno de
estos elementos:
a) Ttulo de la prctica.- Indica el nombre de la prctica y la de manera especfica de lo

que se va a realizar durante la sesin.
b) Objetivo de la prctica.- Seala lo que se espera que el alumno logre al trmino de
esta.
c) Prerrequisitos.- Comprende una serie de puntos, que el alumno debe de conocer su
significado con anterioridad a la explicacin de la prctica, para lo cual se recomienda
consultar la bibliografa recomendada al final de este Manual.
d) Introduccin.- Informacin bsica y muy breve, referente a la prctica a realizar.
e) Mtodos y Materiales.- Es la descripcin del desarrollo de la prctica, sealando el
equipo, cristalera y soluciones a utilizar en la prctica.
Es importante que el alumno entienda la secuencia del desarrollo antes de iniciar el
experimento, por lo cual es necesario que se lea antes de la sesin de explicacin de la
prctica, para que pueda consultar sus dudas con el Docente.
f) Resultados.- En esta seccin se anotan los datos obtenidos durante la sesin de la
prctica, de acuerdo a las indicaciones tanto del Manual como del Profesor.
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h) Discusin.- Es una de las partes principales de todo experimento, ya que consiste en

realizar un anlisis comparativo de los resultados esperados con respecto a los
obtenidos, llevando a cabo la argumentacin necesaria de dichos resultados.
i) Conclusiones.- En base a los resultados obtenidos y a la discusin desarrollada,
concluir cuales son los puntos principales y que consecuencias a futuro plantean esta
prctica.
j) Bibliografa consultada.- En este punto se deben incluir las referencias bibliogrficas
de los libros o artculos consultados, de acuerdo a los siguientes lineamientos:
En el caso de revistas:
Nombre(s) del autor(es), (ao), Ttulo del artculo Nombre de la Revista,
Volumen, Pginas consultadas
En el caso de libros:
Nombre(s) del autores), (ao), Nombre del captulo. Nombre del libro.
Editorial. Edicin. Pas. Pginas consultadas.
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PRCTICA # 1
BIOSEGURIDAD Y MANEJO INTEGRAL DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA
OBJETIVO:
El alumno aprender acerca de la normatividad que rige en el laboratorio de bioqumica para
evitar cualquier riesgo de accidente y trabajar de forma segura, as como de los materiales, equipo,
reactivos y de los usos adecuados de los mismos.
PRERREQUISITOS:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Diferencias entre regla, reglamento, norma y ley.

Diferencia entre ley y costumbre.
Organismos que rigen las normatividades.
Normas involucradas en la seguridad de los laboratorios.
Conocimientos sobre soluciones, diluciones y mezclas.
Diferencia entre fotocolormetro, colormetro y espectrofotmetro.
Definiciones y diferencias entre soluciones Molar, Normal y % w/v.
INTRODUCCIN:
Bioseguridad es una palabra compuesta por bio (del latn que significa vida) y seguridad (del
latn securitas que significa ausencia de riesgo).
El riesgo es la vulnerabilidad ante un dao para personas, cosas y/o el medio ambiente. Existe una
variedad de riesgos en los que se encuentran los riesgos fsicos, qumicos, biolgicos, ambientales,
laborales, financieros, polticos, etc.
Sin embargo, en el trabajo dentro de un laboratorio, el nivel de seguridad depende del grupo de riesgo.
De acuerdo al manual de la Organizacin Mundial de Salud (2005), hace referencia al grupo de riesgo
con el nivel de bioseguridad y el tipo de laboratorio en que se trabaje, incluyendo como una
consecuencia las prcticas de laboratorio y el equipo de seguridad a utilizar, como se establece en la
tabla 1.
En los laboratorios de docencia mismos en los que se encuentra clasificado la academia de bioqumica
de esta Institucin (UACJ), el material y el equipo debern contar con un manual de procedimientos para
el uso adecuado de los mismos y en consecuencia evitar riesgos posibles de accidentes o incidentes que
puedan daar al personal y al mismo tiempo al material y equipo en cuestin.
En el manejo de sustancias qumicas reactivas tambin se encuentran presentes los riesgos, es por eso
que de acuerdo a la Secretaria de Trabajo y Prevencin Social en su Norma 018-STPS-2000 y al
programa de Comunicacin de Riesgos de la OSHA (Occupational Safety and Health Administration), ha
sido implementado el uso de las hojas de uso seguro de los materiales o material safety data sheet
(MSDS por sus siglas en ingles), mismas que estn al alcance de todo el personal usuario.
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Cada sustancia que se maneje en los laboratorios deber estar debidamente etiquetada y referenciada
con un esquema el cual manifiesta el grado de riesgo de las sustancias qumicas. Mismo con el cual
podemos identificar rpidamente el tipo de riesgo al que estamos expuestos (Figura 1).
Tabla I Relacin de los grupos de riesgo con los niveles de bioseguridad, las prcticas y el equipo. OMS (2005)
Grupo
de Nivel
de Tipo de laboratorio
Prcticas de laboratorio
Equipo de seguridad
riesgo
bioseguridad
1
Bsico
Enseanza bsica,
investigacin
TMA
(Tcnicas
Microbiolgicas Apropiadas)
Ninguno; trabajo en mesa

laboratorio al descubierto
de
Servicios
de
atencin primaria;
diagnstico,
investigacin
TMA y ropa protectora; seal

de riesgo biolgico
Trabajo en mesa al descubierto y

CSB (Cmara de Seguridad
Biolgica) para posibles aerosoles
Diagnstico
especial,
investigacin
Prcticas de nivel 2 ms ropa

especial, acceso controlado y
flujo direccional del aire
CSB adems de otros medios de

contencin primaria para todas las
actividades
Unidades
patgenos
peligrosos
Prcticas de nivel 3 ms
cmara de entrada con cierre
hermtico, salida con ducha y
eliminacin
especial
de
residuos
CSB de clase iii o trajes

presurizados junto con CSB de
clase ii, autoclave de doble puerta
(a travs de la pared), aire filtrado
Nivel 1
2
Bsico
Nivel 2
Contencin
Nivel 3
Contencin
mxima
Nivel 4
Figura 1 Rombo de riesgos qumicos
El Sistema de Comunicacin de Riesgos (Right To Know) muy utilizado en los E.U.A. nos refiere de
manera explcita de los riesgos y daos a los cuales estamos expuestos por el manejo de una sustancia
y qu equipo de proteccin personal se debe de utilizar. Aqu en Mxico la Secretaria de Trabajo y
Previsin Social tambin se preocupa por los riesgos ocupacionales de los diferentes centros de trabajo
junto con la Secretaria de Salud, por lo que tambin existen sealizaciones para determinar las reas de
trabajo, puertas de acceso, y salidas, reas despejadas, cdigo de tuberas para sustancias que corran
en ellas, etc. Es por eso que es muy importante tomar en cuenta las barreras de proteccin y el tipo de
ellas, segn su clasificacin: fsica, qumica y biolgica.
Tambin es importante hacer hincapi en el manejo apropiado de los desechos de las sustancias
qumicas, tejidos, agares y material peligroso biolgico infeccioso (RPBI), que se manejan en los
laboratorios los cuales son vigilados por la SEMARNAT ya que estos son dispuestos al medio ambiente,
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llmese agua (a los drenajes que a pesar de llegar a una planta de tratamiento de agua residuales en
algunas ocasiones, estas siguen su curso a canales de irrigacin y/o acequias para riego de cultivos y
por ende al subsuelo), cielo abierto (por la emisin de los gases y que contaminan el aire que
respiramos) o tierra (con la disposicin de los residuos slidos que impactan a el medio alterando los
ciclos naturales biolgicos).
Los residuos RPBI, son aquellos que se generan durante las actividades asistenciales a la salud de
humanos o animales en los centros de salud, laboratorios clnicos o de investigacin, bioterios, centros
de enseanza e investigacin, principalmente; que por el contenido de sus componentes puedan
representar un riesgo para la salud y el ambiente.
De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, son considerados los
siguientes como se muestra en la tabla 2:
Tabla II Caractersticas fsicas y biolgicas de los residuos infecto-contagiosos
TIPO DE RESIDUO
EDO. FSICO
ENVASADO
COLOR
Sangre
Cultivos y cepas de agentes
infecciosos
Patolgicos
Lquidos
Recipientes hermticos
Rojo
Slidos
Bolsa de polietileno
Rojo
Slidos
Amarillo
Lquidos
Amarillo
Slidos
Rojo
Lquidos
Recipientes
rgidos
poliprolileno
Rojo
Residuos no anatmicos
Objetos punzocortantes
Slidos
Rojo
Manejo Integral de un Laboratorio
Por otro lado, para llevar a cabo un experimento en cualquier laboratorio obteniendo los mejores
resultados, es necesario que se manejen tcnicas bsicas de experimentacin tales como se indica a
continuacin, de acuerdo a los procedimientos de manejo y a la clasificacin del material y el equipo
- Tcnicas de medicin de lquidos.
- Tcnicas de pesado de slidos.
- Tcnicas de separacin de lquidos y slidos.
- Tcnicas de cuantificacin de lquidos y slidos
- Tcnicas de mezclado de lquidos y slidos.
Todas estas tcnicas se relacionan con frecuencia con las actividades que cotidianamente se llevan a
cabo en el laboratorio de Bioqumica. Es importante dentro del trabajo de un laboratorio tomar en cuenta
conceptos tales como precisin, exactitud y confiabilidad.
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De acuerdo al Centro Espaol de Metrologa

Exacto: es la capacidad de obtener valores o indicaciones prximas al valor verdadero de la magnitud
medida es decir, ser ms exacto cuanto ms pequeo sea el error sistemtico de medida
Preciso: es la capacidad de obtener valores o indicaciones prximas entre s al efectuar mediciones
repetidas, ser pues ms preciso cuanto menor sea la dispersin que presentan entre s los sucesivos
resultados obtenidos Por lo que podemos tener 4 tipos de resultados:
1._ Exacto y preciso: Resultados muy prximos entre s, con un valor medio muy cercano al valor
verdadero.
2._ Exacto pero no preciso: Valor medio muy cercano al valor verdadero, pero gran dispersin de los
resultados en torno al valor medio.
3._ Preciso pero no exacto: Resultados muy prximos entre s pero valor medio alejado del valor
verdadero.
4._ Ni preciso ni exacto: Gran dispersin de los resultados en torno al valor medio y valor medio alejado
del valor verdadero.
De acuerdo a la Escuela Colombiana de Metrologa
Confiabilidad: Es cuando los resultados obtenidos son iguales a los pronosticados.
Para la medicin de lquidos:
Los instrumentos ms utilizados son: pipetas (serolgicas y volumtricas), buretas, probetas y
matraces volumtricos o aforados. Estos materiales de vidrio pueden modificar la exactitud de la
medicin debido a cambios extremosos de temperatura. La temperatura promedio de trabajo es de 25
C.
Para el pesado de slidos:
El equipo utilizado son las balanzas granatarias, analtica y hace muchos aos las de torsin.
Las balanzas de granatarias son tiles en el laboratorio de bioqumica como una herramienta para el
buen uso de la centrfuga, ya que para equilibrar los tubos de centrfuga siempre debe hacerse en base
al peso y volumen del contenido.
Para la separacin de lquidos y slidos:
Se encuentran todas las centrfugas (clnicas y micro centrfugas), donde se separan las fases
diferentes a alta velocidad, quedando en la base del recipiente contenedor el sedimento y la porcin
lquida en la parte superior como sobrenadante.
Para la cuantificacin de lquidos y slidos:
Los fotmetros, colormetros y especialmente los espectrofotmetros son los equipos
mayormente usados en la cuantificacin de soluciones, donde dependiendo de la cantidad de los solutos
dan una turbidez o coloracin que detectan estos aparatos a una longitud de onda. Estas soluciones
estn basadas en el mezclado de lquidos y slidos.
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Mezclado de lquidos y slidos:

Las soluciones normales, molares y porcentuales as como los diferentes tipos de diluciones son
las mezclas ms utilizadas en el laboratorio. Frecuentemente, las soluciones involucran mezclas de
slidos en lquidos o de lquidos en lquidos en tanto que las diluciones solo involucran mezclas lquidos
en lquidos. De la destreza con que se lleven a cabo estas mezclas depende el buen resultado de la
experimentacin en el laboratorio.
El propsito de esta parte de la prctica, es evaluar la capacidad de cada alumno para la
aplicacin de todas las tcnicas antes descritas, que son una base importante para el desarrollo de
prcticas posteriores.
MATERIAL:
a) En lo referente a bioseguridad, normas aplicables a el uso y manejo de laboratorios
b) En lo referente al material y equipo:
1. 1 pipeta de 10 ml
2. 1 pipeta de 5 ml
3. 1 pipeta de 2 ml
4. 1 pipeta de 1 ml
5. 1 pipeta de 0.5 ml
8. 1 micropipeta de 10 a 100 microlitros
9. 1 micropipeta de 100 a 1000 microlitros
10. 1 probeta de 100 ml
13. 1 bureta de 50 ml
14. 1 matraz Erlenmeyer de 125 ml
15. 1 balanza granataria
16. 1 espectrofotometro
METODOS:
Investigacin y experimentacin
Procedimientos:
A.
Investigue en las diferentes referencias impresas o computarizadas el marco terico
sobre el cual se sustenta la minimizacin de los riesgos para la realizacin del trabajo
seguro en cualquier laboratorio
B.
En presencia del maestro, haga un listado de todo el material del laboratorio de
acuerdo a su material de elaboracin, e investigue la funcin de cada uno de ellos, por
ejemplo:
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Cristalera
Tubos de ensaye
Pipetas serolgicas
Pipetas volumtricas
Matraces Erlenmeyer
etc.
Porcelana
Morteros con pistilos
Metlico
Soporte universal
Gradilla
Pinzas para bureta
Funcin
-
Haga lo mismo para el equipo localizado en el laboratorio

C. En equipos de trabajo segn lo indique el maestro, irn los alumnos conociendo,
manipulando y a su vez comparando todo el material que requieran para hacer los
siguientes experimentos.
Medicin de lquidos._ Utilizando pipetas serolgicas de diferentes volmenes
y en presencia del profesor, seleccione la pipeta adecuada para hacer las
siguientes mediciones:
a) 0.05 ml
b) 5 dcimas de mililitro
c) 2.4 ml
b) d) 5.6 ml
e) 9.8 ml
As mismo, utilizando la probeta adecuada mida tambin los siguientes volmenes:
a) 28 ml
b) 125 ml
c) 265 ml
Utilizando la probeta de 100 ml, llene hasta 50 ml y vaci a la bureta y

posteriormente vaci al matraz Erlenmeyer de 125 ml. Observe y registre todos
los detalles del proceso
Medicin de slidos._ Utilizando la balanza granataria y en presencia del

profesor, realice las siguientes pesadas:
a) 1.5 g
b) 5.5 g
c) 9.8 g
d) 27.5 g
e) 60 g
Cuantificacin de lquidos y slidos
Diluciones dobles._ Utilizando una solucin madre de permanganato de potasio,
realice las siguientes diluciones de tal manera que contenga un volumen total de
4 ml:
a) Dilucin 1:2
b) dilucin 1:4
c)dilucin 1:8 d) dilucin 1:16
Mida en el espectrofotmetro la absorbancia de cada dilucin a una longitud de onda de

520 nm. Registre sus absorbancias.
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Mezclado de lquidos y slidos

Soluciones._ Utilizando un reactivo slido que indique el profesor, prepare las
siguientes soluciones:
a) Solucin 1.5% peso/volumen
b) Solucin 0.1 molar
c) Solucin 0.5 normal
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Una vez hechas las soluciones, proceda a medir las absorbancias en el

espectrofotmetro a la longitud de onda que le indique el profesor. Registre los valores
de absorbancia.
Separacin de lquidos y slidos

De las soluciones anteriores coloque 5 ml de cada una de las soluciones en
tubos de ensaye y coloque un cuarto tubo con 5 ml de agua destilada,
centrifugue y observe y registre los resultados.
RESULTADOS:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
DISCUSIONES:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
CONCLUSIONES:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
BLIBLIOGRAFIA CONSULTADA:
Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. Organizacin Mundial de la Salud. Tercera Edicin.Ginebra
2005
Hanbook of Good Laboratory Practice (GLP). World Health Organization, TDR For Research on diseases
of poverty UNICEF UNDP World Bank Who. Switzeiland. Second Edition
Centro Espaol de Metrologa. www.cem.es/preguntas_frecuentes/
02-mayo-2013
Escuela Colombiana de Metrologa. Metrologa y Mecnica de Banco. Protocolo. Escuela Colombiana de

Ingeniera Julio Garavito, Edicin 2007-1 Pg. 12 02-mayo-2013
www.escuelaing.edu.co/programas/ing_industrial/.../metrologia.pdf
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PRCTICA # 2
ESTRUCTURA Y CLASIFICACIN DE AMINOCIDOS Y PROTENAS
OBJETIVOS:
1.- Al trmino de esta prctica el alumno ser capaz de diferenciar a los aminocidos utilizando tcnicas
colorimtricas ms comunes para identificarlos, as como, relacionar la estructura de los aminocidos
con su reactividad y sus funciones en el organismo.
2.- El alumno deber ser capaz de describir algunas de las tcnicas de deteccin cualitativa de protenas
en base a los componentes de su estructura.
3.- El alumno ser capaz de describir el efecto de los solventes sobre las propiedades electroqumicas de
las protenas de diferente PM de acuerdo a las siguientes variables:
a) Solubilidad de las protenas en diferentes soluciones de sales.
b) Propiedades electroqumicas de las protenas.
c) Efecto del cido actico sobre el punto isoelctrico de una protena.
PRERREQUISITOS:
1.- Conocer las caractersticas diferenciales de la estructura de los aminocidos.
2.- Identificar las diferencias y semejanzas de los aminocidos con otros monmeros (por ejemplo:
carbohidratos y lpidos).
3.- Identificar las propiedades qumicas en base a su polaridad.
4.- Definicin de Pptido, Polipptido y Protena.
5.- Clasificacin de las Protenas.
6.- Niveles de complejidad estructural de las Protenas.
7. - Salting In y Salting Out.
8.- Agentes precipitantes de protenas.
9.- Propiedades fisicoqumicas del agua.
10.- Ecuacin de Henderson/Hasselbach.
INTRODUCCIN:
AMINOCIDOS
Los aminocidos son los monmeros que dan la estructura de los polmeros conocidos como
protenas o polipptidos. Existen cientos de aminocidos, pero solo 20 de ellos son los principales
componentes de las protenas, a estos se les conoce como aminocidos naturales, los cuales poseen las
siguientes caractersticas estructurales (Koolman & Rhm, 2004) (Figura 1):
Contienen un carbn asimtrico (con excepcin de la glicina) llamado carbono alfa. Al cual se le unen
cuatro radicales que son:
- un grupo carboxilo (COO-)
- un grupo amino (+NH3)
- un tomo de hidrgeno (H)
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- un radical de composicin variable que permite diferenciar a los aminocidos (R). Llamado cadena
lateral.
Figura 1.- Estructura de un aminocido

El cuerpo humano es incapaz de sintetizar los 20 aminocidos requeridos para la formacin de todas las
protenas y por lo cual partiendo de esta base, los aminocidos se dividen en: esenciales; porque es
necesario que el individuo ingiera en la dieta y no esenciales; los cuales son producidos por el propio
organismo y por lo tanto no es crtico si el individuo no los consume en su dieta.
Debido a las caractersticas fisicoqumicas de la cadena lateral, es posible relacionar su posicin, dentro
de la estructura proteica ya que si es de caractersticas no polares (hidrofbico), al contacto con el agua
tender a esconderse; o en su defecto, si es de caractersticas polares (hidroflico), tender a
interaccionar con el agua. Desde luego, para saber cul es la estructura de la cadena lateral debemos de
conocer cul es el pH de la solucin ya que dependiendo del pH la cadena lateral estar protonada (H+)
o desprotonada, este parmetro se puede conocer utilizando los pKa de cada aminocido y la ecuacin
de Henderson-Hasselbach lo cual permite determinar cul es la estructura predominante a un pH dado
(Voet & Voet, 2006).
Los cambios de carga dependen del pH en que se encuentre el aminocido, es decir, bajo condiciones
cidas el aminocido est totalmente protonado y en condiciones alcalinas est totalmente
desprotonado, esto se debe a que los aminocidos son cidos dbiles y por lo tanto tienen una constante
de disociacin por cada grupo o radical capaz de comportarse como cido o base dbil. Esto permite
conocer el punto isoelctrico de un aminocido, el cual se define como el pH en el cual la carga neta es
cero (Voet & Voet, 2006; Pea, et al, 2004).
PROTENAS
La unin de dos o ms aminocidos por uniones cido amida genera macromolculas lineales
que a partir de una longitud de cadena de aproximadamente 100 residuos de aminocidos se denominan
protenas (polipptidos). Las protenas estas compuestas por aminocidos naturales ordenados en una
secuencia discreta y unida entre s por enlaces peptdicos que siempre involucran los radicales amino y
carboxilo de cada aminocido, lo cual da lugar a un enlace covalente de tipo carbamida y que tiene
algunas caractersticas peculiares como (Koolman & Rhm, 2004):
a) El enlace C-N tiene cierto carcter de doble enlace, por lo cual le confiere rigidez a la molcula.
b) El oxgeno y el nitrgeno quedan en posicin trans.
c) Todos los elementos que componen el enlace se encuentran ubicados en el mismo plano.
d) La rotacin de la molcula formada queda restringida a los carbonos alfa.
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El proceso de la sntesis protica se da siempre en la clula, dnde los aminocidos se van uniendo
sucesivamente uno tras uno, solamente se utilizan los L-aminocidos. El grupo carboxilo de un
aminocido se une al grupo amino de un segundo aminocido, formando un enlace peptdico y
liberando agua (Mller Esterl, 2008) (Figura 2).
Figura 2.- Formacin de un enlace peptdico

La variabilidad de las protenas se debe a una serie de aspectos tales como: complejidad estructural,
residuos aminoacdicos que la forman, propiedades qumicas y fsicas y funciones especficas de cada
protena en el organismo que la contiene, estas protenas puede llegar a pesar hasta 5000 D (Daltons).
Toda organizacin estructural que implique determinado orden requiere de la presencia de una fuerza
estabilizadora, que en el caso de las protenas estara constituida por diferentes tipos de enlaces o
interacciones fsicas y qumicas que se enuncian en el cuadro siguiente (Mller Esterl, 2008; Voet &
Voet, 2006):
NIVEL DE ORGANIZACIN
ENLACES QUE LO MANTIENEN
Primario
Enlace peptdico
Secundario
Puentes de hidrgeno entre los elementos del enlace

peptdico
Terciario
Puentes de hidrgeno entre las cadenas laterales de los

aminocidos, interacciones hidrofbicas, electrostticas,
puentes disulfuro, enlace ster
Cuaternario
Los mismos que para el nivel terciario, ms las fuerzas

de Van der Walls
La complejidad estructural de las protenas se manifiesta desde el punto de vista funcional en una gran
diversidad de funciones biolgicas: Enzimas, protenas estructurales, de transporte, contrctiles, accin
hormonal, de reservas (Pea, et al., 2004).
En las protenas existen aminocidos hidrofbicos e hidroflico. Luego del doblamiento en solucin
acuosa, los aminocidos hidrofbicos usualmente se encuentran en reas protegidas, mientras que los
aminocidos hidroflico interactan con las molculas del solvente, permitiendo la formacin de puentes
de hidrgeno con las molculas de agua del medio. Si hay suficiente superficie hidroflica, la protena
puede ser disuelta en agua.
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PROPIEDADES DE LAS PROTENAS

Punto isoelctrico
La carga neta de las protenas depende del pH. En el punto de neutralidad (punto isoelctrico, pI) las
cargas acidas y bsicas de las cadenas laterales de la protena estn en equilibrio: la protena ya no se
desplaza a un campo elctrico.
La carga total de la molcula proteica depende pues, del pH de la solucin y del nmero relativo de cada
aminocido en la molcula. As, cuando el pH de la solucin es tal que la carga neta de la molcula
proteica es cero, es decir, cuando el nmero total de cargas negativas iguala al nmero total de cargas
positivas presentes en la molcula, se llama a este valor de pH, punto isoelctrico o pH isoelctrico.
Solubilidad de las protenas
La solubilidad de las protenas depende de la composicin inica del medio. Las protenas generalmente
no se disuelven bien en el agua pura, su solubilidad aumenta al incrementar la fuerza inica, ya que los
iones inorgnicos se unen a la superficie de la protena e impiden la agregacin de las molculas, a este
proceso se le conoce como Salting in o disolucin. Cuando la concentracin de sales aumenta an
ms, algunas de las molculas de agua son atradas por los iones salinos, lo cual disminuye la cantidad
de molculas de agua disponibles para su interaccin con la protena. Como resultado de esto, las
interacciones protena-protena se hacen ms fuertes que las interacciones protena-solvente por lo que
las protenas coagulan formando interacciones hidrofbicas entre ellas, proceso al cual se le conoce
como Salting-out (Koolman & Rhm, 2004; Pea, et al., 2004).
Mtodos para cuantificacin de protenas
Existen diversas tcnicas de deteccin y cuantificacin de protenas algunas ms complicadas que otras
y algunas ms confiables que otras. A continuacin se muestra una tabla con los mtodos ms utilizados:
Mtodo
Ventajas
inconvenientes
Mtodos de absorcin
No se pierden las muestras
Interfieren muchos
absorben en el UV
Bastante especfico para protenas
Tiene poca sensibilidad
compuestos
que
Mtodos Derivados Colorimtricos

Biuret
Muestra pocas interferencias

Es barato
Lowry
Tiene bastante sensibilidad
No todas las protenas reaccionan igual

Muestra muchas interferencias como
detergentes no inicos, sulfato amnico,
etc.
Bradford
Muy sensible
BCA
Muestra interferencias con detergentes

Es el mtodo ms sensible
Es el que muestra menos interferencias
Mtodos Derivados Fluorimtricos

o- ftalaldehido
Muy sensible
La
interferencia
de
contaminantes en la muestra
aminas
No todas las muestras reaccionan igual
De todas las antes mencionadas, Una de las reacciones ms utilizadas es la de Biuret; en esta reaccin,
el sulfato de cobre alcalino reacciona con compuestos que contienen dos o ms enlaces peptdicos, ya
que el radical carbamilo que se forma en el enlace peptdico es muy afn a los iones de cobre. Se le da el
nombre de Biuret porque este es un compuesto que da una reaccin tpicamente positiva con el sulfato
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de cobre alcalino. La formacin del color violeta es directamente proporcional al nmero de enlaces
peptdicos que contenga la protena y no es sensible a pptidos (Clark J.,1964)
MATERIAL:
Tubos de ensaye
Gradilla
Pipetas 1, 5 y 10 ml
Propipetas
Vasos de precipitado
EQUIPO:
Platina caliente
REACTIVOS:
Nitroprusiato de sodio al 5%
Hidrxido de amonio (NH4OH) concentrado
Cianuro de sodio (NaCN) al 5%
Aminocidos al 1%
Nitrosonaftol al 1%
Ninhidrina al 1%
Solucin de Biuret
cido ntrico (HNO3) concentrado
Protenas al 0.5%
Ac. Actico 0.01N
Ac. Actico 0.1
Ac. Actico 1.0N
Albuminato de Sodio 0.1N
PROCEDIMIENTO:
Experimento No. 1 Prueba de Sullivan
Colocar en una gradilla una serie de tubos y etiquetarlos acorde indica la siguiente tabla:
REACTIVOS
Agua
Cistena
NH4OH
NaCN
Nitroprusiato de Sodio
Sol. problema
BLANCO
0.5 ml
------2 gotas
0.5 ml
2 gotas
--------
PATRN
-------0.5 ml
2 gotas
0.5 ml
2 gotas
---------
PROBLEMA
--------------2 gotas
0.5 ml
2 gotas
0.5 ml
Observar los resultados obtenidos, una coloracin rosa roja indica resultados positivos.
Experimento No. 2 Reaccin de identificacin de fenoles p-sustituidos (tirosina)

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REACTIVOS
Agua
Tirosina
Sol. problema
Nitrosonaftol
BLANCO
1.0 ml
--------2 gotas
PATRN
----1.0 ml
----2 gotas
PROBLEMA
--------1.0 ml
2 gotas
Mezclar y calentar en bao de ebullicin durante 5 minutos, sacar y dejar enfriar. Posteriormente agregar
2 gotas de cido Ntrico a todos los tubos sin mezclar. Observar los resultados obtenidos. La aparicin
de un color rosa violceo es positiva.
Experimento No. 3 Reaccin de identificacin de aminocidos con ninhidrina
La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un agente oxidante que reacciona con todos los alfa
aminocidos dando un color purpura. La prolina e hidroxiprolina da un color amarillo.
REACTIVOS
BLANCO
PATRN
PROBLEMA
Aminocido
-----1.0 ml
----Problema
--------1.0 ml
Ninhidrina
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
Agua destilada
1.0 ml
--------Mezclar y calentar en bao de agua hirviendo, sacar en cuanto cambien de color.
Experimento No. 4 Reaccin de Biuret

Preparar una serie de tubos de acuerdo a la siguiente tabla:
TUBO
1 ml
--
--
--
--
Albmina
--
1 ml
--
--
--
Peptona
--
--
1 ml
--
--
Gelatina
--
--
--
1 ml
--
Tirosina
--
--
--
--
1 ml
Agua destilada
Biuret
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
Agitar y dejar reposar los tubos durante 15 min. Observar la coloracin y su intensidad.
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Experimento No. 5 Determinacin del punto Isoelctrico de la Albmina por adicin de un cido.
Fundamento Qumico: Con la adicin de un cido o una base a una solucin protica se alcanza un
estado en que hay el mismo nmero de aniones que de cationes. Este efecto, neutraliza la carga de la
protena y tiende a precipitar. El pH que determina el nmero igual de cargas de signos opuestos se
denomina punto isoelctrico.
Preparar una serie de tubos como se indica a continuacin:
Agua
Ac. Actico 0.01N
Ac. Actico 0.1
Ac. Actico 1.0N
Albuminato
0.1N
8.38
0.62
1.0
7.75
1.25
1.0
8.75
0.25
1.0
8.5
0.5
1.0
8.0
1.0
1.0
7.0
2.0
1.0
5.0
4.0
1.0
1.0
8.0
1.0
7.4
1.6
1.0
10
5.8
3.2
1.0
Tubo
pH
Mezclar bien y observar los cambios que presente la solubilidad del albuminato en cada tubo.
Calcular el pH de cada tubo utilizando la ecuacin de Hendersosn-Hasselbach.
RESULTADOS:
Experimentos No.1, 2 y 3 Identificacin de aminocidos
En la siguiente tabla indicar si los resultados del problema fueron positivos o negativos.
TUBOS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
AMINOACIDOS
Exp. No. 1
Exp. No. 2
Exp. No.3
Experimento No. 4 Reaccin de Biuret
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Reportar los resultados de la siguiente forma: (++) = violeta intenso; (+) = ligeramente coloreado; (-) = no
formacin de color.
Experimento No. 5 Determinacin del punto Isoelctrico de la casena por adicin de un cido.
TUBO
pH
SOLUBILIDAD
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Cul es el punto isoelctrico de la protena?
DISCUSIN:
1.- Describir y explicar mediante un esquema la reaccin entre el Reactivo de Biuret y los enlaces
peptdicos.
2.- Correlacionar los pesos moleculares y los componentes aminoacdicos de la albmina, peptona,
gelatina y tirosina.
3.- Explique porque cada protena se comporta de diferente manera en las reacciones de Biuret y
Xantoproteica.
4.- Analice las dos reacciones y diga si son confiables para una determinacin a nivel clnico.
5.-Cul es el efecto de la adicin de una sal metlica a una solucin protenica?
6.-De qu factores depende la solubilidad de una protena en el agua?
7.-Explique en trminos fisicoqumicos el efecto que provoca la adicin de un cido o una base fuerte.
8.-Explique cmo afecta un cambio en la constante dielctrica del agua a la solubilidad de una protena.
9.-Qu relacin existe entre el punto isoelctrico y la solubilidad de una protena?
10.-Qu es la ecuacin de Henderson-Hasselbach y en qu casos est indicado utilizarse?
11.-Diga si es posible tener dos protenas con puntos isoelctricos muy alejados solubles en un mismo
solvente. Por qu?
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CUESTIONARIO:
1.- Mencione 5 diferencias fundamentales tanto qumicas como bioqumicas que permiten diferenciar a
los aminocidos de los carbohidratos y de los lpidos.
2.- Existe un enorme grupo de aminocidos no naturales, mencione 10 ejemplos e indique su importancia
bioqumica.
3.- Cmo se calcula el punto isoelctrico de un aminocido?
4.- Qu importancia mdica tiene la identificacin de los aminocidos?
5.- Cul es el mecanismo de identificacin de aminocidos al utilizar ninhidrina?
6.- Cul es la funcin del cianuro de sodio en la reaccin del nitroprusiato?
7.- Qu es el Salting in y que tipo de compuestos pueden promoverlo?
8.- Qu es el Salting out y que tipo de compuestos pueden promoverlo?
9.- Mencione y describa dos reacciones que sean anlogas a la xantoproteica.
10.- Mencione dos reacciones que sirvan para cuantificar protenas
11.- Describa el mtodo de Sanger y mencione qu papel juega en la identificacin de protenas.
12.- Defina el trmino Secuenciacin proteica.
13.- Mencione tres reacciones de identificacin que se utilicen en la secuenciacin de protenas.
14.- Analice detalladamente una tcnica que se utilice para secuenciar a las protenas.
15.- Las protenas Bence Jones precipitan a una temperatura mayor de 60C. Las Crioglobulinas
precipitan a una temperatura de 4C. La albmina de huevo precipita a una temperatura mayor de 90C y
tambin precipita a un pH menor de 4.5. Explique el comportamiento de cada una de estas protenas
tomando en cuenta los siguientes parmetros: Fuerza inica del solvente, interacciones electrostticas
soluto-solvente, agentes desacoplantes de la interaccin soluto-solvente.
16.- Mencione que propiedades fisicoqumicas de la albmina le permiten interaccionar y transportar
cualquier compuesto incluyendo hidrofbicos a travs de un medio acuoso.
17.- El punto Isoelctrico de la Gelatina es de 4.7 y el de la colgena es de 8.4. Se sabe que la colgena
es una protena fibrilar precursora de la gelatina. Explique porque hay una diferencia tan grande entre los
puntos isoelctricos de ambas.
18.- El Ac. Tricloroactico, el Ac. Sulfosaliclico y el Ac. Fosfotngstico tienen la propiedad de precipitar
protenas. Cul es el mecanismo fisicoqumico que ocurre en esta precipitacin.
19.- Especifique cual es el efecto del plomo sobre las propiedades electroqumicas de las protenas de la
sangre.
20.- Determine el efecto del litio cuando se encuentra en altas concentraciones sobre las protenas de las
clulas nerviosas.
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BIBLIOGRAFA CONSULTADA:
Koolman J., Rhm C.H. Bioqumica: Texto y atlas. Madrid, Espaa: Panamericana, 2004.
Mller - Esterl W. Bioqumica: Fundamentos para medicina y ciencias de la vida. Barcelona, Espaa:
Revert, 2008.
Pea A., Arroyo A., Gmez A., Tapia R. Bioqumica. Mxico: Limusa, 2004.
Voet D., Voet G. Bioqumica. Madrid, Espaa: Panamericana, 2006
Clark J. Experimental Biochemistry. USA: W. H. Freeman and Company, 1964
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PRCTICA # 3
ANLISIS ENZIMTICO CUALITATIVO
OBJETIVO:
Al trmino de esta prctica, el alumno ser capaz de definir el efecto fisicoqumico que generan las
enzimas sobre diferentes sustratos. Indicando adems, las propiedades qumicas que permiten que una
enzima catalice la modificacin de un sustrato.
PRERREQUISITOS:
1. Definicin de enzima, substrato, apoenzima, holoenzima, proenzima, zimgeno, coenzima, cofactor.
2. Determine lo que significa: especifidad enzimtica y alosterismo.
3. Defina el efecto de una hidrolasa, oxidoreductasa, transferasa, liasa, ligasa e isomerasa.
INTRODUCCIN:
Las enzimas son biocatalizadores que aceleran las reacciones qumicas. De igual manera,
participan en muchos mecanismos de regulacin que de este modo permiten que el metabolismo se
adapte a diferentes situaciones. Casi todas las enzimas son protenas pero tambin hay cidos nucleicos
catalticamente activos conocidos como ribozimas (Koolman & Rhm, 2004).
Las enzimas estn formadas por una parte proteica o apoenzima inactiva. La unin de un cofactor o
grupo prosttico de forma covalente a la apoproteina da lugar a lo que denominamos holoenzimas, que
ya presenta actividad cataltica (enzima activa). Los cofactores son molculas pequeas de naturaleza
orgnica o inorgnica que requieren las enzimas para poder presentar actividad. Los cofactores
inorgnicos pueden estar constituidos por uno o varios iones, como hierro, magnesio, zinc, cobre,
manganeso, entre otros; o bien, por un complejo orgnico o metaloorgnico, en cuyo caso reciben el
nombre de coenzima (Teijn, et al., 2006).
Las enzimas modifican la velocidad de una reaccin qumica sin afectar el equilibrio final y slo se
requieren pequeas cantidades para efectuar la transformacin de un gran nmero de molculas de
sustrato. La actividad de la mayor parte de las enzimas es bastante especfica tanto para el tipo de
accin catalizada como por los compuestos o sustratos cuya modificacin catalizan (Especificidad de
sustrato), as mismo las enzimas funcionan solo bajo condiciones muy definidas de pH, temperatura,
concentracin de sustrato, coenzimas etc. (Teijn, et al., 2006; Koolman & Rhm, 2004).
Clasificacin de las enzimas
En la actualidad hay un gran nmero de enzimas (ms de 2000), para su clasificacin se usa un sistema
que toma en cuenta tanto la especifidad de accin como la especificidad del sustrato. La International
Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) ha establecido un sistema en donde las enzimas
se clasifican en 6 grupos de acuerdo con el tipo de reaccin que catalicen (Figura 1): Oxidoreductasas,
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Transferasas, Hidrolasas, Liasas, Isomerasas, Ligasas o Sintetasas (Teijn, et al., 2006; Voet & Voet,
2006; Koolman & Rhm, 2004).
En el catlogo de enzimas, cada una de ellas est indicada por un nmero EC (Enzyme Comission
Numbers) de varias cifras, donde el primer nmero indica que la enzima corresponde a una de las seis
clases principales de enzimas, los dos nmeros siguientes definen la subclase y la sub-subclase y el
ltimo nmero es el nmero progresivo dentro de la sub-subclase (Teijn, et al., 2006; Koolman & Rhm,
2004). Por ejemplo, en el caso de la enzima tripeptido aminopeptidasa tiene el cdigo EC 3.4.11.4,
construido as:
3 por hidrolasa (enzima que usa el agua para catalizar algunas reacciones).
3.4 por hidrolasa, que acta sobre los enlaces peptdicos.
3.4.11 por aquellas que actan sobre el terminal amino de aminocido de un polipptido.
3.4.11.4 por aquellas que actan sobre el terminal amino final de un tripptido.
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Figura 1.- Esquema de las clases de enzimas
MATERIAL:
Tubos de ensaye
Pipetas de 1.0 ml
Pipetas de 5.0 ml
Propipetas
Gradillas
Tapones de algodn
EQUIPO:
Platina caliente
Incubadora 37C
REACTIVOS:
Semilla vegetal (semilla de sanda u otra que contenga ureasa)
Urea al 2%
Solucin de Azul de bromotimol NaOH
Leche
Oxalato de amonio 2%
Solucion de Renina
Cloruro de calcio 10%
PROCEDIMIENTO:
Experimento No. 1 Efecto del calor sobre la actividad de las enzimas "Actividad de la ureasa.
Tubo
Semilla Vegetal
pizca
pizca
pizca
Agua destilada
5.0 ml
5.0 ml
Mezclar para tratar de homogenizar el polvo de sanda y enseguida coloque un tapn de algodn a los
tubos 1 y 2 y colquelos en bao a ebullicin durante 20 minutos. (Cuidar que no se acabe el agua del
bao).
Agua
5.0 ml
Azul de
Bromotimol
2 Gotas
2 Gotas
2 Gotas
Aadir cido dbil (GOTAS) en caso de que la solucin tenga un color azul.
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Urea
5.0 ml
5.0 ml
5.0 ml
Mezclar y tomar el tiempo que transcurre hasta alcanzar el vire del color amarillo al azul en cada uno de
los tubos.
Experimento No. 2 Determinacin de actividad de la Renina.
Tubo
Leche
3.0 ml
3.0 ml
3.0 ml
Oxalato de
Amonio
0.5 ml
0.5 ml
Solucin renina
3 Gotas
3 Gotas
3 Gotas
Mezclar e incubar a 37C durante 10 minutos y anotar los cambios observados en cada uno de los tubos.
Posteriormente, calentar el tubo No. 2 a ebullicin y enfriar. Cuando ya estn fros los tubos agregar:
Cloruro de Calcio
10 Gotas
10 Gotas
Mezclar y comparar los cambios observados en los tubos No 2 y 3 con el 1.
RESULTADOS:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
DISCUSIN:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
CONCLUSIN:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
CUESTIONARIO:
1.- De acuerdo a la clasificacin enzimtica a que clase pertenecen las enzimas utilizadas (renina y
ureasa) y por qu?
2.- Mencione 3 bacterias que contengan la enzima ureasa:
3.- Qu grupos qumicos participan en el sitio activo de las enzimas?
4.- Las enzimas cambian la constante de equilibrio de las reacciones que catalizan s, no; por qu?
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5.- Por qu algunas protenas actan como catalizadores (enzimas) de reacciones con alta
especificidad, mientras que otras protenas que tambin contienen aminocidos en su estructura no lo
hacen?
Koolman J., Rhm C.H. Bioqumica: Texto y atlas. Madrid, Espaa: Panamericana, 2004.
Teijn J.M., Garrido A., Gaitn D., Villaverde C., Mendoza C., Ramrez J. Fundamentos de bioqumica
estructural. Madrid, Espaa: Tbar. 2006
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PRCTICA # 4
CINTICA ENZIMTICA 1: EFECTO DE LA CONCENTRACIN DEL SUSTRATO
SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA
OBJETIVOS:
El alumno observar el comportamiento de la actividad enzimtica de acuerdo a los parmetros de
concentracin tanto del sustrato determinando los valores de:
a) Vmax (velocidad mxima de la reaccin).
b) 1/2 Vmax
c) Km (constante de Michaelis).
d) [S] ptima (concentracin ptima de sustrato).
PRERREQUISITOS:
1. Describir el mecanismo de accin de las enzimas en las reacciones qumicas.
2. Cul es la relacin que existe entre la velocidad de una reaccin catalizada y la concentracin de
enzima.
3. Definir la relacin entre la concentracin de sustrato y la velocidad de la reaccin enzimtica.
4. Interpretar la cintica de Michaelis-Menten y la de Lineweaver-Burk.
INTRODUCCIN:
La cintica qumica es el estudio de la velocidad de cambio que existe entre el estado inicial de
reactantes y productos y el estado final. La velocidad es expresada en trminos de cambios de
concentracin de sustrato o producto por unidad de tiempo, esto se puede seguir, determinando la
desaparicin de reactantes o aparicin de productos en funcin del tiempo. Es particularmente
importante hacer notar que constantemente hay cambios en la velocidad de reaccin conforme procede
la reaccin hasta llegar al equilibrio, una vez alcanzado ste, los cambios de velocidad son iguales a cero
(Koolman & Rhm, 2004).
Cintica de Michaelis - Menten
En la mayora de las reacciones enzimticas al seguir su comportamiento cintico se pueden obtener

generalmente varios rdenes de reaccin; al examinar la curva de velocidad respecto a la concentracin
de sustrato, La figura 1 muestra el efecto de distintas concentraciones de sustrato sobre la velocidad
inicial de la reaccin catalizada por un enzima (Mller Esterl, 2008).
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Figura 1.- Grfica de una curva de saturacin de una enzima

Si se observa la grfica, se pueden observar tres regiones distintas donde la velocidad responde en
forma caracterstica a los aumentos de concentracin de sustrato (Mller Esterl, 2008; Voet & Voet,
2006; Fersht, 1980):
a) A muy bajas concentraciones de sustrato el comportamiento de velocidad con respecto a la
concentracin de sustrato es esencialmente lineal, esto es, la velocidad es directamente proporcional a la
concentracin de sustrato y en esta regin se presenta la cintica de primer orden.
b) En la etapa final de la curva observamos que la velocidad es esencialmente independiente de la
concentracin de sustrato, aqu la cintica es de orden cero.
c) Para concentraciones de sustrato intermedias la velocidad del proceso deja de ser lineal, y a esta zona
se la denomina de cintica mixta.
Este tipo de estudio cintico fue desarrollado por primera vez por Michaelis-Menten y formularon la
siguiente ecuacin:
V = Vmx [S]
Km + [S]
Donde las constantes Vmx y Km (constante de Michaelis) son caractersticas para cada enzima bajo
ciertas condiciones.
La velocidad mxima (Vmx) se obtiene cuando la velocidad de reaccin se hace independiente de la
concentracin de sustrato, cuando esto ocurre la velocidad alcanza un valor mximo. Este valor depende
de la cantidad de enzima que se tenga.
La constante de Michaelis (Km) nos indica la concentracin de sustrato a la cual la velocidad de reaccin
es la mitad de la velocidad mxima. Este parmetro es independiente de la concentracin de enzima, y
es caracterstico de cada enzima segn el sustrato utilizado (si tiene varios). La Km tambin indica la
afinidad que posee la enzima por el sustrato, siendo sta mayor, cuanto menor es la Km. Cuanto Menor
sea la Km menor ser la cantidad de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad mxima,
Rev. Enero 2015
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por lo que mayor ser la afinidad del enzima hacia ese sustrato (Mller Esterl, 2008; Voet & Voet, 2006;
Fersht, 1980).
MATERIAL:
Tubos de ensaye
Gradillas
Pipetas
Propipetas
Celdas de espectrofotmetro
EQUIPO:
Espectrofotmetro de luz visible
Platina caliente
REACTIVOS:
Solucin de Invertasa 0.001%
Buffer de fosfatos pH 4.7
Sacarosa 0.02M, 0.03M, 0.05M, 0.1M, 0.3M y 0.5M
Solucin de 3,5 Dinitrosalicilato
PROCEDIMIENTO:
La invertasa es una enzima hidroltica que acta sobre sacarosa (un disacrido) liberando glucosa y
fructosa. La actividad de la enzima se detiene al aadir una solucin alcalina y el poder reductor de los
productos se mide hacindolos reaccionar con el reactivo de 3,5-dinitrosalicilato.
Preparar una serie de tubos como se muestra en la siguiente tabla:
Tubo
Invertasa
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Amortiguador
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Sacarosa 0.02 M
1.0
Sacarosa 0.03 M
1.0
Sacarosa 0.05 M
1.0
Sacarosa 0.10 M
1.0
Sacarosa 0.30 M
1.0
Sacarosa 0.5M
1.0
Agua destilada
1.0
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Mezclar e incubar a 35 C durante 20 min, sacar los tubos y agregarles 1 ml de Dinitrosalicilato. Mezclar
y calentar en bao de agua a ebullicin hasta que cambien de color. Enfriar y leer a 540 nm ajustando a
cero con el tubo No. 7
RESULTADOS:
1.- Graficar los valores de As vs. [S]
2.- Graficar los valores de 1/As vs. 1/[S]
3.- Determinar los valores de:
Grfica de M - M
Grfica de L - B
Vmx
Km
Vmx
[S] ptimo
DISCUSIN:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
CONCLUSIN:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
CUESTIONARIO:
1.- La velocidad inicial de una reaccin enzimtica es dependiente exclusivamente de la cantidad de
sustrato presente, si, no, por qu?
2.- Cul es la diferencia entre los cambios de energa libre que existen entre un proceso catalizado por
una enzima y el mismo proceso no catalizado.?
3.- Por qu a concentraciones de sustrato mucho mayores que el valor de la Km la velocidad de la
reaccin es independiente de la concentracin de sustrato?
4.- La Km de una enzima vara con la concentracin de enzima, si, no, por qu?
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Fersht A. Serie de Biologa Fundamental: Estructura y mecanismo de los enzimas. Barcelona, Espaa:
Revert. 1980
Koolman J., Rhm C.H. Bioqumica: Texto y atlas. Madrid, Espaa: Panamericana, 2004
Mller - Esterl W. Bioqumica: Fundamentos para medicina y ciencias de la vida. Barcelona, Espaa:
Revert, 2008
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PRCTICA # 5
CINTICA ENZIMTICA 2: EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA
OBJETIVOS:
El alumno analizar el efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad enzimtica en una reaccin.
Basado en:
a. Discutir el efecto sobre el comportamiento cataltico de una enzima al variar el pH de la mezcla de
reaccin.
b. Discutir los cambios que se presentan en la cintica enzimtica al variar la temperatura de reaccin.
c. Determinar las condiciones ptimas de reaccin en funcin de estos dos factores (pH, temperatura).
PRERREQUISITOS:
1. Describir el efecto del pH sobre la estabilidad y actividad de una enzima.
2. Describir el efecto de la temperatura sobre la estabilidad y actividad de una enzima.
3. Describir el sitio activo y sitio de enlace de una enzima.
4. Describir los agentes desnaturalizantes y su mecanismo de accin sobre una enzima.
5. Explicar los conceptos de pH y temperatura ptimos de una enzima en una reaccin catalizada.
INTRODUCCIN:
Efecto del pH sobre la actividad enzimtica
Es lgico pensar que el pH de una solucin influye sobre la velocidad de una reaccin catalizada por
enzimas. El sitio activo y el sitio de enlace de una enzima generalmente estn compuestos por grupos
ionizables que deben presentarse con una forma inica apropiada o especfica, de tal manera, que se
pueda mantener la conformacin adecuada de estos sitios en la enzima y pueda llevarse a cabo la unin
del sustrato y su transformacin hacia productos.
La curva actividad-pH puede ser diferente para cada tipo de enzima (Figura 1). En el caso ms general la
curva tiene forma de campana. El valor de pH al cual la actividad es mxima se denomina pH ptimo;
dicho pH no tiene por qu coincidir con el pH intracelular. La relacin entre el pH y la actividad depende
del comportamiento cido-base de la enzima y del propio sustrato. Sustrato y enzima (centro activo)
pueden contener grupos funcionales cidos y bsicos, siendo su grado de disociacin dependiente del
pH, lo que Determinar, entre otros aspectos, la conformacin de la protena, la capacidad de unin del
sustrato al centro activo del enzima (Km) y la capacidad de transformacin del sustrato (kcat). Los
estudios cinticos a diferentes valores de pH nos proporcionan informacin sobre el mecanismo cataltico
de las enzimas y la naturaleza de los aminocidos ms directamente implicados en la catlisis (Tena &
Jorrn, 2005).
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Figura 1.- Efecto del pH sobre la actividad de diferentes enzimas

Igualmente puede existir un sustrato con grupos ionizables y debe contener una forma inica especfica
para que pueda unirse a la enzima y posteriormente se realice la catlisis. Los efectos de pH sobre la
estabilidad de una enzima se deben tomar en cuenta en cualquier estudio de efecto de pH sobre la
catlisis de sustrato.
Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica
Otro de los factores que afectan la velocidad de una reaccin es la temperatura, de tal suerte que un
incremento de temperatura proporciona mayor energa cintica a las molculas reactantes, dando como
resultado choques ms productivos por unidad de tiempo. La actividad cataltica de las enzimas resulta
de una estructura altamente ordenada. Si la molcula absorbe mucha energa, la estructura se rompe y
la enzima se desnaturaliza y por lo tanto pierde su actividad cataltica.
Figura 2.- Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica

Si se grafica velocidad vs. Temperatura se obtiene una curva en forma de campana, en el cual el pico se
conoce como temperatura ptima (Figura 2). La estabilidad a la temperatura, de una enzima depende del
pH, fuerza inica del medio, as como de la presencia o ausencia de metales. La mayora de los
sustratos ejercen un efecto de proteccin a la enzima contra la desnaturalizacin por temperatura. Las
enzimas de bajo PM compuestas de cadenas sencillas y que poseen enlaces disulfuro son ms estables
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al calor que las de alto PM. Las enzimas obtenidas de un extracto crudo libre de clulas son ms
estables al calor por la alta concentracin de otras protenas (efecto protector) (Tena & Jorrn, 2005).
MATERIAL:
Tubos de ensaye
Gradillas
Pipetas
Propipetas
Celdas para espectrofotmetro
EQUIPO:
Platina caliente
REACTIVOS:
Solucin de Invertasa 0.001%
Buffer de citratos pH: 2.5, 3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.5
Sacarosa 0.03M
3,5 Dinitrosalicilato
PROCEDIMIENTO:
Experimento No. 1 Efecto del pH
Tubo
Sacarosa 0.3 M
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
Amortiguador pH = 2.5
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
Invertasa
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
Agua
1.5 ml
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Mezclar e incubar a 35C durante 20 min. Posteriormente agregar 1 ml de Dinitrosalicilato a cada uno de
los tubos. Mezclar y calentar en bao de agua a ebullicin hasta cambio de color. Enfriar y leer a 540 nm
ajustando a cero con el tubo No. 7
Experimento No. 2 Efecto de la Temperatura (Clark J, 1964)

Tubo
Sacarosa 0.3 M
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Amortiguaor pH = 4.7
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Invertasa
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Agua
1.0
Temperatura C
26
37
45
60
100
25
Mezclar e incubar 20 minutos a la temperatura indicada.

Agregar 1 mL de Dinitrosalicilato a todos los tubos.
Mezclar y calentar en bao de agua a ebullicin hasta cambio de color. Enfriar y leer a 540 nm ajustando
a cero con el tubo No. 7
RESULTADOS:
1.- Grafique los resultados obtenidos de velocidad vs pH.
2.- Grafique los resultados obtenidos de velocidad vs temperatura.
3.- Indique cuales son los valores de pH y temperatura ptimos obtenidos.
DISCUSIN:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
CONCLUSIN:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
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CUESTIONARIO:
1.- La pepsina presenta su mxima actividad a un pH 1. Mencione cules podran ser los grupos
funcionales presentes en el sitio activo y sobre cuales residuos de aminocidos rompe los enlaces
peptdicos.
2.- Si la concentracin de sustrato en una reaccin enzimtica es igual a un 1/3 de Km. Cul ser la
velocidad inicial de la reaccin.
3.- De acuerdo a la clasificacin de las enzimas a que clase pertenece una enzima que participa en la
conversin de un azcar de tipo aldosa a un azcar de tipo cetosa.
4.- En esta prctica se ha observado cmo influye el pH en la actividad de invertasa, a una concentracin
de sacarosa dada. La estaquiosa es un tetrasacrido y es un sustrato para esta enzima y se ha
observado que es hidrolizado a una velocidad igual al 5% de la sacarosa, bajo las mismas condiciones
de concentracin y pH. Cmo explicara esta velocidad mxima tan baja en relacin al pH de la reaccin.
( a-Gal-a-Gal-a-Glu--Fru ).
5.- Cuando las soluciones enzimticas son calentadas, hay una prdida progresiva de la actividad
cataltica con el tiempo. As, una solucin de hexocinasa incubada a 45C durante 12 minutos pierde el
50% de su actividad; pero cuando la hexocinasa se incuba a 45C, en presencia de altas
concentraciones de glucosa durante el mismo tiempo, solamente se pierde un 3% de su actividad.
Explique el porqu de la variacin desnaturalizante de la hexocinasa por efecto de la temperatura en
ausencia y presencia del sustrato.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:
Tena M., Jorrn J. Estudio cintico de la actividad invertasa de levadura de panadera. Universidad de
Crdova, 2005.
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PRCTICA # 6
DETERMINACIN DE UREA Y CREATININA SRICA
OBJETIVO:
Al finalizar esta prctica, el alumno deber tener los fundamentos para poder interpretar desde el
punto de vista clnico, los resultados obtenidos de la cuantificacin de urea y creatinina de una muestra
de suero de un paciente.
PRERREQUISITOS:
1.- Describir los puntos principales del ciclo de la urea.
2.- Describir los mecanismos de produccin de la creatinina.
3.- Identificar los principales tejidos productores de urea y creatinina.
4.- Interpretacin de aumento y disminuciones de los analitos anteriormente analizados.
INTRODUCCION:
UREA
La urea es el principal producto de excrecin, proveniente del catabolismo de las protenas, el
cual se origina a partir de los grupos amino de los aminocidos. Esta va, es el principal medio de
excrecin de nitrgeno por el organismo. La urea es sintetizada en el hgado por medio del ciclo de la
urea, donde intervienen los aminocidos ornitina y arginina, cuya funcin fundamental es convertir el
amonico y el bixido de carbono en urea (Figura 1).
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Figura 1.- Ciclo de la Urea
El contenido de urea se puede expresar ya sea como concentracin de urea o como concentracin de
nitrgeno ureico (BUN). Para convertir un valor de BUN a su equivalente en urea, debe de multiplicarse
por 2.14, factor resultante de la relacin de pesos moleculares de la urea entre el nitrgeno que contiene.
La urea se elimina por el rin mediante un mecanismo pasivo de filtracin a nivel glomerular. Debido a
la gran solubilidad de la urea esta filtracin es importante, siendo iguales las concentraciones de urea en
el filtrado glomerular y en el plasma. Sin embargo, no toda la urea filtrada a nivel glomerular es eliminada
con la orina, solamente un 30 a 60% es eliminada, el resto es reabsorbida a nivel tubular (Portillo, et al.,
1997).
Los niveles plasmticos de urea dependen principalmente de cuatro factores: la dieta, el metabolismo
proteico, la funcin renal y la funcin heptica, rgano en el que se lleva a cabo la sntesis de urea.
El trmino de azoemia es aplicado a cualquier aumento significativo de la concentracin plasmtica de
compuestos nitrogenados no proteicos, principalmente urea y creatinina. Tradicionalmente la azoemia se
clasifica como prerrenal, intrarrenal o renal y postrenal.
CREATININA
La creatina se forma a partir de la sntesis de arginina y glicina, esto se lleva a cabo en el rin, hgado y
pncreas. La creatina es transportada por el torrente sanguneo hacia musculo y cerebro donde es
fosforilada a fosfocreatina (PCr). Alguna creatina y fosfocreatina libre en musculo es convertida a
creatinina la cual se difunde en la sangre y despus es excretada por los riones (Figura 2). La cantidad
que se produzca de est, es proporcional a la masa muscular de cada individuo. En ausencia de una
enfermedad renal, el rango de excrecin en un individuo debe de ser constante. Debido a que los riones
son los responsables de eliminar la creatinina de la sangre, el medir los niveles de est en suero es un
muy buen indicador de las funciones renales (Cayman chemical company, 2014).
Figura 2.- Sntesis de Creatinina
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La Creatinina sufre filtracin glomerular pero no se reabsorbe y su secrecin tubular es mnima. La razn
ms importante del aumento de este metabolito en sangre es la mala filtracin glomerular. Esto se puede
valorar rpidamente con la determinacin de creatinina en sangre cuando est presente en valores por
encima de los normales y combinando posteriormente estos resultados con los niveles en orina
(Aclaramiento de creatinina). El aumento de los niveles en sangre tambin podra indicar un gran
recambio muscular patolgico porque el msculo se est rompiendo, o bien fisiolgico si el individuo
presenta una gran masa muscular (deportistas por ejemplo). Una de las aplicaciones clnicas de
emergencia ms importantes de la determinacin de creatinina en sangre es la deteccin de la
Insuficiencia Renal Aguda que es la disminucin rpida en horas o das de la funcin renal con cada de
la filtracin glomerular y en algunos casos disminucin en la produccin de orina acompaada de
retenciones nitrogenadas y alteraciones hidroelctricas y acido bsicas. Durante el curso de esta
enfermedad los valores de creatinina sufren un gran aumento en un periodo corto mostrando valores que
superan los 1.5 mg/dl (Perazzi, 2011).
En el laboratorio se medir la cantidad de miligramos de creatinina que hay en un decilitro de

sangre (mg/dL). Las concentraciones de creatinina en la sangre pueden variar. Cada laboratorio tiene su
escala de referencia. En muchos laboratorios la referencia normal de creatinina es 0,6 a 1,2 mg/dL. Si la
concentracin de creatinina en sangre es apenas superior a esta referencia, probablemente no se sienta
enfermo, pero el aumento es una seal de que sus riones no estn funcionando a pleno. Una frmula
para estimar la funcin renal establece que 1,7 mg/dL de creatinina en el hombre, y 1,4 mg/dL en la
mujer, equivalen a 50 por ciento de funcin renal normal. Sin embargo, como los valores de creatinina
son muy variables y son afectados por la alimentacin, deber controlar regularmente su nivel de
creatinina para saber si su funcin renal decrece. El mdico puede referirse a la cantidad de creatinina
de su sangre con el trmino "creatinina en suero". No confunda el valor de creatinina en suero con el
valor de depuracin de creatinina.
MATERIAL:
Pipetas 5.0 ml
Pipetas 1.0 ml
Pipetas 0.1 ml
Propipetas
Tubos de ensaye
Agujas
Ligadura
Camisa para tubo vacutainer
Tubos vacutainers
EQUIPO:
Platina caliente
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REACTIVOS:
Solucin de Diacetilmonoxima (DAM)
Solucin de Reactivo cido (H2SO4 al 6% y Ac. Fosfrico del 85% al 1%)
Tungstato de sodio 10%
cido sulfrico 2/3N
Solucin de Acido pcrico
Hidrxido de sodio 0.75N (NaOH)
PROCEDIMIENTO:
Tomar una muestra de sangre por puncin venosa (3.0 ml aproximadamente) de uno de sus
compaeros, con o sin anticoagulante, centrifugar la muestra y separe el suero o plasma segn sea el
caso.
Experimento No. 1 Cuantificacin de urea
Reactivos
Blanco
Estndar
Problema
Diacetilmonoxima
3 ml
3 ml
3 ml
Agua
0.05 ml
-----
------
Solucin estndar
------
0.05 ml
------
Suero o plasma
-----
-----
0.05 ml
Reactivo cido
3 ml
3 ml
3 ml
Mezclar y calentar en bao a ebullicin durante 15 minutos. Enfriar al chorro de agua y leer las
absorbancias ajustando con el blanco a cero a una longitud de onda de 520 nm.
CALCULOS:
Absorbancia del problema
--------------------------------------------Absorbancia del estndar o control
Nitrgeno ureico =
=
Concentracin
del estndar o control
que se est usando
] mg/dl
mg
-------- Urea = Nitrgeno ureico (2.14)
dl
Experimento No. 2 Cuantificacin de creatinina srica (Reaccin de Jaff, modificado por Folin Wu)
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REACTIVOS
BLANCO
ESTANDAR
PROBLEMA
Agua
4.0 ml
3.5 ml
3.5 ml
Tungstato de sodio
10%
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
cido sulfrico 2/3N
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
Suero o plasma (ml.)
----
---
0.5 ml
Solucin estndar
--0.5 ml
--(ml.)
Centrifugar los tubos donde exista turbidez (Estndar y Problema) a 2,500 rpm por 10 min
Tomar sobrenadante y realizar lo siguiente:

REACTIVOS
BLANCO
ESTANDAR
PROBLEMA
Sobrenadante
3.0 ml
3.0 ml
3.0 ml
NaOH 0.75 N
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
cido Pcrico
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
Reposar por 15 min a temperatura ambiente y leer absorbancia a 490 nm del tubo patrn y problema,
ajustando a cero de absorbancia con el tubo blanco.
CALCULOS
mg
-------- Creatinina = ---------------------------------------------------- X
dl
Absorbancia del estndar o control
Concentracin del estndar

o control que se est usando
Valores de referencia:
Nitrgeno ureico: 10 18 mg/dl
Urea: 22 40 mg/dl
Creatinina:
Hombres 0.7 a 1.2 mg/dl
Mujeres 0.5 a 1.0 mg/dl
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RESULTADOS:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
DISCUSIN:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
CUESTIONARIO:
1. En qu consiste la Azoemia prerrenal, intrarrenal y postrenal?
2. Mencione otras circunstancias por las cuales puede aumentar o disminuir la urea en sangre
3. Mencione otras causas por las cuales puede aumentar o disminuir el valor normal de creatinina
en sangre.
4. Qu es y en qu consiste el mtodo de depuracin de creatinina?
BIBLIOGRAFA:
Daz J., Fernandez del Barrio M.T., Paredes F. Aspectos bsicos de bioqumica clnica. Madrid: Das de
santos, 1997.
Fundacin norteamericana de rin y urologa www.kidneyurology.org Fecha de consulta 12 de enero
2015
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PRCTICA # 7
EXTRACCIN DE GLUCGENO Y REACCIONES DE IDENTIFICACIN DE
CARBOHIDRATOS
OBJETIVOS:
a) Desarrollar una tcnica de extraccin de glucgeno a partir de tejido heptico de conejo o rata y
determinar la calidad del glucgeno obtenido por medio de reacciones cualitativas de caracterizacin.
b) Conocer las tcnicas de anlisis cualitativo que permiten identificar carbohidratos y su utilizacin como
herramienta de trabajo en ciertos experimentos.
PREREQUISITOS:
1. Identificar la composicin del glucgeno y sus diferencias estructurales y funcionales con el almidn.
2. Diferenciar los efectos sobre el metabolismo del glucgeno de las siguientes hormonas: Insulina,
Glucagn y Adrenalina
3. Identificar las caractersticas de por lo menos tres enfermedades por almacenamiento de glucgeno.
4. Definir el trmino carbohidrato.
5. Diferenciar los tipos de carbohidratos y mencionar ejemplos.
6. Identificar las propiedades qumicas de los carbohidratos.
INTRODUCCIN:
Los hidratos de carbono o sacridos son componentes esenciales de los organismos vivos y
constituyen la clase ms abundante de molculas biolgicas. El nombre carbohidrato, que significa
hidrato de carbono surge de su composicin qumica, que es aproximadamente (C H2O)n en la que
n 3. Las unidades bsicas de los hidratos de carbono se conocen como monosacridos.
Los carbohidratos son derivados aldehdicos o cetnicos de alcoholes superiores polivalentes (ms de un
OH). Se clasifican en base al nmero de molculas que los componen. Monosacridos (azcares
simples) no se pueden hidrolizar en molculas ms sencillas, pueden subdividirse en triosas, tetrosas,
pentosas, hexosas etc. (Figura 1). segn el nmero de tomos de carbono que tengan. Los
oligosacridos presentan algunas unidades de monosacridos ligadas de forma covalente, se encuentran
unidos a protenas (glucoprotenas) y lpidos (glucolipidos). Los polisacridos presentan en muchas
unidades de monosacridos ligadas de forma covalente y poseen funciones estructurales indispensables
en todos los tipos de organismos (celulosa, almidn, glucgeno, entre otros) (Voet & Voet, 2006; Melo &
Cuamatzi, 2007).
Figura 3.- Estructura de carbohidratos simples. De izquierda a derecha: triosa, tetrosa, pentosa y hexosa.
Rev. Enero 2015
Page 40
Los monosacridos se clasifican segn la naturaleza qumica de su grupo carbonilo y el nmero de sus
tomos de C. Si el grupo carbonilo es un aldehdo, como en la glucosa, el azcar es una aldosa. Si el
grupo carbonilo es una cetosa, como la fructosa, el azcar es una cetosa (Figura 2).
Figura 4.- Diferencia entre una aldosa y una cetosa
Los monosacridos se unen entre s a travs de un enlace glucosdico. En este proceso de
condensacin de dos molculas de monosacridos, se elimina una molcula de agua (Figura 3).
Figura 5.- Formacin de un enlace glucosdico
Existen diferentes tipos de pruebas para determinar el tipo de carbohidrato que hay en alguna muestra:
Rev. Enero 2015
Carbohidratos en general (Prueba de Molish)

Cetosas (prueba de Seliwanoff)
Azucares con capacidad reductora (Prueba de Fehling)
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Oligosacridos y Polisacridos (Prueba de Yodo-Lugol)
MATERIAL:
Tubos de ensaye
Mortero con pistilo
Pipetas de 1, 5 y 10 ml
Propipetas
Vasos de precipitados
Gradilla.
Vidrio de reloj
Probeta de 100 ml.
EQUIPO:
Balanza granataria
Platina caliente
REACTIVOS:
cido tricloroactico (TCA) 10%
Alcohol etlico 96%
Solucin de Yodo - Lugol
Solucin de Molish
Reactivo de Fehling A
Reactivo de Fehling B
Reactivo de Selliwanoff
Carbohidratos al 1%
cido sulfrico (H2SO4) concentrado
PROCEDIMIENTO:
Experimento No. 1 Extraccin de Glucgeno
1. Pese 5g de tejido heptico y cortarlo en trozos pequeos (utilizar el vidrio de reloj).
2. Coloque los trozos en un mortero fro al cual se le aade TCA al 10 % en proporcin de 1.0 ml por
cada gramo de tejido y una pizca de arena lavada.
3. Centrifugue 10 min. a 2500 r.p.m.
4. Recupere todo el sobrenadante en una probeta de 100 ml y medir el volumen.
5. Aada 2 volmenes de alcohol al 96 % por volumen de sobrenadante agitando lentamente hasta que
el glucgeno flocule.
6. Vace en tubos de ensaye limpios de igual tamao y centrifugue a 2 500 r.p.m. 10 min.
7. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 5.0 ml. de agua destilada.
8. Utilice la suspensin de glucgeno como muestra problema, desarrolle las tcnicas de Fehling, Molish,
Selliwanoff y Yodo Lugol al mismo tiempo que los carbohidratos provedos por el profesor.
Rev. Enero 2015
Page 42
EXPERIMENTO # 2 REACCIN DE FEHLING (IDENTIFICACIN DE COMPUESTOS REDUCTORES)

Esta reaccin nos identifica carbohidratos con capacidad reductora, se basa en que algunos azcares en
un medio fuertemente alcalino y en presencia de oxgeno o de diversos agentes oxidantes ej. Cu, Ag dan
las reacciones de reduccin que dependen de la existencia de un grupo carbonilo libre como en la
glucosa, galactosa, fructosa, maltosa y lactosa. Si la prueba se efecta con una solucin que contenga
cloroformo como conservador, puede obtenerse un resultado positivo, sin que exista azcar, las sales de
amonio tambin interfieren en la reaccin. Si la solucin problema es cida debe neutralizarse antes de
efectuar la prueba.
Fundamento: si calentamos una solucin de Cu(OH) 2 en un medio alcalino formamos oxido cprico
(negro) CuO y en presencia de sustancias reductoras se precipita como oxido cuproso Cu 2O de color
caf rojizo pardo. (Pileggi & Szustkiewicz, 1974)
Solucin A contiene sulfato de cobre.
Solucin B contiene tartrato de sodio y potasio e Hidrxido de potasio.
METODO:
A 1.0 ml de muestra (carbohidratos sealados y glucgeno), agregar 0.5 ml de solucin de Fehling A y
0.5 ml de solucin de Fehling B, mezclar y calentar a bao a ebullicin por 5 min, la presencia del color
rojo indicar positivo
EXPERIMENTO # 3 REACCIN DE MOLISH-UDRANSKY.(Clark J.,1964; Plummer D.,1981)

Esta prueba es positiva con aldehdos y algunos cidos como el frmico, oxlico, lctico, ctrico, etc. Esta
reaccin es muy sensible, dicha sensibilidad para la glucosa es de hasta 0.001% y para sacarosa de
0.0001%.
METODO:
A 1.0 ml de muestra (carbohidratos sealados y glucgeno), agregar 3 gotas de Reactivo de Molish
Mezclar y aadir 0.5 ml de cido sulfrico concentrado (resbalando por la pared del tubo) NO mezclar.
La aparicin en la interfase de un anillo violceo es indicativa de que la prueba result positiva.
EXPERIMENTO # 4 REACCIN DE SELLIWANOFF (Clark J., 1964; Plummer D., 1981)

Est reaccin permite diferenciar Aldosas de Cetosas. Anote el tiempo en el cual aparece el color en
cada uno de los tubos. Una reaccin positiva est dada por la aparicin de un color rojo. Es utilizada para
diferenciar Cetosas de Aldosas (Reaccin de Seliwanoff)
METODO:
A 1.0 ml de muestra (carbohidratos sealados y glucgeno), agregar 5.0 ml del reactivo de Selliwanoff
Mezclar y calentar en bao de ebullicin durante 1 minuto, anote el resultado.
Las Cetosas dan un color rojo y las aldosas dan la prueba dbil y lentamente.
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EXPERIMENTO # 4 REACCIN DE YODO LUGOL

Esta reaccin identifica los polisacridos como Amilosa, Amilopectina, Glucgeno, Almidn formando un
complejo adsortivo (nube electrnica) (Van Holde Mathus, 2002) entre el Iodo y las cadenas helicoidales
del polisacrido (enlaces alfa 1,4 glucosdicos y enlaces alfa 1,6 glucosdicos de entre 8 a 12 residuos de
glucosas).
METODO:
A 1.0 ml de muestra (carbohidratos sealados y glucgeno), agregar 3 gotas del reactivo de Yodo Lugol
(Plummer D.,1981; Martin-Snchez et al.,2013), mezclar y si es necesario calentar solo por 2 segundos
en bao de ebullicin.
La aparicin de los colores azul violeta, caf y negro indican la presencia de oligosacrido y/o
polisacrido segn sea el caso.
RESULTADOS:
MUESTRA
FEHLING
LUGOL
MOLISH
SELLIWANOFF
Glucgeno
Glucosa
Sacarosa
Fructuosa
Galactosa
Amilosa
Amilopectina
Almidn
Lactosa
DISCUSIONES:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
CONCLUSIONES:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
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CUESTIONARIO:
1. Mencione las diferencias en las propiedades qumicas de los monosacridos con los aminocidos y los
lpidos.
2. Mencione 3 funciones fundamentales de los carbohidratos en la clula, ejemplificando en cada caso.
3. Mencione 2 homopolisacaridos y 3 heteropolisacaridos y su composicin, indicando tambin los tipos
de enlaces que presentan.
4. Defina y ejemplifique con carbohidratos los siguientes conceptos: Isomera ptica, Anomerismo,
Epimerismo.
5. Explique el mecanismo de accin de los segundos mensajeros en la regulacin hormonal y enzimtica
del metabolismo del glucgeno.
6. Describa las implicaciones bioqumicas que se presentan en la enfermedad de Von Gierke
7. Describa dos eventos bajo los cuales se puede activar la va de la glucogenolisis.
BIBLIOGRAFA
Melo V., Cuamatzi O. Bioqumica de los procesos metablicos. Barcelona: Revert, 2007
Pileggi V., Szustrkiewicz C. Clinical Chemistry Principles and Technics. USA: Harper and Row, 1974
Mathus C. Van Holde K Ahern K. Bioqumica. Espaa: Pearson Addison Wesley, 2002
Martin Snchez M., Martin Snchez T., Pinto G. Reactivo de Lugol: Historia de su Descubrimiento y
Aplicaciones Didcticas. Educ. Qum. 24 (1). 2013. [Enero 30,2015]
Plummer D. Bioqumica Prctica. Bogot Colombia: McGraw Hill, 1981
Rev. Enero 2015
Page 45
PRCTICA #. 8
CUANTIFICACIN DE COLESTEROL SRICO
OBJETIVO:
Determinar la concentracin de colesterol srico y analizar las implicaciones clnicas de niveles
anormales de colesterol.
PRERREQUISITOS:
1. Estructura, funcin y tipos de colesterol
2. Relacin metablica entre el colesterol y las lipoprotenas
3. Anlisis de la digestin del colesterol esterificada y no esterificado
4. Relacin de las Lipoprotenas plasmticas con la Aterognesis.
INTRODUCCIN:
El colesterol es uno de los lpidos que se encuentran en mayor concentracin en la sangre, se
puede afirmar que la fraccin lipdica del colesterol, es la segunda en cuanto a concentracin y sta se
localiza principalmente formando parte de las lipoprotenas. Qumicamente el colesterol es un compuesto
cclico con estructura bsica de perhidrofenantreno con un total de 27 carbones, un radical OH en el
carbono 3 y un doble enlace entre los carbonos 5 y 6 (Devlin, 2006) (figura 1).
Figura 1.- Estructura del colesterol

El colesterol es un lpido muy poco soluble en agua (0.2 mg/100 ml). La concentracin de colesterol en el
plasma de individuos sanos es de 150 a 200 mg/100 ml, lo que constituye una concentracin doble de la
concentracin normal de glucosa sangunea. El colesterol existe en dos formas: como colesterol libre en
muy pequeas cantidades y como colesterol esterificado mediante la unin de un cido graso no
saturado de cadena media al carbono 3. Este tipo de colesterol es el ms frecuente tanto en sangre
como en tejidos (Devlin, 2006).
La mayor parte de colesterol que existe en el organismo es sintetizado en el hgado, esto implica que el
colesterol exgeno tenga menor importancia metablica. La sntesis de colesterol endgeno es activada
en primera instancia ante el excedente de Acetil-S-CoA que haya en el hepatocito, ya que ste funciona
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como metabolito precursor y en segunda instancia ante la presencia de efectores hipercolesterolmicos

que aumentan la sntesis de colesterol o bien disminuyen el catabolismo del colesterol ya formado.
Determinacin de colesterol total
Existen dos mtodos para la determinacin del colesterol: los qumicos y los enzimticos. Los primeros
se basan en la clsica reaccin de Lieberman Burchard y posterior medicin colorimtrica. Estos
mtodos han quedado obsoletos y abandonados por su imprecisin, inexactitud, complejidad y
frecuentes interferencias analticas.
Los mtodos enzimticos se basan en el empleo de la enzima colesterol esterasa que hidroliza los
esteres de colesterol, y el colesterol libre es el substrato de la enzima colesterol oxidasa, que oxida
especficamente al colesterol segn la siguiente reaccin;
Colesterol
Colestona + H2O2
Determinndose a continuacin el agua oxigenada liberada mediante unas reacciones enzimticas

auxiliares. Entre ellas las ms difundidas son las que emplean la enzima peroxidasa y el sistema
cromognico fenol antipirina. La mayora de los mtodos enzimticos incorporan todas las enzimas en
un solo reactivo, facilitndose su utilizacin y automatizacin en el laboratorio (Daz, et al., 1997).
MATERIAL:
Tubos de ensaye
Gradilla
Micropipeta de 25 microlitros
Puntas para micropipeta
Agujas
Tubos Vacutainer
Ligadura
Pipeta de 5 ml
Propipetas
EQUIPO:
REACTIVOS:
Reactivo de colesterol
Estndar de colesterol
PROCEDIMIENTO:
Preparar una serie de tubos acorde a la siguiente tabla:
REACTIVOS
Suero
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BLANCO
----
ESTNDAR
-----
COLESTEROL
0.025ml
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Solucin estndar
Agua destilada
Reactivo de Colesterol
---0.025ml
2.5ml
0.025ml
---2.5ml
------2.5ml
Mezclar y dejar que se lleve a cabo la reaccin durante 20 minutos a temperatura ambiente. Leer la
absorbancia del problema y el patrn ajustando a cero con el tubo blanco a una longitud de onda de
640nm.
CALCULOS:
mg
-------- Colesterol total = ---------------------------------------------------- X
dl
Absorbancia del estndar o control
Concentracin del estndar

o control que se est usando
Valores de referencia:
Hasta 29 aos: 120 215 mg/dl
30 39 aos: 135 240 mg/dl
40 49 aos: 140 280 mg/dl
50 59 aos: 145 295 mg/dl
RESULTADOS:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
DISCUSIN:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
CONCLUSIN:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
CUESTIONARIO:
1.
2.
3.
4.
Qu tipos de colesterol hay?

Mencione algunas enfermedades relacionadas con los niveles altos de colesterol
Cmo regula el colesterol su propia sntesis?
Resuma los acontecimientos qumicos de la biosntesis de colesterol
BIBLIOGRAFA:
Devlin T.M., Bioqumica: texto con aplicaciones clnicas. Espaa: Revert, 2006
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Page 48
Daz J., Fernndez T., Salido F. Aspectos bsicos de bioqumica clnica. Madrid, Espaa: Das de Santos,
1997
Rev. Enero 2015
Page 49

Manual 2014 Bioquimica General Medicina

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INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS

MANUAL DE PRCTICAS DE BIOQUMICA GENERAL PARA

Documento modificado, actualizado y revisado por:

Cd. Jurez Chihuahaua

Semestre regular Enero Mayo 20XX

NOMBRE DEL ALUMNO____________________________________

Atentamente Comisin Elaboradora

M.C. Hctor Reyes Leal

Biol. Hctor Esparza Valencia

Q.B.P. Oscar Barrozo

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REGLAS PARA LOS ALUMNOS QUE ASISTEN A LOS LABORATORIOS DE

de 10 min. de la hora de entrada.

3. - Toda falta a la prctica equivale a cero en su reporte.

Incluyendo el trabajo experimental y la discusin y participacin en la prctica.

Rev. Enero 2015

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INSTRUCCIONES PARA EL USO DE ESTE MANUAL

a) Ttulo de la prctica.- Indica el nombre de la prctica y la de manera especfica de lo

h) Discusin.- Es una de las partes principales de todo experimento, ya que consiste en

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Diferencias entre regla, reglamento, norma y ley.

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Ninguno; trabajo en mesa

TMA y ropa protectora; seal

Trabajo en mesa al descubierto y

Prcticas de nivel 2 ms ropa

CSB adems de otros medios de

CSB de clase iii o trajes

Figura 1 Rombo de riesgos qumicos

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Tabla II Caractersticas fsicas y biolgicas de los residuos infecto-contagiosos

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De acuerdo al Centro Espaol de Metrologa

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Figura 2.- Formacin de un enlace peptdico

ENLACES QUE LO MANTIENEN

Puentes de hidrgeno entre los elementos del enlace

Puentes de hidrgeno entre las cadenas laterales de los

Los mismos que para el nivel terciario, ms las fuerzas

PROPIEDADES DE LAS PROTENAS

No se pierden las muestras

Bastante especfico para protenas

Tiene poca sensibilidad

Mtodos Derivados Colorimtricos

Muestra pocas interferencias

Tiene bastante sensibilidad

No todas las protenas reaccionan igual