Universidad de Oviedo

Manipulación genética de microorganismos para la obtención

de nuevos fármacos de tipo indolocarbazol

César Sánchez*, Aaroa Pérez, Alfredo F. Braña, Carmen Méndez y José A. Salas
Departamento de Biología Funcional
e Instituto Universitario de Oncología del Principado de Asturias (IUOPA)
Universidad de Oviedo
 Generación de nuevos compuestos bioactivos
mediante manipulación genética de microorganismos

Un microorganismo produce un compuesto

con actividad biológica reconocida

Identificación de los genes responsables de su biosíntesis

Manipulaciones genéticas

Obtención de nuevos productos derivados

Ensayos de actividad biológica

 Compuestos antitumorales en estudio
H
H3C H3C H3CO OH O N O
O HO O
HO O CH3
HO O
H
O OH OH
H3C O
O
OH OH O O N N
HO H
H3C
H3C CH3
O O Cl Cl
O HO O O OH
HO O
H3C
O HO

OH
HO
MITRAMICINA OH O OH OMe
(inhibidor de replicación y transcripción de ADN)
Streptomyces argillaceus OVIEDOMICINA REBECAMICINA
(inductor de apoptosis) (inhibidor de ADN topoisomerasa I)
Streptomyces antibioticus Lechevalieria aerocolonigenes
OCH3
CH3 OOCCH3
O
HO CH3 OCH3 OH H
O H N O
O O CH3 CH3 CH3 CH3

O OH OH
H3C O
OH OH O OH O
H3C N N
H3C
H3C O
O HO
O O
NC H
HO O
O
CH3 COOH MeO
H3C
O
H3CCOO
NHCH3
HO

CROMOMICINA BORRELIDINA ESTAUROSPORINA

(inhibidor de replicación y transcripción de ADN) (inhibidor de angiogénesis) (inhibidor de quinasas)
Streptomyces griseus Streptomyces parvulus Streptomyces longisporoflavus
Indolocarbazoles: nuevos agentes antitumorales

H
O N O H
N O

N N
H N N
Cl Cl
O OH O
H3C H
HO
H3CO
OH
NHCH3
OCH3
ESTAUROSPORINA
REBECAMICINA
Derivados en ensayos clínicos:
Derivados en ensayos clínicos: PKC412, CEP-751,
NSC655649 (“rebeccamycin analog”), UCN-01 (7-hidroxi-estaurosporina)
NB-506, J-107088
 Aislamiento de genes biosintéticos de rebecamicina

Genoteca del ADN cromosómico de

Lechevalieria aerocolonigenes ATCC 39243
(cósmido pKC505: bifuncional E. coli - Streptomyces)

Hibridación en colonia (sonda: fragmento interno del gen ngt)

Cósmidos positivos

Transformación de protoplastos de Streptomyces albus

¿ Producción de rebecamicina ?
 Streptomyces albus conteniendo cósmidos “reb”

Extracción y purificación

Caracterización estructural
1400
* O
H
N O

min N N
6.0 12.0 H
Cl Cl
O OH
Streptomyces albus / cósmido 14E8 HO
OH

OCH3

Rebecamicina
 Los genes biosintéticos de rebecamicina

1 kb

G O D C P M R F U H T

Formación de indolocarbazol Metilación del azúcar

Glicosilación Secreción
Halogenación Regulación
 Biosíntesis de rebecamicina: ruta propuesta (I-III)

II. Dimerización
I. Modificación del triptófano
III. Cierre del sistema de anillos

H
NH2 NH2
HOOC HOOC RebO O N O
RebH RebD
x2
N N RebC
RebC
H Cl H RebP N N
RebP H H
L-triptófano Cl Cl
aglicón
 Biosíntesis de rebecamicina: ruta propuesta (IV-V)

IV. Glicosilación V. Modificación del azúcar

H
H N
N O O
O O

H
O N O N N
RebG N N RebM
RebG Cl H Cl
Cl H Cl
OH
OH O
N N O
Cl H H Cl HO HO

OH OH
aglicón
OH O
CH3
rebecamicina
Expresión heteróloga de genes biosintéticos de rebecamicina

1 kb

G O D C P M R F U H T

p O D C P M pREB6

G O D C P M R F U pREB7
 Streptomyces albus / pREB6

p O D C P M pREB6

(Compuesto esperado: aglicón de descloro-rebecamicina)

Análisis HPLC
H
O N O
mAU

600
1

N N
H H
min
10.0 20.0

Aglicón de descloro-rebecamicina
 Streptomyces albus / pREB7

G O D C P M R F U pREB7
(Compuesto esperado: descloro-rebecamicina)

H
O N O
Análisis HPLC
mAU 2 (R=CH3)
2 Descloro-rebecamicina
150 N N
H

O OH 3 (R=H)
3 HO 4’-Desmetil-descloro-
min
10.0 20.0 OH rebecamicina

O R
 Biosíntesis combinatoria de indolocarbazoles (I)
H
O N O
O
CH3
H2N
Cl O
NH O
N N
N H H
H O N O
CH3
Cl Cl
H3C
O OH
OH
O

HO N N
O OH
CH3
OCH3 O
O H 3C H
O
rebecamicina H3CO
O CH3
NHCH3
O (Lechevalieria aerocolonigenes)
HN OH
estaurosporina
OH (Streptomyces longisporoflavus)
CH3
H 3C
CH3
COOH

H
pirroindomicina β N O
(Streptomyces rugosporus) R1

R6 R7
O
NH
HN
O O
R4 N N R5 HO
NH2 H H
S R2 R3 N
H
Cl N
H
R1= CO, CHOH, CH2 violaceína
tienodolina R2 , R3= H, Cl, Br (Chromobacterium violaceum)
(Streptomyces albogriseolus) R4 , R5= H, Cl, Br
R6 , R7= H, Cl, Br, OH
 Biosíntesis combinatoria de indolocarbazoles (II)

S. longisporoflavus
L. aerocolonigenes rebecamicina estaurosporina

G O D C P M R F U H T
genes biosintéticos

S. rugosporus pirroindomicina

H
staC

M pyrH
estructura básica banco de genes S. albogriseolus tienodolina
S. albus G
modificadores
O D C P thal

vioC

vioD
C. violaceum violaceína
 Biosíntesis combinatoria de indolocarbazoles (III)
staC pyrH Ensayos de actividad antitumoral
H staC
vioC vioD G
M pyrH
staC
Caracterización estructural
banco de genes H staC G (MS, NMR)
modificadores
G thal
thal
staC vioD G M
vioD vioC combinaciones de genes
Extracción y purificación (HPLC)
modificadores (en plásmidos)

estructura básica
S. albus
O D C P
I. Modificación III. Cierre del V. Modificación
II. Dimerización IV. Glicosilación
de Trp sistema de anillos del azúcar

RebC
RebP

StaC
RebP

RebH

RebC
RebP
RebO RebM
RebD RebG
StaC
RebP

PyrH

RebC
RebP

StaC
RebP
 Trabajo en curso y planes inmediatos

Agotar las posibilidades de la biosíntesis combinatoria de indolocarbazoles:

Modificaciones del sistema de anillos (aglicón)

Modificaciones del azúcar

Y combinar ambos tipos de modificaciones