Escherichia coli es el agente causal ms comn de la infeccin del tracto
urinario (UTI), y el diagnstico de esta infeccin por lo general se basa en
mtodos bacteriolgicos. Sin embargo, los mtodos de cribado pueden ser tiles para un diagnstico rpido presuntivo, aunque algunos de estos mtodos de cribado tienen poca sensibilidad o son caros. Para investigar un posible nuevo enfoque alternativo, un inmunoensayo basado en antgenoenzima vinculado a inmunoelectrodiffusion ensayo (ELIEDA) fue estandarizado para el cribado de esta infeccin bacteriana. Combinando contra inmunoelectroforesis con un ensayo inmunoenzimtico, ELIEDA requiere muestras de orina concentradas, una membrana de acetato de celulosa, anticuerpos policlonales contra E. coli criados en conejos y anticuerpos de oveja marcados con peroxidasa a la inmunoglobulina G (IgG) de conejo. Esta tcnica ELIEDA se evalu con 244 muestras de orina, 76 de ellas con E. coli, 47 con bacterias heterlogas y 121 sin bacterias. En comparacin con los mtodos bacteriolgicos, la sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos positivos y negativos para ELIEDA fueron de 93,4%, 98,2%, 95,9% y 97,1%, respectivamente. Los datos obtenidos sugieren que este ensayo es til para la deteccin sistemtica de diagnstico de IU causada por E. coli. Adems, puesto que las membranas teidas con ELIEDA pueden ser almacenadas, este ensayo hace posibles estudios retrospectivos. Las infecciones urinarias (ITU) estn entre las infecciones ms comunes en los seres humanos. La mayora de los casos son causados por un nmero limitado de gneros bacterianos; Las cepas de E. coli, en particular, son responsables del 80% de los casos de UTI observados en consultas ambulatorias (1). Estas cepas se encuentran en la flora normal del tracto intestinal, la piel y la vagina. Sin embargo, bajo condiciones predisponentes individuales pueden multiplicarse rpidamente y son capaces de adherirse a las clulas uroepiteliales, produciendo infeccin (1, 2). El diagnstico de IU bacteriana se ha realizado generalmente mediante mtodos bacteriolgicos de aislamiento e identificacin en orina anulada. Sin embargo, el uso de otros mtodos de cribado puede tener ventajas. Los resultados se pueden obtener ms rpidamente que con el mtodo de cultivo estndar, y la mayora de estos otros mtodos son simples y fciles de realizar. Mientras que los mtodos bioqumicos y automatizados se usan a menudo para el cribado de UTI, son insensibles (2) o costosos (3). En Brasil, los mtodos automatizados son demasiado caros para muchos laboratorios clnicos. Los mtodos inmunolgicos se utilizan menos frecuentemente para diagnosticar infecciones bacterianas. Sin embargo, se pueden detectar antgenos o anticuerpos bacterianos en los fluidos biolgicos de pacientes infectados a travs de ensayos inmunolgicos tales como la contrainmunoelectroforesis, la coaglutinacin, la aglutinacin con ltex y los ensayos inmunoenzimticos (4-16). Los laboratorios hospitalarios y de salud pblica de los pases en desarrollo suelen utilizar sistemas de electroforesis o de contrainmunoelectroforesis con fines diagnsticos (15, 16). Pinon y Dropsy (14) combinaron la contraimunoelectroforesis (CIE) con tincin inmunoenzimtica para crear el denominado ensayo de inmunoelectrodifusin (ELIEDA). Este ensayo demostr ser ms sensible que el CIE en el serodiagnstico de infecciones parasitarias y fngicas (17). Antes de este estudio, el ELIEDA no se haba aplicado para la deteccin de
antgenos en las enfermedades infecciosas bacterianas. En el presente
estudio, este ensayo inmunoenzimtico se normaliz para detectar antgenos del grupo E. coli en muestras de orina de pacientes ambulatorios con E. coli U T I, utilizando un anticuerpo policlonal especfico. Este trabajo tambin compar ELIEDA con mtodos bacteriolgicos convencionales. MATERIALES Y MTODOS Especmenes de orina Se recolectaron y analizaron un total de 244 muestras de orina entre febrero de 1993 y mayo de 1994 de pacientes ambulatorios que estaban clnicamente sospechosos de infeccin del tracto urinario. Los especmenes fueron recolectados en dos localidades de la ciudad de So Paulo, Brasil, el Laboratorio de Microbiologa Clnica del Departamento de Anlisis Clnicos de la Universidad de So Paulo y el Hospital de la Universidad de So Paulo. Los pacientes ambulatorios tenan una edad de 2 a 90; El 75% de ellos eran mujeres y el 25% eran varones. Los especmenes fueron examinados por mtodos de cultivo cuantitativo estndar (2), y los resultados fueron comparados con los obtenidos por ELIEDA. Las muestras de orina que fueron negativas o positivas del cultivo cuantitativo de orina se utilizaron como controles para las pruebas ELIEDA. Los especmenes de orina utilizados como controles positivos fueron positivos para E. coli; No se aislaron microorganismos en los controles negativos. El serogrupo O6 de E. coli en suero hiperinmune se cultiv en caldo de soja trptico (Difco Laboratories, Detroit, MI, Estados Unidos de Amrica) durante una noche a 37C. En tres inoculaciones que contenan formalina al 5% (primera inoculacin, 0,3 ml, segundo, 0,5 ml, tercero, 1,0 ml), un conejo macho de Nueva Zelanda de 3 meses recibi bacterias del medio de cultivo completo y sus productos extracelulares. En tres inoculaciones posteriores de 2,0 ml cada una, no se us formalina. Se utiliz el mtodo de inoculacin de Ewing (18) y se recogi sangre 7 das despus de la ltima inoculacin. Los sueros obtenidos se almacenaron a 220 C. Los ttulos de anticuerpos se determinaron mediante una prueba de aglutinacin sobre la placa de vidrio (18). La estabilidad del suero hiperinmune se comprob a lo largo del perodo experimental, con la misma prueba de aglutinacin cuantitativa. Se utiliz el ensayo de inmunotransferencia (IBA) (19, 20) para caracterizar el suero policlonal, utilizando especmenes de orina de siete de los pacientes ambulatorios incluidos en el grupo de estudio. E. coli se aisl de dos de ellos; Otros tres presentaron Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis y Streptococcus sp .; Y los dos especmenes restantes eran totalmente negativos. Para el IBA, 20 ml de muestra, 2,3% p / v; Glicerol 10% v / v; B-mercaptoetanol al 5% v / v) a 20 ml de orina centrifugada, y la preparacin se hirvi durante 5 min. La electroforesis se llev a cabo en gel de SDS-poliacrilamida al 12%, se transfiguraron las bandas antignicas a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 mm (Millipore, Bedford, MA, Estados Unidos) y se incub la membrana con suero hiperinmune (1: 2000 a E. Coli). Despus del lavado, la membrana se incub con anticuerpo conjugado con peroxidasa (1: 2000) a inmunoglobulina G de conejo (IgG) (Cappel-Organon Teknika Corp., West Chester, PA, Estados Unidos) y se desarroll con diaminobencidina (DAB) ). Ensayo de inmunoelectrodifusin unida a enzima (ELIEDA) El ELIEDA se realiz como se describi anteriormente (14, 21), con algunas modificaciones. Para cada ensayo, se centrifugaron 5 ml de orina recin recogida en un tubo de vidrio cnico a 1 500 3 g durante 30 min. El
sedimento resultante ( 100 ml) se proces inmediatamente o se almacen
a 220 C. Se sumergi una tira de acetato de celulosa Cellogel (Chemetron, Miln, Italia) en tampn de Tris-glicinfosfato 0,1 M, pH 8,5, durante 15 min. La tira de acetato se retir entonces del tampn y se sec con papel de filtro. Se aplic un volumen de 10 ml del concentrado de orina a la tira de acetato de celulosa y se aadieron a la tira 5 ml de suero hiperinmune de conejo no diluido a E. coli a una distancia de 1,5 cm de la orina. Usando el mismo tampn Tris-glicina-fosfato, se llev a cabo la corrida eletrofortica durante 60 min a 110 V y 1 mA / cm de ancho. La tira se lav en NaCl al 0,85% que contena Tween 80 al 1% durante 30 min, con agitacin. Para obtener resultados ms especficos, la tira se trat con leche descremada al 5% en tampn fosfato 0,15 M (PBS), pH 7,2, que contena 0,05% de Tween 20, durante 30 min, con agitacin. Despus de lavar en PBS tres veces durante 15 min cada una, la tira se incub con conjugado de peroxidasa de IgG anti-conejo de oveja (Cappel-Organon Teknika Corp., West Chester, PA, Estados Unidos) diluido a 1: 500 en PBS, durante 30 min A 37 C. Despus de tres lavados ms de 15 min cada uno en PBS, la tira se incub a continuacin en una mezcla de 0,5 mg / ml de DAB y 1 ml / ml de H2O2 al 30% en tampn Tris-HCl 0,1 M, pH 7,6, durante 5 min. sacudida. Se aadi agua destilada para detener la reaccin. Despus de ser secada y transparente, se almacen la tira. En este ensayo, los especmenes de orina con varios serogrupos de E. coli desarrollaron una a cuatro lneas precipitantes. La primera lnea cercana a la mancha hiperinmune srica estaba presente de forma consistente en la orina de pacientes con IU de E. coli, por lo que se consider que esta lnea era especfica. Las lneas precipitantes ms distantes de la mancha srica hiperinmune se interpretaron como correspondientes a lneas reactivas cruzadas o no especficas (Figura 1). El ELIEDA se evalu en trminos de sensibilidad, especificidad, concordancia y valor predictivo positivo y negativo comparando sus resultados con los obtenidos por cultivo de orina, que se utiliz como patrn oro (22). Se determin la reproducibilidad inter e intraensayo, as como la estabilidad de los antgenos bacterianos en la orina que se haban almacenado a 220 C. RESULTADOS Cultivo de orina A travs de los cultivos de orina, se aislaron bacterias de 123 muestras de orina; No se encontr ningn microorganismo en los 121 ejemplares restantes. Se consider que un cultivo de orina con 105 unidades formadoras de colonias / mL (CFU / mL) era positivo, se consider que un cultivo con 104 pero <105 CFU / mL era limtrofe, y un cultivo con <104 UFC / mL Considerado negativo. Todos los microorganismos cultivados en el cultivo se identificaron mediante mtodos previamente descritos (23). De los 123 especmenes de orina infectados con bacterias, 71 fueron positivos para E. coli, y otros 5 fueron limtrofes para E. coli. De los 47 ejemplares de orina infectados restantes, 44 de ellos contenan una nica bacteria heterloga y 3 mostraban una asociacin de dos especies bacterianas diferentes. Las concentraciones de las 50 bacterias heterlogas variaron de 1,3 a 104 UFC / ml a 105 UFC / ml. De los 50, 35 de las bacterias heterlogas se encontraron en el nivel positivo y 15 en el nivel fronterizo. Ensayo ELIEDA El ELIEDA fue positivo para todos los 71 de los especmenes de orina en los que E. coli haba sido identificado a una concentracin bacteriana superior a 105 UFC / ml. Sin embargo, el ensayo ELIEDA dio resultados negativos para los 5
especmenes de orina con concentraciones de E. coli que oscilaban entre
1,2 3 104 y 5 3 104 UFC / ml. Estos valores inferiores a 105 UFC / ml se consideran convencionalmente no significativos desde el punto de vista clnico (10, 24). En una de estas 5 muestras de orina se observ una asociacin de E. coli con P. mirabilis. El ELIEDA fue negativo para todos los 121 de los especmenes de orina para los cuales los cultivos haban dado resultados negativos. El ELIEDA tambin fue negativo para los 44 especmenes de orina de los cuales se aislaron especies bacterianas heterlogas mediante cultivo cuantitativo de orina. El ELIEDA fue positivo para 3 muestras de orina de las cuales se aislaron especies bacterianas heterlogas mediante cultivo cuantitativo de orina. Las tres bacterias que fueron reactivas cruzadas con el suero anti-E.c o 1 i fueron K. pneumoniae, Klebsiella oxytoca y P. mirabilis. Una comparacin de los resultados en la deteccin de antgenos de E. coli por cultivo cuantitativo de orina y por ELIEDA se da en la Tabla 1. Los rasgos diagnsticos de ELIEDA pueden expresarse en trminos de sensibilidad, especificidad, acuerdo y valor predictivo positivo y negativo. Los valores encontrados en este estudio fueron: 93,4% (95% IC = 85,0% -97,2%), 98,2% (95% IC = 94,9% -99,4%), 96,7% (95% IC = 93,7% -98,3% 95,9% (IC del 95% = 88,7% -98,6%) y 97,1% (95% CI = 93,3% -98,7%), respectivamente. Un grupo de 29 muestras de orina almacenadas a 220 C no mostr diferencias en sus resultados incluso despus de dos a cinco congelaciones-descongelaciones consecutivas durante un perodo de 10 meses. El suero hiperinmune no cambi en el ttulo de aglutinacin (1: 4 096) durante este periodo de estudio. La reactividad del conejo hiperinmune Se caracteriz por IBA para determinar la especificidad y la reactividad cruzada entre los antgenos de E. coli excretados con orina, otros antgenos enterobacterianos (K. pneumoniae y P. mirabilis) y los antgenos Gram positivos ( Streptococcus sp.) Antgenos bacterianos. El suero hiperinmune reaccion con todos los especmenes de orina estudiados. Sin embargo, se detectaron bandas de 77, 66, 51, 43 y 21 kDa en muestras de orina positivas para E. coli. Las muestras de orina que fueron positivas para bacterias heterlogas mostraron una a cuatro bandas, que fueron combinacin de bandas 77, 66, 51, 24 y 22 kDa. En dos muestras de orina negativas, se visualiz una banda de 77 kDa. Para identificar cules de estas bandas corresponden a las lneas de precipitacin de ELIEDA, el suero hiperinmune debe ser absorbido con antgenos excretados concentrados de E. coli y reexaminados en el IBA. Es difcil establecer una correlacin directa entre las lneas de precipitacin de ELIEDA y las bandas te~nidas con IBA ya que en el ELIEDA los antgenos bacterianos eran crudos, mientras que en el IBA estos antgenos se trataron con b-mercaptoetanol. DISCUSIN En las infecciones de las vas urinarias, Las pruebas pueden proporcionar un diagnstico presuntivo ms rpido que los mtodos bacteriolgicos convencionales. El ELIEDA para la deteccin del antgeno de E. coli tiene algunas caractersticas interesantes. Por ejemplo, los resultados estn disponibles dentro de las 4 horas de la recoleccin de orina. Adems, las tiras de acetato de celulosa teidas se pueden almacenar durante un largo perodo de tiempo despus de ser hechas transparentes. Esto permite revisar los resultados y realizar estudios retrospectivos. Las caractersticas diagnsticas del ELIEDA son prometedoras debido a la alta
sensibilidad y especificidad de la prueba y otros parmetros diagnsticos.
Cuando la concentracin de E. coli era superior a 105 UFC / ml, es decir, clnicamente significativa, se observ un acuerdo del 100% entre ELIEDA y el mtodo cuantitativo de cultivo de orina. La reproducibilidad del ELIEDA se consider satisfactoria ya que 10 muestras de orina procedentes de pacientes con IU dieron resultados positivos similares cuando se probaron dos veces el mismo da, y otras 17 muestras de orina procedentes de pacientes con IU dieron resultados positivos similares en tres das diferentes. Los datos obtenidos en el presente estudio son mejores que los obtenidos con el Bac-T-Screen, un mtodo de deteccin rpida utilizado con frecuencia para determinar bacteriuria y / o pyuria inespecficos. En un estudio realizado por Davis et al. (25), la sensibilidad, especificidad y valor predictivo positivo y negativo de este mtodo fueron 93,2%, 77,2%, 69,2% y 95,5%, respectivamente, para 104 UFC / mL. Nuevos mtodos de cribado recientemente reportados (26, 27) tienen menor sensibilidad que el ELIEDA pero similar especificidad. Estos mtodos, sin embargo, generalmente toman de 18 a 24 horas para proporcionar resultados, mucho ms largos que las 4 horas que ELIEDA requiere. Como est estandarizado aqu, ELIEDA proporciona datos que reflejan tanto la identificacin bacteriana como la bacteriuria significativa. El criterio ms aceptado para la bacteriuria, 105 UFC / ml, se tom como referencia en el presente estudio, aunque este valor puede variar segn las diferentes condiciones individuales (1, 2, 24). Cinco muestras de orina en las que E. coli se identific por el mtodo bacteriolgico, pero a concentraciones de 5 3 104 UFC / mL fueron negativas con ELIEDA. Estos resultados implican que estas personas estaban en la etapa inicial de la infeccin por E. coli o que sus muestras de orina estaban contaminadas. La significacin de los recuentos bajos de E. coli podra ser elucidada slo cuando se recogen nuevas muestras de orina de los mismos pacientes ambulatorios.
En tres muestras de orina se observ una asociacin de dos bacterias en los
cultivos. Sin embargo, los P. mirabilis, S. saprophyticus y S. aureus encontrados fueron probablemente contaminantes, ya que su conteo fue mucho menor que 105 UFC / mL. Como una infeccin concomitante por dos bacterias es infrecuente en las ITU, las bacterias asociadas con recuentos bajos se interpretaron como contaminantes de las muestras de orina. UTI con bacterias heterlogas se observ en 35 pacientes ambulatorios. Los 12 pacientes ambulatorios restantes fueron casos lmite; UTI podra o no haber desarrollado, por lo que estos pacientes ambulatorios deben haber sido objeto de seguimiento. El ELIEDA mostr alta especificidad, pero se observ reactividad cruzada con tres enterobacterias: K. pneumoniae, K. o x y t o c a, y P. mirabilis. A p re r p a r e n t l, la reactividad cruzada parece estar relacionada con las cepas bacterianas en lugar de con las especies. Las
absorciones del suero hiperinmune no se llevaron a cabo con cepas
bacterianas reticuladas. Dado que la reactividad cruzada se produce slo en algunas cepas bacterianas y no en especies, se piensa que las absorciones son difciles. Los antgenos bacterianos de las muestras de orina demostraron ser resistentes a varios ciclos de congelacin-descongelacin y parecen ser polisacridos. Este aspecto est ahora bajo investigacin. La reactividad del antisuero de conejo con antgenos de E. coli O6 y la reactividad cruzada de IBA con otras bacterias no relacionadas puede proporcionar una base para producir otros anticuerpos monoclonales para inmunoensayos diseados para capturas de antgenos bacterianos. A pesar de que ELIEDA an no est automatizado, es adecuado para los pases en desarrollo ya que se puede adaptar fcilmente a cualquier laboratorio en el que se lleve a cabo la electroforesis srica habitual. Para un laboratorio de salud pblica, el costo sera de aproximadamente US $ 0,70 por muestra de orina. Otra ventaja de ELIEDA es la posibilidad de almacenar tiras manchadas durante un largo perodo de tiempo, permitiendo as estudios retrospectivos. Los presentes hallazgos sugieren que el ELIEDA es til para la deteccin diagnstica de laboratorio de ITU causada por E. Co l Sin embargo, este ensayo podra mejorarse concentrando la orina, para obtener resultados ms sensibles; Preparar una mezcla de suero hiperinmune especfico para diferentes especies bacterianas; Y la identificacin y caracterizacin de antgenos bacterianos en las excreciones urinarias.