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B G.A., Moreno D., Cutaia L., Baruselli P.S. & Reis, E.L. 2004.

Manipulao hormonal do ciclo estral em doadoras e receptoras


Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004
de embrio bovino. Acta Scientiae Veterinariae, 32 (Supl ): p.1-22.

MANIPULAO HORMONAL DO CICLO ESTRAL EM DOADORAS E RECEPTORAS


DE EMBRIO BOVINO
G.A. B1; D. Moreno1; L. Cutaia1; P.S. Baruselli2; E.L. Reis2
1

Instituto de Reproduccin Animal Crdoba (IRAC), J.L. de Cabrera 106, X5000GVD Crdoba,
Argentina; 2Departamento de Reproduo Animal, FMVZ-USP, So Paulo, Brazil, 05508-000

RESUMO
Embora a transferncia de embries seja uma tcnica amplamente empregada em todo o mundo, a variabilidade
da resposta ao tratamento superovulatrio ainda uma importante limitao. Essa variabilidade pode ser
controlada levando em considerao os conhecimentos da funo ovariana. Em bovinos, recentes protocolos
para o controle da dinmica folicular e lutenica permitem iniciar o tratamento superovulatrio em momento
predeterminado. A aspirao folicular guiada por ultra-sonografia (incio do tratamento superovulatrio 1 a 2
dias aps) e o tratamento com estrgeno e progesterona (incio do tratamento superovulatrio 4 dias aps)
tm sido amplamente utilizados em protocolos de superovulao, com produo embrionria equivalente a
doadoras superovuladas com o sistema tradicional (incio do tratamento superovulatrio 8 a 12 dias aps o
estro). Em receptoras, recentes protocolos foram elaborados para controlar o status lutenico e folicular,
possibilitando uma eficiente sincronizao e permitindo a transferncia de embries sem a necessidade de
deteco de estro (TETF). O tratamento com GnRH, associado a prostaglandina F2 (PGF) 7 dias aps e
a uma segunda aplicao de GnRH 48h aps a PGF (protocolo Ovsynch) tm apresentado aceitveis
taxas de prenhez aps a inseminao artificial em tempo fixo em vacas de leite e em receptoras inovuladas
sem deteco do estro. Como alternativa, tratamentos com estrgeno e dispositivos contendo progesterona/
progestgenos tm apresentado taxas de prenhez comparveis quelas obtidas em receptoras inovuladas 7
dias aps a deteco do estro. Alm disso, o tratamento com estrgeno e progesterona associado a PGF e
ao eCG (administrado 1 dia aps a emergncia folicular) tem apresentado altas taxas de receptoras selecionadas
e de prenhez. Esse tratamento freqentemente utilizado para sincronizao de um grande nmero de receptoras
na Amrica do Sul. Com esse protocolo 85 a 90% das receptoras tratadas so selecionadas para TE, com
taxa de prenhez (receptoras prenhes por receptoras tratadas) em torno de 40 a 50%. possvel obter um
custo benefcio satisfatrio com o emprego de um protocolo que resulte em 40 a 50% de prenhez, considerando
que o tratamento tambm elimina a necessidade de deteco do estro e reduz o intervalo entre o tratamento
e a prenhez.
Palavras chave: desenvolvimento folicular, estrgeno, progesterona, transferncia de embrio em tempo
fixo, superovulao
Aknowledgments
Research was supported by the Agencia Crdoba Ciencia and Instituto de Reproduccin Animal Crdoba
(IRAC), Argentina. We also thank Syntex S.A., Argentina for DIB, InterAG, New Zealand for CIDR-B and
Bioniche Animal Health, for Folltropin-V. Special thanks to our colleagues of IRAC, U. of Saskatchewan and
U. of So Paulo for technical assistance. e-mail: gabrielbo@iracbiogen.com.ar
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INTRODUO
Embora a transferncia de embries seja uma tcnica amplamente empregada em todo o mundo, com
mais de 500 mil embries transferidos por ano, a variabilidade da resposta ao tratamento superovulatrio
ainda uma importante limitao (20). Maiores conhecimentos da funo ovariana, recentemente adquiridos
pela ultra-sonografia, possibilitam controlar o desenvolvimento folicular e a ovulao. Recentes protocolos,
que controlam a funo folicular e lutenica, permitem iniciar o tratamento superovulatrio e a sincronizao
das receptoras em momento predeterminado. O objetivo desse artigo revisar esses protocolos e discutir
seu impacto e aplicao em programas de transferncia de embries, com destaque especial na Amrica do
Sul.

SINCRONIZAO DO ESTRO E DA OVULAO


A Prostaglandina F2 tem sido o tratamento mais empregado para a sincronizao do estro em bovinos (revisado no artigo 64). Estudos anteriores mostraram que a maturidade do CL no momento da aplicao de PGF influenciou a resposta luteoltica e que a PGF no induziu efetiva lutelise durante 5 a 6 dias aps
o estro (63). Alm disso, em vacas que ocorreu a lutelise, o estro foi detectado ao longo de 6 dias (45).
Estudos recentes mostraram que o intervalo entre o tratamento com PGF e a manifestao do estro determinado pelo estgio de desenvolvimento do folculo dominante no momento do tratamento (37). Se a PGF
for administrada quando o folculo dominante estiver na fase final de crescimento ou no incio da fase esttica,
a ovulao ocorrer em 3 a 4 dias. Por outro lado, se o tratamento com PGF for realizado no momento em
que o folculo dominante estiver no meio ou no final da fase esttica, a ovulao do folculo dominante da
prxima onda de crescimento folicular ocorrer aps 5 a 7 dias (37). Esse intervalo reflexo do tempo
necessrio para que o folculo dominante da nova onda cresa e se desenvolva at o estgio pr-ovulatrio
e enfatiza a necessidade do controle folicular e lutenico para a obteno de altas taxas de prenhez em
programas de IA e TE em tempo fixo, sem a necessidade de deteco do estro.
Geralmente, os tratamentos usados para a sincronizao de receptoras consistem na administrao de
duas doses de PGF com intervalos de 11 a 14 dias (22). Se todas as receptoras estiverem ciclando, em torno
de 80% delas apresentaro sinais de estro 5 dias aps o tratamento. Entretanto, devido a baixa acurcia na
deteco do estro, apenas 50% das receptoras tratadas sero detectadas em cio, apresentaro CL e recebero um embrio 7 dias aps o estro (20). Essa situao pode apresentar maiores comprometimentos se as
receptoras utilizadas forem Bos indicus ou cruza Bos indicus criadas a pasto. A tabela 1 exemplifica taxas de
aproveitamento das receptoras em programas comerciais de transferncia de embries no Brasil e na Bolvia.
A taxa total de prenhez foi em torno de 13% devido ao baixo nmero de receptoras detectadas em estro e/
ou que apresentavam CL no momento da transferncia dos embries (Burry, comunicao pessoal, citado
em 20). Essa ineficincia afeta sobremaneira a viabilidade desses programas em receptoras criadas a pasto
na Amrica do Sul.

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TRATAMENTOS HORMONAIS PARA O CONTROLE DA EMERGNCIA DA ONDA DE CRESCIMENTO FOLICULAR E DA SINCRONIZAO DA OVULAO
GnRH
Tem sido demonstrado que a administrao de GnRH induz a ovulao ou a luteinizao do folculo
dominante presente no momento do tratamento (46). Vrias pesquisas foram realizadas para tentar desenvolver protocolos que empregam GnRH e PGF para inseminao artificial em tempo fixo em bovinos de leite
e de corte (65, 66, 69, 71, 74). Esse protocolo conhecido como tratamento Ovsynch (66) e consiste na
administrao de GnRH seguido de PGF 7 dias aps, um segundo tratamento com GnRH 48 horas aps a
PGF e a inseminao artificial em tempo fixo 16 horas depois. A administrao de GnRH induzir um pico de
LH, resultando na ovulao ou luteinizao do folculo dominante e emergncia de uma nova onda de crescimento folicular nos prximos 2 dias. A administrao de PGF 7 dias aps o primeiro GnRH induz a
lutelise e o segundo GnRH promove outro pico de LH e sincroniza a ovulao do novo folculo dominante.
Outros autores utilizaram um protocolo similar em bovinos de corte com intervalo de 6 dias entre a primeira
administrao de GnRH e o tratamento com PGF (55, 80).
O protocolo Ovsynch tem sido mais eficiente em vacas que em novilhas (66,55). Resultados de
recentes estudos confirmaram que o tratamento com GnRH nem sempre induz a ovulao ou a luteinizao
do folculo dominante em novilhas. Verificou-se tambm, que a emergncia da nova onda de crescimento
folicular sincronizada somente quando o tratamento causa ovulao (54). Consequentemente, a ovulao
ao segundo GnRH pode apresentar comprometimentos se o tratamento com o primeiro GnRH no sincronizar a emergncia da nova onda de crescimento folicular. Ainda, foi verificado que algumas novilhas podem
manifestar sinais de estro antes do tratamento com o segundo GnRH. A preveno de ovulaes precoces
pode ser alcanada pela adio de um CIDR-B (Pfizer Animal Health) por 7 dias durante o protocolo
Ovsynch, verificando aumento significativo na taxa de prenhez em novilhas inseminadas em tempo fixo
(55).
O protocolo Ovsynch tambm tem sido utilizado para sincronizar a ovulao em receptoras de
embries produzidos in vivo (5, 36, 84) ou in vitro (2). Em dois estudos, novilhas (5, 84) e vacas (84) Bos
indicus x Bos taurus foram tratadas com uma dose de PGF e submetidas a observao de estro por 5 dias
ou com o protocolo Ovsynch sem a deteco do estro. Sete dias aps o estro (Grupo PGF) ou aps a
segunda administrao de GnRH (grupo Ovsynch), as receptoras que apresentavam CL detectado por ultra3

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sonografia (5) ou por palpao retal (84) foram selecionadas para a transferncia de embrio. Todas as
receptoras selecionadas receberam por transferncia direta um embrio descongelado. A taxa de prenhez foi
maior em receptoras tratadas com o protocolo Ovsynch (Tabela 2); nesse grupo um maior nmero de
receptoras foram inovuladas por no depender da deteco do estro. tambm digno de nota que em um
dos estudos (5), 53,7% das novilhas tratadas com PGF foram detectadas em estro, reflexo da dificuldade de
observao de cio em Bos indicus, confirmando a informao anteriormente mencionada nesse artigo (27).

Em outro estudo (10, 36), 499 vacas lactantes cruza Bos taurus (28 a 92 dias ps parto) foram
divididas em 3 grupos experimentais. As vacas do grupo controle foram tratadas com GnRH no dia 0, PGF
no dia 7 e o estro foi detectado pelo sistema Heat Watch (GnRH + PGF). As vacas dos outros 2 grupos
foram tratadas somente com o protocolo Ovsynch (Ovsynch) ou com o protocolo Ovsynch associado a
um implante de norgestomet (SMB, Syncro-Mate-B, Merial) por 7 dias (Ovsynch + P4) e no foram submetidas a observao de estro. Seis a 8 dias aps o estro (Grupo GnRH + PGF) ou sete dias aps a segunda
administrao de GnRH (Grupo Ovsynch e Ovsynch + P4) as vacas foram examinadas por palpao retal e
aquelas que apresentavam CL receberam por transferncia direta um embrio descongelado grau 1 ou 2.
Apesar da taxa de concepo (receptoras prenhas/receptoras inovuladas) ter apresentado uma tendncia
(P<0,07) de melhores resultados nas vacas do grupo GnRH + PGF, a taxa de prenhez total no diferiu
significativamente entre os grupos, principalmente pelo maior numero de receptoras (P< 0,01) selecionadas
para transferncia de embrio nos grupos Ovsynch e Ovsynch + P4 (Tabela 3). Os mesmos pesquisadores
tambm fizeram experimentos a campo envolvendo 1637 receptoras tratadas com protocolo Ovsynch
associado a um implante auricular SMB ou a um dispositivo intravaginal CIDR-B sem a deteco do estro,
obtendo taxa de prenhez total de 59,9% (12). Resumidamente, os resultados desses estudos indicaram que
aceitveis taxas de prenhez podem ser obtidas quando embries so transferidos para receptoras submetidas sincronizao da ovulao sem a necessidade de deteco do estro. Na figura 1 est descrito o
protocolo.

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Figura 1. Protocolo Ovsynch ou Ovsynch associado a um dispositivo de progestgeno/progesterona


(Ovsynch+P4) para TETF em fmeas bovinas. O protocolo Ovsynch consiste na aplicao de
GnRH no dia 0, seguido pela administrao de PGF no dia 7 e uma segunda aplicao de GnRH
no dia 9. No tratamento Ovsynch + P4, um implante de progestgeno ou um dispositivo liberador
de progesterona inserido no dia 0 e removido no dia 7. No efetuada a deteco do estro e a
inovulao realizada no dia 16 (receptoras que apresentem CL).

Progesterona
Estudos realizados para avaliar diferentes protocolos a base de progestgenos/progesterona mostraram que tratamentos longos para regresso espontnea do CL (14 d), sincronizam o estro. No entanto,
esses tratamentos levam formao de folculos dominantes de maior tamanho (persistentes; 29, 40, 70, 73)
e de reduzida fertilidade (68, 83). A baixa fertilidade atribuda a maturao espontnea do ocito (quebra
da vescula germinativa e expanso do cmulus) presente no folculo persistente (67). Tratamentos que induzem a regresso do folculo persistente e levam emergncia de uma nova onda de crescimento folicular
melhoraram as taxas de prenhez em programas de IA (38, 43). Baseado nos resultados de um estudo
anterior acreditava-se que, o folculo persistente no afetava a qualidade do CL e a taxa de concepo em
receptoras (81). No entanto, nesse estudo as taxas de prenhez foram baixas (em torno de 30% em todos os
tratamentos). Entretanto, resultados de um recente estudo indicaram que um CL de maior tamanho, originado de um folculo persistente, diminui as taxas de concepo (49).
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Progesterona e estrgeno
Nos ltimos anos, o tratamento com estrgeno e progestgeno/progesterona tem sido cada vez mais
empregado em programas de sincronizao do estro em bovinos de leite e de corte (48, 18, 28, 38, 55). O
tratamento consiste na insero de um dispositivo contendo progestgeno/progesterona e na administrao
de estrgeno e progestgeno/progesterona no dia 0 (para emergncia de uma nova onda de crescimento
folicular e preveno de folculos persistentes), de PGF no momento da retirada do dispositivo nos dias 7, 8
ou 9 (induo da lutelise), e subseqente aplicao de reduzida dose de estradiol aps 24 h (30) ou de
GnRH/LH aps 48 a 54 h (18, 55) para sincronizao da ovulao. As taxas de prenhez IATF mostraramse similares s da IA com deteco de estro (38).
Uma srie de experimentos foram realizados para avaliar o emprego de protocolos a base de estrgeno
e progesterona para IATF na sincronizao de receptoras para transferncia de embries em tempo fixo. Em
um experimento (77), as vacas do grupo estrgeno/progesterona receberam um dispositivo intravaginal contendo progesterona CIDR-B, associado a 2 mg de benzoato de estradiol e 50 mg de progesterona im no dia
0, PGF no momento da remoo do CIDR-B no dia 7 e 1 mg de BE no dia 8. No observou-se estro e o dia
9 foi considerado o dia do estro. As vacas do grupo controle foram tratadas com 2 doses de PGF com 14
dias de intervalo e submetidas a observao de cio por 5 dias. Sete dias aps o estro (grupo PGF) ou o dia
esperado do estro (grupo CIDR-B), todos os animais que apresentavam um CL (> 15 mm estimado por
palpao retal) receberam por transferncia direta um embrio descongelado. As taxas de prenhez (receptoras
prenhas/receptoras tratadas) no diferiram entre os tratamentos (PGF: 32,0% vs CIDR-B: 37%; P>0,6).
Estes resultados foram confirmados em outros 2 experimentos nos quais no observou-se diferena entre
receptoras tratadas com CIDR-B por 7 ou 8 dias (19) e DIB (Syntex, Argentina) por 8 dias (19).
Apesar do uso de estrgeno e progestgeno/progesterona ter eliminado a deteco do cio, as taxas de
prenhez mantiveram-se em torno de 20 a 35%, necessitando serem aumentadas (20). Assim, 2 estudos
foram realizados para verificar se o momento da administrao de PGF no protocolo a base de estrgeno e
progestgeno/progesterona afetaria o nmero de receptoras selecionadas para TE. As vacas foram tratadas
com dispositivo intravaginal contendo progesterona (DIB) associado a 2 mg de BE e 50 mg de P4 im no dia
0, e foram divididas homogeneamente para receberem PGF no dia 4 (dia esperado da emergncia da nova
onda de crescimento folicular) ou no dia 8 (momento da retirada do DIB). No dia 9, todas as vacas receberam 1 mg de BE im e o dia 10 foi considerado o dia do estro. As receptoras que apresentaram um CL 12
mm de dimetro no dia 17 receberam um embrio. No primeiro experimento, o desenvolvimento folicular foi
monitorado por ultra-sonografia diria. A aplicao de PGF no momento da emergncia folicular (Dia 4),
comparada aplicao de PGF no momento da retirada do dispositivo contendo progesterona (Dia 8),
aumentou o dimetro do folculo dominante (13,20,2 vs. 11,50,2 mm; P<0,05); antecipou o momento da
ovulao (66,60,4 vs 70,82,3 h; P<0,01) e aumentou a concentrao plasmtica de progesterona no dia
da inovulao (6,90,8 vs 5,20,6 ng/ml; P=0,08; 57). No segundo experimento, o tratamento com PGF no
dia 4 aumentou a proporo de receptoras selecionadas para TE (70,5%; P<0,02) e a taxa de concepo
(41,1%; P<0,004) comparado ao tratamento com PGF no dia 8 (52,7% e 21,5%, respectivamente). Alm
disso, foi colhida uma amostra de sangue em um grupo de animais e o tratamento com PGF no dia 4 (6,80,7
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ng/ml; n=43) aumentou a concentrao plasmtica de progesterona, comparado ao tratamento com PGF no
dia 8 (4,00,4 ng/ml; n=27; P=0,008).

Tratamentos com eCG para aumentar a concentrao plasmtica de progesterona e a taxa de


prenhez

Diversos estudos relacionaram as taxas de concepo com as concentraes plasmticas de progesterona


em bovinos (revisado em 74). No entanto, a suplementao com progesterona tem apresentado resultados
inconsistentes na taxa de concepo. A insero de uma dispositivo intravaginal de progeterona CIDR-B no
momento da TE aumentou 12,8% na taxa de concepo de receptoras cclicas em lactao (47). Entretanto,
nosso grupo no foi capaz de demonstrar nenhum benefcio do CIDR-B em receptoras novilhas e vacas de
leite, e em novilhas cruza Bos indicus (76). Bousquet (comunicao pessoal) foi capaz de verificar efeito
benfico da suplementao com P4 aps a TE somente em embries de baixa qualidade, e Fuentes (32)
relatou aumento nas taxas de concepo somente quando o PRID foi inserido em novilhas que apresentavam
CL de tamanho reduzido. Em um estudo mais recente a insero de um CIDR-B do dia 7 ao dia 20 do ciclo
estral no resultou em aumento significativo da concentrao plasmtica de P4 em novilhas (52). Uma alternativa para o aumento das concentraes plasmticas de P4 pode ser a formao de um CL acessrio pela
induo da ovulao do folculo dominate com hCG ou pela insero do implante de deslorelina no dia 5 do
ciclo estral (revisado em 74). Em receptoras Bos indicus o tratamento com hCG no dia 7 aumentou a
concentrao plasmtica de P4 (52) e os tratamentos com GnRH, hCG, pLH ou CIDR-B aumentaram as
taxas de concepo. Levando todos os trabalhos em considerao, os efeitos benficos da maior concentrao de P4 parecem ser evidentes apenas quando as taxas de concepo das receptoras controle (no
tratadas) foram menores que o esperado, sugerindo que o escore de condio corporal, ciclicidade e/ou
qualidade o embrio podem ser fatores que contribuem na eficincia dos programas de TE.
Outra estratgia para aumentar as concentraes circulantes de progesterona em receptoras a induo
de mltiplas ovulaes pela administrao de eCG durante o protocolo de sincronizao. Fuentes e de la
Fuente (33) foram os primeiros a reportar que o tratamento com 1000UI de eCG no dia 4 do tratamento
com PRID por 6,5 dias e com 17 estradiol em novilhas Holandesas resultou em mltiplos CLs (2 a 5 por
ovrio), maior (P<0,05) nmero de receptoras selecionadas para TE (89,7%) e maior taxa de prenhez
(58,6%) quando comparados s novilhas sincronizadas com o mesmo tratamento sem eCG (49,1% e 22,2%,
respectivamente). As receptoras tratadas com dose nica de PGF (44,8% e 19,0%, respectivamente) ou
que receberam um embrio 7 dias aps o cio natural (50,0% e 28,8%, respectivamente) tambm apresentaram menor eficincia. Em outro estudo (6), novilhas Bos taurus x Bos indicus foram tratadas com CIDR-B
por 7,5 dias, combinado com 2mg de BE e 50mg de P4 im no dia 0. Metade das novilhas receberam 800UI
de eCG no dia 5 e todas novilhas receberam PGF no dia 7 e 1 mg de BE im no dia 8. Todos animais foram
examinados por ultra-sonografia 1 dia antes da TE e uma amostra de sangue foi colhida para determinao
da concentrao plasmtica de P4. Os resultados mostrados na Tabela 4 revelaram que o tratamento com
eCG aumentou o nmero de ovulaes (nmero de CL), a concentrao plasmtica de P4 e a taxa de
prenhez.
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tambm digno de nota que, considerando apenas as receptoras com 1 CL, a rea do CL (P<0,01)
e a concentrao plasmtica de P4 (P=0,1) tambm foram maiores nas novilhas tratadas com eCG (2,9
0,6 cm2 e 2,31,6 ng/mL; n=8), que nas no tratadas com eCG (2,20,5 cm2 e 1,30,8 ng/mL; n=17).
Um posterior estudo foi realizado para avaliar se uma menor dose de eCG tambm poderia aumentar
as taxas de prenhez em receptoras inovuladas em tempo fixo. Vacas Bos taurus x Bos indicus foram tratadas
com DIB combinado com 2mg de BE e 50mg de P4 im no dia 0. Metade das vacas receberam 400UI de
eCG im e todas receberam PGF no dia 5. O DIB foi retirado no dia 8 e 1mg de BE im foi administrado no dia
9. Todas as vacas foram examinadas por ultra-sonografia um dia antes da TE. Embora esse tratamento no
tenha resultado em muitas mltiplas ovulaes como nos estudos anteriores, o tratamento com eCG aumentou o dimetro do CL e as taxas de prenhez (Tabela 5). Em uma amostra de 55 receptoras inovuladas
colheu-se sangue para determinao das concentraes plasmtica de P4. A concentrao plasmtica de P4
em receptoras tratadas com eCG que apresentaram 2 ou 3 CLs (30,28,2 ng/mL; n=8) ou apenas 1 CL no
momento da TE (7,50,7 ng/mL; n=18) foi significativamente maior (P<0,01) que nas receptoras no tratadas com eCG (5,70,4 ng/mL; n=29).

Em outro experimento, nosso grupo de pesquisa comparou as taxas de prenhez de vacas tratadas com
DIB e BE e foi induzida a ovulao com BE ou hCG (58). Foram utilizadas vacas de corte Bos taurus x Bos
indicus com escore de condio corporal entre 2,5 e 3,5 (escala 1 a 5). No incio de cada rplica (Dia 0)
todos os animais receberam um DIB e 2 mg de BE associado a 50 mg de P4 im. No dia 5 todas as vacas
foram tratadas com 400 UI de eCG e 500 g de cloprostenol (Estroplan, Syntex), e o DIB foi removido no
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dia 8. Os animais foram divididos aleatoriamente para receberem 1 mg de BE im no dia 9ou 1500 UI de hCG
(Ovusyn, Syntex Argentina) no dia 10. Como em outros experimentos, as receptoras no foram submetidas
a observao de estro. No dia 17, todas as receptoras foram examinadas por ultra-sonografia e as que
apresentavam CL > 12 mm de dimetro receberam por transferncia direta um embrio fresco ou descongelado. O dimetro do CL no dia 17 foi semelhante entre as receptoras tratadas com BE (21,10,6 mm) ou
hCG (21,30,5 mm). No observou-se efeito do embrio (fresco ou descongelado), da qualidade do embrio ou do tcnico sobre as taxas de prenhez (P>0,4). Alm disso, as taxas de prenhez foram semelhantes
entre as receptoras tratadas com BE e hCG (Tabela 6; P>0,09). Concluiu-se que os 2 tratamentos avaliados
apresentam eficincia semelhante na sincronizao de receptoras Bos taurus x Bos indicus.

Apesar de estudos anteriores terem demostrado a eficincia desse protocolo, os animais so manejados por, no mnimo, 4 vezes durante o tratamento. Dessa forma, um estudo recente foi realizado para tentar
simplificar o protocolo, reduzindo o nmero de dias ou de injees durante o tratamento. O primeiro objetivo
foi comparar as taxas de prenhez em receptoras tratadas com DIB e 400 UI de eCG no dia 5 (1 dia aps a
emergncia da nova onda de crescimento folicular) ou no dia 8 (momento da retirada do DIB, 61). O
segundo objetivo foi determinar o efeito da P4 injetvel, administrada im no momento da insero do dispositivo e da administrao de BE, sobre os mesmos parmetros. Novilhas Bos taurus x Bos indicus foram
divididas homogeneamente em 4 tratamentos em um arranjo fatorial 2 por 2. Todos as novilhas receberam
um DIB e 2 mg de BE im no dia 0, com ou sem a administrao de 50 mg de P4. As novilhas foram tratadas
com 150 g D (-) cloprostenol im e 400 UI de eCG im no dia 5 ou no dia 8. O DIB foi removido no dia 8 e
administrou-se 1 mg de BE em todos os animais. No dia 17, todas as novilhas foram examinadas por ultrasonografia para determinao da quantidade de CL e as receptoras com mais de 1 CL ou CL nico com
dimetro 18 mm foram inovuladas com um embrio produzido in vitro por transferncia no cirrgica pelo
mesmo veterinrio. A proporo de receptoras inovuladas/tratadas (P=0,15) e prenhas/inovuladas (P=0,23)
foram semelhantes. No entanto, a taxa de prenhez (receptoras prenhas/tratadas) apresentou tendncia (P=0,1)
de melhores resultados em novilhas tratadas com eCG no dia 5 que nas tratadas com eCG no dia 8. No
verificou-se efeito da P4 injetvel em nenhum dos parmetro avaliados (Tabela 7).

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Um grupo de 154 receptoras foi selecionado e foram colhidas amostras de sangue para determinao
da concentrao plasmtica de progesterona. O tratamento com eCG no dia 5 resultou em maior nmero de
CL (1,40,1) e maior concentrao plasmtica de progesterona (2,40,3 ng/ml) no dia 17 (dia da TE) que
em novilhas tratadas com eCG no dia 8 (1,10,1 CL e 1,70,2 ng/ml). No se verificou efeito da P4
injetvel em nenhum dos parmetros avaliados.
Os resultados sugerem que a o tratamento com eCG no dia 5 aumenta o nmero de CL, a concentrao plasmtica de progesterona e tende a aumentar a taxa de prenhez em receptoras de embrio bovino
sincronizadas com DIB e BE e inovuladas em tempo fixo. Estes resultados foram confirmados em um posterior estudo comparando diferentes doses de eCG administradas no dia 5 ou no dia 8. No se verificou efeito
da dose de eCG (400 UI vs 500 UI vs 600 UI) nas taxa de prenhez. No entanto, como demonstrado na
Tabela 8, o tratamento com eCG no dia 5 apresentou maiores taxas de prenhez que o tratamento com eCG
no dia 8.

Assim como existem diversos estudos relatando satisfatrias taxas de prenhez em receptoras sincronizadas com dispositivos de progesterona/progestgeno (42, 44, 58), como os descritos na presente reviso,
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existem relatos de reduzidas taxas de prenhez (41, 75, 82). A razo para essa divergncia ainda no clara,
no entanto, relatou-se que a expresso do estro foi maior em animais tratados com progestgenos que em
animais tratados com PGF (82). Pelo menos um estudo em vacas de corte lactantes revelou que aproximadamente 50% dos animais estavam em anestro; assim o tratamento com estradiol e progesterona pode
induzir o estro e a ovulao em vacas que no tenham um adequado perodo ps-parto ou inadequada
condio corporal, levando a reduzidas taxas de prenhez (75). Isso pode explicar a diferena entre os grupos
controle (sem eCG) nos primeiros experimentos discutidos nesse captulo. Embora tenham sido utilizados
animais Bos taurus x Bos indicus em ambos os experimentos, possvel que as novilhas do primeiro experimento (6) no apresentassem condio corporal satisfatria como no segundo experimento (78). Esses
resultados enfatizam a importncia do uso de vacas ou novilhas cclicas em boa condio corporal como
receptoras de embries. De 842 receptoras sincronizadas com estrgeno/progesterona e eCG em um programa comercial de TE, 709 (84,2%) receberam um embrio pelo mtodo no cirrgico e 392 (46,6%)
ficaram gestantes. Considerando que um dos maiores custos em programas de TE a alimentao das
receptoras at tornarem-se gestantes (36), um protocolo com 45 a 50% de taxa de prenhez parece ser
adequado e de satisfatria relao custo/benefcio, especialmente considerando que este tratamento tambm
elimina a necessidade de deteco do estro. Na figura 2 est descrito o protocolo recomendado.

Figura 2. Protocolo para transferncia de embrio em tempo fixo em bovinos. O tratamento consiste na
insero de um dispositivo liberador de progesterona e 2 mg de BE im no dia 0, PGF e 400 UI de
eCG no dia 5, remoo do dispositivo no dia 8, e BE no dia 9. No efetuada a deteco do estro
e a TE realizada no dia 17.

MANIPULAO DA ONDA DE CRESCIMENTO FOLICULAR PARA SUPEROVULAO


O protocolo convencional de superestimulao ovariana no diestro foi baseado originalmente em informaes empricas e experimentais nas quais se verificou maior resposta superovulatria quando o tratamento foi iniciado 8 a12 dias aps o estro (revisado em 15). No entanto, nenhum desses estudos anteriores
avaliou o status folicular no incio dos tratamentos superovulatrios. Isso foi devido, principalmente, s
dificuldades encontradas por muitos grupos de pesquisa de monitorar o desenvolvimento folicular por ultrasonografia nos estgios iniciais de desenvolvimento por no possurem o equipamento.
Atravs das informaes geradas pela ultra-sonografia, sabe-se que 8 a 12 dias aps o estro (7 a 11
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dias aps a ovulao) pode ser, aproximadamente, o dia da emergncia da segunda onda de crescimento
folicular em ciclos de 2 ou 3 ondas (34), podendo um grupo de folculos em crescimento estar presente nesse
perodo. No entanto, o dia da emergncia da segunda onda de crescimento folicular tem se mostrado diferente em ciclos de 2 ou 3 ondas (1 a 2 dias antes em ciclos de 3 ondas), assim como apresenta diferenas
individuais (34). Dessa forma, mostrou-se claramente que a resposta superovulatria foi maior quando o
tratamento foi iniciado no momento da emergncia da onda de crescimento folicular que quando iniciado
mais tarde (1,60). O incio do tratamento apenas 1 dia aps a emergncia da onda reduziu significativamente
a resposta superovulatria comparada a tratamentos no dia da emergncia da onda de crescimento folicular
(1,60).
A probabilidade do folculo dominante no ser funcional (fase esttica final ou de regresso), baseada
na durao das fases de crescimento do folculo dominante durante o ciclo estral de, aproximadamente,
30% (6 de 20 d) para novilhas com duas ondas e de 35% (8 de 23 d) para novilhas com 3 ondas. Ainda,
apenas 20% (4 ou 5 d) dos dias do ciclo estral so adequados para o iniciar o tratamento superovulatrio no
momento da emergncia da onda de crescimento folicular. Assim, 80% do ciclo estral no apropriado para
obteno de tima resposta superovulatria. A necessidade de se esperar at a metade do ciclo estral para
iniciar o tratamento superovulatrio implica na monitorao do estro e em obrigatrio atraso. Para eliminar
esses problemas, uma alternativa iniciar o tratamento superovulatrio aps o controle exgeno da emergncia da onda de crescimento folicular.
Um estratgia para controlar a dinmica folicular a ablao transvaginal guiada por ultra-sonografia
de todos folculos 5 mm para emergncia de uma nova onda de crescimento folicular sincronizada em dia
aleatrio do ciclo estral, seguida do tratamento com FSH (Folltropin-V, Bioniche Animal Health, Canada) 1
dia aps a ablao e com PGF 48 h aps o incio do tratamento com FSH (14, Tabela 9). Foi demonstrado
que o momento do estro pde ser controlado mais precisamente quando foi inserido um dispositivo contendo
progesterona/progetgeno durante a superovulao e quando foram administradas 2 aplicaes de PGF no
dia da remoo do dispositivo. As novilhas que no foram submetidas ablao foram tratadas com FSH 8
a 12 d aps o estro e com PGF 48 h aps. Combinando os dois experimentos, no se observou diferena na
resposta superovulatria entre os grupos submetidos ablao e os grupos controle (no submetidos
ablao). Em outros experimentos, a ablao transvaginal guiada por ultra-sonografia de todos os folculos
(35) ou apenas do folculo dominante (23, 35, 39) dois dias antes da superovulao (no meio do diestro),
apresentou maior resposta superovulatria que em doadoras no submetidas ablao do folculo dominante (Tabela 9). Em um estudo retrospectivo de respostas superovulatrias em vacas de leite, a ablao folicular
resultou em maior nmero de estruturas colhidas, mas semelhante nmero de embries transferveis que
vacas superovuladas 7 a 13 d aps o estro (72; Tabela 9). Em um estudo recente, a ablao dos 2 maiores
folculos em dia aleatrio do ciclo estral foi to eficiente na sincronizao da emergncia da onda de crescimento folicular para superovulao quanto a ablao de todos os folculos 5 mm, eliminando a necessidade
de determinar qual folculo o dominante (3).

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Outra maneira de sincronizar a emergncia da onda de crescimento folicular para superovulao envolve o uso de GnRH ou LH suno (LHp). No entanto, os relatos de disperso na emergncia da onda de
crescimento folicular (de 3 dias antes a 5 dias depois do tratamento) sugerem que este mtodo no deve ser
empregado para a superovulao (54). Apesar da grande distribuio nos dias de emergncia da onda de
crescimento folicular relatada nesse estudo (54), a nova onda emergiu 3 d aps o tratamento em 44 das 54
(81%) novilhas. De fato, em um estudo envolvendo 3 diferentes experimentos (31), o tratamento com GnRH
ou LH apresentou resultados consistentes quanto ao baixo nmero de embries colhidos comparados aos do
tratamento com 17 estradiol e progesterona ou ablao folicular para a emergncia da onda de crescimento
folicular. Desse modo, no recomendamos esta tcnica para a sincronizao da emergncia da onda de
crescimento folicular para a superovulao de bovinos.
Nossa tcnica preferencial para a sincronizao da onda de crescimento folicular para a superovulao
envolve o tratamento com 17 estradiol e P4 im no momento da insero do dispositivo contendo progesterona/
progestgeno, seguido pelo tratamento com FSH 4 dias aps (16). Resultados de experimentos (revisado
em 15) e de programas comerciais de superovulao (17,62) tm demonstrado que a resposta superovulatria
de doadoras tratadas com 17 estradiol e P4 em dia aleatrio do ciclo estral semelhante ou melhor que
doadoras superovuladas 8 a 12 d aps a deteco do estro (20,62).
O 17-estradiol no permitido para o uso comercial em alguns pases. Dessa forma, nosso grupo de
pesquisa investigou a possibilidade do uso de outros steres de estrgenos como o BE ou valerato de
estradiol. O tratamento com 2,5 mg de BE e 50 mg de P4 no momento da insero do CIDR-B induziu a
emergncia de uma nova onda de crescimento folicular sincronizada 3 a 4 dias aps o tratamento (24). A
superovulao iniciada 4 dias aps o tratamento com 2,5 mg de BE e 50 mg de P4 resultou em respostas
semelhantes quelas iniciadas 4 dias aps o tratamento com 5 mg (25) ou com 2,5 mg (26) de 17-estradiol
associados a 50 mg de P4 (Figura 3 e Tabela 10) ou quelas iniciadas 8 a 12 d aps o estro (56). O
tratamento com 5 mg de valerato de estradiol e 3mg de norgestomet apresentou menor sincronizao da
emergncia da onda de crescimento folicular e menor resposta superovulatria que o tratamento com 5 mg
de 17-estradiol e 100 mg de P4 em vacas com dois implantes SMB (50). No entanto, menores doses de
valerato de estradiol tm sido investigadas e doses de 1 ou 2 mg resultaram na emergncia da onda folicular
aps 3 a 4 dias, com baixa variabilidade (51). Estes resultados sugerem que menores doses podem ser
usadas na sincronizao da emergncia da onda de crescimento folicular para a superovulao. Mais estudos
so necessrios para confirmar esses resultados.
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Figura 3. Protocolo para superovulao de doadoras com benzoato de estradiol (BE) e dispositivo contendo progesterona. O tratamento consiste na insero de um dispositivo contendo progesterona e a
aplicao de benzoato de estradiol e progesterona im no dia 0. O tratamento superovulatrio tem
incio no dia 4, com duas aplicaes dirias de FSH por 4 dias. As doadoras so tratadas com
PGF na manh e na tarde do dia 6 e o dispositivo contendo progesterona removido no momento
da segunda aplicao de PGF. Os animais so inseminados artificialmente 12 e 24 h aps a deteco
do cio ou 48 e 60 h aps a remoo do dispositivo contendo progesterona. Os embries so
colhidos no dia 15.

Estes estudos demonstraram que o controle exgeno da emergncia da onda folicular oferece a vantagem de iniciar o tratamento superovulatrio no momento mais adequado (recrutamento folicular), independentemente do estgio do ciclo estral. O tratamento prtico, simples de executar pelos funcionrios da
fazenda e, mais importante, no necessita da deteco do estro e da ovulao para aguardar o incio do
tratamento gonadotrfico 8 a 12 d aps. A sincronizao da emergncia da onda de crescimento folicular
pela ablao folicular ou pelo tratamento com estrgeno/progesterona tem apresentado semelhantes respostas superovulatrias (3,11,15).
digno de nota que em estudos envolvendo superovulao no momento da emergncia folicular, a
reposta aplicao nica de FSH no foi diferente da resposta a mltiplas aplicaes (14,16). Os nveis
basais de FSH so responsveis pela preveno da emergncia de uma nova onda folicular (13); a administrao de FSH durante esse perodo pode levar ao crescimento de pequenos folculos anterior ao dia esperado da emergncia da nova onda de crescimento folicular (os efeitos da supresso pelo folculo dominante
so diminudos pelo FSH). Isso pode explicar como maiores doses de FSH exgeno em esquemas
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superovulatrios convencionais podem suprimir o ritmo endgeno e mascarar o efeito da onda na resposta
ovariana. Se o tratamento superovulatrio for administrado por um longo perodo, o recrutamento folicular
ser evidente, independente do estgio de desenvolvimento folicular no momento do tratamento gonadotrfico.
No entanto, o recrutamento dessincronizado pode resultar em maior variabilidade na resposta folicular e na
qualidade dos embries colhidos (16,62).
Estudos recentes, principalmente realizados no Brasil, tm sido elaborados para o desenvolvimento de
protocolos de superovulao que possibilitem a IA em tempo fixo em bovinos da raa Nelore (4, 7, 9). Um
dos tratamentos usados rotineiramente para superovulao de doadoras com IA em tempo fixo semelhante
ao tratamento descrito anteriormente, exceto pelo fato do dispositivo intravaginal contendo progesterona ser
removido na manh ou tarde do dia 7 (Dia 7 manh e Dia 7 tarde; Tabela 11; 85). Todas as doadoras
tambm recebem 25 mg de LHp (Lutropin-V, Bioniche Animal Health) ou uma dose de GnRH na manh do
dia 8 e so submetidas IATF 12 e 24 h aps. No verificou-se diferena quando o dispositivo de progesterona
foi removido no dia 7 pela manh ou no dia 7 pela tarde (Tabela 11 e Figura 4) em vacas Nelore.

Figura 4. Protocolo para superovulao com inseminao artificial em tempo fixo em vacas Nelore. O tratamento consiste na insero de um dispositivo contendo progesterona e na aplicao de benzoato
de estradiol (BE) e progesterona (P4) im no dia 0. Inicia-se o tratamento superovulatrio no dia 4,
com duas aplicaes dirias de FSH por 4 dias. As doadoras so tratadas com PGF na manh e
na tarde do dia 6 e o dispositivo contendo progesterona removido no momento da ltima aplicao de FSH, na tarde do dia 7. Os animais recebem pLH ou GnRH na manh do dia 8 e so
inseminados artificialmente 12 e 24 h aps, sem a deteco do cio. Os embries so colhidos no
dia 15.
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Resultados preliminares de um experimento em andamento feito em vacas Holandesas sugerem que


so necessrias, pelo menos, 24 h de intervalo entre a retirada do dispositivo de progesterona/progestgeno
e o tratamento com LHp ou GnRH (Rodrigues, comunicao pessoal). Nesse experimento, 40 vacas Holandesas foram tratadas com 1 ou 2 Crestar associados a 3 mg de BE e 50 mg de P4 im no dia 0, o tratamento
com FSH foi iniciado no dia 4 e a PGF foi administrada na manh e na tarde do dia 6. O Crestar foi removido
na tarde do dia 7 e o GnRH foi administrado na manh do dia 8 (12 h) ou na tarde do dia 8 (24 h). No
verificou-se diferena entre 1 e 2 Crestar. No entanto, o tratamento com GnRH 24 h aps a retirada do
Crestar resultou em menor nmero de folculos anovulatrios (1,70,3) que quando o GnRH foi administrado 12 h aps a retirada do Crestar (3,50,5). Esse resultado no resultou em aumento significativo do
nmero de embries transferveis, mas os nmeros claramente favorecem o tratamento com GnRH 24 h aps
a remoo do Crestar (GnRH 24 h: 4,21,3 vs GnRH 12 h: 2,70,8). Um maior nmero de vacas so
necessrias para se obter concluses e recomendar o tratamento. Todavia, resultados de estudos atuais no
Brasil e na Argentina sugerem que diferentes protocolos podem ser empregados em animais Bos taurus : 1)
remoo do dispositivo de progesterona/progestgeno na tarde do dia 6 e observao de estro com IA 12
e 24 h aps ou 48 e 60 h aps a remoo do dispositivo (Figura 3); 2) remoo do dispositivo de progesterona/
progestgeno na manh do dia 7 e administrao de GnRH ou LHp na manh do dia 8 com IA 12 e 24 h
aps; ou 3) remoo do dispositivo na tarde do dia 7 e administrao de GnRH ou LHp na tarde do dia 8
com IA 12 e 24 h aps. Provavelmente a colheita dos embries pode ser realizada a tarde (segunda e na
terceira alternativa), para evitar a colheita de mrulas iniciais, que no resistem bem ao processo de congelao. Mais experimentos devem ser realizados para determinar o melhor protocolo para IA em tempo fixo
em doadoras Bos taurus.

Concluses
A variabilidade da resposta continua a ser um dos maiores problemas associados aos programas de
sincronizao do estro e superovulao em bovinos. A incorporao de tcnicas para o controle da dinmica
das ondas foliculares, como as discutidas nessa reviso, reduzir a variabilidade ao tratamento de doadoras
em diferentes estgios do ciclo estral. Esquemas de sincronizao de estro baseados tanto no controle lutenico
quanto no controle folicular do ciclo estral permitem a IA em tempo fixo e eliminam a necessidade de deteco
de estro em receptoras de embries. Estudos realizados at o momento ainda no minimizaram adequadamente a variabilidade da resposta superovulao, mas protocolos de sincronizao da emergncia da onda
de crescimento folicular oferecem a convenincia de se iniciar os tratamento mais rapidamente e em momento
pr determinado, sem a necessidade da deteco do estro e sem comprometimento dos resultados.
Referncias
1. Adams GP, Nasser LF, Bo GA, Mapletoft RJ, Garcia A, Del Campo MR. Superstimulatory response
of ovarian follicles of wave 1 versus wave 2 in heifers. Theriogenology 1994; 42: 1103-1113.
2. Ambrose JD, Drost RL, Monson RL, Rutledge JJ, Leibfried-Rutledge ML, Thatcher MJ, Kassa T,
16

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

Binelli M, Hansen PJ, Chenoweth PJ, Thatcher WW. Efficacy of timed embryo transfer with fresh and
frozen in vitro produced embryos to increase pregnancy rates in heat-stressed dairy cattle. J Dairy Sci
1999; 82:2369-2376.
3. Baracaldo MI, Martinez M, Adams GP, Mapletoft RJ. Superovulatory response following transvaginal
follicle ablation in cattle. Theriogenology 2000; 53:1239-1250.
4. Barros CM, Nogueira MFG. Embryo transfer in Bos indicus cattle. Theriogenology 2001; 56: 14831496
5. Baruselli PS, Marques MO, Carvalho NAT, Valentim R, Berber RCA, Carvalho Filho AF, Madureira
EH, Costa Neto WP. Ovsynch protocol with fixed-time embryo transfer increasing pregnancy rates in
bovine recipients. Arq Fac Vet UFRGS, Porto Alegre, Brazil, 2000; 28 (Suppl): 205 abstr.
6. Baruselli PS, Marques MO, Madureira EH, Costa Neto WP, Grandinetti RR, Bo GA. Increased
pregnancy rates in embryo recipients treated with CIDR-B devices and eCG. Theriogenology 2001;
55:157 abstr.
7. Baruselli PS, Marquez MO. Ultimos avances en superovulacion de donantes de razas cebuinas.
Resmenes del IV Seminario Internacional de Reproduccin en Grandes Animales. CGR, Biotecnologa
Reproductiva E.U. Divisin Capacitacin. Bogot 25 al 27 de septiembre; Medelln 27 y 28 de
septiembre 2003; 116-120.
8. Baruselli PS, Reis EL. Sincronizacin de receptoras cruza ceb en condiciones tropicales. Resmenes
del IV Seminario Internacional de Reproduccin en Grandes Animales. CGR, Biotecnologa
Reproductiva E.U. Divisin Capacitacin. Bogot 25 al 27 de septiembre; Medelln 27 y 28 de
septiembre 2003; 53-62.
9. Baruselli PS, Marquez MO, Reis EL, Nasser LF, Silva RCP, Menegatti JA, Valentin R, Santos ICC.
Adequacao da dose de FSH (Folltropin-V) em protocolos de superovulacao de vacas nelore (Bos
taurus indicus) com inseminacao artificial em tempo fixo. XVII Reuniao Anual da Sociedade Brasileira
de Technologia de Embrioes, Fortaleza; Acta Scientae Veterinarie 2003; 244-245.
10. Beal WB. Streamlining embryo transfer. 18th Annual Convention AETA, Colorado Springs, CO, USA,
1999; 78-85.
11. Beal WB. Practical application of ultrasound in bovine embryo transfer. 18th Annual Convention AETA,
Colorado Springs, CO, USA, 1999; 66-77.
12. Beal WE, Hinshaw RH. Synchronization of estrus and ovulation in bovine embryo transfer recipients.
Proceedings of the Advanced Embryo Transfer Seminar 12. Annual Meeting of the American Association of Bovine Practitioners, Vancouver, BC, Canada, 2001.
13. Bergfelt DR, Plata-Madrid H, Ginther OJ. Counteraction of inhibitory effect of follicular fluid by
administration of FSH in heifers. Can J Anim Sci 1994; 74:633-639.
14. Bergfelt DR, Bo GA, Mapletoft RJ, Adams GP. Superovulatory response following ablation-induced
follicular wave emergence at random stages of the oestrous cycle in cattle. Anim Reprod Sci 1997;
49:1-12.
15. Bo GA, Adams GP, Pierson RA, Mapletoft RJ. Exogenous control of follicular wave emergence in
cattle. Theriogenology 1995; 43:31-40.
16. Bo GA, Adams GP, Pierson RA, Mapletoft RJ. Effect of progestogen plus E-17 treatment on
17

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

superovulatory response in beef cattle. Theriogenology 1996; 45:897-910.


17. Bo GA, Mapletoft RJ. Control del desarrollo folicular y su aplicacin en programas de superovulacion
de donantes de embriones. Taurus 1999; 4:14-27.
18. Bo GA, Medina M, Tegli JC, Costamagna A, Brogliatti GM. Fixed-time artificial insemination in CIDRB treated cows induced to ovulate with estradiol benzoate or GnRH. 14th International Congress on
Animal Reproduction, Stockholm, Sweden, 2000; 2:45 abstr.
19. Bo GA, Tribulo H, Caccia M, Tribulo R. Pregnancy rates in embryo recipients treated with progesterone vaginal devices and transferred without estrus detection. Theriogenology 2001; 55:357 abstr.
20. Bo GA, Baruselli PS, Moreno D, Cutaia L, Caccia M, Trbulo R, Trbulo H, Mapletoft RJ. The control
of follicular wave development for self-appointed embryo transfer programs in cattle. Theriogenology
2002; 57:53-72.
21. B GA, Moreno D, Cutaia L, Caccia M, Tribulo RJ, Tribulo H. Transferencia de embriones a tiempo
fijo: tratamientos y factores que afectan los ndices de preez. Taurus 2004; 21:25-40 (2004).
22. Broadbent PJ, Stewart M, Dolmal DF. 1991. Recipient management and embryo transfer.
Theriogenology; 35:125-140.
23. Bungartz L, Niemann H. Assessment of the presence of a dominant follicle and selection of dairy cows
suitable for superovulation by a single ultrasound examination. J Reprod Fert 1994; 101:583-591.
24. Caccia M, Bo GA. Follicle wave emergence following treatment of CIDR-B implanted beef heifers
with estradiol benzoate and progesterone. Theriogenology 1998; 49:341 abstr.
25. Caccia M, Tribulo R, Trbulo H, Bo GA. Effect of different estrogen and progesterone treatments on
superovulatory response in beef (Bos taurus) cattle. Arq Fac Vet UFRGS, Porto Alegre, Brazil, 1998;
26 (Suppl): 211 abstr.
26. Caccia M, Tribulo R, Tribulo H. Superovulatory response of beef cows treated with progesterone
devices and estradiol-17 or estradiol benzoate. Theriogenology 2002; 57:762 abstr.
27. Cavalieri J, Fitzpatrick LA. Oestrus detection techniques and insemination strategies in Bos indicus
heifers synchronized with norgestomet-oestradiol. Aust Vet J 1995; 72:177-182.
28. Colazo MG, Sefcheck M, Illuminati H, Meglia G, Schmidt EE, Bo GA. Fixed-time artificial insemination in beef cattle using CIDR-B devices, progesterone and estradiol benzoate. Theriogenology 1999;
51:404 abstr.
29. Custer EE, Beal WE, Wilson SJ, Meadows AW, Berardinelli JG, Adair R. Effect of melengestrol
acetate (MGA) or progesterone-releasing intravaginal device (PRID) on follicular development, concentrations of estradiol-17 and progesterone, and LH release during an artificially lengthened bovine
estrous cycle. J Anim Sci 1994; 72:1282-1289.
30. Cutaia L, Moreno D, Villata ML, Bo GA. Synchrony of ovulation in beef cows treated with progesterone
vaginal devices and estradiol benzoate administered at device removal or 24 hours later. Theriogenology
2001; 55:244 abstr.
31. Deyo CD, Colazo MG, Martinez MF, Mapletoft RJ. The use of GnRH or LH to synchronize follicular
wave emergence for superstimulation in cattle. Theriogenology 2001; 55:513 abstr.
32. Fuentes S. Utilizacion de tratamientos hormonales para la sincronizacion de receptoras de embriones.
Produccin Animal 2000; 160: 26-32.
18

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

33. Fuentes S, De la Fuente J. Different synchronization treatments for direct embryo transfer to recipients
heifers. Proc XIII Annual Meeting AETE, Lyon, France, 1997; 148 abstr.
34. Ginther OJ, Knopf L, Kastelic JP. Temporal associations among ovarian events in cattle during oestrous
cycles with two and three follicular waves. J Reprod Fert 1989; 87:223-230.
35. Hill BR, Kuehner LF. Follicle aspiration prior to superovulation in cattle. Theriogenology 1996; 43:324
abstr.
36. Hinshaw RH. Formulating ET contracts. Annual Meeting Soc for Theriogenology, Nashville, USA,
1999; 399-404.
37. Kastelic JP, Ginther OJ. Factors affecting the origin of the ovulatory follicle in heifers with induced
luteolysis. Anim Reprod Sci 1991; 26:13-24.
38. Kastelic JP, McCartney DH, Olson WO, Barth AD, Garcia A, Mapletoft RJ. Estrus synchronization in
cattle using estradiol, melengestrol acetate and PGF. Theriogenology 1996; 46:1295-1304.
39. Kim HI, Son DS, Yeon H, Choi SH, Park SB, Ryu IS, Suh GH, Lee DW, Lee CS, Lee HJ, Yoon JT.
Effect of dominant follicle removal before superstimulation on follicular growth, ovulation and embryo
production in Holstein cows. Theriogenology 2001; 55:937-945.
40. Kinder JE, Kojima FN, Bergfeld EGM, Wehrman ME, Fike KE. Progestin and estrogen regulation of
pulsatile LH release and development of persistent ovarian follicles in cattle. J Anim Sci 1996; 74:14241440.
41. King ME, Odde KG, Lefever DG, Brown LN, Neubauer CJ. Synchronization of estrus of embryo
transfer recipients receiving demi-embryos with Syncro-Mate-B or Estrumate. Theriogenology
1986; 25:162 abstr.
42. Looney CR, Roberts JW, Jones M, Day ML, Anderson JC, Hafs HD, Forrest DW. Synchrony and
conception to insemination or embryo transfer in beef females treated with an intravaginal progesterone-releasing device with or without an injection of estradiol. Theriogenology 1999; 51:266 abstr.
43. McDowell CM, Anderson LG, Kinder JE, Day ML. Duration of treatment with progesterone and
regression of persistent ovarian follicles in cattle. J Anim Sci 1998; 76:850-855.
44. McGrath AB, Looney CR, Bluntzer JS, Odeon AJ, Massey JM. Comparison of norgestomet and
prostaglandin F (PGF) for estrus synchronization of recipients nursing embryo transfer (ET) calves.
2
Theriogenology 1985; 23:207 abstr.
45. Macmillan KL, Henderson HV. Analyses of the variation in the interval from an injection of prostaglandin F to estrus as a method of studying patterns of follicle development during diestrous in dairy
2
cows. Anim Reprod Sci 1984; 6:245-254.
46. Macmillan KL, Thatcher WW. Effects of an agonist of gonadotropin-releasing hormone on ovarian
follicles in cattle. Biol Reprod 1991; 45:883-889.
47. Macmillan KL, Taufa VK, Hayman DL. Pregnancy rates in lactating dairy cows used as recipients for
frozen/thawed embryos and receiving supplemental progesterone. New Zealand Embryo Transfer
Workshop, Hamilton, NZ, 1994; 34-35.
48. Macmillan KL, Burke CR. Effects of oestrus cycle control on reproductive efficiency. Anim Reprod
Sci 1996; 42:307-320.
49. Mantovani AP, Reis EL, B GA, Baruselli PS, Gacek F. Prolonged use of a progesterone-releasing
19

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

intravaginal device (CIDR) on the induction of persistent follicles in bovine embryo recipients. 15th
International Congress on Animal Reproduction, Porto Seguro, Brazil, 2004; abstr.
50. Mapletoft RJ, Martinez MF, Adams GP, Kastelic J, Burnley CA. The effect of estradiol preparation on
follicular wave emergence and superovulatory response in norgestomet-implanted cattle. Theriogenology
1999; 51:411 abstr.
51. Mapletoft RJ, Colazo MG, Small JA, Ward DR, Kastelic J P. Effect of dose of estradiol valerate on
ovarian follicular dynamics in CIDR-treated beef cows. Reprod Fert Dev 2004; 16:130 abstr.
52. Marques MO, Madureira EH, Bo GA, Baruselli PS. Ovarian ultrasonography and plasma progesterone
concentration in Bos taurus x Bos indicus heifers administered different treatments on Day 7 of the
estrous cycle. Theriogenology 2002; 57: 548 abstr.
53. Marques MO, Nasser LF, Silva RCP, Bo GA, Baruselli PS. Increased pregnancy rates in bos taurus x
bos indicus embryo recipients with treatments that increase plasma progesterone concentrations.
Theriogenology 2003; 59:369 abstr.
54. Martinez MF, Adams GP, Bergfelt D, Kastelic JP, Mapletoft RJ. Effect of LH or GnRH on the dominant follicle of the first follicular wave in heifers. Anim Reprod Sci 1999; 57:23-33.
55. Martinez MF, Kastelic JP, Adams GP, Cook RB, Olson WO, Mapletoft RJ. The use of progestins in
regimens for fixed-time artificial insemination in beef cattle. Theriogenology 57 2002; 1049-1059.
56. Meyer JA, Wideman DJr, Looney CR, Long CR, Bo GA, Day ML, Anderson JC, Forrest DW.
Embryo production rates of cattle superovulated with and without the presence of an intravaginal progesterone-releasing device. Theriogenology 2000; 53: 504 abstr.
57. Moreno D, Cutaia L, Villata ML, Caccia M, Gatti G, Tribulo R, Tribulo H, Bo GA. Effect of the time
of prostaglandin administration on pregnancy rates in embryo recipients treated with progesterone vaginal devices and transferred without estrus detection. Theriogenology 2002; 57:552 abstr.
58. Moreno D, Cutaia L, Tribulo R, Caccia M, Tribulo H, Chesta P, Villata ML, Bo GA. Fixed-Time
embryo transfer in cows treated with progesterone vaginal devices and induced to ovulate with estradiol
benzoate or hCG. Theriogenology 2003; 59:307 abstr.
59. Moyaert I, Gielen JTh, Coryn M, Vandeplassche M. Estrus synchronization with Syncro-mate-B or
prostaglandins in recipients for embryo transfer. Theriogenology 1987; 27:260 abstr.
60. Nasser L, Adams GP, Bo GA, Mapletoft RJ. Ovarian superstimulatory response relative to follicular
wave emergence in heifers. Theriogenology 1993; 40:713-724.
61. Nasser LF, Reis EL, Oliveira AM, Bo GA, Baruselli PS. Effect of time of eCG pretreatment on pregnancy rates in Bos indicus x Bos taurus recipients synchronized with progesterone vaginal devices and
transferred without estrus detection. Reproduction Fertility and Development 2004; 212 abstr.
62. Nigro M, Burry E, Villata ML, Bo GA. Effect of different estrogen and progestogen treatments on
superovulatory response in beef and dairy cattle. Theriogenology 2002; 57:769 abstr.
63. Momont HW, Seguin BE. Influence of the day of estrous cycle on response to PGF products:
2
Implications for AI programs for dairy cattle. 10th International Congress on Animal Reproduction
1984; 3:336.
64. Odde KG. A review of synchronization of estrus in postpartum cattle. J Anim Sci 1990; 68:817-830.
20

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

65. Pursley JR, Mee MO, Wiltbank MC. Synchronization of ovulation in dairy cows using PGF2 and
GnRH. Theriogenology 1995; 44: 915-923.
66. Pursley JR, Kosorok MR, Wiltbank MC. Reproductive management of lactating dairy cows using
synchronization of ovulation. J Dairy Sci 1997; 80:301-306.
67. Revah I, Butler WR. Prolonged dominance of follicles and reduced viability of bovine oocytes. J Reprod
Fert 1996; 106:39-47.
68. Roche JF. Synchronization of oestrous in heifers with implants of progesterone. J Reprod Fertil 1974;
41:337-334.
69. Roy GL, Twagiramungu H. A fixed time AI program using the GnRH-PGF-GnRH method for beef
females. J Anim Sci 1996; 74 (Suppl 1):462.
70. Savio JD, Thatcher WW, Morris GR, Entwistle K, Drost M, Mattiacci MR. Effects of induction of low
plasma progesterone concentrations with a progesterone-releasing intravaginal device on follicular turnover and fertility in cattle. J Reprod Fert 1993; 98:77-84.
71. Seguin B. Ovsynch: A method for breeding dairy cows without doing heat detection. The Bovine
Practitioner 1997; 31:11-14.
72. Shaw DW, Good TE. Recovery rates and embryo quality following dominant follicle ablation in superovulated cattle. Theriogenology 2000; 53;1521-1528.
73. Stock AE, Fortune JE. Ovarian follicular dominance in cattle: Relationship between prolonged growth
of the ovulatory follicle and endocrine parameters. Endocrinology 1993; 132:1108-1114.
74. Thatcher WW, Moreira F, Santos JEP, Mattos RC, Lopez FL, Pancarci SM, Risco CA. Effects of
hormonal treatments on reproductive performance and embryo production. Theriogenology 2001; 55:7590.
75. Tribulo H, Bo GA, Kastelic JP, Pawlyshyn V, Barth AD, Mapletoft RJ. Estrus synchronization in cattle
with estradiol-17 and CIDR-B vaginal devices. Theriogenology 1995; 43:340 abstr.
76. Tribulo R, Nigro M, Burry E, Caccia M, Tribulo H, Bo GA. Pregnancy rates in recipients receiving
CIDR-B devices immediately following embryo transfer. Theriogenology 1997; 47:372 abstr.
77. Tribulo H, Bo GA, Gatti G, Tegli JC, Cutaia L, Moreno D, Brito M, Tribulo R. Pregnancy rates in
embryo recipients treated with estradiol benzoate and CIDR-B vaginal devices to eliminate the need for
estrus detection. 14th International Congress on Animal Reproduction, Stockholm, Sweden, 2000;
2:115 abstr.
78. Tribulo H, Moreno D, Cutaia L, Gatti G, Trbulo R, Caccia M, B GA. Pregnancy rates in embryo
recipients treated with progesterone vaginal devices and eCG and transferred without estrus detection.
Theriogenology 2002; 57:563 abstr.
79. Thibier M. More than half a million bovine embryos transferrred in 2002. Embryo Transfer Newsletter,
IETS, December 2003; 12-19.
80. Twagiramungu H; Guilbault LA, Dufour JJ. Synchronization of ovarian follicular waves with a
gonadotropin-releasing hormone agonist to increase the precision of estrus in cattle: A review. J Anim
Sci 1995; 73: 3141-3151.
81. Wehrman ME, Fike KE, Melvin EJ, Kojima FN, Kinder JE. Development of a persistent ovarian
follicle and associated elevated concentrations of 17-estradiol preceding ovulation does not alter the
21

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

pregnancy rate after embryo transfer in cattle. Theriogenology 1997; 47:1413-1421.


82. Wenkoff MS. The management of drug-induced manipulation of the estrous cycle in normal cows and
heifers. Can Vet J 1987; 28:366-373.
83. Wiltbank JN, Zimmerman DR, Ingalls JE, Rowden WW. Use of progestational compounds alone or in
combination with estrogen for synchronization of estrus. J Anim Sci 1965; 24: 990-994.
84. Zanenga CA, Pedroso MS, Lima GS, Santos ICC. Embryo transfer without estrus observation. Arq
Fac Vet UFRGS, Porto Alegre, Brazil, 2000; 28(Suppl): 337 abstr.
85. Zanenga CA, Marquez MO, Santos ICC, Valentin R, Baruselli PS. Comparacao entre dois protocolos
de superovulacao com inseminacao artificial em tempo fixo en vacas Nelore. XVII Reuniao Anual da
Sociedade Brasileira de Technologia de Embrioes, Fortaleza; Acta Scientae Veterinarie 2003; 626627.

22

Barros C.M. & Ereno, R.L. 2004. Avanos em tratamentos hormonais para a inseminao artificial com tempo fixo (IATF) em
Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004
bovinos de corte. Acta Scientiae Veterinariae, 32 (Supl ): 23-34.

AVANOS EM TRATAMENTOS HORMONAIS PARA A INSEMINAO ARTIFICIAL


COM TEMPO FIXO (IATF) EM BOVINOS DE CORTE
Ciro Moraes Barros e Ronaldo Luiz Ereno
Departamento de Farmacologia, Instituto de Biocincias, UNESP,
Botucatu , So Paulo. cmbarros@ibb.unesp.br

RESUMO
A inseminao artificial (IA) uma biotecnologia fundamental para o melhoramento gentico do rebanho
bovino. Entretanto, a deteco do cio, a qual requer tempo e pessoal adequadamente treinado, continua a
ser um dos principais fatores limitantes para a ampla utilizao da IA.
Nesta ltima dcada, a melhor compreenso da fisiologia do crescimento folicular ovariano permitiu o
desenvolvimento de tratamentos hormonais capazes de controlar o momento da ovulao e desta forma
possibilitou a utilizao da inseminao artificial com tempo fixo (ou seja, IA com tempo pr-determinado,
sem a necessidade de observao do cio). Na Amrica do Sul, principalmente no Brasil e Argentina, a
disponibilidade comercial de diversos hormnios esterides e proticos, tem permitido o desenvolvimento de
inmeros protocolos hormonais visando a IATF. Nesta mini-reviso ser dada nfase a tratamentos hormonais
utilizados para a IATF de bovinos de corte, sobretudo vacas em anestro ps-parto.

INTRODUO
Os animais de raas zebunas (sub-espcie Bos taurus indicus, Meirelles et al., 1999) constituem a
maior parte do rebanho bovino de corte em regies de clima tropical, devido a sua maior adaptao aos
climas quentes, maior tolerncia ao estresse trmico e resistncia aos parasitos, em relao aos animais de
raas europias (sub-espcie Bos taurus taurus). No Brasil, entre as raas de corte, a Nelore a que possui
o maior contingente numrico (100 milhes do total de 176 milhes de cabeas), sendo considerada o
alicerce da cadeia produtiva pecuria (ANUALPEC, 2002)
H grande expectativa de crescimento da pecuria de corte no Brasil, no s pelo aumento do mercado
nacional, mas tambm pela insero de nosso Pas no mercado mundial da carne bovina. No entanto,
fundamental que se elevem os ndices de produo e a eficincia reprodutiva do rebanho, para garantir maior
retorno econmico aos produtores.
A inseminao artificial pode trazer benefcios econmicos, a curto prazo, para a grande maioria dos
pecuaristas. Entretanto, a carncia de pessoal treinado e deficincias bsicas de manejo nas propriedades
tm limitado uma utilizao mais ampla. Um dos principais fatores que determinam o sucesso de um programa
de inseminao artificial (IA) a deteco do cio, a qual requer tempo e pessoal adequadamente treinado.
23

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

Em fmeas zebunas, a curta durao do estro (cerca de 11 horas) dificulta a deteco do mesmo e prejudica
a implantao de programas convencionais de IA (Barros et al., 1995, Pinheiro et al., 1998, Misuta, 2003).
A partir do conhecimento detalhado da dinmica folicular (Pierson & Ginther, 1988; Savio et al.,
1988; Sirois & Fortune, 1988) tornou-se possvel o desenvolvimento de tratamentos hormonais capazes de
regular o crescimento folicular e o momento da ovulao, de forma a viabilizar a inseminao artificial com
tempo fixo (IATF, ou seja, IA com tempo pr-determinado, sem a necessidade de observar cio) em taurinos
(Twagiramungu et al., 1992a,b; Thatcher et al., 1993; Pursley et al., 1994) e zebunos (Barros et al., 1998,
2000; Fernandes et al., 2001).
O aperfeioamento e aplicao da IATF poder incrementar a utilizao da inseminao artificial e da
transferncia de embries e, conseqentemente, contribuir para o melhoramento gentico, eficincia reprodutiva
e produtividade do rebanho nacional.
Nesta mini-reviso ser dada nfase a tratamentos hormonais utilizados para a IATF de bovinos de
corte, sobretudo vacas em anestro ps-parto.
CICLO ESTRAL
O perodo entre dois estros consecutivos denominado de ciclo estral e pode ser dividido em duas
fases principais: folicular e luteal. A fase folicular tem incio aps a lutelise induzida pela prostaglandina F2
(PGF2), com conseqente queda nos nveis sangneos de progesterona (< 1 ng/ml) entre 12 e 36 horas
aps o incio da lutelise, seja ela natural ou induzida por PGF2 exgena (Dieleman et al.,1986). O incremento
na freqncia de pulsos de LH estimula o desenvolvimento do folculo dominante que secreta quantidades
crescentes de estradiol induzindo o comportamento estral ou cio (Mukasa-Mugerwa, 1989).
O cio caracterizado pelo desejo sexual, onde a fmea permite ser montada (Blockey, 1980; Esslemont
et al., 1980). A simples observao diria do comportamento sexual de vacas e novilhas permite a identificao
do cio, entretanto, a freqncia (2 a 4 vezes ao dia) e o tempo (15 a 60 minutos) dispendido nesta observao
influenciam na acurcia da deteco do cio (Vaca et al., 1985).
Nas raas europias (Bos taurus taurus ) o cio dura cerca de 16 a 18 horas e a ovulao ocorre, em
mdia, entre 28 e 30 horas aps o incio do cio (Escobedo et al.,1989; Galina & Arthur, 1990), ou seja,
entre 10 e 12 horas aps o final do cio (Hansel & Echternkamp, 1972; Wishart, 1972; Hunter & Wilmut,
1984). Por outro lado, em zebunos, a receptividade sexual , em mdia, de apenas 11 horas (MukasaMugerwa, 1989; Galina & Arthur, 1990; Pinheiro et al., 1998) podendo variar de 1,3 a 20 horas (MukasaMugerwa, 1989; Galina & Arthur, 1990). Pinheiro et al. (1998), utilizando a tcnica de ultra-sonografia,
verificaram que o intervalo entre o incio do cio e a ovulao era de 26,6 0,44 horas e a durao do cio de
aproximadamente 11 horas em vacas Nelore, com estro natural ou induzido por tratamentos hormonais.
Estes resultados foram confirmados por Misuta (2003) utilizando o sistema Heat-Watch para detectar o
estro e a ultra-sonografia para observar a ovulao.
As quantidades crescentes de estradiol secretadas pelos folculos ovarianos induzem o estro e, atravs
de retroalimentao positiva no hipotlamo/hipfise, um pico de LH, o qual induz a ovulao e a formao do
corpo lteo (CL). A presena do CL caracteriza a fase ltea do ciclo estral. Nesta fase, o CL produz
progesterona em quantidades crescentes do 4 ao 10 dia do ciclo estral, e a secreo se mantm estvel at
24

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

que ocorra a lutelise, entre o 15 e o 20 dia (Hafez, 1993).


Sincronizao do estro
A partir da comprovao dos efeitos luteolticos da PGF2 em bovinos por Rowson et al. (1972),
vrios anlogos sintticos desta luteolisina foram comercializados e amplamente utilizados para controlar o
ciclo estral (revisto por Odde, 1990).
A PGF2 pode ser utilizada em dose nica, porm requer identificao prvia da presena do corpo
lteo. A fim de evitar a fase inicial do ciclo estral, duas doses de PGF2 podem ser administradas com
intervalo de 11 a 14 dias, obtendo-se assim melhores taxas de manifestao de cio aps a segunda dose
(Lauderdale et al., 1981; Odde, 1990; Chenault, 1992). Uma das limitaes da utilizao da PGF2 a
baixa taxa de sincronizao na induo do cio. O tempo entre a aplicao da PGF2 e a manifestao do
estro em bovinos varia de acordo com o estgio de desenvolvimento folicular no momento da administrao
da PGF2 (Savio et al.,1990; Kastelic et al., 1990; Wiltbank et al., 1996). Por exemplo, o uso de PGF2
na presena de um folculo dominante em fase de crescimento permite rpida maturao e ovulao do
mesmo, enquanto que a administrao de PGF2 no incio da fase de atresia do folculo dominante, necessitar
de aproximadamente 4 a 6 dias para que um novo folculo dominante se desenvolva o suficiente para induzir
o estro.
Sincronizao da ovulao
Protocolo ovsynch e similares
No final de dcada de oitenta, quando o advento da ultra-sonografia permitiu a caracterizao do
desenvolvimento folicular bovino, Thatcher et al., (1989) e Macmillan & Thatcher (1991), utilizaram um
anlogo do GnRH para alterar a dinmica folicular e forneceram a base para o desenvolvimento de um novo
sistema de sincronizao do estro.
Quando administrado em estgios aleatrios do ciclo estral, o GnRH causa ovulao do folculo
dominante e induz a emergncia de uma nova onda de crescimento folicular dentro de 2 a 3 dias aps o
tratamento (Thatcher et al., 1989; Guilbault et al., 1990, Macmillan & Thatcher, 1991; Twagiramungu et al.,
1994; Pursley et al., 1995). Assim, 6 a 7 dias mais tarde, a maioria dos animais estaro em estgio de
desenvolvimento folicular similar no momento da administrao de PGF2 e, conseqentemente, haver
melhor sincronizao do estro (Twagiramungu et al., 1992a,b; Thatcher et al., 1993, Wiltbank e al., 1996).
A administrao de uma segunda dose de GnRH 1 a 2 dias aps a PGF2 sincroniza o momento da
ovulao e os animais, tanto de raas europias (Pursley et al., 1995; Twagiramungu et al., 1995; Burke et
al., 1996) quanto de zebunas ( Barros et. al, 1998; Barros et al., 2000; Fernandes et al., 2001), podem ser
inseminadas com horrio predeterminado. O GnRH injetado 24 ou 48 horas aps a PGF2 concentra as
ovulaes dentro de um perodo de 8 a 12 horas o que permite a realizao da IA com tempo fixo 16 a 24
horas aps a segunda dose de GnRH (Pursley et al., 1994, 1995, 1997ab; Wiltbank et al., 1996; Burke et
al., 1996, Barros et al., 2000; Fernandes et al., 2001). Esta seqncia de tratamentos hormonais (GnRH25

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

PGF-GnRH), que permite a inseminao artificial em tempo fixo, passou a ser conhecida como protocolo
ovsynch. Para simplificar nesta reviso ser adotada a sigla GPG no lugar de GnRH-PGF-GnRH.
Uma forma de diminuir o custo do protocolo GPG substituir a segunda dose de GnRH por benzoato
de estradiol (BE, 1,0 mg para vacas e 0,75 mg para novilhas; via IM, Protocolo GPE). Neste caso, aps a
lutelise induzida pela PGF2, o BE, por meio de retroalimentao positiva no hipotlamo/hipfise, induz o
pico pr-ovulatrio de LH cerca de 40 a 44 h aps sua administrao, ou seja, cerca de 10 a 12 horas mais
tarde do que quando se utiliza GnRH (Barros et al., 2000). Portanto, os animais devem ser inseminados, sem
observao de cio, 30 a 36 horas aps a aplicao de BE. O protocolo GPE foi eficiente em sincronizar a
ovualao de vacas Nelore ciclando, resultando em taxas de prenhez de 40 a 45% aps uma nica inseminao
com tempo fixo (Barros et al., 2000; Fernandes et al., 2001). Entretanto, quando os protocolos GPG ou
GPE foram testados em vacas em anestro, as taxas de prenhes aps a IATF foram bem mais baixas: 14,9%
no grupo GPG (n = 67) e 19,1% no GPE (n = 68). Portanto, estes tratamentos no foram efetivos em animais
em anestro e devem ser utilizados somente em vacas que esto ciclando (Fernandes et al., 2001). Alm
disso, as taxas de prenhez em novilhas (entre 21 e 43%) geralmente so menores do que as observadas em
vacas (de 41 a 48%) aps a utilizao destes protocolos (McGowan, 1999, Fernandes al., 2001; Williams
et al., 2002).
Existem outras variaes do protocolo ovsynch (GPG) que tem sido utilizadas principalmente em
gado de leite. O protocolo denominado pr-synch, o ovsynch precedido por duas aplicaes de PGF2
(realizadas em um intervalo de 11 a 14 dias), com o objetivo de iniciar-se o tratamento GPG durante uma
fase do crescimento folicular mais responsiva ao pico de LH, induzido pela primeira aplicao de GnRH.
Apesar de apresentar resultados um pouco melhores do que os observados aps o protocolo GPG, o prsynch tambm s efetivo quando aplicando em animais ciclando.
A remoo temporria de bezerros (RTB) realizada antes da primeira aplicao de GnRH e/ou aps a
administrao de PGF2, induz aumento na pulsatilidade de LH (Edwards, 1985), e pode melhorar a reposta
de vacas em anestro ao tratamento GPG (Geary et al., 2001) ou GPE (Vilela et al., 1999, 2001).

Progesterona/progestgenos associados a estrgenos


A ao da progesterona na sincronizao do ciclo estral em bovinos tem sido relatada h dcadas
(Lamond, 1964; Gordon, 1976). Os animais recebiam doses dirias de progesterona por perodos de at
20 dias. Estes tratamentos resultavam em altas taxas de sincronizao do estro, no entanto apresentavam
baixa fertilidade, alm de serem pouco prticos (Macmillan e Peterson, 1993). Com o passar do tempo
foram desenvolvidos mtodos mais prticos de administrao de progesterona.
Existem atualmente no mercado brasileiro produtos (Crestar e Syncro-Mate-B) que so implantados
nas orelhas (via subcutnea), com a finalidade de manter nveis sangneos elevados de um progestgeno
(norgestomet) e, desta forma, diminuir a liberao endgena do hormnio luteinizante, simulando a fase ltea
do ciclo estral. A regresso do CL alcanada pela aplicao de valerato de estradiol no incio do tratamento
ou pela administrao de PGF2 no momento da remoo do implante. O implante hidrnico de SyncroMate-B contm 6 mg de norgestomet, enquanto que o implante silstico de Crestar apenas 3 mg. Segundo
26

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

Kesler et al. (1995), o implante de silicone provoca a liberao do progestgeno de forma mais homognea
e linear, enquanto que o implante hidrnico libera norgestomet em quantidades mais altas nos primeiros dois
dias, diminuindo nos dias subsequentes.
Tem sido demonstrado que a utilizao de implantes de norgestomet, induz o estro em mais de 90%
dos animais, porm as taxas de concepo variam de 33 a 68% (Odde et al., 1990). Cavalieri et al. (1997)
verificaram que o tratamento com gonadotrofina corinica equina (eCG) promove maior sincronizao do
pico de LH e da ovulao em vacas tratadas com implantes de norgestomet. Os autores sugerem que a
utilizao de eCG pode melhorar a eficincia de tratamentos de sincronizao da ovulao para inseminao
artificial com tempo fixo.
Em uma srie de artigos, B e colaboradores demonstraram que a associao de estrgenos a
dispositivos que liberam progesterona promove atresia do folculo dominante e induz a emergncia de uma
nova onda de crescimento folicular cerca de 4 dias aps a aplicao destes esterides (revisto por B et al.,
1995, 2003). Esta possibilidade de sincronizar a onda de crescimento folicular por meio do uso concomitante
de progesterona e estrgenos possibilitou o desenvolvimento de vrios protocolos hormonais, especialmente
teis para realizao de IATF em animais que se encontram em anestro e, portanto, no respondem bem ao
protocolo ovsynch e similares.
Nos ltimos anos tornaram-se disponveis no Brasil vrios dispositivos intravaginais que liberam
progesterona (CIDR, DIB, PRID, Cronipress e algumas Esponjas). O uso destes dispositivos intravaginais
liberadores de progesterona (P4) associados administrao de BE um dos tratamentos mais utilizados
para a IATF de bovinos (Macmillan & Burke, 1996; B et al., 2002, 2003). O tratamento mais popular
consiste na administrao de benzoato de estradiol (BE; 2,0 mg, via IM) no momento da insero do dispositivo
(Dia 0), aplicao de PGF2 quando o dispositivo intravaginal for removido (Dia 8) e 1,0 mg de BE (via
IM) 24 h mais tarde. A IATF realizada 30-36 h aps a ultima administrao de BE. Portanto, neste
protocolo so utilizados os seguintes hormnios: progesterona-estrgeno-prostaglandina-estrgeno (protocolo
PEPE, veja Figura 1).

Figura 1. Associao de progesterone (P4) e benzoato de estradiol (BE) para inseminao artificial com
tempo fixo (IATF, protocolo PEPE).
O protocolo PEPE tem sofrido modificaes na tentativa de melhorar ainda mais o crescimento folicular
e a sincronizao da ovulao. Trabalhos recentes sugerem que no protocolo PEPE, logo aps a aplicao
de PGF2 a administrao de eCG (400 UI, via IM, protocolo PEPE/eCG) tende a aumentar a taxa de
prenhez de vacas em anestro ps-parto (Baruselli et al., 2003; Cutaia et al., 2003).
Um recurso interessante a ser utilizado em vacas no anestro ps-parto a remoo temporria de
bezerros (RTB = 54 horas), realizada entre a aplicao de PGF2 e a IATF (protocolo RTB/PEPE).
Barreiros et al. (2003) testaram, num experimento realizado em duas fazendas, se a RTB seria capaz de
melhorar o protocolo PEPE. Na primeira fazenda, a RTB (Grupo RBR/PEPE) no melhorou as taxas de
27

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

prenhez quando comparada ao Grupo PEPE (45/84; 53,6% vs 44/87; 50,6%), entretanto, na segunda
fazenda a RTB aumentou significativamente a taxa de prenhez (48/71; 67,6% vs 35/77; 45,6%, p<0,05).
Estes resultados indicam que a RTB pode ter efeitos benficos quando associada ao protocolo PEPE. No
entanto, novos experimentos devem ser realizados para confirmar esta possibilidade.
Associao da RTB ao protocolo GPE/eCG
Um dos maiores obstculos ao uso do protocolo GPE em bovinos de corte sua ineficcia em animais
em anestro. Acredita-se que aps o parto as vacas necessitam de um primeiro contato com a progesterona
(priming) para que se desenvolva um corpo lteo com vida funcional normal (Hunter, 1991; Garverick et
al., 1992; Yavas & Walton, 2000). Tanto que na primeira ovulao ps-parto (isto , sem o priming de
progesterona) geralmente se forma um corpo lteo com vida curta, devido a liberao prematura de PGF2
pelo endomtrio uterino ( Peter et al., 1989; Stagg et al., 1998; Yavas & Walton, 2000).
Mais recentemente, Mann et al. (2000) propuseram que a vida curta do primeiro CL ps-parto esta
relacionada ao fato do folculo dominante no se desenvolver o suficiente para produzir elevadas concentraes
de estradiol, que seriam responsveis pela diminuio (down regulation) dos receptores do prprio estradiol
no endomtrio uterino. Se houver disponibilidade de receptores no endomtrio uterino, a interao do estradiol
com os mesmos desencadear eventos que resultaro na sntese de PGF2 no endomtrio uterino e lise
prematura do corpo lteo.
Levando-se em considerao a hiptese levantada por Mann et al. (2000), o protocolo GPE foi
modificado com o objetivo de se induzir, em vacas de corte com 40 a 70 dias ps-parto, a formao de um
folculo dominante capaz de produzir quantidades suficientes de estradiol para promover down regulation
dos receptores para estradiol, de forma a evitar a liberao prematura de PGF2. Neste novo protocolo
(RTB/GPE/eCG) o tratamento GPE precedido pela RTB durante 48 horas, a fim de diminuir o efeito
inibitrio da amamentao e presena do bezerro na liberao das gonadotrofinas. Alm disso, feita aplicao
de eCG, logo aps a administrao de PGF2, para acelerar o crescimento e maturao folicular. Vinte e
quatro horas mais tarde administrado BE para induzir pico pr-ovulatrio de LH e ovulao (veja Figura
2). de se esperar que o BE tenha um efeito aditivo com o estradiol endgeno, produzido sobretudo pelo
folculo dominante, para diminuir (down regulation) os receptores endometriais de estradiol e,
consequentemente, evitar a lise prematura do corpo lteo.
No protocolo RTB/GPE/eCG, mesmo que a administrao de GnRH no promova ovulao e formao
de CL (priming de progesterona), de acordo com a teoria proposta por Mann et al. (2000), os nveis de
estradiol provocados por este tratamento, devero ser suficientes para evitar a lise prematura do CL e
manter a gestao resultante da IATF.
Resultados preliminares indicam que a remoo temporria de bezerro pode ser benfica ao protocolo
GPE/eCG. Souza et al. (2004) reportaram que vacas (40 a 70 dias ps-parto), cujos bezerros foram removidos
por 48 h antes do tratamento GPE/eCG, apresentaram aumento na taxa de prenhez, quando comparadas as
do grupo GPE/eCG sem RTB (34/66; 51,2%, vs 21/74; 28,4%, respectivamente, p<0,05), tanto em animais
ciclando (17/31; 54,8% vs 11/33; 33,3%,) como em anestro (17/35; 48,5%, vs 10/41; 24,3%, a ciclicidade
dos animais foi determinada pela presena de CL, antes do incio dos tratamentos).
28

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

Figura 2. Associao da remoo temporria de bezerro (RTB) e aplicao de eCG ao tratamento GPE,
para a inseminao artificial com tempo fixo (IATF) de vacas em anestro ps-parto (protocolo
RTB/GPE/eCG).
Na tentativa de corroborar a hiptese discutida acima, ser testado, em vacas de corte em anestro, se
o tratamento RTB/GPE/eCG reduz a liberao de PGFM (metablito da PGF2), induzida pelo desafio
com ocitocina, e mantm um CL funcional durante as primeiras semanas aps a IATF. Novos experimentos
se encontram em andamento para confirmar ou no o efeito benfico da RTB no protocolo GPE/eCG.
CONCLUSO
Existem vrios protocolos hormonais que possibilitam a utilizao da inseminao com tempo fixo em bovinos
de corte, alguns necessitam que os animais estejam ciclando para serem efetivos (Ovsynch e similares) e
outros tem apresentado taxas de prenhez aceitveis, mesmo em vacas em anestro ps-parto (PEPE associado
ou no ao eCG ou RTB). A escolha do tratamento mais apropriado depender da relao custo/benefcio
para cada situao relacionada ao manejo da fazenda e a condio reprodutiva dos animais. medida que
o conhecimento sobre a fisio-farmacologia da reproduo dos bovinos avana, aumentam as possibilidades
de se desenvolverem tratamentos para IATF cada vez mais baratos e efetivos.
Agradecimentos
Agradecemos aos ps-graduandos Marcelo Pegorer, Alfredo F. Souza e Vinicius G. Pinheiro, por
terem contribudo para a realizao dos experimentos mais recentes com IATF. Agradecemos tambm a
FAPESP pelo auxlio financeiro e a CAPES, CNPq e FAPESP pelas bolsas de estudo e a Syntex (Argentina)
e Tecnopec (Brasil) pelos hormnios utilizados em alguns dos experimentos.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
ANUALPEC 2002: Anurio da Pecuria Brasileira. So Paulo: FNP Consultoria e Comrcio/Argos,
400p., 2002.
BARREIROS, T.R.R., SENEDA, M.M., BALARIN, O.F., REIS, E.L., BARUSSELI, P.S., PEGORER,
M., ERENO, R.L., BARROS, C.M. Effect of temporary calf removal on synchronization of ovulation for
fixed timed artificial insemination. Acta Scientiae Veterinariae, v.31, p.238-239, 2003.
BARROS, C.M.; FIGUEIREDO, R.A.; PINHEIRO, O.L. Estro, ovulao e dinmica folicular em zebunos.
29

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

Rev. Bras. Reprod. Anim., v.19, p.9-22, 1995.


BARROS, C.M., MOREIRA, M.B.P., FERNANDES,P. Manipulao farmacolgica do ciclo estral para
melhorar programas de inseminao artificial ou de transferncia de embries. Arq. Fac.Vet. UFRGS,
Supl.26, p.179-89, 1998.
BARROS, C.M.; MOREIRA, M.B.P.; FIGUEIREDO, A.R.; TEIXEIRA, A.B.; LA TRINCA.
Synchronization of ovulation in beef cows (Bos indicus) using GnRH, PGF2 and estradiol benzoate.
Theriogenology, v.53, p.1121-1134, 2000.
BARUSELLI, P.S., MARQUES, M.O., NASSER, L.F., REIS, E.L., B, G.A. Effect of eCG on pregnancy
rates of lactating zebu beef cows treated with CIDR-B devices for timed artificial insemination. Theriogenology,
v.59, p.214 (abstract), 2003.
BLOKEY, M.A. Sheep and cattle mating behavior. Vet. Rural. Sci., v.4, p.53-62, 1980.
BO, G.A.; ADAMS, G.P.; CACCIA, M.; MARTINEZ, M.; PIERSON, R.A.; MAPLETOFT, R.J. Ovarian
follicular wave emergence after treatment with progestogen and estradiol in cattle. Anim. Reprod. Sci. V39,
p.193-204, 1995.
BO, G.A., BARUSELLI, P.S., MORENO, D., CUTAIA, L., CACCIA, M., TRBULO, R., TRBULO,
H., MAPLETOFT, R.J. The control of follicular wave development for self-appointed embryo transfer programs
in cattle. Theriogenology.v.57, p.53-72, 2002.
B, G.A.; BARUSELLI, P.S.; MARTINEZ, M.F. Pattern and manipulation of follicular development in Bos
Indicus cattle. Animal Reproduction Science. V.78, p.307-326, 2003.
BURKE, J.M.; DE LA SOTA, R.L.; RISCO, C.A.; STAPLES, C.R.; SCHIMITT, E.J.P.; THATCHER,
W.W. Evaluation of timed insemination using a gonadotropin-releasing hormone agonist in lactating dairy
cows. J. Anim. Sci., v.79, p.1385-93, 1996.
CAVALIERI, J.; RUBIO, L.; KINDER, J.E.; ENTWISTLE, K.W.; FITSPATRICK, L.A. Synchronization
of estrus and ovulation and associated endocrine changes in Bos indicus cows. Theriogenology, v.47,
p.801-814, 1997.
CHENAULT, J.R. Pharnaceutical control of estrous cycles. In: LARGE DAIRY HERD MANAGEMENT.
H.H. Van Horn and C.J. Wilcox, An. Dairy Sci. Assoc., Savoy, I.L., p153, 1992.
CUTAIA, L., TRBULO, R., MORENO, D., B, G.A. Pregnancy rates in lactating beef cows treated with
progesterone releasing devices, estradiol benzoate and equine chorionic gonadotropin (eCG).
Theriogenology, v.59, p.216 (abstract), 2003.
DIELEMAN, S. J., BEVERS, M. M, VAN TOL, H. T. M., WILLEMSW, A H. Peripheral plasma
concentrations of estradiol, progesterone, cortisol, LH and prolactin during the estrous cycle in the cow,
with emphasis on the peri-oestrus period. Anim. Reprod. Sci., v.10, p.275-92, 1986.
EDWARDS, S. The effect of short term calf removal on pulsatile LH secretion in the postpartum beef cow.
Theriogenology, v.23, p.777-785, 1985.
30

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

ESCOBEDO, F.; ENCISO, A.; GOMEZ, G.; SISNEROS, E.; COPUY, A.; CALLEGOS, J.; KINDER,
J.E.; GARCIA-WINDER, M. Norgestomet induces estrous but not ovulation in prepupertal Bos Taurus X
Bos indicus. J. Anim. Sci., v,67, p.410-, 1989.
ESSLEMONT, R.J.; GLENCROSS, R.G.; BRYANT, M.J.; POPE, G.S. A quantitative study of pre-ovulatory
behavior in cattle (British Friesian heifers). Appl. Anim. Ethol., v.6, p.1-17, 1980.
FERNANDES, P.; TEIXEIRA, A.B.; CROCCI, A.J.; BARROS, C.M. Timed artificial insemination in beef
cattle using GnRH agonist, PGF2 and estradiol benzoate (EB).Theriogenology, v.55, p.1521-1532, 2001.
GALINA, C.S.; ARTHUR, G.H.; Review on cattle reproduction in the tropics. Part4. Oestrus cycles. Anim.
Breed. Abst., v.58, p.697-707, 1990.
GARVERICK, H.A., ZOLLERS, W.G., SMITH, M.F. Mechanisms associated with corpus luteum lifespan
in animals having normal or subnormal luteal function. Anim. Reprod. Sci., v.28, p.111-124, 1992.
GEARY, T.W.; WHITTIER, J.C.; HALLFORD, D.M.; MACNEIL, M.D. Calf removal improves conception
rates to the Ovsynch and Co-Synch protocols. J Anim .Sci. v.79, p.1-4, 2001.
GORDON, I. Controlled breeding in cattle. Part.1. Hormones in the regulation, oestral control, and set-time
artificial insemination. Anim. Breed. Abst., v.44, p.265-75, 1976.
GUILBAULT, L.A.; LUSSIER, J.G.; GRASSO, F.; MATTON, P. Influence of a GnRH analogue on follicular
dynamics in cow pretreated or not with FSH-P. Theriogenology, v.33, p.240, 1990.
HAFEZ, E.S.E. Reproduction in farm animal. 6 ed. Philadelphia, Lea & Febiger, 585p. 1993
HANSEL, W.; ECHTERNKAMP, S.E. Control of ovarian functions in domestic animals. Am. Zool. V.12,
p.225-43, 1972.
HUNTER, R.H.F.; WILMUT, I. Sperm transport in the cow: peri-ovulatory redistribuition of viable cells
within the oviduct. Reprod. Nutr. Dev., v.24, p.597-608, 1984.
HUNTER, M.G. Characteristics and causes of the inadequate corpus luteum. J. Reprod. Fertil., v.43,
p.91-99, 1991.
KASTELIC, J.P., KNOPF, L., GINTHER, O.J. Effect of day of prostaglandin F2 treatment on
selection and development of the ovulatory follicle in heifers. Anim. Reprod. Sci., v.23., p.169- 80, 1990.
KESLER, D.J.; FAVERO, R.J.; TROXEL, T.R. Comparasion of hydron and silicone implants in the bovine
norgestomet and estradiol valerate synchronization procedure. Drug Dev. Ind. Pharm., v.21, p.475-85,
1995.
LAMOND, D.R. Synchronization of ovarian cycles in sheep and cattle. Anim. Breed. Abstr., v. 32, p. 269285, 1964.
LAUDERDALE, J.W.; MACALLISTER, J.F.; KRATZER, D.D.; MOODY, E.L. Use of prostaglandin
F2 in cattle breeding. Acta Vet. Scand., v.77, p.181, 1981.
MACMILLAN, K.L., BURKE, C.R. Effects of oestrus cycle control on reproductive efficiency.
31

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

Anim.Reprod.Sci.v.42, p.307-320, 1996.


MACMILLAN, K.L., PETERSON, A.J. A new intravaginal progesterone realising device for cattle
(CIDR - B) for estrous synchronization, increasing pregnancy rates and the treatment of post-partum
anestrous. Anim. Reprod. Sci., v.33, p.1-25, 1993.
MACMILLAN, K.L.; THATCHER, W.W. Effect of an agonist of gonadotropin releasing hormone on ovarian
follicles in cattle. Biol. Reprod., v.45, p.883-9, 1991.
MANN, G.E.; LAMMING, G.E. The role of sub-optimal preovulatory oestradiol secretion in the aetiology
of premature luteolysis during the short oestrus cycle in the cow. Anim.Reprod.Sci. v.64, p.171-180, 2000.
MCGOWAN, M.R. Sincronizacin de cellos y programas de inseminacin artificial a tiempo fijo en ganado
Bos indicus y cruza Bos indicus . B. G.A ., Caccia M (Eds). Resmenes Tercer Simposio Internacional
de Reproduccin Animal. Carlos Paz, Crdoba, Argentina, p.71-82, 1999.
MEIRELLES, F.V.; Rosa, A.J.M.; Lbo, B.R. et al. Is the American Zebu really Bos indicus? Genetics
and Molecular Biology, v.22, p.543-547, 1999.
MIZUTA, K. Estudo comparativo dos aspectos comportamentais do estro e dos teores plasmticos
de LH, FSH, Progesterona e Estradiol que precedem a ovulao em fmeas bovinas Nelore (Bos
taurus indicus), Angus (Bos taurus taurus) e Nelore x Angus (Bos taurus indicus x Bos taurus
taurus). So Paulo, 2003, 98p. dissertao (doutorado em Reproduo Animal) Faculdade de Medicina
Veterinria e Zootecnia Departamento de Reproduo Animal Universidade de So Paulo.
MUKASA-MUGERWA, E. A review of reproductive performance of female Bos indicus (Zebu) cattle.
ILCA monog. v.6, p. 1-34, 1989.
ODDE, K.G. A review of synchronization of estrus in postpartum cattle. J. Anim. Sci. V.68, p.817-30,
1990.
PETER, A.T, Bosu, W.T.K., Liptrap, R.M., Cummings, E. Temporal changes in serum prostaglandin F2
and oxytocin in dairy cows with short luteal phases after the first postpartum ovulation. Theriogenology,
v.32, p.277-284, 1989.
PIERSON, R.A.; GINTHER, O.J. Ultrassonic imaging of the ovaries and uterus in cattle. Theriogenology,
v.29, p.21-37, 1988.
PINHEIRO, O.L., BARROS, C.M., FIGUEREDO, R.A., VALLE, E.R., ENCARNAO, R.O.,
PADOVANI, C.R., Estrous behavior and the estrous to ovulation interval in Nelore cattle (Bos indicus) with
natural estrus or estrus induced with prostaglandin F2 or norgestomet and estradiol valerate.
Theriogenology, v.49, p.667-81, 1998.
PURSLEY, J.R.; MEE, M.O.; BROWN, M.D.; WILTBANK, M.C. Synchronization of ovulation in dairy
cattle using GnRH and PGF2. J. Anim. Sci., v.72, p.230, 1994.
PURSLEY, J.R.; MEE, M.O.; WILTBANK, M.C. Synchronization of ovulation in dairy cattle using GnRH
and PGF2. Theriogenology, v.44, p.915-23, 1995.
32

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

PURSLEY, J.R.; WILTBANK, M.C.; STEVENSOM, J.S.; OTTOBRE, J.S.; BARVERICK, H.A.;
ANDERSOM, L.L. Pregnancy rates per artificial insemination for cows and heifers inseminated at a
synchronized ovulation or synchronized estrus. J. Anim. Sci., v.80, p.295-300, 1997a.
PURSLEY, J.R.; KOSOROK, M.R.; WILTBANK, M.C. Reproductive management of lactating dairy
cows using synchronization of ovulation. J. Dairy Sci., v.80, p.295-300, 1997b.
ROWSON, L.E.A.; TERVIT, R.; BRAND, A. The use of prostaglandin for synchronization of estrus in
cattle. J. Reprod. Fertil., v.29, p.145, 1972.
SAVIO, J.D.; KEENAN, L.; BOLAND, M.P; ROCHE, J.F. Pattern of growth of dominant follicles during
the oestrus cycle of heifers. J.Reprod. Fert., v.83, p.663-71, 1988.
SAVIO, J.D., BOLAND, M.P., HYNES, N., MATTIACI, M.R., ROCHE, J.F. Will the first dominant
follicle of the estrous cycle of heifers ovulate following luteolysis on day 7? Theriogenology, v.33, p.677,
1990.
SIROIS, J., FORTUNE, J.E. Ovarian follicular dynamics during the estrus cycle in heifers monitored by
Real-Time Ultrasonography. Biol. Reprod., v.39, p.308-17, 1988.
SOUZA, A.F., PINHEIRO, V.G., ERENO, R.L., BARROS, C.M. Taxa de prenhez , em vacas Nelore,
aps a remoo temporria de bezerros (RTB) e utilizao de protocolos hormonais com eCG. Acta Scientiae
Veterinariae, abstract, 2004 (in press).
STAGG, K.; SPICER, L.J.; SREENAN, J.M., ROCHE, J.F.; DISKIN, M.G. Effect of calf isolation on
follicular wave dynamics, gonadotropin and metabolic hormone changes, and interval to first ovulation in bee
cows fed either of two energy levels postpartum. Biol. Reprod., v.59, p.777-783, 1998.
THATCHER, W.W.; MACMILLAN, K.L.; HANSEN, P.J.; DROST, M. Concepts for regulation of corpus
luteum function by the conceptus and ovarian follicles to improve fertility. Theriogenology, v.31, p.149-64,
1989.
THATCHER, W.W.; DROST, M.; SAVIO, J.D.; MACMILLAN, K.L.; ENTWISTLE, K.W.; SCHIMITT,
E.J.; DE LA SOTA, R.L.; MORRIS, G.R. New clinical uses of GnRH and its analogues in cattle. Anim.
Reprod. Sci., v.33, p.27-49, 1993.
TWAGIRAMUNGU, H.; GUIBAULT, L.A.; PROULX, J.; VILLEUVE, P.; DUFOUR, J.J. Synchronization
of estrus and fertility in beef cattle with two injections of buserelin and prostaglandin. Theriogenology, v.38,
p.1131-44, 1992a.
TWAGIRAMUNGU, H.; GUIBAULT, L.A.; PROULX, J.; VILLEUVE, P.; DUFOUR, J.J. Influence of na
agonist of Gonadotropin-Releasing Hormone (Buserelin) on estrus synchronization and fertility in beef cows.
J. Anim. Sci., v.70, p.1904-10, 1992b.
TWAGIRAMUNGU, H.; GUIBAULT, L.A.; PROULX, J.; DUFOUR, J.J. Influence of corpus luteum and
induced ovulation on ovarian follicular dynamics in postpartum cyclic cows treated with buserelin and
cloprostenol. J. Anim. Sci., v.72, p.1796, 1994.
33

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

TWAGIRAMUNGU, H.; GUILBAULT, L.A.; DUFOUR, J.J. Synchronization of ovarian follicular waves
with a gonadotropin-releasing hormone agonist to increase the precision of estrus in cattle: A review. J.
Anim. Sci., v.73, p.3141-51, 1995.
VACA, L.A.; GALINA, C.; FERNANDEZ, B.S. Oestrus cycle, oestrus and ovulation of the zebu in the
Mexican tropics. Vet. Rec., v.117, p.434-7, 1985.
VILELA, E.R., Vasconcelos, J.L.M., Figueiredo, R.A., Alessandri, A.M.M., Cerri, R.L.A., Wechister, F.S.,
Barros, C.M.Efeito da remoo dos bezerros, em dois diferentes momentos durante protocolo de sincronizao
na taxa de ovulao em vacas Nelore. Rev. Bras. Reprod. Anim., v.23, p.314-317, 1999.
VILELA, E.R. et. al. Efeito da remoo dos bezerrons na taxa de prenhez IA com tempo fixo e monta
natural nos primeiros 30 dias da estao de monta em vacas Nelore. Rev. Bras. Reprod. Anim., v. 27,
p.288-289, 2001.
WILTBANK, M.C.; PURSLEY, J.R.; FRICKE, P.M.; VASCONCELOS, J.LM; GUENTHER, J.N.,
GIBBONS, J.R.; GINTHER, O.J. Development of IA and ET programs that do not require detection of
estrus using recent information on follicular growth. In: ANNUAL CONVENTION PORTLAND, 15, 1996,
Oregon. Proceedings...Oregon: American Embryo Transfer Association, 1996, p.23-44.
WILLIAMS, S.W., STANKO, R.L., AMSTALDEN, M., WILLIANS, G.L. Comparison of three approaches
for synchronization of ovulation for timed artificial insemination in Bos indicus-influenced cattle managed on
the Texas gulf coast. J. Anim. Sci. v.80, p.1173-1178, 2002.
WISHART, D.F. Observations on the oestrus cycle of the Friesian heifers. Vet. Rec., v.90, p.595-7, 1972.
YAVAS, Y.; WALTON. Postpartum acyclicity in suckled beef cows: a review. Theriogenology, v.54, p.2555, 2000.

34

Sartori, R. 2004. Fertilizao


e morte
embrionria
em bovinos.
Acta Scientiae
Veterinariae, 32 (Supl ): 35-50.
Acta
Scientiae
Veterinariae
32(Suplemento),
2004

FERTILIZAO E MORTE EMBRIONRIA EM BOVINOS


R. Sartori
Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, Braslia, DF, Brasil; Department of Dairy Science,
University of Wisconsin, Madison, WI, USA E-mail: sartori@cenargen.embrapa.br

RESUMO Em um programa de manejo reprodutivo de bovinos, alm dos aspectos relacionados ao smen
e tcnicas de inseminao ou monta natural, alteraes na qualidade ovocitria tambm afetam os ndices de
fertilizao e de desenvolvimento embrionrio. Dentre os fatores que podem comprometer o transporte de
gametas, fertilizao dos ovcitos, integridade ovocitria, ou a viabilidade embrionria e fetal em bovinos,
encontram-se fatores ambientais, genticos, metablicos, nutricionais e infecciosos. A maioria dos estudos
que avaliaram embries coletados do oviduto ou tero de vacas inseminadas com smen de boa qualidade
relatou elevada taxa de fertilizao (80 a 100%), independentemente de idade, raa, ou estgio de lactao.
Resultados inferiores na taxa de fertilizao foram observados em vacas com alta produo leiteira sob
condies de estresse trmico (55%) e em vacas leiteiras repetidoras de cio (62 a 72%). Embora, na
maioria dos casos, falha na fertilizao no seja um entrave para o estabelecimento da prenhez, perda
embrionria considerada a causa mais importante para o aumento do intervalo entre partos nos rebanhos.
A maioria das perdas pr-natais ocorre durante o perodo embrionrio ( 42 d) em bovinos de corte e leite,
sendo que dentre essas perdas embrionrias a maior parte ocorre durante os primeiros dias aps a fertilizao
e durante o processo de implantao do embrio no tero. Estudos que avaliaram vacas de corte com alta
incidncia de infertilidade, observaram em torno de 30% de perda embrionria at o dia 7 aps o estro. Por
outro lado, estudos com novilhas de corte de fertilidade elevada, descreveram altas taxas de sobrevivncia
embrionria at o dia 8. A maioria das mortes embrionrias nesses estudos ocorreu entre o dia 8 e 18 aps
IA. Estudos mais recentes que coletaram embries de vacas de alta produo de leite no superovuladas,
observaram taxas de perda embrionria elevadas. Em geral, apesar da elevada taxa de fertilizao (80 a
90%), a taxa de embries viveis coletados 5 a 7 dias aps a IA foi de 50 a 60%. Estudos que avaliaram
morte embryonria/fetal entre os dias 25 e 60 de gestao atravs de ultra-sonografia transretal relataram
entre 10 e 30% de perda em vacas leiteiras lactantes e 10% de mortalidade em bovinos de corte e novilhas
de leite. Em concluso, a elevada morte embrionria durante os primeiros dias de gestao considerada a
principal causa responsvel pela baixa eficincia reprodutiva, especialmente em vacas de alta produo de
leite. A utilizao de biotecnologias reprodutivas tais como tratamentos hormonais e transferncia de embries
provenientes de animais com elevada fertilidade tem se mostrado alternativas viveis para o incremento da
eficincia reprodutiva. Alm disso, o uso de tcnicas adequadas de IA e a reduo de problemas sanitrios,
nutricionais e ambientais so condies essenciais para a obteno de elevados ndices de fertilizao e
manuteno da gestao, culminando no sucesso dos programas reprodutivos em bovinos.
Palavras-chave: bovino, fertilizao, embrio, mortalidade.
35

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

1. INTRODUO
Na reproduo de bovinos, alm dos aspectos relacionados ao smen e tcnicas de inseminao ou
monta natural, alteraes na qualidade ovocitria, ou no ambiente uterino e de ovidutos tambm podem
afetar os ndices de fertilizao e de desenvolvimento embrionrio. Dentre os fatores que podem comprometer
o transporte de gametas, fertilizao dos ovcitos, integridade ovocitria, ou a viabilidade embrionria e fetal
em bovinos, encontram-se fatores ambientais, genticos, metablicos, nutricionais e infecciosos. Esta reviso
procura descrever e discutir resultados de diversos estudos que avaliaram taxas de fertilizao e de morte
embrionria em bovinos com ovulao nica ou superovulados. Alm disso, apresenta dados de morte
embrionria em receptoras de embries produzidos in vivo e in vitro.

2. TAXAS DE FERTILIZAO EM FMEAS BOVINAS COM OVULAO NICA (NO


SUPEROVULADAS)
Durante a monta, o touro deposita bilhes de espermatozides na vagina da vaca. Entretanto, devido
ao fato da crvix ser o maior obstculo ao transporte espermtico, o nmero de espermatozides que alcanam
o corpo uterino no ultrapassa 1% (Harper, 1982). Na IA, o smen depositado diretamente no tero,
ultrapassando a crvix e permitindo o uso de um nmero reduzido de espermatozides. Aps a monta ou IA,
o smen exposto a uma srie de ambientes distintos que alteram significativamente o nmero e a funo
espermtica. Muitos espermatozides so perdidos no trato genital feminino pelo transporte retrgrado
(Mullins e Saacke, 1989). Espermatozides viveis que so retidos no trato genital feminino devem atravessar
o tero, passar para o oviduto pela juno tero-tubrica, interagir com o epitlio do oviduto e sofrer capacitao
antes de poder fertilizar o ovcito (Berger, 1996).
Na fmea bovina, ao incio do estro, altas concentraes de LH desencadeadas pelas elevadas
concentraes circulantes de estradiol (E2) induzem o reincio da meiose no ovcito (revisado por Mermillod
et al., 1999) e iniciam uma seqncia de eventos que levam ovulao. Quando o folculo se rompe, o
ovcito rodeado por clulas do cumulus liberado na cavidade peritoneal e capturado pelas clulas epiteliais
ciliadas do infundbulo. O ovcito ento transportado atravs da ampola para a juno istmo-ampolar,
onde ocorre a fertilizao.
Diversos estudos tm relatado que a taxa de fertilizao aps IA de estruturas coletadas de oviduto ou
tero de vacas no superovuladas alta, independente de idade ou raa (Tabela 1). Estudos com novilhas de
corte ou leite observaram 82 a 100% de taxa de fertilizao aps uma nica IA. Taxas de fertilizao
similares (75 a 100%) foram tambm relatadas em vacas de corte (Tabela 1). Resultados inferiores na taxa
de fertilizao, entretanto, foram observados em algumas circunstncias especficas. Vacas com alta produo
leiteira sob condies de estresse trmico apresentaram taxas de fertilizao de apenas 55% (Tabela 1).
Vacas leiteiras repetidoras de cio (repeat-breeders) tiveram 62 e 72% de fertilizao, como descrito por
Almeida (1995) e OFarrell et al. (1983), respectivamente. Em um experimento em que vacas holandesas
no lactantes foram inseminadas somente no momento do incio do estro, a taxa de fertilizao foi ao redor de
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67% (Tabela 1). Portanto, embora em geral as taxas de fertilizao so elevadas em bovinos, algumas
condies especiais tais como estresse trmico, ou momento inadequado da IA, podem comprometer a
fertilizao em vacas.
TABELA 1

Aps a fertilizao, o zigoto passa por uma srie de divises celulares (clivagem) e permanece no
oviduto at o dia 3 ou 4, quando ento entra no tero. A porcentagem de ovcitos que no so capturados
pelo infundbulo aps a ovulao ou a porcentagem de embries/vulos que no so transportados ao tero
aps 3 a 4 dias do pico de LH, no conhecida, mas muito provvel que alguns embries/vulos so
perdidos antes de alcanarem o tero. De fato, diversos estudos que lavaram o oviduto ou tero de bovinos
com o propsito de avaliar taxa de fertilizao ou qualidade embrionria entre os dias 3 e 14 aps IA em
vacas no superovuladas (Breuel et al., 1993; Ryan et al., 1993; Almeida, 1995; Dunne et al., 2000; Dalton
et al., 2001a; Sartori et al., 2002b) ou superovuladas (Kelly et al., 1997; Sartori et al., 2003b; 2004b)
coletaram abaixo de 85% de embries e/ou vulos por corpo lteo (CL). Caso de fato nem todos os vulos
alcanam o stio de fertilizao, provvel que as taxas de fertilizao relatadas na literatura estejam
superestimadas. Alm disso, os estudos que avaliaram taxas de fertilizao em bovinos foram conduzidos
sob condies experimentais controladas, que podem no refletir completamente a realidade nas fazendas.

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3. TAXAS DE FERTILIZAO EM FMEAS BOVINAS SUPEROVULADAS


Vacas e novilhas submetidas a tratamentos hormonais com o propsito de produzirem ovulaes
mltiplas, geralmente apresentam uma alta porcentagem de ovcitos no fertilizados no lavado uterino (Tabela
2). Entre os trabalhos citados na Tabela 2, as menores taxas de fertilizao aps superovulao foram
observadas em vacas repetidoras de cio (Hawk e Tanabe, 1986), vacas inseminadas no incio do estro
(Dalton et al., 2000), e novilhas inseminadas com espermatozides sexados (Sartori et al., 2004b). Em
contraste, quando fmeas superovuladas foram inseminadas com smen de alta qualidade e no momento
apropriado em relao ao estro (Dalton et al., 2000; Sartori et al., 2004b), as taxas de fertilizao relatadas
foram superiores a 80%. Apesar disso, nos estudos que compararam diretamente vacas no superovuladas
s superovuladas (Elsden et al., 1976; Saacke et al., 1998 [Tabelas 1 e 2]), taxas menores de fertilizao
ocorreram nas superovuladas. Como discutido por Kafi e McGowan (1997), a menor taxa de fertilizao
em bovinos superovulados pode ser decorrncia de distrbios no transporte de espermatozides e ovcitos,
alm da qualidade inferior dos ovcitos. De fato, conforme Hyttel et al. (1991), tratamentos superovulatrios
tm efeitos adversos na maturao ovocitria ou das clulas da granulosa, comprometendo no somente a
fertilizao mas tambm a viabilidade embrionria.

TABELA 2

4. DESENVOLVIMENTO E SOBREVIVNCIA EMBRIONRIA


Diversos estgios do desenvolvimento embrionrio inicial so importantes para o desenvolvimento e
sobrevivncia do embrio. O embrio move-se do oviduto para o tero no estgio de 8 a 16 clulas (Grealy
et al., 1996). Com 5 a 6 d de idade o embrio atinge o estgio de 16 a 32 clulas e estas clulas comeam
a se juntar para se formar uma esfera compacta denominada mrula. A compactao celular e as junes
intercelulares representam o primeiro estgio crtico em que o embrio comea a atuar como um organismo
individual. Nos dias 7 ou 8 uma cavidade se forma e as clulas do blastocisto inicial diferenciam-se em massa
celular interna, destinada a formar o feto, e trofoblasto, destinado a formar a placenta (revisado por Sreenan
et al., 2001). Entre os dias 9 e 10, o blastocisto expandido eclode da zona pelcida e continua a se expandir
antes de comear a elongar por volta do dia 13. O elongamento ocorre ao redor do momento do
reconhecimento materno da gestao e acompanhado por um aumento na atividade metablica e secreo
de interferon (revisado por Mann et al., 1999; Thatcher et al., 2001). A fixao do embrio ao endomrio
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comea aproximadamente no dia 19. A implantao embrionria est completa no dia 42. A sobrevivncia
do embrio e estabelecimento da gestao envolvem comunicao ativa e passiva entre o embrio e o tero.
A manuteno do CL, como resultado dos sinais embrionrios para a me, garante a produo continuada
de progesterona (P4), a qual necessria para preparar o endomtrio para implantao e nutrio embrionria.
A presena do embrio por volta do dia 16 do ciclo inibe a sntese e liberao de PGF2 do endomtrio
(revisado por Geisert et al., 1994; Mann et al., 1999; Thatcher et al., 2001; Okuda et al., 2002), prevenindo
assim a lutelise e o conseqente declnio na produo de P4.
Embora falha na fertilizao aps inseminao no parea ser um grande problema para o estabelecimento
da gestao em bovinos, mortalidade embrionria considerada a principal causa responsvel pelo aumento
no intervalo entre partos nos bovinos. A maioria das perdas embrionrias ocorre durante o perodo embrionrio
da gestao (< 45 d) tanto em bovinos de corte quanto de leite (Thatcher et al., 1994; Vanroose et al., 2000;
Sreenan et al., 2001), e de acordo com Wathes (1992), a maioria das mortes embrionrias ocorre nos
primeiros dias aps fertilizao e durante o processo de implantao.
As condutas utilizadas para avaliar mortalidade embrionria precoce em bovinos tm sido abater animais
em intervalos especficos aps a inseminao e coletar embries/vulos do oviduto ou tero, e mais
recentemente, coletar embries in vivo do tero utilizando-se lavados uterinos. Diversos estudos sobre
perda embrionria inicial foram realizados h mais de 20 anos (Boyd et al., 1969; Ayalon et al., 1978; Diskin
e Sreenan, 1980; Roche et al., 1981; Maurer e Chenault, 1983). Estudos que avaliaram vacas de corte com
alta incidncia de infertilidade (repeat-breeders), observaram em torno de 30% de perda embrionria at
o dia 7 aps o estro (Ayalon et al., 1978; Maurer e Chenault, 1983). Por outro lado, estudos com novilhas
de corte de fertilidade elevada, descreveram altas taxas de sobrevivncia embrionria at o dia 8. A maioria
das mortes embrionrias nesses estudos ocorreu entre o dia 8 e 18 aps IA (Diskin e Sreenan, 1980; Roche
et al., 1981). Em um estudo mais recente, Dunne et al. (2000) no observaram diferenas na sobrevivncia
embrionria nos dias 14, 30 ou ao parto em novilhas de corte. Os autores sugeriram que a maioria das
perdas embrionrias nas novilhas havia ocorrido antes do dia 14. A Tabela 3 resume resultados de diversos
estudos sobre desenvolvimento e sobrevivncia embrionria inicial em bovinos de corte, novilhas de leite e
vacas de leite no lactantes. Em geral, com exceo de vacas que ovularam folculos persistentes, a porcentagem
de embries viveis coletados entre os dias 3 e 16 foi elevada na maioria dos estudos (78% de mdia).

TABELA 3

Contrastando com o elevado nmero de embries viveis observado em bovinos de corte, e fmeas
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de leite no lactantes, estudos que avaliaram o desenvolvimento embrionrio inicial em vacas de leite lactantes,
demonstraram ndices muito mais baixos de sobrevivncia embrionria entre os dias 3 e 14, especialmente
em vacas com alta produo leiteira (Tabela 4). Um estudo mais antigo (Boyd et al., 1969) relatou 70% de
sobrevivncia embrionria at o dia 26 da gestao. Entretanto, estudos mais recentes que coletaram embries
do tero de vacas com alta produo de leite no superovuladas (Wiebold, 1988; Ryan et al., 1993; Sartori
et al., 2002b; Cerri et al., 2004) demonstraram uma incidncia muito mais elevada de mortalidade embrionria
precoce. Wiebold (1988) coletou 25 embries de 23 vacas lactantes no dia 7 e notou que todas as estruturas
estavam fertilizadas (Tabela 1), sendo que 12 eram embries normais e 13 anormais. Dos 13 anormais, pelo
menos 9 eram degenerados e possuiam = 8 clulas. Ryan et al. (1993) coletaram embries nas estaes
quente e fria do ano na Arbia Saudita e observaram uma porcentagem baixa de embries viveis nos dias 6
ou 7 (59% durante o vero e 52% durante o inverno). Vacas coletadas nos dias 13 ou 14 durante o inverno
demonstraram porcentagens similares de embries viveis em relao aos dias 6 ou 7 (60%). Entretanto,
vacas coletadas nos dias 13 ou 14 durante o vero tiveram uma porcentagem ainda menor de embries
viveis (27%). Nos experimentos relatados por Sartori et al. (2002b), entre os embries coletados no dia 6
aps IA de vacas holandesas com alta produo leiteira no superovuladas, 67% no estavam viveis no
experimento durante o vero e 52% no eram viveis no experimento do inverno (Tabela 4). No mesmo
estudo, novilhas holandesas geraram 72% de embries viveis no vero e vacas holandesas no lactantes
geraram 82% de embries viveis no inverno (Tabela 3). Um estudo recente (Cerri et al., 2004) que avaliou
os efeitos de dietas com fontes de gordura com diferentes perfis de cidos graxos na taxa de fertilizao e
qualidade embrionria em vacas lactantes sincronizadas com o protocolo Ovsynch (Pursley et al., 1995),
relatou que 26 a 48% dos embries coletados no dia 5 aps IA eram de qualidade pobre ou degenerados.
Quando os dados apresentados na Tabela 4 foram agrupados, apenas 51% dos embries coletados de
vacas lactantes entre os dias 3 e 14 eram viveis. Portanto, em vacas com alta produo leiteira, a maioria
dos embries pode estar com sua viabilidade comprometida antes do dia 13 da gestao. Alm disso, a
maior parte desses embries parece j estar comprometida antes do dia 7 em vacas com alta produo
leiteira no superovuladas.

TABELA 4

Estudos que avaliaram mortalidade embrionria em bovinos entre os dias 25-28 e 42 com auxlio de
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ultra-sonografia transretal e mortalidade fetal precoce entre os dias 42 e 60-70 observaram resultados muito
distintos, que em geral estavam associados raa, idade, lactao, ou procedncia dos embries (Tabela 5).
Quando mortalidade embrionria tardia foi comparada mortalidade fetal precoce, a maioria das perdas
ocorreu antes do estgio fetal (Beal et al., 1992; Vasconcelos et al., 1997; Tabela 5). Os poucos estudos que
avaliaram mortalidade embrionria tardia/fetal precoce em bovinos de corte, ou novilhas de leite descreveram
incidncias baixas (10%) de perda (Tabela 5), com exceo de novilhas e vacas de corte receptoras de
embries produzidos in vitro (Reis et al., 2004). Contrastando com a baixa perda embrionria/fetal em
bovinos de corte e novilhas de leite, trabalhos recentes em vacas de leite lactantes tm demonstrado uma
incidncia mais elevada de mortalidade embrionria tardia/fetal precoce. Valores entre 15 e 30% de mortalidade
foram os mais comumente observados na maioria dos estudos (Tabela 5), mesmo quando embries congelados
produzidos em novilhas superovuladas e de esperada fertilidade alta foram trasferidos em vacas lactantes
(Sartori et al., 2003a). Aps exaustiva pesquisa na literatura, encontramos apenas um estudo recente em
vacas leiteiras lactantes que descreveu baixas taxas de mortalidade entre os dias 28 e 42 de gestao (Silke
et al., 2002; Tabela 5). Uma peculiaridade desse estudo, entretanto, foi que as vacas eram manejadas a
pasto, diferentemente dos demais estudos descritos na Tabela 5. Esses resultados conflitantes sugerem que
nveis de produo de leite, e especialmente fatores nutricionais e de manejo (conforto animal) possam estar
influenciando direta ou indiretamente a sobrevivncia embrionria/fetal em bovinos.

TABELA 5

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5. DISCUSSO
Como mencionado anteriormente, h diversos fatores que podem estar envolvidos com a falha na
fertilizao ou mortalidade embrionria/fetal em bovinos. Problemas de fertilizao ou abortamentos podem
ser causados por doenas infecciosas (Bearden e Fuquay, 2000; Vanroose et al., 2000), ou infeces localizadas
e restritas a rgos especficos tais como tero (Nakao et al., 1992; Loeffler et al., 1999a,b; Grhn e RajalaSchultz; 2000), ou glndula mamria (Moore et al., 1991; Loeffler et al., 1999a,b; Schrick et al., 2001;
Santos et al., 2004). Causas no infecciosas, entretanto, provavelmente contribuem para a maioria das
perdas (Christianson, 1992; Thatcher et al., 1994; Labrnia et al., 1996; Vanroose et al., 2000). Algumas
dessas causas so anormalidades cromossmicas, fatores externos (por exemplo, estresse, produtos txicos,
teratognicos ou abortivos, e nutrio), e fatores maternos (por exemplo, desbalanos hormonais, lactao e
idade). Aspectos tcnicos ou relacionados anatomia e fisiologia que esto associados fertilidade reduzida
em bovinos tambm foram estudados e incluem: ambiente tubrico e/ou uterino inapropriados (Wiebold,
1988; Binelli et al., 1999), fertilidade ovocitria reduzida devido a anormalidades foliculares (Eicker et al.,
1996; Emanuelson e Oltenacu, 1998), tcnica de IA inapropriada em relao ao momento do estro (Senger
et al., 1988; Lpez-Gatius, 2000; Dalton et al., 2001a,b), e problemas espermticos ou de fertilizao
(Lpez-Gatius, 2000; Dalton et al., 2001a,b; Lpez-Gatius et al., 2002).
A maior incidncia de mortalidade embrionria/fetal, e conseqentemente, baixa fertilidade em vacas
de alta produo leiteira quando comparadas s demais fmeas bovinas, tem estimulado pesquisadores a
investigar com maiores detalhes os aspectos fisiolgicos que possam estar associados subfertilidade neste
grupo distinto de animais. Raa no parece ser o fator mais relevante associado baixa fertilidade de
bovinos leiteiros, porque estudos sobre associaes genticas com fertilidade tm demonstrado que a
hereditariedade para caracteres de fertilidade baixa (Weller e Ezra, 1997; Dematawewa e Berger, 1998).
Alm disso, a continuada fertilidade elevada em novilhas de leite sugere que qualquer componente gentico
relacionado fertilidade reduzida nas vacas lactantes teria interaes com lactao, manejo, ou idade. Diversos
estudos avaliaram possveis causas nutricionais da baixa fertilidade em gado leiteiro, incluindo: balano
energtico negativo evidenciado pela perda de escore de condio corporal (Nebel e McGilliard, 1993;
Ruegg e Milton, 1995; Domecq et al., 1997; Loeffler et al., 1999a,b; Moreira et al., 2000; Butler, 2001;
Lpez-Gatius et al., 2002), efeitos detrimentais de nveis elevados de energia na dieta (Dunne et al., 1999),
efeitos txicos da uria e nitrognio (Ferguson e Chalupa, 1989; Butler, 1998; Sinclair et al., 2000; Dawuda
et al., 2002), e deficincias de vitamina e/ou minerais (Ingraham et al., 1987; Arechiga et al., 1994; 1998).
Alguns peptdeos, tais como a leptina e fatores de crescimento (IGF-1 e IGF-2), cujas concentraes variam
na circulao em funo do estado metablico do animal, especialmente durante o perodo ps parto em
vacas leiteiras, aparentemente esto envolvidos na mediao dos efeitos da nutrio na funo reprodutiva
(OCallaghan e Boland, 1999; Boland et al., 2001; Lucy, 2001).
Vacas leiteiras em lactao tm capacidade reduzida de responder a aumentos de temperatura ambiente
ou outras formas de estresse (Lucy et al., 1986; Sartori et al., 2002b). Estresse trmico reduz a eficincia
reprodutiva, particularmente em vacas lactantes, atravs da reduo da expresso/deteco de estro e pela
diminuio nas taxas de concepo (Stevenson et al., 1984; Ryan et al., 1993). O efeito do estresse trmico
na fertilidade parece estar associado a quedas na taxas de fertilizao e elevao na perda embrionria (Al42

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Katanani et al., 1999, 2002; Hansen et al., 2001; Rivera e Hansen, 2001; Sartori et al., 2002b).
Muitos dos mecanismos envolvidos no transporte de gametas, fertilizao e desenvolvimento embrionrio
inicial sofrem influncia dos hormnios esterides ovarianos E2 e P4. Alteraes nas concentraes sricas
de esterides, que ocorrem em vacas de alta produo leiteira podem comprometer a eficincia reprodutiva.
Pesquisadores relataram que o crescimento prolongado do folculo ovariano em vacas com baixos nveis
circulantes de P4 resultou em fertilidade reduzida (Mihm et al., 1994; Ahmad et al., 1995). Por exemplo, em
um experimento (Ahmad et al., 1996), a produo de um folculo persistente dramaticamente reduziu a taxa
de concepo de 54% para 15% em vacas lactantes. Essa persistncia do folculo dominante (que talvez
ocorra naturalmente na vaca de alta produo leiteira) est associada exposio prolongada de elevadas
concentraes de E2 antes da ovulao (Ahmad et al., 1996; Bigelow e Fortune, 1998), porm, ainda est
por ser determinado se essa elevao prolongada de E2 circulante ou intra-folicular antes da ovulao
compromete a fertilidade. O estrgeno tambm est associado reteno do ovcito no oviduto, enquanto
que a P4 acelera o transporte (Bearden e Fuquay, 2000). Alterao nas concentraes sricas dos esterides
pode afetar fertilizao ou transporte do embrio/vulo. Alm disso, protenas secretrias dependentes de
E2 parecem ser parte essencial de um ambiente tubrico de suporte para capacitao espermtica, fertilizao
e desenvolvimento embrionrio inicial (King et al., 1994; DeSouza e Murray, 1995; Binelli et al., 1999).
Binelli et al. (1999) observaram um ambiente tubrico alterado em vacas com folculos dominantes persistentes.
Eles sugeriram que esse microambiente inapropriado contribui com a fertilidade reduzida em vacas com
folculos persistentes. esperado que vacas de alta produo leiteira tenham concentraes sricas de P4
mais baixas do que novilhas (Sartori et al., 2002a; 2004a). Reduzidas concentraes sricas de P4 no
perodo periovulatrio poderiam ser responsveis, pelo menos em parte, pela reduo na fertilidade de vacas
leiteiras. Vacas com concentraes mais baixas de P4 antes da IA tiveram fertilidade reduzida (Folman et al.,
1973; Fonseca et al., 1983) e suplementao de P4 antes da IA aumentou a taxa de concepo (Folman et
al., 1990; Wehrman et al., 1993; Xu et al., 1997). Baixas concentraes sricas de P4 permitem um aumento
na freqncia de pulsos de LH (Roberson et al., 1989; Bergfelt et al., 1991; Adams et al., 1992), causando
maturao prematura dos ovcitos (Revah e Butler, 1996), queda na qualidade ovocitria no momento da
ovulao e conseqente qualidade embrionria inferior aps a fertilizao (Ahmad et al., 1995). Concentraes
reduzidas de P4 aps a IA tambm esto associadas fertilidade reduzida (Lukaszewska e Hansen, 1980;
Mann et al., 1995; Ahmad et al., 1996; Larson et al., 1997). Essa reduo na fertilidade pode ser devido s
baixas concentraes sricas de P4 que talvez atrasem o desenvolvimento embrionrio (Mann et al., 1998;
Mann e Lamming, 2001), e/ou permitam uma induo precoce da lutelise (Mann e Lamming, 1995; Mann
et al., 1995).

6. CONSIDERAES FINAIS
A elevada morte embrionria durante os primeiros dias de gestao considerada a principal causa
responsvel pela baixa eficincia reprodutiva, especialmente em vacas de alta produo de leite. A utilizao
de biotecnologias reprodutivas tais como tratamentos hormonais e transferncia de embries provenientes de
animais com elevada fertilidade tem se mostrado alternativas viveis para o incremento da eficincia reprodutiva.
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Alm disso, o uso de tcnicas adequadas de IA e a reduo de problemas sanitrios, nutricionais e ambientais
so condies essenciais para a obteno de elevados ndices de fertilizao e manuteno da gestao,
culminando no sucesso dos programas reprodutivos em bovinos.
7. REFERNCIAS
Adams GP, Matteri RL, Kastelic JP, Ko JC, Ginther OJ. Association between surges of follicle-stimulating
hormone and the emergence of follicular waves in heifers. J Reprod Fertil 1992; 94: 177-188.
Ahmad N, Beam W, Butler WR, Deaver DR, Duby RT, Elder DR, Fortune JE, Griel LC, Jones LS, Milvae
RA, Pate JL, Revah I, Schreiber DT, Townson DH, Tsang PCW, Inskeep EK. Relationship of fertility to
patterns of ovarian follicular development and associated hormonal profiles in dairy cows and heifers.
Cooperative Regional Research Project. J Anim Sci 1996; 74: 1943-1952.
Ahmad N, Schrick FN, Butcher RL, Inskeep EK. Effect of persistent follicles on early embryonic losses in
beef cows. Biol Reprod 1995; 52: 1129-1135.
Al-Katanani YM, Paula-Lopes FF, Hansen PJ. Effect of season and exposure to heat stress on oocyte
competence in Holstein cows. J Dairy Sci 2002; 85: 390-396.
Al-Katanani YM, Webb DW, Hansen PJ. Factors affecting seasonal variation in 90-day nonreturn rate to
first service in lactating Holstein cows in a hot climate. J Dairy Sci 1999; 82: 2611-2616.
Almeida LAP. Early embryonic mortality in repeat-breeder cows. ARS Veterinaria 1995; 11: 18-34.
Arechiga CF, Ortiz O, Hansen PJ. Effect of prepartum injection of vitamin-E and selenium on postpartum
reproductive function of dairy-cattle. Theriogenology 1994; 41: 1251-1258.
Arechiga CF, Vazquez-Flores S, Ortiz O, Hernandez-Ceron J, Porras A, McDowell LR, Hansen PJ. Effect
of injection of beta-carotene or vitamin E and selenium on fertility of lactating dairy cows. Theriogenology
1998; 50: 65-76.
Ayalon N. Review of embryonic mortality in cattle. J Reprod Fertil 1978; 54: 483-493.
Beal WE, Perry RC, Corah LR. The use of ultrasound in monitoring reproductive physiology of beef-cattle.
J Anim Sci 1992; 70: 924-929.
Bearden HJ, Fuquay JW. Applied animal reproduction. Upper Saddle River, NJ: Prentice Hall; 2000.
Berger T. Fertilization in ungulates. Anim Reprod Sci 1996; 42: 351-360.
Bergfelt DR, Kastelic JP, Ginther OJ. Continued periodic emergence of follicular waves in non-bred
progesterone-treated heifers. Anim Reprod Sci 1991; 24: 193-204.
Bigelow KL, Fortune JE. Characteristics of prolonged dominant versus control follicles: follicle cell numbers,
steroidogenic capabilities, and messenger ribonucleic acid for steroidogenic enzymes. Biol Reprod 1998; 58:
1241-1249.
Binelli M, Hampton J, Buhi WC, Thatcher WW. Persistent dominant follicle alters pattern of oviductal secretory
proteins from cows at estrus. Biol Reprod 1999; 61: 127-134.
44

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

Boland MP, Lonergan P, OCallaghan D. Effect of nutrition on endocrine parameters, ovarian physiology, and
oocyte and embryo development. Theriogenology 2001; 55: 1323-1340.
Boyd H, Bacsich P, Young A, McCracken JA. Fertilization and embryonic survival in dairy cattle. Br Vet J
1969; 125: 87-97.
Breuel KF, Lewis PE, Schrick FN, Lishman AW, Inskeep EK, Butcher RL. Factors affecting fertility in the
postpartum cow - Role of the oocyte and follicle in conception rate. Biol Reprod 1993; 48: 655-661.
Butler WR. Nutritional effects on resumption of ovarian cyclicity and conception rate in postpartum dairy
cows. In: 26 Occ Publ Br Soc Anim Sci (ed.) Fertility in the high producing dairy cow. 2001: 133-145.
Butler WR. Review: Effect of protein nutrition on ovarian and uterine physiology in dairy cattle. J Dairy Sci
1998; 81: 2533-2539.
Cerri RLA, Bruno R, Chebel RC, Galvo KN, Rutgliano H, Thatcher WW, Luchini D, Santos JEP. Effect of
source of fatty acids on fertilization rate and embryo quality in early postpartum high producing dairy cows. J
Dairy Sci 2004; 87 (Suppl.) (Abstract in press).
Chebel RC, Santos JEP, Cerri RLA, Galvao KN, Juchem SO, Thatcher WW. Effect of resynchronization
with GnRH on day 21 after artificial insemination on pregnancy rate and pregnancy loss in lactating dairy
cows. Theriogenology 2003; 60: 1389-1399.
Christianson WT. Stillbirths, mummies, abortions, and early embryonic death. Vet Clin North Am 1992; 8:
623-639.
Dalton JC, Nadir S, Bame JH, Noftsinger M, Nebel RL, Saacke RG. Effect of time of insemination on
number of accessory sperm, fertilization rate, and embryo quality in nonlactating dairy cattle. J Dairy Sci
2001a; 84: 2413-2418.
Dalton JC, Nadir S, Bame JH, Noftsinger M, Saacke RG. The effect of time of artificial insemination on
fertilization status and embryo quality in superovulated cows. J Anim Sci 2000; 78: 2081-2085.
Dalton JC, Nadir S, Bame JH, Noftsinger M, Saacke RG. Towards the enhancement of pregnancy rate: The
effect of insemination time on sperm transport, fertilization rate and embryo quality in dairy cattle. In: Fertility
in the high producing dairy cow. 26 Occ Publ Br Soc Anim Sci; 2001b: 161-174.
Dawuda PM, Scaramuzzi RJ, Leese HJ, Hall CJ, Peters AR, Drew SB, Wathes DC. Effect of timing of urea
feeding on the yield and quality of embryos in lactating dairy cows. Theriogenology 2002; 58: 1443-1455.
Dematawewa CMB, Berger PJ. Genetic and phenotypic parameters for 305-day yield, fertility, and survival
in Holsteins. J Dairy Sci 1998; 81: 2700-2709.
DeSouza MM, Murray MK. An estrogen-dependent secretory protein, which shares identity with chitinases,
is expressed in a temporally and regionally specific manner in the sheep oviduct at the time of fertilization and
embryo development. Endocrinology 1995; 136: 2485-2496.
Diskin MG, Sreenan JM. Fertilization and embryonic mortality-rates in beef heifers after artificial-insemination.
J Reprod Fertil 1980; 59: 463-468.
Domecq JJ, Skidmore AL, Lloyd JW, Kaneene JB. Relationship between body condition scores and conception
at first artificial insemination in a large dairy herd of high yielding Holstein cows. J Dairy Sci 1997; 80: 11345

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

120.
Dunne LD, Diskin MG, Boland MP, OFarrell KJ, Sreenan JM. The effect of pre- and post-insemination
plane of nutrition on embryo survival in beef heifers. Anim Sci 1999; 69: 411-417.
Dunne LD, Diskin MG, Sreenan JM. Embryo and foetal loss in beef heifers between day 14 of gestation and
full term. Anim Reprod Sci 2000; 58: 39-44.
Eicker SW, Grohn YT, Hertl JA. The association between cumulative milk yield, days open, and days to first
breeding in New York Holstein cows. J Dairy Sci 1996; 79: 235-241.
Elsden RP, Hasler JF, Seidel GE, Jr. Non-surgical recovery of bovine eggs. Theriogenology 1976; 6: 523532.
Emanuelson U, Oltenacu PA. Incidences and effects of diseases on the performance of Swedish dairy herds
stratified by production. J Dairy Sci 1998; 81: 2376-2382.
Ferguson JD, Chalupa W. Impact of protein nutrition on reproduction in dairy-cows. J Dairy Sci 1989; 72:
746-766.
Folman Y, Kaim M, Herz Z, Rosenberg M. Comparison of methods for the synchronization of estrous cycles
in dairy cows. 2. Effects of progesterone and parity on conception. J Dairy Sci 1990; 73: 2817-2825.
Folman Y, Rosenberg M, Herz Z, Davidson M. The relationship between plasma progesterone concentration
and conception in post-partum dairy cows maintained on two levels of nutrition. J Reprod Fertil 1973; 34:
267-278.
Fonseca FA, Britt JH, McDaniel BT, Wilk JC, Rakes AH. Reproductive traits of Holsteins and Jerseys.
Effects of age, milk yield, and clinical abnormalities on involution of cervix and uterus, ovulation, estrous
cycles, detection of estrus, conception rate, and days open. J Dairy Sci 1983; 66: 1128-1147.
Fricke PM, Caraviello DZ, Weigel KA, Welle ML. Fertility of dairy cows after resynchronization of ovulation
at three intervals following first timed insemination. J Dairy Sci 2003; 86: 3941-3950.
Geisert RD, Short EC, Morgan GL. Establishment of pregnancy in domestic species. In: Geisert RD, Zavy
MT (eds.), Embryonic mortality in domestic species. Florida: CRC Press; 1994: 23-53.
Grealy M, Diskin MG, Sreenan JM. Protein content of cattle oocytes and embryos from the two-cell to the
elongated blastocyst stage at day 16. J Reprod Fertil 1996; 107: 229-233.
Grohn YT, Rajala-Schultz PJ. Epidemiology of reproductive performance in dairy cows. Anim Reprod Sci
2000; 60: 605-614.
Hansen PJ, Drost M, Rivera RM, Paula-Lopes FF, al-Katanani YM, Krininger CE, 3rd, Chase CC, Jr.
Adverse impact of heat stress on embryo production: causes and strategies for mitigation. Theriogenology
2001; 55: 91-103.
Harper MJK. Sperm and egg transport. In: Austin CR, Short RV (eds.), Reproduction in mammals: 1. Germ
Cells and Fertilization. Cambridge: Cambridge University Press; 1982: 102-127.
Hawk HW, Tanabe TY. Effect of unilateral cornual insemination upon fertilization rate in superovulating and
single-ovulating cattle. J Anim Sci 1986; 63: 551-560.
46

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

Hyttel P, Callesen H, Greve T, Schmidt M. Oocyte maturation and sperm transport in superovulated cattle.
Theriogenology 1991; 35: 91-108.
Ingraham RH, Kappel LC, Morgan EB, Srikandakumar A. Correction of subnormal fertility with copper and
magnesium supplementation. J Dairy Sci 1987; 70: 167-180.
Kafi M, McGowan MR. Factors associated with variation in the superovulatory response of cattle. Anim
Reprod Sci 1997; 48: 137-157.
Kelly P, Duffy P, Roche JF, Boland MP. Superovulation in cattle: Effect of FSH type and method of administration
on follicular growth, ovulatory response and endocrine patterns. Anim Reprod Sci 1997; 46: 1-14.
King RS, Anderson SH, Killian GJ. Effect of bovine oviductal estrus-associated protein on the ability of
sperm to capacitate and fertilize oocytes. J Androl 1994; 15: 468-478.
Labernia J, Lpez-Gatius F, Santolaria P, Lpez-Bejar M, Rutllant J. Influence of management factors on
pregnancy attrition in dairy cattle. Theriogenology 1996; 45: 1247-1253.
Lamb GC, Miller BL, Traffas V, Corah LR. Estrus detection, first service conception, and embryonic death in
beef heifers synchronized with MGA and prostaglandin. Kansas AES Report of progress. 1997; 783:97.
Larson SF, Butler WR, Currie WB. Reduced fertility associated with low progesterone postbreeding and
increased milk urea nitrogen in lactating cows. J Dairy Sci 1997; 80: 1288-1295.
Loeffler SH, de Vries MJ, Schukken YH, de Zeeuw AC, Dijkhuizen AA, de Graaf FM, Brand A. Use of AI
technician scores for body condition, uterine tone and uterine discharge in a model with disease and milk
production parameters to predict pregnancy risk at first AI in holstein dairy cows. Theriogenology 1999a; 51:
1267-1284.
Loeffler SH, de Vries MJ, Schukken YH. The effects of time of disease occurrence, milk yield, and body
condition on fertility of dairy cows. J Dairy Sci 1999b; 82: 2589-2604.
Lpez-Gatius F, Santolaria P, Yaniz J, Rutllant J, Lpez-Bejar M. Factors affecting pregnancy loss from
gestation Day 38 to 90 in lactating dairy cows from a single herd. Theriogenology 2002; 57: 1251-1261.
Lpez-Gatius F. Site of semen deposition in cattle: A review. Theriogenology 2000; 53: 1407-1414.
Lucy MC, Stevenson JS, Call EP. Controlling 1st service and calving interval by prostaglandin-f2-alpha,
gonadotropin-releasing-hormone, and timed insemination. J Dairy Sci 1986; 69: 2186-2194.
Lucy MC. Reproductive loss in high-producing dairy cattle: Where will it end? J Dairy Sci 2001; 84: 12771293.
Lukaszewska J, Hansel W. Corpus luteum maintenance during early pregnancy in the cow. J Reprod Fertil
1980; 59: 485-493.
Mann GE, Lamming GE, Robinson RS, Wathes DC. The regulation of interferon-t production and uterine
hormone receptors during early pregnancy. J. Reprod. Fertil. (Suppl.) 1998: 317-328.
Mann GE, Lamming GE, Fray MD. Plasma estradiol and progesterone during early-pregnancy in the cow
and the effects of treatment with buserelin. Anim Reprod Sci 1995; 37: 121-131.
Mann GE, Lamming GE, Robinson RS, Wathes DC. The regulation of interferon-tau production and uterine
47

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

hormone receptors during early pregnancy. J Reprod Fertil 1999: 317-328.


Mann GE, Lamming GE. Relationship between maternal endocrine environment, early embryo development
and inhibition of the luteolytic mechanism in cows. Reproduction 2001; 121: 175-180
Maurer RR, Chenault JR. Fertilization failure and embryonic mortality in parous and nonparous beef-cattle. J
Anim Sci 1983; 56: 1186-1189.
Mermillod P, Oussaid B, Cognie Y. Aspects of follicular and oocyte maturation that affect the developmental
potential of embryos. J Reprod Fertil 1999: 449-460.
Mihm M, Baguisi A, Boland MP, Roche JF. Association between the duration of dominance of the ovulatory
follicle and pregnancy rate in beef heifers. J Reprod Fertil 1994; 102:123-130.
Moore DA, Cullor JS, Bondurant RH, Sischo WM. Preliminary field evidence for the association of clinical
mastitis with altered interestrus intervals in dairy-cattle. Theriogenology 1991; 36: 257-265.
Moreira F, Risco C, Pires MFA, Ambrose JD, Drost M, DeLorenzo M, Thatcher WW. Effect of body
condition on reproductive efficiency of lactating dairy cows receiving a timed insemination. Theriogenology
2000; 53: 1305-1319.
Mullins KJ, Saacke RG. Study of the functional anatomy of bovine cervical mucosa with special reference to
mucus secretion and sperm transport. Anat Rec 1989; 225: 106-117.
Nakao T, Moriyoshi M, Kawata K. The effect of postpartum ovarian dysfunction and endometritis on
subsequent reproductive-performance in high and medium producing dairy-cows. Theriogenology 1992; 37:
341-349.
Nebel RL, Mcgilliard ML. Interactions of high milk-yield and reproductive-performance in dairy-cows. J
Dairy Sci 1993; 76: 3257-3268.
OCallaghan D, Boland MP. Nutritional effects on ovulation, embryo development and the establishment of
pregnancy in ruminants. Anim Sci 1999; 68: 299-314.
OFarrell KJ, Langley OH, Hartigan PJ, Sreenan JM. Fertilization and embryonic survival rates in dairycows culled as repeat breeders. Vet Rec 1983; 112: 95-97.
Okuda K, Miyamoto Y, Skarzynski DJ. Regulation of endometrial prostaglandin F(2alpha) synthesis during
luteolysis and early pregnancy in cattle. Domest Anim Endocrinol 2002; 23: 255-264.
Pursley JR, Mee MO, Wiltbank MC. Synchronization of ovulation in dairy cows using PGF and GnRH.
2
Theriogenology 1995; 44: 915-923.
Reis EL, Nasser LF, Nichi M, Baruselli PS. Embryonic mortality in recipients (Bos indicus x Bos taurus)
superovulated with eCG. Acta Scientiae Veterinariae 2004; 32 (Abstract in press).
Revah I, Butler WR. Prolonged dominance of follicles and reduced viability of bovine oocytes. J Reprod
Fertil 1996; 106: 39-47.
Rivera RM, Hansen PJ. Development of cultured bovine embryos after exposure to high temperatures in the
physiological range. Reproduction 2001; 121: 107-115.
Roberson MS, Wolfe MW, Stumpf TT, Kittok RJ, Kinder JE. Luteinizing hormone secretion and corpus
48

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

luteum function in cows receiving two levels of progesterone. Biol Reprod 1989; 41: 997-1003.
Roche JF, Bolandl MP, Mcgeady TA. Reproductive wastage following artificial-insemination of heifers. Vet
Rec 1981; 109: 401-404.
Rodrigues CFM. Ocorrncia de mortalidade embrionria em programa de transferncia de embries. ARS
Veterinaria 1995; 11: 76-78.
Ruegg PL, Milton RL. Body condition scores of Holstein cows on Prince-Edward-Island, Canada Relationships with yield, reproductive-performance, and disease. J Dairy Sci 1995; 78: 552-564.
Ryan DP, Prichard JF, Kopel E, Godke RA. Comparing early embryo mortality in dairy-cows during hot and
cool seasons of the year. Theriogenology 1993; 39: 719-737.
Saacke RG, DeJarnette JM, Bame JH, Karabinus DS, Whitman SS. Can spermatozoa with abnormal heads
gain access to the ovum in artificially inseminated super- and single-ovulating cattle? Theriogenology 1998;
50: 117-128.
Santos JEP, Cerri RLA, Ballou MA, Higginbotham GE, Kirk JH. Effect of timing of first clinical mastitis
occurrence on lactational and reproductive performance of Holstein dairy cows. Anim Reprod Sci 2004; 80:
31-45.
Sartori R, Gmen A, Guenther JN, Souza AH, Wiltbank MC. Comparison of artificial insemination (AI)
versus embryo transfer (ET) in lactating dairy cows. J Dairy Sci 2003a; 86: 238-239 (Abstract).
Sartori R, Haughian, J. M., Shaver, R. D., Rosa, G. J. M., Wiltbank M. C. Comparison of ovarian function
and circulating steroids in estrous cycles of Holstein heifers and lactating cows. J. Dairy Sci. 2004a; 87: 905920.
Sartori R, Rosa GJM, Wiltbank MC. Ovarian structures and circulating steroids in heifers and lactating cows
in summer and lactating and dry cows in winter. J Dairy Sci 2002a; 85: 2813-2822.
Sartori R, Sartor-Bergfelt R, Mertens SA, Guenther JN, Parrish JJ, Wiltbank MC. Fertilization and early
embryonic development in heifers and lactating cows in summer and lactating and dry cows in winter. J Dairy
Sci 2002b; 85: 2803-2812.
Sartori R, Souza AH, Guenther JN, Caraviello DZ, Geiger LN, Schenk JL, Wiltbank MC. Fertilization rate
and embryo quality in superovulated Holstein heifers artificially inseminated with X-sorted or unsorted sperm.
Braz J Anim Reprod 2004b (in press).
Sartori R, Surez-Fernndez CA, Monson RL, Guenther JN, Rosa GJM, Wiltbank MC. Improvement in
recovery of embryos/ova using a shallow uterine horn flushing technique in superovulated Holstein heifers.
Theriogenology 2003b; 60: 1319-1330.
Schrick FN, Hockett ME, Saxton AM, Lewis MJ, Dowlen HH, Oliver SP. Influence of subclinical mastitis
during early lactation on reproductive parameters. J Dairy Sci 2001; 84: 1407-1412.
Senger PL, Becker WC, Davidge ST, Hillers JK, Reeves JJ. Influence of cornual insemination on conception
in dairy-cattle. J Anim Sci 1988; 66: 3010-3016.
Silke V, Diskin MG, Kenny DA, Boland MP, Dillon P, Mee JF, Sreenan JM. Extent, pattern and factors
associated with late embryonic loss in dairy cows. Anim Reprod Sci 2002; 71:1-12.
49

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

Sinclair KD, Kuran M, Gebbie FE, Webb R, McEvoy TG. Nitrogen metabolism and fertility in cattle: II.
Development of oocytes recovered from heifers offered diets differing in their rate of nitrogen release in the
rumen. J Anim Sci 2000; 78: 2670-2680.
Sreenan JM, Diskin MG, Morris DG. Embryo survival rate in cattle: a major limitation to the achievement of
high fertility. In: Fertility in the high producing dairy cow. 26 Occ Publ Br Soc Anim Sci; 2001: 93-104.
Stevenson JS, Johnson SK, Medina-Britos MA, Richardson-Adams AM, Lamb GC. Resynchronization of
estrus in cattle of unknown pregnancy status using estrogen, progesterone, or both. J Anim Sci 2003; 81:
1681-1692.
Stevenson JS, Schmidt MK, Call EP. Stage of estrous cycle, time of insemination, and seasonal effects on
estrus and fertility of Holstein heifers after prostaglandin F2 alpha. J Dairy Sci 1984; 67: 1798-1805.
Tanabe TY, Deaver DR, Hawk HW. Effect of gonadotropin-releasing-hormone on estrus, ovulation, and
ovum cleavage rates of dairy-cows. J Anim Sci 1994; 72: 719-724.
Thatcher WW, Binelli M, Arnold D, Mattos R, Badinga L, Moreira F, Staples CR, Guzeloglu A. Endocrine
and physiological events from ovulation to establishment of pregnancy in cattle. In: Fertility in the high producing
dairy cow. 26 Occ Publ Br Soc Anim Sci; 2001: 81-91.
Thatcher WW, Staples CR, Danet-Desnoyers G, Oldick B, Schmitt E-P. Embryo health and mortality in
sheep and cattle. J Anim Sci 1994; 72 (Suppl. 3): 16-30.
Vanroose G, de Kruif A, Van Soom A. Embryonic mortality and embryo-pathogen interactions. Anim Reprod
Sci 2000; 60: 131-143.
Vasconcelos JLM, Silcox RW, Lacerda JA, Pursley JR, Wiltbank MC. Pregnancy rate, pregnancy loss, and
response to head stress after AI at 2 different times from ovulation in dairy cows. Biol Reprod 1997; 56: 140
(Abstract).
Wathes DC. Embryonic mortality and the uterine environment. J Endocrinol 1992; 134: 321-325.
Wehrman ME, Roberson MS, Cupp AS, Kojima FN, Stumpf TT, Werth LA, Wolfe MW, Kittok RJ, Kinder
JE. Increasing exogenous progesterone during synchronization of estrus decreases endogenous 17 betaestradiol and increases conception in cows. Biol Reprod 1993; 49: 214-220.
Weller JI, Ezra E. Genetic analysis of somatic cell score and female fertility of Israeli Holsteins with an individual
animal model. J Dairy Sci 1997; 80: 586-593.
Wiebold JL. Embryonic mortality and the uterine environment in 1st-service lactating dairy-cows. J Reprod
Fertil 1988; 84: 393-399.
Xu ZZ, Burton LJ, Macmillan KL. Reproductive performance of lactating dairy cows following estrus
synchronization regimens with PGF2 alpha and progesterone. Theriogenology 1997; 47: 687-701.
Zanenga CA, Pedroso MF. Early pregnancy check by ultrasound scanning in bovine embryo transfer. ARS
Veterinaria 1995; 11: 151 (Abstract).

50

Galuppo, A.G. 2004. Controle de qualidade de laboratrios de produo de embries. Acta Scientiae Veterinariae, 32 (Supl ):
Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004
51-54.

CONTROLE DE QUALIDADE DE LABORATRIOS DE PRODUO DE EMBRIES


Andrea Giannotti Galuppo
Laboratrio de Reproduo Humana-Fac. de Medicina do ABC

INTRODUO
Cada um dos procedimentos realizados em um laboratrio de fertilizao in vitro (FIV) deve ser
executado com extrema ateno e responsabilidade, desde a obteno dos ocitos, at a transferncia dos
embries, passando pela manipulao dos meios de cultura e do smen (Llerena, 2002). Descuidos ou falta
de ateno podem provocar danos ao desenvolvimento do embrio in vitro e conseqentemente prejudicar
a qualidade dos resultados obtidos pelo laboratrio.
Em geral um laboratrio de reproduo assistida avaliado apenas quanto as suas taxas de gestao.
Entretanto no se pode esquecer que para definir a qualidade do servio prestado por um laboratrio, devese inicialmente saber qual o objetivo final desse servio. Se este for apenas a obteno da gestao, ento
possuir altas taxas de gestao seria um excelente parmetro de qualidade (Alper et al., 2002). Porm, o
objetivo de um laboratrio de FIV deve ser, alm de se obter o maior nmero de gestaes possveis,
promover tambm melhora na qualidade gentica dos animais, evitar a transmisso de doenas infecciosas, e
fornecer um servio diferenciado que possibilite competio no mercado tanto nacional quanto internacional.
Para tanto necessrio o estabelecimento de um programa de controle de qualidade. O controle de
qualidade um conjunto de normas que devem ser seguidas em um estabelecimento, permitindo a padronizao
e a otimizao dos procedimentos realizados. O objetivo da implementao de um sistema de controle de
qualidade assegurar o melhor desenvolvimento e preciso dos procedimentos e tcnicas utilizadas, almejando
a otimizao dos resultados com maior segurana e fidelidade (WHO, 1999). Necessita-se de um controle
rigoroso da rotina, da aparelhagem e do desempenho da equipe de laboratrio, que deve estar apta a identificar
e corrigir eventuais problemas. Sendo assim sero aqui discutidos os pontos mais importantes para o
estabelecimento de um programa de controle de qualidade eficiente.
Instalaes do Laboratrio
Antes de estruturar um laboratrio de FIV, deve-se realizar um projeto cuidadoso e minucioso, no qual
o laboratrio apresente um espao fsico que comporte os equipamentos necessrios e permita uma circulao
adequada de pessoal durante a realizao dos procedimentos (Gianaroli et al., 2000; Gonalves et al.,
2002). O local aonde ir se instalar o laboratrio de FIV deve ser de uso exclusivo para esses procedimentos
e totalmente isolado do ambiente externo. Aconselha-se que no seja prximo a vias de grande movimento
e postos de gasolina, devido a grande quantidade de poluentes presente no ar nesses locais, o que pode
prejudicar seriamente a qualidade dos resultados (Cohen et al., 1997; Cohen et al., 1998).
As reas de trabalho devem ser devidamente delimitadas de forma a permitir o mximo de segurana
e eficincia. O laboratrio deve possuir um escritrio, vestirio, estoque, rea de lavagem e esterilizao de
51

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

materiais, laboratrios de preparo dos meios de cultura, coleta e processamento seminal, coleta e manipulao
dos ocitos, salas de transferncia de embries e criopreservao, alm de um nicho externo para o
armazenamento dos cilindros de CO2 (Gianarolli et al., 2000). Todo laboratrio de FIV deve possuir um
gerador de emergncia para o caso de falha de energia (Gianarolli et al., 2000).
Ambiente
O laboratrio deve fornecer um ambiente assptico para a manipulao dos gametas. A temperatura
deve ser devidamente controlada, em torno de 25C (Gonalves et al., 2002), pois este um dos fatores que
mais afetam a qualidade dos ocitos e embries (Almeida et al., 1995). A iluminao deve ser adequada
para a manipulao de gametas e embries (penumbra ou luz amarela no fluorescente) (Noda et al., 1994).
Para manter uma boa qualidade do ar deve-se possuir, de preferncia, um sistema de high efficiency
particulate air filtration (HEPA) a fim de eliminar partculas de poeira e microrganismos antes que o ar seja
injetado no laboratrio ou diretamente nas incubadoras (Cohen et al., 1998). A qualidade do ar dentro do
laboratrio depende tambm de fatores como o nmero de pessoas presentes, que deve ser restrito, uso de
cosmticos, e tipo de roupas utilizadas, devendo-se optar por tecidos que no liberem fibras. Preferencialmente
as roupas devem possuir mangas longas a fim de cobrir ao mximo a superfcie do corpo e, portanto, diminuir
o nmero de partculas liberadas no ambiente. O uso de touca, mscara, pro-ps e luvas sem talco (Reddy et
al., 1999) essencial. Sabe-se que sem a indumentria adequada uma pessoa pode gerar cerca de 2 milhes
de partculas menores que 5m/min (Llerena, 2002). Deve ser proibido o uso de qualquer material de limpeza
que possa ser txico ou embriotxico, como substncias adstringentes, ceras, aerossis, ou materiais de
construo como frmica, cola e tinta, durante a realizao de procedimentos.
Equipamentos
Os equipamentos devem ser adequados para o uso em reproduo assistida e de fcil limpeza (Gianarolli
et al., 2000). Uma fonte de gua ultrapura essencial para o bom funcionamento de um laboratrio de FIV.
Essa gua pode ser utilizada no preparo de meios de cultura, na limpeza de materiais e bancadas. Esse
equipamento necessita de manuteno constante, com a troca de filtros e desinfeco do sistema (Llerena,
2002). Para laboratrios que no possuem esse tipo de equipamento a compra de gua ultrapura pode ser
uma opo vivel (Gonalves et al, 2002).
O laboratrio deve conter um fluxo laminar, que funciona filtrando o ar que ir circular em seu interior,
excluindo partculas inclusive bactrias e fungos (Clitherow et al, 2001). Para a manipulao do smen devese utilizar de preferncia um fluxo vertical classe II de biossegurana, que oferece maior proteo ao operador,
por possuir uma tela de vidro, propiciando uma turbulncia mnima do ar interno. Para manipulao dos
ocitos e embries utiliza-se normalmente um fluxo horizontal devido necessidade do auxlio de uma lupa
para a visualizao desses. O fluxo deve ser limpo ao final de cada procedimento, com gua ultrapura ou
lcool 70%, e deve ter os filtros trocados de acordo com a recomendao do fabricante.
Recomenda-se ter pelo menos duas incubadoras, as quais devem ser periodicamente limpas, com uma
soluo desinfetante tipo Rocall, esterilizadas, e abertas o menor nmero de vezes possvel. Parmetros
como: presso de CO2, temperatura e umidade devem ser controlados com regularidade (Gianarolli et al.,
2000). A presso de CO2 pode ser controlada com o auxlio de um aparelho, o Fryrite (Bacharach Instruments,
52

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

Pittsburg, PA, USA), ou atravs da medida do pH do meio de cultura, pois a presso adequada (5% de
CO2) mantm o pH do meio entre 7,2 e 7,4 (Clitherow et al, 2001). A temperatura pode ser controlada com
o uso de um termmetro aferido, mantido dentro da incubadora para comparao com a medida apresentada
no visor. A umidade, em torno de 98%, mantida pela adio de gua deionizada ou ultrapura em uma
bandeja na base da incubadora, a qual deve ser trocada, pelo menos, a cada dez dias para evitar a proliferao
de microrganismos, principalmente fungos (Llerena, 2002; Clitherow et al., 2001).
Os microscpios e lupas devem passar por manuteno pelo menos uma vez ao ano. Devem possuir
placas aquecedoras em sua superfcie, a fim de minimizar a variao trmica sofrida pelos gametas durante a
manipulao. A temperatura das placas aquecedoras tambm deve ser monitorada atravs do uso de
termmetros aferidos mantidos em sua superfcie. As centrfugas devem ser reguladas para evitar oscilaes
na rotao. O banho-maria deve ser lavado periodicamente e ter sempre sua temperatura verificada antes do
uso. Se possvel deve-se optar pelo uso de uma geladeira especifica para laboratrio, pois esta possui um
sistema mais eficiente de controle de temperatura. No caso de uma geladeira residencial deve-se manter em
seu interior um termmetro aferido para checagem da variao da temperatura (Giannaroli et al., 2000).
Todos os aparelhos devem possuir certificao de manuteno peridica.
Materiais Descartveis e Meios de Cultura
Para manuteno da qualidade dos procedimentos deve-se utilizar sempre que possvel materiais
descartveis, estreis e devidamente testados para laboratrio de FIV. Os materiais no devem ser reutilizados
de um procedimento para outro, devendo ser descartados imediatamente aps o uso.
Os meios de cultura produzidos comercialmente devem ser monitorados quanto forma de transporte,
armazenamento e integridade dos frascos. Devem ser mantidos refrigerados e abrigados da ao da luz para
manuteno de suas caractersticas fsico-qumicas, como osmolaridade e pH. O registro do controle de
qualidade de cada produto deve ser fornecido pelo fabricante sempre que solicitado. sempre recomendvel
anotar o lote e data de validade dos meios e reagentes utilizados em cada procedimento (Giannaroli et al.,
2000). Os meios devem ser sempre manipulados sob condies asspticas.
Qualificao do Pessoal
Para garantir as condies seguras de cultura o pessoal do laboratrio deve estar bem capacitado
quanto as tcnicas de assepsia e antissepsia. A manipulao de material biolgico deve sempre ser realizada
com muito cuidado, devido a possibilidade de contaminao cruzada e transmisso de doenas infecciosas,
tanto para os animais quanto para o pessoal do laboratrio. muito importante a lavagem correta das mos,
antes de iniciar qualquer procedimento laboratorial, e o uso de todos os equipamentos de segurana biolgica,
como luvas e culos de proteo (Giannaroli et al., 2000). Toda a equipe deve passar constantemente por
cursos de reciclagem e educao continuada, para que novas tecnologias possam ser aplicadas no laboratrio,
a fim de melhorar sua eficincia e resultados.
Documentao
Todo material que chega ao laboratrio deve estar devidamente identificado. Todos os procedimentos
devem ser documentados, incluindo resultados e intercorrncias. Devem ser mantidos livros com as anotaes
referentes ao controle de qualidade do ambiente do laboratrio (ex: temperatura), manuteno dos
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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

equipamentos (ex: trocas de filtros e reviso), limpeza do laboratrio e etc. Os resultados devem ser avaliados
regularmente, principalmente quanto a taxas de fertilizao, gestao, implantao e qualidade dos embries
produzidos (Gianarolli et al., 2000).
Concluso
Para que um programa de controle de qualidade seja bem executado depende da participao e
cooperao de toda a equipe. A falta de comprometimento com as normas pr-estabelecidas pe em risco
a segurana no s do indivduo responsvel, mas tambm, de toda a equipe e dos animais, podendo resultar
em danos para os gametas e embries e at na transmisso de doenas. Sendo assim extremamente
importante que todas as normas sejam respeitadas, para que ao final o produto obtido seja o de melhor
qualidade possvel, e que esta qualidade possa ser certificada atravs de toda a documentao produzida
durante a execuo dos procedimentos.

Referncias
Almeida, P.A.& Bolton, V.N. The effect of temperature fluctuations in the cytoskeletal organization and
chromosome constitution of the human oocyte. Zygote, 3: 357-65, 1995.
Alper, M.M.; Brinsden, P.R.; Fisher, R. & Wikland, M. Is your IVF programme good? Hum. Reprod. 17(1):
8-10, 2002.
Clitherow, B.; Froud, S.J. & Luker, J. Good laboratory practice in the cell culture laboratory. In: Basic cell
culture. Ed Oxford press, EUA, cap10, p325, 2001.
Cohen, J.; Gilligan, A. & Willadsen, S. Culture and quality control of embryos. Hum.Reprod. 13(3): 137144, 1998.
Cohen, J.; Gilligan, A.; Esposito, W.; Schimel, T.; Dale, B. Ambient air and its potential effects on conception
in vitro. Hum.Reprod. 12(8): 1742-9, 1997.
Gianaroli, L.; Plachot, M.; Kooij, R.; Al-Hasani, S.; Dawson, K.; DeVos, A. et al. ESHRE guidelines for
good practice in IVF laboratories. Hum.Reprod. 15(10): 2241-2246, 2000.
Gonalves, P.B.D; Visintin, J.A.; Oliveira, M.A.L.; Montagner, M.M.; Costa, L.F.S. Produo in vitro de
embries. In: Biotcnicas aplicadas reproduo animal Ed Varela, So Paulo, cap10, p.195, 2002.
Llerena, P.V. Control de calidad en el laboratorio de reproduccin asistida. In: Reproduccin humana e
infertilidad. Ed. Imp. Boutique creativa, Quito, cap10, p.475, 2002.
Noda, Y.; Goto, Y.; Umaoka, Y.; Shiotani, M. Culture of human embryos in alpha modification of Eagle
medium under low oxygen tension and low illumination. Fertil Steril, 62: 1022-7, 1994.
Reddy, V.R.; Thomas, T.S.; Wright, H.R.; Fisher, M.D.; Edlich, R.F. The scientific basis of surgical glove
selection in an in vitro fertilization laboratory. J.Biomed.Mater.Res., 48(4): 569-71, 1999.
World Healthy Organization. Quality control in the andrology laboratory. In: WHO laboratory manual for the
examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction, 4th ed., Cambridge University Press,
UK, cap4, p.36, 1999.

54

Coutinho da Silva, M.A. 2004. Transferncia de ovcitos e injeo intracytoplasmatica de espermatozide em eqinos. Acta
Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004
Scientiae Veterinariae, 32 (Supl ) 55-64.

TRANSFERNCIA DE OVCITOS E INJEO INTRACYTOPLASMATICA DE


ESPERMATOZIDE EM EQINOS
Marco A. Coutinho da Silva
Animal Reproduction and Biotechnology Laboratory Colorado State University,
Fort Collins, CO 80523, USA

Introduo
Avanos nas tcnicas de reproduo assistida tem ajudado na obteno de gestaes de animais
subfrteis. Em humanos, e tambm em varias espcies de animais domsticos, a produo in vitro de embries
tem sido realizada com sucesso. Entretanto, em eqinos, a produo de embries in vitro ainda no bem
sucedida. Comparado com as outras espcies, as razes que podem ser atribudas ao progresso retardado
da tcnica de fertilizao in vitro em eqinos incluem: escassez de ovrios para obteno de ovcitos, e a falta
de um mtodo adequado para maturao dos ovcitos e para capacitao espermtica. Atualmente, somente
dois potros foram produzidos atravs de fertilizao in vitro de ovcitos maturados in vivo(3, 50). Embora a
fertilizao in vitro no tenha alcanado sucesso em eqinos, mtodos alternativos para a fertilizao in vitro
ou in vivo de ovcitos eqinos tem sido desenvolvidos, como a transferncia de ovcito (OT), transferncia
intrafallopiana de gametas (GIFT) e a injeo intracitoplasmtica de ovcitos (ICSI).
Transferncia de Ovcito
OT envolve a transferncia do ovcito da gua doadora para o oviduto da receptora, e inseminao
intra-uterina da receptora com smen do garanho desejado. OT geralmente realizada em guas valiosas,
as quais no produzem mais embries que possam ser coletados. Razes associadas com a falha na produo
de embries viveis incluem: falha na ovulao, falha na captao do ovcito, e patologias no oviduto, tero
e cervix[9]. Para OT, o ovcito coletado antes da ovulao e, portanto, a nica exigncia para a gua
doadora o desenvolvimento de folculos pr-ovulatrios.
A primeira OT realizada com sucesso em eqinos ocorreu em 1988[46]. Entretanto, altas taxas de
prenhez com OT s foram obtidas por Carnevale e Ginther em 1995, quando uma taxa de desenvolvimento
embrionrio de 92% foi obtida aps a transferncia de ovcitos de doadoras jovens para receptoras jovens.
O sucesso da OT depende da qualidade do ovcito, da receptora, e do smen utilizados.
Coleta, cultivo e transferncia de ovcito.
Ovcitos podem ser coletados em diferentes estgios de maturao. Ovcitos utilizados em experimentos
so geralmente coletados de ovrios obtidos em abatedouro ou de guas vivas. Entretanto, a qualidade dos
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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

ovcitos coletados de ovrios de abatedouro tem sido inconsistente[5, 6]. A coleta de ovcitos de guas vivas
permite um maior controle de fatores que afetam a qualidade do ovcito, como a idade da doadora, o estagio
do ciclo reprodutivo, prenhez, e condio corporal da doadora[1, 4, 25].
Vrios mtodos j foram utilizados para a coleta de ovcitos em eqinos, entre eles: laparotomia[60],
puno transcutanea pelo flanco[51] e aspirao transvaginal guiada por ultra-som (TVA;[22]). Atualmente, em
nosso laboratrio, o mtodo utilizado para a coleta de ovcitos e a TVA utilizando um transdutor linear de
ultra-som, como descrito por Carnevale e Ginther (1993). TVA tem a vantagem de ser um procedimento
no-cirrgico, permitindo coletas repetidas de ovcitos. Durante o procedimento, a probe do ultra-som,
colocada em um prolongador de plstico que contem o guia da agulha, e introduzida na poro cranial da
vagina. O ovrio colocado sobre o transdutor atravs de manipulao retal, e o folculo e visualizado. Uma
agulha introduzida no folculo e o contedo folicular removido utilizando-se aspirao a vcuo e lavagem
do folculo com meio.
As taxas de recuperao de ovcitos utilizando-se a TVA variam de acordo com o estgio de
desenvolvimento do folculo. Taxas de recuperao para ovcitos eqinos imaturos e baixa, variando de 12
a 47%[7, 33, 40, 48, 58]. Em comparao, as taxas de recuperao de ovcitos apos a induo da ovulao variam
entre 50 e 85%[4, 11, 12, 14, 22-24, 43]. O aumento da taxa de recuperao de ovcitos pre-ovulatorios em comparao
com ovcitos imaturos pode ser explicada por alteraes morfologias nas conexes entre o ovcito e a
parede do folculo que ocorrem durante a expanso das clulas do cumulus[35].
As taxas de maturao de ovcitos eqinos in vitro (IVM) so baixas quando comparadas com as de
outras espcies. Alem disto, o desenvolvimento embrionrio de ovcitos maturados in vitro tambm baixo,
variando entre 10 e 18%[52,58]. Em comparao, a transferncia de ovcitos coletados de folculos provulatorios resulta em melhores taxas de desenvolvimento embrionrio.
Geralmente, os ovcitos so coletados aproximadamente entre 24 e 36 h apos a administrao de
gonadotropina corionica humana (hCG). Ovcitos coletados as 24 h aps a administrao de hCG encontramse em metfase I e necessitam cultivo in vitro para completarem a maturao [13]. Esses ovcitos so cultivados
a 38,5 C em uma atmosfera de 5 to 6% CO2 em ar por aproximadamente 12 h. A maioria dos ovcitos
coletados a 36 h apos a administrao de hCG encontram-se em metfase II[4] e, portanto, podem ser
transferidos imediatamente para o oviduto da receptora. As taxas de recuperao de ovcitos e
desenvolvimento embrionrio para ovcitos coletados as 24 ou 36 h apos a administrao de hCG so
semelhantes[24, 38].
A transferncia de ovcitos para o oviduto da receptora realizada atravs de laparotomia pelo
flanco[10, 14]. Aps sedao e anestesia local, uma inciso e feita no flanco do animal e o ovrio e o oviduto
so exteriorizados. O ovcito e um pequeno volume de meio (< 150 l) so aspirados em uma pipeta de
vidro. A abertura do infundbulo localizada e a pipeta e introduzida de dois a trs cm no oviduto, onde o
ovcito e depositado. O ovrio reposicionado na cavidade abdominal e as camadas musculares e a pele
so suturadas. As receptoras recebem phenylbutazona (2 g por dia) durante a cirurgia e por mais dois dias.
O antibitico (Penicilina G Procana, 20,000 IU/kg, i.m., por dia) administrado durante a cirurgia e por mais
cinco dias aps a transferncia.
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guas receptoras
Durante OT, o transporte e a capacitatao espermtica, bem como a fertilizao e o desenvolvimento
embrionrio, ocorrem no trato reprodutivo da receptora. Portanto, a seleo de guas receptoras para
serem utilizadas em um programa de OT muito importante. guas jovens (3 a 10 anos) so selecionadas
aps um completo exame fsico e reprodutivo, e somente guas em perfeito estado so selecionadas. Alm
disto, durante o exame reprodutivo, o comprimento do ligamento largo avaliado para determinar se os
ovrios podem ser facilmente expostos durante a transferncia; guas com um comprimento pequeno do
ligamento largo no so utilizadas como receptoras de ovcitos.
As receptoras de ovcitos podem ser cclicas ou acclicas. O uso de guas cclicas como receptoras
envolve a sincronizao entre a doadora e a receptora, e tambm a remoo do ovcito pr-ovulatrio da
receptora[10]. Portanto, as receptoras recebem 2000 I.U. de hCG ao mesmo tempo em que as doadoras, e
o ovcito da receptora e coletado aproximadamente 24 h apos a administrao do hCG. Somente so
utilizadas as receptoras das quais o ovcito foi coletado. O uso de receptoras acclicas elimina a necessidade
de sincronizao entre doadora e receptora e da coleta do ovcito da receptora antes da transferncia[8].
Receptoras acclicas recebem 3 mg de estradiol diariamente, por aproximadamente 3 a 6 dias antes da
transferncia. Suplementao de progesterona ou progestagenos apos a transferncia e necessria, usando
receptoras cclicas ou acclicas. Embora haja a formao de um corpo lteo apos a aspirao do folculo
pr-ovulatorio[39], a secreo de progesterona pode ser mais lenta e reduzida[46]. Em guas acclicas, a
ausncia de corpo lteo exige a suplementao de progesterona. Portanto, Altrenogest (0.044 mg/kg) ou
progesterona em leo (200 mg/dia) administrado[8].
Smen e inseminaes
Para a fertilizao ocorrer com sucesso, alem do ovcito maduro, e necessrio que o espermatozide
esteja presente no oviduto. Para se obter uma alta taxa de fertilizao, so necessrios: numero suficiente de
spermatozoides na inseminao, com boa motilidade, morfologia normal, e habilidade de sofrer a capacitao
e a reao acrosomal. As receptoras de ovcitos devem ser inseminadas com um mnimo de 5 x 108
espermatozides moveis, com smen fresco ou refrigerado. O uso de smen congelado para inseminao de
receptoras de ovcitos no e aconselhvel, porque a fertilidade do smen congelado geralmente menor do
que o smen a fresco ou refrigerado[54, 55].
Quando smen fresco ou refrigerado de boa qualidade utilizado, as receptoras de ovcitos podem
ser inseminadas apenas uma vez, aproximadamente 12 h antes da transferncia. Em um estudo recente,
Carnevale et al. (2002) inseminou as receptoras de ovcitos 12 h antes e 2 h depois da transferncia com
smen resfriado de garanhes diferentes; os autores observaram que 94% dos embries produzidos foram
originados da primeira inseminao. Entretanto, quando a qualidade espermtica no e tima, uma segunda
inseminao 2 h aps a cirurgia pode aumentar as chances de fertilizao.
O tero das receptoras avaliado por ultra-sonografia por 2 a 3 dias aps a transferncia para a
deteco de fluido intra-uterino. As receptoras que acumulam fluido so tratadas com 20 a 30 IU de
ocitocina a cada 12 h, ate a completa eliminao do fluido intra-uterino.
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Aplicao clinica da transferncia de ovcito


OT vem sendo realizada comercialmente na Colorado State University desde 1998. As guas doadoras
do programa de OT possuem historias de falha reprodutiva em programas de inseminao e transferncia de
embrio. Os procedimentos realizados no programa comercial so similares aos descritos acima. Quando
se observa na doadora um folculo maior ou igual a 35 mm em dimetro, juntamente com edema uterino, e
relaxamento da cervix e tero, a doadora recebe uma combinao de GnRH e hCG. As doadoras recebem
deslorelin (Ovuplant, 2.2 mg; Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA, USA) e, apos 4 h, 2000 I.U. de
hCG. A coleta de ovcito e realizada aproximadamente 22 h apos a administrao do hCG.
As receptoras utilizadas no programa comercial so guas jovens, e podem ser cclicas ou acclicas.
Dados obtidos das estaes reprodutivas entre 1998 e 2002 demonstraram taxas de prenhez similares quando
os ovcitos foram transferidos em receptoras cclicas (27/79, 34%) ou acclicas (98/249, 39%). No dia da
transferncia, as receptoras comeam a receber suplementao de progesterona injetvel, em doses crescente
(50, 100, 150 and 200 mg), ate que 200 mg de progesterona sejam administrados diariamente. O diagnstico
de gestao e feito nos dias 12, 14 e 16 apos a transferncia e, quando prenha, as receptoras comeam a
receber Altrenogest (ReguMate, 0.044 mg/kg, daily; Intervet Inc., Millsboro, DE, USA) e a administrao
de progesterona injetvel e interrompida. A suplementao de progestgenos e interrompida por volta de
120 a 150 dias de gestao, desde que nveis elevados de progestgenos de origem placentria sejam
observados.
Em nosso programa comercial, a maioria das receptoras so inseminadas com smen refrigerado de
garanhes com fertilidade variada. Como j foi mencionado, o uso de smen de boa qualidade e necessrio
para o sucesso da OT. Os proprietrios so aconselhados a utilizar smen de garanhes frteis, e a enviar
mltiplas doses de smen por transferncia para assegurar que um nmero suficiente de espermatozides
estaro no oviduto no momento da fertilizao. As receptoras so inseminadas aproximadamente 12 h antes
da transferncia e, se houver smen suficiente, novamente 2 h apos a transferncia.
Durante a estao reprodutiva de 2003, nosso programa comercial realizou OT em 30 guas doadoras,
com idades entre 4 e 20 anos (media = 19.2 anos). No total, 148 folculos foram aspirados, em 122 ciclos,
e 110 ovcitos foram recuperados, resultando em uma taxa de recuperao de ovcito de 74% por folculo
aspirado, e 90% por ciclo. Um total de 102 transferncias foram realizadas e as taxas de prenhez obtidas
nos dias 16 e 50 apos a transferncia foram de 43% e 35% respectivamente. Uma ou mais gestaes foram
obtidas de 22/30 (73%) doadoras em nosso programa. Portanto, OT provou ser uma tcnica eficaz na
produo de gestaes de guas subfrteis.
Transferncia Intrafallopiana de Gametas
Embora as siglas OT e GIFT sejam utilizadas indistintivamente na literatura, algumas diferenas devem
ser mencionadas. Durante OT, o ovcito da doadora e transferido para o oviduto da receptora, e a receptora
e inseminada no tero. GIFT envolve a transferncia do ovcito e de um baixo nmero de espermatozides
(2 to 5 x 105 sperm) para o oviduto da receptora. Uma vez que a GIFT exige um baixo nmero de
espermatozides e os espermatozides so depositados prximo ao local de fertilizao, essa tcnica tem o
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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

potencial para ser utilizada nos casos em que o nmero de espermatozides disponveis para a inseminao
so baixos, i.e., garanhes subfrteis, smen congelado, e smen sexado.
Durante GIFT, os espermatozides so depositados na regio do infundbulo ou ampola do oviduto,
no passando pelo tero e a juno utero-tubarica. Portanto, os espermatozides devem ser separados do
plasma seminal, contaminao e debri. Alm disto, spermatozoides com morfologia normal e mveis devem
ser selecionados do ejaculado. O mtodo escolhido para separar espermatozides para serem usados em
GIFT foi o gradiente de Percoll[8, 9, 23, 24]. Nestes estudos, smen foi centrifugado atravs do gradiente de
Percoll (90/45%), e aproximadamente 2 a 5 x 105 espermatozides foram transferidos para o oviduto
juntamente com os ovcitos. A taxa de desenvolvimento embrionrio com GIFT utilizando-se smen a
fresco (no diludo) variou de 27 a 82%, demonstrando que GIFT pode ser uma tcnica alternativa a OT,
quando o numero de espermatozides disponvel baixo.
Entretanto, em programas comerciais, a maioria das inseminaes de rotina so feitas com smen
refrigerado e congelado. Portanto, em um estudo recente, o uso de smen refrigerado e congelado para
GIFT foi investigado[24]. Quando as receptoras foram inseminadas com smen resfriado no tero (OT) ou no
oviduto (GIFT), as taxas de desenvolvimento embrionrio foram 83% (19/23) e 25% (4/16) respectivamente.
O uso de smen congelado para GIFT resultou em uma taxa de desenvolvimento embrionrio de apenas 8%
(1/12). As baixas taxas de desenvolvimento embrionrio encontradas com o uso de smen resfriado ou
congelado podem ser causadas por fatores associados com os processos de refrigerao e congelamento
que prejudicam a fertilizao quando o smen e depositado no oviduto. Estudos so necessrios para
investigar os efeitos do meio diluente, refrigerao e congelaco dos espermatozides nas interaes entre
espermatozide, oviduto e ovcito, apos a inseminao no oviduto. Para a indstria do cavalo, a utilizao
bem sucedida de smen resfriado e congelado para GIFT resultaria em uma nova tcnica de reproduo
assistida para ser usada na produo de gestaes de guas e garanhes subfrteis.
Injeo Intracitoplasmtica de Espermatozide
A fertilizao in vitro (IVF) em eqinos tem produzido resultados insatisfatrios. As taxas de fertilizao
apos IFV descritas na literatura variam de 4 a 33%[19, 29, 61], mas somente um laboratrio, que obteve altas
taxas de fertilizao, publicou trabalhos subseqentes utilizando a mesma tcnica, e a taxas de fertilizao no
foram reproduzidas[27, 28]. Uma das razes para a falta de sucesso da IVF em eqinos a inabilidade do
espermatozide em penetrar a zona pelcida. Isto pode ser atribudo a mtodos ineficientes de capacitao
espermtica in vitro e/ou alteraes na zona pelcida que a fazem resistente penetrao. Os problemas
associados com a penetrao do espermatozide na zona pelcida podem ser superados pela injeo do
espermatozide atravs da zona pelcida, em um procedimento chamado injeo intracitoplasmtica de
espermatozide (ICSI). ICSI tem sido utilizada em eqinos porque ela faz com que no sejam necessrios
alguns dos eventos crticos para a fertilizao, como a capacitao espermtica, reao acrosomal, aderncia
e penetrao da zona pelcida, e fuso do espermatozide com o ovcito.
Os ovcitos usados para ICSI podem ser coletados e maturados in vivo ou in vitro. O desenvolvimento
embrionrio de ovcitos maturados in vitro (IVM) e geralmente menor do que o de ovcitos maturados in
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vivo, quando transferidos para o oviduto de receptoras[52, 58]. Entretanto, a maioria dos estudos realizados
com ICSI utilizaram ovcitos coletados de ovrios obtidos em abatedouros e maturados in vitro[2, 16-18, 20, 2628, 32, 36, 37, 43-45, 59]
. Aps a maturao, as clulas do cmulos so removidas e somente os ovcitos que
expeliram o primeiro corpsculo polar, e esto em metfase II, so injetados com o espermatozide.
Para se obter sucesso com a ICSI, algumas caractersticas devem ser observados com relao ao
espermatozide escolhido para a injeo. Na teoria, no ha necessidade de que o espermatozide a ser
utilizado para ICSI seja mvel, uma vez que o espermatozide e injetado dentro do ovcito. Entretanto,
Lazzari et al. (2002) observaram baixas taxas de fertilizao (9%) e ausncia de desenvolvimento embrionrio quando espermatozides sem motilidade foram utilizados para a ICSI. No mesmo estudo, quando
espermatozides de garanhes subfrteis com motilidade entre 10 e 30% foram utilizados, taxas de fertilizao e morula/blastocisto de 79 e 36% foram observadas, respectivamente. Portanto, a utilizao de
espermatozides mveis para ICSI resultou em maiores taxas de fertilizao e desenvolvimento embrionrio.
Durante a preparao do espermatozide para ICSI, o flagelo do espermatozide danificado para
imobilizar o espermatozide e tambm para lesar a membrana plasmtica. Acredita-se que a ruptura da
membrana plasmtica facilite a liberao de fatores espermticos para ativao do ovcito[30]. A ativao do
ovcito durante a fertilizao induz oscilaes dos nveis de clcio intracelular, importantes para o reinicio da
meiose, formao dos proncleos, sntese de DNA, e inicio das divises celulares[15, 31, 42, 49]. Em eqinos,
existe controvrsia com relao a necessidade de se ativar o ovcito aps ICSI. A ativao qumica dos
ovcitos aps ICSI foi benfica quando smen a fresco foi utilizado[37, 41, 56, 57]. Entretanto, quando se utilizou
smen congelado, taxas satisfatrias de formao de proncleo (50%) foram observadas sem a necessidade
de ativao do ovcito[27, 28, 36, 47]. Alm disto, Choi et al. (2002) obteve taxas de formao de proncleo
similares utilizando smen a fresco ou congelado, sem a ativao dos ovcitos. Portanto, a necessidade de
ativao dos ovcitos eqinos apos ICSI permanece obscura; resultados similares podem ser obtidos com a
ICSI utilizando-se smen a fresco ou congelado.
Aps a ICSI, os zigotos podem ser cultivados in vitro ou transferidos imediatamente para o oviduto da
receptora. Poucos estudos foram realizados na rea de cultivo de embries eqinos e, ate o momento, no
existe um sistema adequado. O maior problema associado com a falta de pesquisa na rea de cultivo de
embries eqinos e o numero escasso de embries disponveis para pesquisa, uma vez que a produo de
embries in vitro no e bem sucedida. Alternativamente, os zigotos podem ser transferidos para o oviduto da
receptora aps a ICSI. Em alguns estudos, os zigotos foram transferidos com sucesso para o oviduto de
ovelhas[34, 43], camundongo[36] e guas[20, 47]. A transferncia de zigotos para o oviduto de receptoras resultou
em taxas de morula/blastocisto entre 19 e 50%. Hinrichs et al. (2004) obteve maiores taxas de blastocisto
quando os zigotos foram transferidos para o oviduto de guas (36%) comparado com vrios mtodos de
cultivo in vitro (0-20%). Alm disto, McKinnon et al. (2000) observou uma reduo significativa nas taxas
de prenhez aps a transferncia de embries cultivados por 24 (17%) ou 48 h (0%) apos a ICSI, comparado
com um cultivo de 4-6 h (38%). A transferncia de zigotos apos a ICSI para o oviduto de receptoras
proporcionou melhores condies para o desenvolvimento embrionrio do que os mtodos de cultivo in
vitro. Entretanto, somente 52 a 67% dos embries transferidos foram recuperados do oviduto apos a
transferncia[16, 20].
Apesar das baixas taxas de desenvolvimento embrionrio obtidas com a ICSI, alguns potros j foram
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produzidos com essa tcnica[21, 45, 47, 59]. Alm disto, durante a estao reprodutiva de 2003, nosso laboratrio produziu 4 potros utilizando smen de um garanho subfrtil. Entretanto, ICSI exige um equipamento
caro e treinamento extensivo e, portanto, a utilizao clinica desta tcnica ainda e limitada. Em um futuro
prximo, com a melhora nas taxas de desenvolvimento embrionrio da ICSI devido aos avanos obtidos
com pesquisas nas reas de maturao e ativao de ovcitos e cultivo de embries, ICSI poder ser
utilizada para a produo de gestaes a partir de animais subfrteis.

Referncias
1.

2.

3.
4.
5.

6.
7.

8.
9.

10.
11.
12.
13.
14.

Ball B.A., Miller P.G. 1992. Survival of equine embryos co-cultured with equine oviductal epithelium
from the four- to eight-cell to the blastocyst stage after transfer to synchronous recipient mares.
Theriogenology.37:979-991.
Bedford S.J., Kurokawa M., Hinrichs K., Fissore R.A. 2004. Patterns of intracellular calcium oscillations
in horse oocytes fertilized by intracytoplasmic sperm injection: possible explanations for the low success
of this assisted reproduction technique in the horse. Biol Reprod.70:936-44.
Bezard J. 1992. In vitro fertilization in the mare. Proc Int Sci Conf Biotech Horse Reprod.12.
Bezard J., Goudet G., Duchamp G., Palmer E. 1995. Preovulatory maturation of ovarian follicles and
oocytes in unstimulated and superovulated mares. Biol Reprod Monographs.1:261-271.
Bezard J., Mekarska A., Goudet G., Duchamp G., Palmer E. 1997. Timing of in vivo maturation of
maturation of immature oocytes collected simultaneously. Equine Vet J Suppl.33-equine preovulatory
oocytes and competence for in vitro 7.
Blue B.J., McKinnon A.O., Squires E.L., Seidel G.E., Jr. 1989. Capacitation of stallion spermatozoa
and fertilization of equine oocytes in vitro. Equine Vet J (suppl).8:111-116.
Bracher V., Parlevliet J., Fazeli A.R., Pieterse M.C., Vos P.L.A.M., Dieleman S.J., Taverne M.A.M.,
Colenbrander B. 1993. Repeated transvaginal ultrasound-guided follicle aspiration in the mare. Equine
Vet J.15:75-78.
Carnevale E.M. 2000. Applications of intraoviductal transfer of gametes in the equine. Arq Fac Vet
UFRGS.28:89-97.
Carnevale E.M., Alvarenga M.A., Squires E.L. 1999a. Use of oocyte transfer in a commercial breeding
program to obtain pregnancies from mares with reproductive pathologies. Proc 45th Ann Conv Amer
Assoc Equine Pract.200.
Carnevale E.M., Alvarenga M.A., Squires E.L., Choi Y.H. 1999b. Use of noncycling mares as recipients
for oocyte transfer and GIFT. Proc Ann Conf Soc for Theriogenology.44.
Carnevale E.M., Coutinho da Silva M.A., Maclellan L.J., Neves Neto J.R., Squires E.L. 2002. Effects
of culture media and time of insemination on oocyte transfer. Theriogenology.58:759-762.
Carnevale E.M., Ginther O.J. 1993. Use of a linear ultrasonic transducer for the transvaginal aspiration
and transfer of oocytes in the mare. J Equine Vet Sci.13:331-333.
Carnevale E.M., Ginther O.J. 1995. Defective oocytes as a cause of subfertility in old mares. Biol
Reprod Monographs.1:209-214.
Carnevale E.M., Maclellan L.J., Coutinho da Silva M.A., Scott T.J., Squires E.L. 2000. Comparison of
culture and insemination techniques for equine oocyte transfer. Theriogenology.54:981-7.
61

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

15. Carroll J. 2001. The initiation and regulation of Ca2+ signalling at fertilization in mammals. Semin Cell
Dev Biol.12:37-43.
16. Choi Y.H., Love C.C., Love L.B., Varner D.D., Brinsko S., Hinrichs K. 2002. Developmental competence
in vivo and in vitro of in vitro-matured equine oocytes fertilized by intracytoplasmic sperm injection with
fresh or frozen-thawed spermatozoa. Reproduction.123:455-65.
17. Choi Y.H., Love C.C., Varner D.D., Love L.B., Hinrichs K. 2003. Effects of gas conditions, time of
medium change, and ratio of medium to embryo on in vitro development of horse oocytes fertilized by
intracytoplasmic sperm injection. Theriogenology.59:1219-29.
18. Choi Y.H., Love L.B., Varner D.D., Hinrichs K. 2004. Factors affecting developmental competence of
equine oocytes after intracytoplasmic sperm injection. Reproduction.127:187-94.
19. Choi Y.H., Okada Y., Hochi S., Braun J., Sato K., Oguri N. 1994. In vitro fertilization rates of horse
oocytes with partially removed zonae. Theriogenology.42:795-802.
20. Choi Y.H., Roasa L.M., Love C.C., Varner D.D., Brinsko S.P., Hinrichs K. 2004. Blastocyst formation
rates in vivo and in vitro of in vitro-matured equine oocytes fertilized by intracytoplasmic sperm injection.
Biol Reprod.70:1231-8.
21. Cochran R., Meintjes M., Reggio B., Hylan D., Carter J., Pinto C., Paccamonti D., Graff K.J., Godke
R.A. 2000. Production of live foals from sperm-injected oocytes harvested from pregnant mares. J
Reprod Fertil Suppl.56:503-512.
22. Cook N.L., Squires E.L., Ray B.S., Cook V.M., Jasko D.J. 1993. Transvaginal ultrasound-guided
follicular aspiration of equine oocytes. J Equine Vet Sci.15:71-74.
23. Coutinho da Silva M.A., Carnevale E.M., Maclellan L.J., Preis K.A., Seidel G.E., Jr., Squires E.L.
2004. Oocyte transfer in mares with intrauterine or intraoviductal insemination using fresh, cooled, and
frozen stallion semen. Theriogenology.61:705-13.
24. Coutinho da Silva M.A., Carnevale E.M., Maclellan L.J., Seidel G.E., Jr., Squires E.L. 2002. Effect of
time of oocyte collection and site of insemination on oocyte transfer in mares. J Anim Sci.80:1275-9.
25. Del Campo M.R., Donoso M.X., Parrish J.J. 1992. In vitro maturation of equine oocytes.
Theriogenology.37:200.
26. DellAquila M.E., Albrizio M., Maritato F., Minoia P., Hinrichs K. 2003. Meiotic competence of equine
oocytes and pronucleus formation after intracytoplasmic sperm injection (ICSI) as related to granulosa
cell apoptosis. Biol Reprod.68:2065-72.
27. DellAquila M.E., Cho Y.S., Minoia P., Traina V., Lacalandra G.M., Maritato F. 1997. Effects of follicular
fluid supplementation of in-vitro maturation medium on the fertilization and development of equine oocytes
after in-vitro fertilization or intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod.12:2766-72.
28. DellAquila M.E., Cho Y.S., Minoia P., Traina V., Lacalandra G.M., Maritato F. 1997. Intracytoplasmic
sperm injection (ICSI) versus conventional IVF on abattoir-derived and in-vitro matured equine oocytes.
Theriogenology.47:1139-1156.
29. DellAquila M.E., Fusco S., Lacalandra G.M., Maritato F. 1996. In vitro maturation and fertilization of
equine oocytes recovered during the breeding season. Theriogenology.45:547-560.
30. Dozortsev D., Rybouchkin A., De Sutter P., Dhont M. 1995. Sperm plasma membrane damage prior to
intracytoplasmic sperm injection: a necessary condition for sperm nucleus decondensation. Hum
Reprod.10:2960-4.
31. Fissore R.A., Dobrinsky J.R., Balise J.J., Duby R.T., Robl J.M. 1992. Patterns of intracellular Ca2+
62

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

32.

33.
34.

35.

36.
37.
38.
39.

40.

41.
42.
43.

44.
45.

46.
47.

concentrations in fertilized bovine eggs. Biol Reprod.47:960-9.


Franz L.C., Choi Y.H., Squires E.L., Seidel G.E., Jr., Hinrichs K. 2003. Effects of roscovitine on
maintenance of the germinal vesicle in horse oocytes, subsequent nuclear maturation, and cleavage rates
after intracytoplasmic sperm injection. Reproduction.125:693-700.
Franz L.C., Squires E.L., ODonovan M.K., Scott T.J., Carnevale E.M. 2001. Collection and in vitro
maturation of equine oocytes from estrus, diestrus and pregnant mares. J Equine Vet Sci.21:26-32.
Galli C., Crotti G., Turini P., Duchi R., Mari G., Zavaglia G., Duchamp G., Daels P., Lazzari G. 2002.
Frozem-thawed embryos embryos produced by ovum-pick up of immature oocytes and ICSI are capable
of establish pregnancies in the horse. Theriogenology.58:705-708.
Goudet G., Bezard J., Duchamp G., Gerard N., Palmer E. 1997. Equine oocyte competence for nuclear
and cytoplasmic in vitro maturation: effect of follicle size and hormonal environment. Biol Reprod.57:23245.
Grondahl C., Hansen T.H., Hossaini A., Heinze I., Greve T., Hyttel P. 1997. Intracytoplasmic sperm
injection of in vitro-matured equine oocytes. Biol Reprod.57:1495-501.
Guignot F., Ottogalli M., Yvon J.M., Magistrini M. 1998. Preliminary observations in in vitro development
of equine embryo after ICSI. Reprod Nutr Dev.38:653-63.
Hinrichs K., Betschart R.W., McCue P.M., Squires E.L. 2000. Effect of timing of follicle aspiration on
pregnancy rates after oocyte transfer in mares. J Reprod Fertil Suppl.56:493-498.
Hinrichs K., Rand W.M., Palmer E. 1991. Effect of aspiration of the preovulatory follicle on luteinization,
corpus luteum function, and peripheral plasma gonadotropin concentrations in the mare. Biol
Reprod.44:292-8.
Kanitz W., Becker F., Alm H., Torner H. Ultrasound-guided follicular aspiration in mares. In: Sharp DC,
Bazer FW, eds. Equine Reproduction. VI vol. Madison, WI: Society for the Study of Reproduction;
1995:225-231.
Kato H., Seidel G.E., Squires E.L., Wilson J.M. 1997. Treatment of equine oocytes with A23187 after
intracytoplasmic sperm injection. Equine Vet J Suppl.51-3.
Kline D., Kline J.T. 1992. Repetitive calcium transients and the role of calcium in exocytosis and cell
cycle activation in the mouse egg. Dev Biol.149:80-9.
Lazzari G., Crotti G., Turini P., Duchi R., Mari G., Zavaglia G., Barbacini S., Galli C. 2002. Equine
embryos at the compacted morula and blastocyst stage can be obtained by intracytoplasmic sperm
injection (ICSI) of in vitro matured oocytes with frozen-thawed sperm from semem of different fertilities.
Theriogenology.58:709-712.
Li X., Morris L.H., Allen W.R. 2000. Effects of different activation treatments on fertilization of horse
oocytes by intracytoplasmic sperm injection. J Reprod Fertil.119:253-60.
Li X., Morris L.H., Allen W.R. 2001. Influence of co-culture during maturation on the developmental
potential of equine oocytes fertilized by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Reproduction.121:92532.
McKinnon A.O., Carnevale E.M., Squires E.L., Voss J.L., Seidel G.E., Jr. 1988. Heterogenous and
xenogenous fertilization of in vivo matured equine oocytes. J Equine Vet Sci.8:143-147.
McKinnon A.O., Lacham-Kaplan O., Trounson O. 2000. Pregnancies produced from fertile and infertile
stallions by intracytoplasmic sperm injection (ICSI) of single frozen-thawed spermatozoa into in vivo
matured mare oocytes. J Reprod Fertil Suppl.56:513-517.
63

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

48. Meintjes M., Bellow M.S., Paul J.B., Broussard J.R., Li L.Y., Paccamonti D., Eilts B.E., Godke R.A.
1995. Transvaginal ultrasound-guided oocyte retrieval from cyclic and pregnant horse and pony mares
for in vitro fertilization. Biol Reprod Monographs.1:281-292.
49. Nakada K., Mizuno J., Shiraishi K., Endo K., Miyazaki S. 1995. Initiation, persistence, and cessation of
the series of intracellular Ca2+ responses during fertilization of bovine oocytes. J Reprod Dev.41:77-84.
50. Palmer E., Bezard J., Magistrini M., Duchamp G. 1991. In vitro fertilization in the horse. A retrospective
study. J Reprod Fertil Suppl.44:375-84.
51. Palmer E., Duchamp G., Bezard J., Magistrini M., King A., Bousquet D., Betteridge K.J. 1986. Recovery
of follicular fluid and oocytes of mares by non-surgical puncture of the preovulatory follicle.
Theriogenology.25:178.
52. Preis K.A., Carnevale E.M., Coutinho da Silva M.A., Caracciolo di Brienza V., Gomes G.M., Maclellan
L.J., Squires E.L. 2004. In vitro maturation and transfer of equine oocytes after transport of ovaries at
12 or 22 degrees C. Theriogenology.61:1215-23.
53. Ray B.S., Squires E.L., Cook N.L., Tarr S.F., Jasko D.J., Hossner K.L. 1994. Collection and in vitro
maturation of equine oocytes from estrus, diestrus and pregnant mares. J Equine Vet Sci.14:27-30.
54. Samper J.C. 2001. Management and fertility of mares bred with frozen semen. Anim Reprod Sci.68:21928.
55. Samper J.C., Hellander J.C., Crabo B.G. 1991. Relationship between the fertility of fresh and frozen
stallion semen and semen quality. J Reprod Fertil Suppl.44:107-14.
56. Schimid R.L., Kato H., Herickhoff L.A., Shenk J.L., McCue P.M., Chung Y.G., Squires E.L. 2000.
Effects of follicular fluid or progesterone on in vitro maturation of equine oocytes before intracytoplasmic
sperm injection with non-sorted or sex-sorted spermatozoa. J Reprod Fertil Suppl.56:519-525.
57. Schmid R.L., Kato H., Herickhoff L.A., Shenk J.L., McCue P.M., Chung Y.G., Squires E.L. 2000.
Effects of follicular fluid or progesterone on in vitro maturation of equine oocytes before intracytoplasmic
sperm injection with non-sorted or sex-sorted spermatozoa. J Reprod Fertil Suppl.56:519-525.
58. Scott T.J., Carnevale E.M., Maclellan L.J., Scoggin C.F., Squires E.L. 2001. Embryo development
rates after transfer of oocytes matured in vivo, in vitro, or within oviducts of mares. Theriogenology.55:70515.
59. Squires E.L., Wilson J.M., Kato H., Blaszczyk A. 1996. A pregnancy after intracytoplasmic sperm
injection into equine oocytes matured in vitro. Theriogenology.45:306.
60. Vogelsang M.M., Kraemer D.C., Bowen M.J., Potter G.D. 1986. Recovery of equine follicular oocytes
by surgical and non-surgical techniques. Theriogenology.25:208.
61. Zhang J.J., Muzs L.Z., Boyle M.S. 1990. In vitro fertilization of horse follicular oocytes matured in vitro.
Mol Reprod Dev.26:361-5.

64

Acta Scientiae
Veterinariae
2004 Veterinariae, 32 (Supl ): 65-74.
Medina, M. 2004. Aplicao de smen
sexado em
animais de 32(Suplemento),
produo. Acta Scientiae

APLICAO DE SMEN SEXADO EM ANIMAIS DE PRODUO


Mariano Medina
Centro de Reproduo Goyaike SAACIYF Argentina:
Na atualidade Argentina dispe comercialmemte da tecnologia de sexagem de smen atravs da empresa
Goyake SA, utilizando de forma exclusiva em bovinos, eqinos e ovinos e semi exclusiva para o Brasil, que
tem a possibilidade de pr-selecionar o sexo das crias nas exploraes pecurias.
Esta tecnologia utiliza a citometria de fluxo para separar as clulas do espermatozides de mamferos
com uma exatido de quase de 90% para o sexo que se quer, e alcanando porcentagens similares de
fecundao como smen no sexado. A quantidade de DNA, at o momento constitui a nica diferena entre
os espermatozides com cromossomo sexual X e Y que permite a aplicao de uma tcnica que se pode
repetir para a separao. A diferena de contedo de DNA entre ambas sub-populaes de 3,8% em
bovinos, 3,6% em eqinos e de 4.2% em ovinos.
Na dcada 80, L. Johnson desenvolveu um procedimento de separao de espermatozides utilizando
a citometria de fluxo, baseado nas distintas intesidades de luz que emite o DNA dois espermatozides com
cromossomo X ou Y adulterados com uma cor de DNA florescente ao serem excitados com uma luz
ultravioleta. Uma vez detectada esta diferena, os espermatozides podem ser separados eletricamente.
Numerosas metodologias foram propostas para conseguir esta separao: centrifugao e separao
por gradientes, migrao por diferentes cargas eltricas, complexos antgeno-anticorpo. Mas no permitiram
uma aplicao em forma efetiva e repetitiva.
Entre as vantagens que oferece a tcnica que se destaca a possibilidade de intesificar a seleo
gentica sobre as amostras segumdo as caractersticas produtivas a um tempo e custo muito menores.
A possibilidade de utilizar a tcnica associada a outras como a transferncia embrionria, vertilizao
in vitro e ICSI sobre animais de alto mrito gentico, permite acelerar ainda mais o progresso gentico dos
sistemas produtivos.

TCNICA DE SEXAGEM DE ESPERMATIZOIDES POR CITOMETRIA DE FLUXO


Esta tcnica brinda a vantagem de poder selecionar o sexo do produto no momento da concepo,
com um acerto maior a 90 % e resultados que se podem repetir, sem impactos importantes de diminuio das
porcentagens de fecundao.
Se basea na diferena de contedo de DNA entre o espermatozide que contm cromossoma sexual
X do que tem cromosoma sexual Y. O primeiro tem por volta de 4% mais de DNA. A citometria de fluxo e
a separao de clulas uma excelente ferramenta para a medio do contedo de DNA e separao de
clulas a velocidades altas. Este o nico mtodo com validade cientfica para a separao de espermatozides
nas sub-populaes X e Y.
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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

Para a medio do contedo de DNA na clula do espermatozide ao passar pelo citmetro de fluxo
necessrio colorir o DNA com uma cor fluorescente que colore de maneira uniforme o DNA da clula e
que no produza danos celulares nem comprometa a fertilizao ou o desenvolvimento do embrio e a
normalidade do animal. Para isso se utiliza Hoechst 33342 e excitado pela luz ultravioleta de um laser que
faz parte do citmetro. A imagem est represemtada por uma populao com maior contedo de DNA e por
tanto com maior fluorescncia que a outra, ao situar-se em distintas posies nas coordenadas X e Y. Uma
vez definida a quantidade de DNA que contem a clula, se seleciona a sub-populao que queremos e se
separa carregando-a eletricamente em uma micro gota, cada uma destas clulas sero atradas pelo campo
oposto. Para isso necessrio que os espermatozides recorram os sistemas envolvidos em um fluido especfico
para cada espcie animal que se est processando.

Assim, atravs desta sada, os espermatozides so carregados eletricamente pela pea de cristal
eltrica; orientados, enfrentando a luz ultravioleta e os detectores pticos a sada imediata da pipeta. Os
espermatozides devem ser alienados corretamente e calculados de forma correta no tempo necessrio para
que o espermatozide iluminado e identificado como X ou Y possa ser carregado e separado eletricamente
do resto, do micro gotas no final do fluxo.
Todos estes eventos necessitam uma coordenao que permita uma certeza superior a 90% de que o
espermatozide selecionado e separado seja do sexo escolhido. A velocidade de separao alta, alcanando
at 4500 espermatozides separados por segundo.
Para realizar a anlise de pureza da produo de espermatozides sexados em certo perodo de
produo, se separa uma amostra qualquer da produo e se realiza a leitura atravs do citmetro e se mede
a porcentagem que representa a populao do sexo escolhido. Se descarta toda a produo que no alcana
um mnimo de 85 % de espermatozides do sexo escolhido.
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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

SEXAGEM DE SMEN EM BOVINOS E SUA APLICAO COMERCIAL


O uso de smen sexado pode aumentar a rentabilidade da produo atravs da planificao dos
servios e maior progresso gentico em prazos mais curtos, e criar diferentes linhas de animais segundo cada
propsito.
O procedimento para a obteno do sexo sexado considera:

Coleta do smen: a coleta do smen pode realizar-se por meio da vagina artificial, em casos especficos,
com um eletro-ejacuador. Se registram as caractersticas do ejaculado: volume, aspeto e momento da
coleta. O ejaculado tem de ter de 60% de movilidade progressiva e mais de 75% dos espermatozides
normais.(1) Se recomenda o uso de ejaculados com uma concentrao de espermatozides por milmetro
igual ou maior a 1,000.(2) Os antibiticos devem se agregar dentro dos 15 minutos da coleta do ejaculado.(1)

Preparao da amostra para sexagem: a amostra do smen diluda em XE TALP a 400 x 106
espermatozides por ml para que se afecte com Hoechst 33342 (H33342; Sigma, Saint Louis, MO,
USA), incubando a amostra a 35 C durante 30 40 minutos. Depois da incubao se agrega 2 ml de
XE TALP com 4% de gema de ovo e 0.002 de F & C # 40 (Warner Jemkinson Compane Inc., Saint
Louis, MO, USA). Se filtra a amostra por um filtro de 40 m e logo se processa pelo citmetro de fluxo
usando um meio lquido que se baixa em meio a base de TRIS (SX MoFlo, Cetomation Inc. Fort
Collins, CO, USA), operando a 40 psi.(1, 3)

Procesamento do smen sexado: uma vez selecionado, os espermatozides so coletados at alcanar


um total de 15 ml ou 12 x 106 espermatozides sexados totais por tubos plsticos de 50 ml com 2 ml
meio baseado em TRIS e 20% de gema de ovo, a temperatura ambiente.(1) Posteriormente se esfria os
tubos com smen sexados durante 1.5 horas a 5 C como mnimo. Logo se centrifugam a 600 g durante
15 minutos, se tira o sobrenadante e se ressuspendem os pellets em meio de congelao at ajustar a a
concentrao a 20 x 106 espermatozides por ml. Carrega-se o smen em palhetas de 0,25 ml e se
congelam com curva de congelao padro em congeladora automtica de smen.

Avaliao da qualidade seminal pos descongelado: uma palheta tomada ao acaso de cada ejaculado
processado avaliada por motilidade progressiva ps descongelado, descartando aquelas que tenham
menos de 35% de motilidade progressiva. Ademais se realiza a avaliao da pureza no citmetro.

Utilizao na inseminao artificial: a palheta que se utiliza para inseminao deve ser descongelada 30
segundos a 37 C, e ser utilizada o mais rpido possvel.

A repetio dos resultados obtidos foram demonstrados nos ensaios realizados nos Estados Unidos
em distintos Estados e estabelecimentos, utilizando smen sexado e controle convencional em novilhas
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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

inseminadas com diferentes touros.(4) Tambm se realizaram provas em distintos lugares de inseminao, com
diferentes doses inseminantes. Resultados obtidos na Argentina estandarizam a utilizao de doses de 3 x 106
espermatozides totais para a utilizao em inseminao de novilhas a cio que se detectou e sincronizao do
cio com prostagandinas.

TABELA 1

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Aplicao de smen sexado para potenciar outras tecnologias: o smen sexado foi posto a ponto
para a utilizao em transferncia embrionria e fertilizao in vitro. Para o caso de seu uso em um
programa de super-ovulao e transferncia de embries se utilizam 4 palhetas de 10 x 106
espermatozides sexado totais, uma a tempo zero, duas as 12 horas e 1 as 24 horas da deteco do
cio.

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

TABELA 2

Tambm foi utilizado em programas de congelao de embries coletados in vivo. Os resultados


demonstram que sua utilizao no difere da do smen convencional.

Sua aplicao tambm foi levada ao laboratorio de FIV, obtendo resultados que permitem sua aplicao
com resultados similares ao smen convencional. Se recomenda o uso de trs palhetas de smen sexado de
3 x 106 espermatozides totais cada uma, para a fertilizao de aproximadamente 50 ovinhos.

Em todos os casos, os bezerros nascidos apresentaram iguais caractersticas fsicas e fisiolgicas que
os nascidos de smen controle e seu crescimento, desenvolvimento e capacidades produtivas e reprodutivas
no se viram alteradas.(5, 18)
SMEN SEXADO EM OVINOS
A aplicao comercial da tecnologia de smen sexado por citometra de fluxo em bovinos, foi alcanada
graas a utilizao de processos de criopreservao exitosos.(6)
O primeiro cordeiro produzido com smen sexado se obteve no ano 1996 mediante a tcnica de ICSI.
Os primeiros 4 cordeiros nascidos (13 % de prenhez) por inseminao com sexado de smen foram com
smen sexado em fresco, no ano 1996, utilizando inseminao laparoscpica na ponta do corno e 100,000
espermatozides sexados totais.(7, 8)
Na Argentina se realizou um ensaio com smen sexado fresco na temporada reprodutiva 2002 com
dois carneiros os resultados foram:

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

O processo utilizado foi o seguinte: se coletou de smen de carneiros com vagina artificial e se utilizaram
ejaculados com mais de 60 % de motilidade progressiva. Se diluiu o smen com XE TALP com 10 %
plasma seminal heterologo PH 7,4 a 400 x 106 espermatozides/ml, 2 ml, e se agregou Hoechst 33342.
Logo se agregaram 2 ml XE TALP PH 6,8 com 0.002 % de F & C # 40. As amostras foram processadas
em um citmetro de fluxo com separador de clulas (SX MoFlo, Cetomation Inc. Fort Collins, CO, USA),
utilizando como Sheath Fluid, uma soluo de PBS. Se coletaram 8 a 10 x 106 espermatozides totais
sexados em um tubo Falcom de 15 ml em 0,9 ml de XE TALP PH 6.8 com plasma seminal heterologo a
10 %. Logo se centrifugou 12 minutos a 600 g e o pellet foi resuspendido a 300 l com XE TALP com
plasma seminal a 10 %. A inseminao laparoscpica padro se realizou com 8 x 106 espermatozides totais
por ovelhas em cio que se detectou. O diagnstico de gestao se realizou por ultra-sonografia aos 30 dias
da inseminao e a porcentagem de acerto para o sexo escolhido foi de 100 %.
Os primeiros dados de prenhez obtidos com smen sexado congelado foram realizados na Austrlia
durante a temporada reprodutiva 2002. Se utilizaram dois carneiros diferentes, dois lugares de inseminao
laparoscpica e dois processos de meios de cogelao distintos.(9)
A coleta do smen em carneiros se realiza em temporada reprodutiva por meio da vagina artificial e s
se utilizam ejaculados que contm mais do 70 % de motilidade progressiva.(9)
Para a preparao da amostra para sexado se diluiu o smen em XE TALP(6) a 400 x 106
espermatozides/ ml, 2 ml totais, com o agregado de Hoechst 33342 (H33342; Sigma, Saint Louis, MO,
USA), incubando a amostra durante 1 hora a 34 C. A concentrao de Hoechst que se utilizou foi determinada
previamente por uma serie de provas para cada carneiro. Logo da incubao se agregaram 2 ml de XE
TALP com 4 % de gema de ovo (v/v) e 0.002 % de F & C # 40 (Warner Jemkinson Compane Inc., Saint
Louis, MO, USA), levando a concetrao final a 200 x 106 espermatozides/ ml.(9)
As amostras foram processadas em um citmetro de fluxo com separador de clulas (SX MoFlo,
Cetomation Inc. Fort Collins, CO, USA). Uma vez coletados os espermatozides do sexo desejado, estes
foram centrifugados a 700 g durante 6 minutos a 30 C. Logo de aspirar o sobrenadante, o pellet de 80 l foi
resuspenso em dois meios de congelao distintos em relao 1:4 (smen: diluinte). Os meios utilizados
foram tampo TES com 20 % de gema de ovo e 3 % de glicerol(10), e Zwitterion tampo com 13,5 % de
gema de ovo e 6 % de glicerol(11). O smen convencional controle foi preparado em uma diluio 1:4 (smen
: diluente) com os mesmos meios. O esfriado se levou a cabo em 1.5 horas at 4 C. Se congelou em forma
de pellet sobre gelo seco e logo se submergiram em nitrognio lquido. A descongelao se realizou a 37 C
e a inseminao dentro dos 10 minutos de haver realizado a descongelao.(9)
Se utilizaram duas pastilhas de smen sexado e um total de 4 x 106 espermatozides totais para
inseminar, e 140 x 10 6 espermatozides totais para o caso do controle.
A sincronizao do cio das ovelhas se realizou colocando uma esponja intravaginal de progestgenos
durante 12 dias, se injetaram 400 UI de PMSG no momento de retirar a esponja e as 54-57 horas se realizou
a inseminao artificial laparoscpica. Se compararam dois lugares de inseminao: standard e na unio tero
tubrica por meio de uma sonda.
No houve diferenas significativas nos resultados de prenhez entre os dois lugares de inseminao,
mas entre sexado e controle e entre os dois carneiros utilizados.(9)
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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

Na Argentina se realizou o primeiro ensaio na temporada reprodutiva 2002 utilizando um carneiro e os


resultados foram: 3 ovelhas preadas de 10 inseminadas (33 %), utilizando um processo similar ao utilizado
anteriormente em smen fresco mais o diluente em que se resuspendeu foi a base de TES, TRIS, frutose e
4% de leite desnatado, 20% de gema de ovo e 6% de glicerol. O smen foi refrigerado durante 1.5 horas a
4 C e envasado em mini palhetas com 5 x 106 espermatozides totais por palheta, e congelado em congelador
automtico.
Os resultados foram os seguintes:

A inseminao laparoscpica padro se realizou com 10 x 106 espermatozides totais por ovelhas. O
diagnstico de gestao se realizou por ultra-sonografia aos 30 dias da inseminao e a porcentagem de
acerto para o sexo escolhido foi de 100 %.
Posteriormemte se realizou um ensaio em duas Estancias do sul da Argentina com um maior nmero de
fmeas(12).

Na Austrlia se realizaram provas com um protocolo baseado na utilizao de solues com tampo
TRIS em preparao da diluio da amostra de sexado, no Sheath Fluid e na soluo que recebe os
espermatozides sexados.
Provas in vitro de integridade acrossomal, e capacidade de migrao em mucus cervical no
demonstraram diferenas entre smen sexado e no sexado congelado-descongelado.
Enquanto a capacidade de unio dos espermatozides a clulas do oviduto, no houve diferenas
entre espermatozides sexados e no sexado, embora os sexados se desprenderam mais rapidamente. In
vivo, se obteve um 33 % de prenhez com 5 x 106 espermatozides totais por palheta, versus um 59 % obtido
com 100 x 106 espermatozides totais por palheta de smen controle convencional comercial.(13)
Durante a temporada 2003, utilizando o mesmo protocolo e a inseminao laparoscpica se realizou
um ensaio com sincronizao de ovulao e inseminao a tempo fixo versus a inseminao a cio detectado
e se obtiveram os seguintes resultados:
71

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

Os resultados demonstraram que a pesar de que no h diferenas entre as porcentagens de prenhez


entre os diferentes processos de inseminao, para o caso do uso de smen sexado Y, houve um porcentagem
significativamente maior de prenhez com Inseminao Artificial a Tempo Fixo, que para o smen sexado X.
Para o caso de smen sexado X houve um porcentagem significativamente maior de prenhez com Inseminao
a Cio Detectado que com smen sexado Y.
Tambm durante esta temporada se provaro os dois processos para obteno de smen sexado: o j
provado anteriormente na Argentina baseado em TALP e PBS, e o protocolo utilizado em Austrlia baseado
em TRIS.
SMEN SEXADO EM EQUINOS
Na espcie eqina, a possibilidade de selecionar o sexo do produto, brinda a possibilidade no somente
de acelerar o progresso gentico, como tambm de sua aplicao as melhoras na performance esportiva.
A aplicao do smen sexado em eqinos no momento se encontra restringido a inseminao artificial
profunda com smen fresco, cujo os primeiros resultados em Colorado mostram um 37,5 % de prenhez(14).
O desenvolvimento da utilizao da tecnologia de inseminao hiteroscpica na ponta do corno a
doses baixas possibilita a utilizao do smen sexado em eqinos, j que permite baixar as doses inseminantes
a 14 x 106 espermatozides totais sem alterar as porcentagens de prenhez.(15)
Se encontram como limitantes que a congelao de smen sexado ainda apresenta baixos porcentagens
de prenhez (13,3 % versus 37,5 % para o controle, utilizando 5 x 106 espermatozides mtiles sexados totais
e inseminao histeroscpica)(16), que no existe ainda um protocolo de superovulao com resultados repetveis
para sua aplicao em transferncia embrionria(17) e que em algumas raas, as associaes de criadores no
permitem a aplicao de diferentes biotecnologias da reproduo.
Na Argentina se realizaram distintos ensaios ao longo das temporadas reprodutivas 2001 2003.
Para estes experimentos se utilizaram garanhes de fertilidade conhecida.
-

72

Coleta de smen e tratamento do ejaculado: os garanhes foram coletados com vagina artificial.
Foram procesados aqueles ejaculados cujas caractersticas eram: motilidade maior que 55 % e mais
do 70 % de espermatozides normais. Se utilizaram ejaculados livres de gel por filtrao e foram
liberados do plasma seminal por meio de diluio em diluente KMT e centrifugao durante 10
minuto a 600 g, ou bem diludo a 25 x 106 espermatozides por ml para transporte em Equitainer e
posterior conservao a 15 C at um mximo de 15 horas. Prvio a preparao da amostra, o
smen foi ajustado a 100 x 106 espermatozides por ml.

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

Preparao de a dose inseminante de smen sexado: o smen j diludo foi alterado com Hoechst
33342 para seu posterior processamento pelo citometro (SX MoFlo, Cetomation Inc. Fort Collins,
CO, USA). Os espermatozides sexados foram coletados em tubos plsticos de 50 ml com 2 ml de
extender KMT at alcanar 15 ml. Uma vez coletados uma quantidade total de 45 (IA profunda) o
25 (IA histeroscpica) x 106 espermatozides totais se utiliza uma alquota de 0,5 ml para anlise da
pureza. Se descartaram aquelas doses com menos do 85 % de acerto ao sexo escolhido. Logo se
centrifugaram os tubos a 850 g durante 20 minutos, e os pellet se resuspendem em um total de 0,5 ml
de diluinte KMT e se colocou em uma palheta de 0,5 ml.

Inseminao profunda da gua: cada gua foi revisada por ultra-sonografia e palpao retal at que
se detectou um folculo maior a 35 mm. A partir de este momento se administrou uma dose de hCG
para sincronizao da ovulao e se continuou revisando cada 4 - 6 horas at o momento mais
prximo da ovulao. Se realizaram uma mdia de duas inseminaes por gua. Se utilizou um
fibroscpio para inseminao na ponta do corno na primeira temporada reprodutiva e na segunda, se
provou esta tcnica versus a inseminao artificial profunda com pipeta.
Temporada 2001 - 2002

Se prenharam 6 guas de 17 inseminadas, das quais 5 foram inseminadas depois de detectada a


ovulao.
Temporada 2003 2004
Se inseminaram 24 guas de boa performance reprodutiva com IA profunda, e se prenharam 13.
A deteco de prenhez se realizou aos 30 dias de ovulao e o diagnstico de sexo fetal a os 62 dias
com confirmao no nascimento em alguns casos. Para todos os casos, o acerto do sexo foi do 100 %.
-

Aplicao em transferncia de embries:


Temporada 2002- 2003

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

Durante a temporada 2003 2004 se realizou um ensaio utilizando dois garanhes de fertilidade
conhecida e 18 gua ciclicas de 8 a 12 anos de idade com boa atitude reprodutiva. Das 18 coletas se
recuperaram 11 embries e se obtiveram 8 prenhez.
Atualmente a Argentina o nico pas que possui a licena comercial exclusiva para a comercializao
de smen sexado eqino e produo de embries com esta tecnologia.

REFERENCIAS CITADAS
(1) Schenk J.L., Suh T.K., Cran D.G., and Seidel Jr. Theriogenology 52: 1375-1391, 1999.
(2) Cattaneo L., Aguilar J., Caballero J., Perez S., Cerrate H. And Brogliatti G. Annual Meeting of
International Embryo Transfer Society, 2002.
(3) Campos Chilln L. F., De la Torre J. F. and Seidel Jr. Theriogenology , 2003.
(4) Seidel Jr., Schenk J.L., Herickhoff L.A., Doyle S. P., Brink Z., Green R.D. and Cran D.G. Theriogenology
52: 1407-1420, 1999.
(5) Seidel Jr., Hasler J. P. Simposio Internacional de Reproduccin Animal, Huerta Grande, Crdoba,
Argentina, 2001.
(6) Schenk JL, Suh TK, Cran DG, Seidel Jr GE Theriogenology 52:1375-1391, 1999.
(7) Catt SL, Catt JW, Gomez MC, Maxwell WMC, Evans G. Vet Rec 139: 494-495, 1996.
(8) Cran DG, McKelvey WAC, King ME, Dolman DF, McEvoy TG, Broadbent PJ, Robinson JJ,
Theriogenology 47: 267 (Abstr), 1997.
(9) Hollinshead F.J., Obrein J.K., He L., Maxwell W.M.C. and Evan G. Rep. Fert. And Dev., 2002.
(10) Johnson LA, Flook JP, Hawk HW Biol Reprod 41:199-203, 1989.
(11) Molinia FC, Evans G, Maxwell WMC Reprod Nutr Dev 36:21-29, 1996.
(12) Cattaneo L., Panarace M., Caballero J., Viteri B., Puy E. Y Medina M. Proc. Of Annual Meeting of
International Embryo Transfer Society, 2003.
(13) Hollinshead FK, Gillan L, OBrien JK, Evans G, Maxwell WM. Reprod, Fert. And Dev. 15 (6): 351259, 2003.
(14) Lindsey AC, Bruemmer JE, Squires EL. Anim Reprod Sci 68 (3-4): 279-289, 2001.
(15) Morris LH, Tiplady C, Allen WR. Equine Vet J. 35(2):197-201, 2003.
(16) Lindsey AC, Schenk JL, Graham JK, Bruemmer JE, Squires EL. Equine Vet J. 34(2):121-7, 2002.
(17) Alvarenga MA, McCue PM, Bruemmer J, Neves Neto JR, Squire EL. Theriogenology 56 (5): 879887, 2001.
(18) Tubman L. M., Brink Z., Suh T. K. and Seidel Jr. Journal of Anim Sci 82: 1029-1036, 2004.
74

Acta Scientiae
2004
Miglino, M.A. 2004. Clonagem
animal eVeterinariae
placentao.32(Suplemento),
Acta Scientiae Veterinariae,
32 (Supl ): 75-78.

CLONAGEM ANIMAL E PLACENTAO

Maria Anglica Miglino

A clonagem animal traduz sem dvida o grande avano tecnolgico obtido no campo da biotecnologia
animal. Os recentes resultados de clonagem por transferncia nuclear, abrem novas perspectivas no campo
da biotecnologia da reproduo e produo animal, bem como sinaliza um futuro promissor para a preservao
de espcies em extino.
Embora muitas espcies tm sido clonadas com sucesso, sugerindo boas perspectivas para as aplicaes
prticas, o processo no pode ainda ser considerado totalmente eficiente.
Sabe-se, hoje que apenas um nmero mnimo de gestaes de clones levado a termo, se comparado
com gestaes de animais produzidos por fertilizao in vitro. Outro dado muito relevante, que aparece
em gestaes de animais clonados, a ocorrncia de perdas embrionrias, fetais e ps-natais.
Segundo Bordignon(1), a baixa viabilidade dos embries clonados principalmente expressa pela reduo
na taxa de implantao, pelo aumento na taxa de mortalidade fetal e perinatal, e pelas diversas anomalias
observadas nos animais recm-nascidos. Esses problemas ocorrem possivelmente porque os ncleos de
clulas diferenciadas no so corretamente reconduzidos a um estdio embrionrio nos embries clonados,
o que leva expresso errnea de genes que so necessrios para sustentar o desenvolvimento normal.
Todavia, pelo menos em bovinos, uma pequena proporo dos animais clonados fenotipicamente normal,
cresce de forma saudvel, possui um sistema imunitrio funcional e pode reproduzir-se e produzir normalmente.
Mesmo que ainda no existam provas definitivas de que os animais clonados sejam totalmente normais, os
resultados desses estudos sugerem que, em certas condies especficas, pelo menos uma pequena proporo
dos ncleos diferenciados pode ser adequadamente reprogramada para voltar ao estdio embrionrio.
Identificar como essa condio pode ser conseguida representa um dos principais desafios para desenvolver
melhores protocolos para clonar animais.
A baixa eficincia do processo de clonagem animal envolve problemas, tais como anomalias
cromossmicas, alocao anormal do nmero de clulas no boto embrionrio e trofoectoderma e formao
deficiente do fuso mittico.
Quando ocorre clivagem e desenvolvimento de blastocisto, a taxa de implantao menor e as perdas
fetais normalmente elevadas sugerem deficincias do processo normal de desenvolvimento biolgico da espcie.
Apesar das causas do desenvolvimento anormal continuarem obscuras, genes que so marcados
(imprinted) de forma diferente tm sido responsabilizados por essas anormalidades(2).
HILL et al.(3) demonstraram em bovinos, uma expresso anormal do complexo de histocompatibilidade
maior do tipo I no trofoblasto, e um maior acmulo de linfcitos T no endomtrio de gestaes produzidas
com embries clonados comparados com animais controle. Estes resultados sugerem que uma rejeio
imunolgica tambm possa estar contribuindo para a grande incidncia de perdas gestacionais com embries
clonados.
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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

Uma das causas apontadas por perdas gestacionais a deficincia placentria. HILL et al(3) apontam
que 82% de bovinos clonados por transferncia nuclear no sobrevivem entre o 30o e 90o dias de prenhez.
Os autores atribuem a essa viabilidade deficiente, o desenvolvimento de um corioalantide rudimentar, quando
comparado quele dos animais de controle. De outra parte, os problemas podem estar associados aos
fatores que promovem o crescimento placentrio e vascular e suas interaes materno-fetais tais como
conexes placentrias e formao de vilos corinicos. De acordo com Dinnys(4), a deficincia do
desenvolvimento vascular placentrio pode ser evidenciada nos ruminantes (bovinos) por estruturas
cotiledonrias reduzidas ou ausentes.
Fetos anormais, hepatomegalia, hemorragia drmica(4) hidropsia em vacas receptoras de animais
clonados(5) so alteraes constantes envolvidas no processo gestacional de clones, de maneira a sugerir que
o desenvolvimento normal de gestaes representa casos de exceo.
Placentaes ineficientes em embries clonados foram observadas em camundongos(6), bovinos e
ovinos(7,8). Tais anormalidades em ruminantes incluem irrigao sangnea deficiente, aumento da ocorrncia
de hidroalantide, e reduo do nmero e aumento do tamanho dos placentomas. Destas condies decorrem
as perdas gestacionais, as anomalias e a menor viabilidade de animais clonados.
Casos de hidroalantide so normalmente detectados em bovinos durante o terceiro trimestre de
gestao, e esto associados ao aumento da concentrao plasmtica materna da glicoprotena (PSP60). A
PSP60 produzida pelas clulas trofoblsticas binucleadas as quais desenvolvem um processo migratrio
em direo ao epitlio uterino(9).
O nmero reduzido de placentomas - 39 - menor que em gestaes normais e o dimetro aumentado
destas estruturas - 21cm - maior que os grandes placentomas de gestaes normais 11cm(12), e o peso e a
espessura exagerada dos mesmos - 153g , indicam que a placentao em bovinos clonados apresenta
anormalidades dignas de maiores esclarecimentos(12) e (13).
De outra parte, reas hemorrgicas aparentes sobre a superfcie dos placentomas edemaciado
certamente sugerem comprometimento da gestao.
Estruturalmente existe total desorganizao das rvores vilosas fetais, as quais aparecem inseridas
nas criptas endometriais em placentas de bovinos clonados. Outro fato notvel a menor densidade de vilos
presentes nos chamados megacotiledones. Soma-se a estes fatos a deficiente ramificao vascular sobre a
superfcie das chamadas rvores vilosas, bem como as dilataes anormais das criptas endometriais onde
esses vilos se inserem.
Os capilares fetais (5-10m de dimetro) so menos calibrosos que aqueles observados em gestaes
normais (7-12m). De maneira semelhante, os capilares maternos, so menos calibrosos (9-14m), que os
encontrados em gestaes normais (14-28m), porm mais ramificados.
A interface materno-fetal apresenta-se desorganizada e, as clulas trofoblsticas que se evidenciam
como binucleadas encontram-se polinucleadas (tri, tetra, pentanucleadas), com alteraes nucleares
significativas(11,12).
Consideraes parte podem ser feitas com relao a problemas do desenvolvimento embrionrio e/
ou fetal associado produo de esterides e os fatores de crescimento endoteliais (VEGF) e os fatores de
crescimento bsicos dos fibroblastos (bFGF) com seus importantes papis na vasculognese e angiognese
placentrios, assim como na esteroidognese placentria(13).
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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

Com vistas a estudar comparativamente a produo de progesterona (P4) na placenta de bovinos


clonados e no clonados (de termo), sob a influncia do VEGF e bFGF, verificamos que as clulas placentrias
das gestaes de clones no so capazes de produzir progesterona, tal como as clulas placentrias de
gestaes normais da mesma fase. Nestas, a estimulao de VEGF e bFGF poderia incrementar a produo
de progesterona nas clulas placentrias em 48 horas em cultura, enquanto ambos os fatores juntos induzem
um incremento de P4 em 24 horas. De outra parte, as clulas placentrias de clones no respondem adio
dos fatores de crescimento. Isto pode ser explicado pelas diferenas na ativao gnica e expresso em
animais clonados e nas suas placentas.
Quando comparamos reaes imunomarcadas de VEGF em cortes de placentomas de animais clonados
e no clonados, verificamos que a marcao nos clonados mais evidente que nos controles. Ao mesmo
tempo, a expresso do VEGFR-1 menor nos placentomas de clones, enquanto que a marcao para
VEGFR-2 permanece a mesma ou reduzida em relao ao controle. A expresso de bFGF foi reduzida em
todas as amostras dos placentomas de clones.
VEGF, VEGFR-1 e VEGFR-2 so regulados por fatores como hipxia e nveis de hormnios
esterides(14) os quais potencializam ou decrescem o sistema de transcrio do VEGF. Variaes do sistema
de expresso do VEGF podem comprometer o crescimento vascular, a permeabilidade e o suprimento
tecidual. Um decrscimo da expresso de bFGF pode contribuir para os defeitos vasculognicos e
angiognicos, assim como para as alteraes da diferenciao das clulas trofoblsticas, como j relatado
nas placentas dos clonados.
Nosso resultados demonstram que dois dos principais fatores controladores da vasculognese e
angiognse da placenta esto alterados, os quais podem contribuir para a alta mortalidade destes embries.
Referncias bibliogrficas
1. Bordingnon, V. Clonagem de animais por transferncia nuclear: Avanos e desafios. Acta scientiae
2.

3.

4.
5.
6.

7.

veterinarie. Supl. 31, P. 64-73, 2003.


Bordignon, V.; Smith, L. Clonagem animal por transferncia nuclear In: Gonalves, P.B.D.;
Figueiredo, J.R.; Freitas, V.J.F. Biotcnicas aplicadas reproduo animal. So Paulo: Varela,
p.281-303, 2002.
Hill, J.R.; Burghardt, R.C.; Jones, K.; Long, C.R.; Shin, T.; Spencer, T.E.; Thompson, J.A.; Winger,
Q.A.; Wethusin, M.E. Evidence for placental abnormality as the major cause of mortality in firsttrimester somatic cell cloned bovine fetuses. Biology of reproduction, v.63, p. 17871794, 2000.
Dinnys, A.; Sousa, P.; King, T.; Wilmut, I. Somatic cell nuclear transfer: recent progress and
challenges. Cloning and stem cells, v.4, n.1, 2002.
Heyman, Y; Zhou, Qi; Lebourhis, D.; Chavatte-Palmer, P.; Renard, J.P.; Vignon, X. Novel approaches
and hurdles to somatic cloning in cattle. Cloning and stem cells, v.4, n.1, 2002.
Tanaka S.; Oda M.; Toyoshima Y.; Wakayama T.; Tanaka M.; Yoshida N.; Hattori N.; Ohgane J.;
Yanagimachi R.; Shiota K.: Placentomegaly in cloned mouse concepti caused by expansion of the
spongiotrophoblast layer. Biology of reproduction. v.65(6), p.1813-21, 2001.
Hill, R.; Edwards, J.F.; Sawyer, N.; Blackwell, C.; Cibelli, J.B. Placental anomalies in a viable
77

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

cloned calf. Cloning, v.3, n.2, p.83-88, 2001.


8. Allen, W.R.; Carter, A.M.; Chavatte-Palmer, P.; Dantzer, V.; Enders, A.C.; Freyer, C.; Leiser, R.;
Miglino, M.A. Comparative placentation - a workshop report Placenta. Apr; 24 Suppl A:S1003, 2003.
9. Constant, F.; Guillomot, M.; Chavatte-Palmer, P.; Heyman, Y.; Berthelot, V.; Camous, S.; Turbe, A.;
Renard, J.P. Structural and functional studies on placenta of bovines somatic clones Placenta,
A.37, P.114 - Epg 2003.
10. Miglino, M.A. Pesquisa anatmica sobre a ramificao e distribuio das artrias e veias da placenta
de bovinos So Paulo, 1991. 303p. Tese de livre- docncia - Faculdade de Medicina Veterinria e
Zootecnia, Universidade de So Paulo.
11. Miglino, M.A.; Verechia, F.T.; Visintin, J.A.; Mello, M.R.B.; Garcia, J.M.; Yamazaki, W.; Ambrsio,
C.E.; Carvalho,A.F.; Braga, F.C.; Santos, T.C.; Leiser, R.; Carter, A.M. placentao em bovinos
clonados: arquitetura microvascular e estrutura. Acta scientiae veterinarie. Supl. 31, p.484-485,
2003a.
12. Miglino, M.A.; Verechia, F.T.; Visintin, J.A.; Mello, M.R.B.; Garcia, J.M.; Yamazaki, W.; Ambrsio,
C.E.; Carvalho,A.F.; Braga, F.C.; Santos, T.C.; Leiser, R.; Carter, A.M. Cloned cattle placentation:
microvascular arquitecture and structure. Placenta, A.37, P113, p.484-485, 2003b.
13. Campos, D.B.; Moura, C.E.B., Kfoury Jr, J.R., Miglino, M.A., Oliveira, C.A., Machado, U.F.,
Pappa, P.C. Influence of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor on
progesterone production by cultured placental cells, Placenta, 24(8/9) A 44, 2003.
14. Tsatsaris, V., Goffin, F., Munaut, C. et al. Overexpression of the soluble vascular endothelial growth
factor receptor in preeclamptic patients: pathophysiological consequences. J. Clin Endocrinol
Metabol., v. 88, n. 11, p. 5555-5563, 2003.
15. Westhusin, M.E., Long, C.R., Shin, T et al. Cloning to reproduce desired genotypes. Theriogenology,
v. 55, n. 1, p.35-49, 2001.
16. Reynolds, L.P., Redmer, D.A. Angiogeneses in the placenta, Biol. Reprod. v.64, p.1033-1040, 2001.
17. Taniguchi F, Harada T, Yoshida S, et al. Paracrine effects of bFGF and KGF on the process of
mouse blastocist implantation. Mol Reprod Dev. v.50, p.54-62, 1998.

78

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

MESA
REDONDA

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CRIOPRESERVAO DE EMBRIES PIV


Alceu Mezzalira
CAV/UDESC Lages SC
A viabilidade dos primeiros embries congelados(20,21) dinamizaram a tcnica de TE, desencadeando
processos de adequao e criao de novas metodologias. Para embries produzidos in vivo, o mtodo
convencional mostra-se adequado, embora com variaes em diferentes raas. J para embries produzidos
in vitro (PIV), h a necessidade de novas alternativas de criopreservao, dentre as quais candidatam-se o
congelamento ultra-rpido (UR) e a vitrificao. Estas inovaes introduziram novos conceitos, alm dos
clssicos efeitos do gelo intracelular e da concentrao de solutos(6 7).
O mtodo UR possibilita o congelamento direto de embries no nitrognio(16,17), sendo muito empregado na dcada de 80 para embries murdeos. Com esta tecnologia so relatados resultados de 92,9% de
blastocistos eclodidos e 32% de fetos(9). J com embries bovinos, os dados de literatura so escassos.
Taxas de ecloso de 17,3% aps congelamento UR de Bi bovinos, em glicerol e sacarose e que subiram para
56,4% de ecloso com Bx, demonstram a influncia do estgio de desenvolvimento(3). observada ainda,
uma grande variao na viabilidade (18,5 a 67,7% de ecloso) com diferentes tempos (2 a 7min.) e temperaturas(4). No Brasil, poucos trabalhos utilizaram congelamento UR em bovinos, sendo descrito o primeiro
nascimento em 1991(2). Taxas de 19,2% de nascimentos aps transferncia embries congelados UR com
glicerol 3,0M e sacarose 0,25M(11) e 17% e 13% de prenhez aos 45 dias, com etileno glicol 2,0 ou 3,0M +
0,3M trealose(1), so descritas. Entretanto, poucos resultados positivos foram obtidos com embries PIV. J
a vitrificao, que possibilita a solidificao de uma soluo sem a formao de gelo, vem crescendo em
importncia na criopreservao ocitos e embries PIV, com resultados significativos, principalmente com a
utilizao de etileno glicol(13,14) ou a associao Etileno glicol + DMSO(18). MARTINO e colaboradores(5)
utilizando a metodologia adotada para preservar embries de Drosophila(8), obtiveram os primeiros resultados importantes, usando grades metlicas de microscopia eletrnica, imersas em nitrognio. Com base nestes princpios, foi desenvolvido o sistema denominado OPS (Open Pulled Straw), que proporciona velocidade de 20.000oC / minuto(18), sendo hoje a metodologia mais utilizada para criopreservar ovcitos, mostrando-se adequada tambm para embries, principalmente PIV. Mezzalira e colaboradores(10) obtiveram 47,1%
de ecloso aps vitrificao de blastocistos bovinos PIV em D7. Existe indicao da necessidade do ajuste
do mtodo aos requerimentos da estrutura a ser criopreservada(19). Com Bx PIV em D7, resultados semelhantes de ecloso (49,6 e 54,2%) foram obtidos com diferentes perodos de exposio aos crioprotetores
(1 e 3 minutos) e diferentes concentraes de crioprotetores(12). Entretanto, com Bx em D8, o menor tempo
de exposio com maior concentrao de crioprotetor resultou em maior taxa de ecloso (51,7%) em relao ao tratamento com maior exposio e menores concentraes de crioprotetores (33,2%)(12). A influncia de diferentes formas de cultivo de embries (em grupo X isolado), na viabilidade ps vitrificao, associada a taxas de ecloso extremamente significativas (77,4 a 96,9%) em todos os grupos, foram obtidas
recentemente(15). Assim, o caminho a ser percorrido esta indicado, resta-nos buscar as melhores trilhas para
chegar l.
1. ALMEIDA, N.V. Congelamento ultra-rpido de embries com etilenoglicol e trealose. 2001.
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Dissertao de Mestrado em Medicina Veterinria, Universidade Federal de Santa Maria, Santa


Maria RS, 26p. 2001.
2. BERNARDI, M.L., RUBIN, M.I.B, COSTA, C.P.D., MEZZALIRA, A., SILVA, C. A.M. Congelamento ultra-rpido de embries bovinos: Primeiro terneiro obtido no Brasil. In: REUNIO ANUAL DA SBTE, 6, Curitiba, Anais... Curitiba: Sociedade Brasileira de Transferncia de Embries,
1991. p.51.
3. CHUPIN, D. Quick freezing of bovine blastocysts. Theriogenology, v.25, n.1, p.147, 1986. Abstract.
4. CHUPIN, D. Quick freezing of day 7 bovine blastocysts: Optimum parameters of dehydration step.
Theriogenology, v.27, n.1, p.219, 1987. Abstract.
5. MARTINO, A.; POLLARD J.W.; LEIBO, S.P. Effect of chilling bovine oocytes on their developmental competence. Mol. Reprod. Dev., v.45, p.503-512, 1996.
6. MAZUR, P. Cryobiology: The freezing of biological systems. Science, v.168, p.939-949, 1970.
7. MAZUR, P.; LEIBO, S.P.; CHU, E.H.Y. A two-factor hypothesis of freezing injury. Exp. Cell
Res., v.71, p.345-355, 1972.
8. MAZUR, P.; COLE, K.W.; HALL, J.W. et al. Cryobiological preservation of Drosophila embryos.
Science, v.258, p.1932-1935, 1992.
9. MEZZALIRA, A. & RUBIN, M.I.B. Ultrarapid freezing and transfer of mouse morulae.
Theriogenology, v.37, n.1, p.257, 1992. Abstract.
10. MEZZALIRA, A.; THALER NETO, A.; BARBIERI, D.P. Vitrificao de embries bovinos PIV
tratados com Citocalasina B. Ver. Bras. Reprod. Animal, v.25, n.3, p.422-423, 2001.
11. MEZZALIRA, A.; VIEIRA, A.D.; SILVA, L.F.A., KAJIYAMA, V.Y. Congelamento ultra-rpido
de embries bovinos. Rev. De Cincias Agroveterinrias, v.2, p.115-119, 2002.
12. MEZZALIRA, A.; MEZZALIRA, J.C.; BARBIERI, D.P. et al. Vitrificao de embries bovinos
produzidos in vitro.: Avaliao de dois protocolos. Acta Scientiae Veterinariae, v.31, p.480-481,
2003. Suplemento.
13. NOWSHARI, M.A. & BREM, G. Rapid-freezing of in vitro produced bovine embryos with ethylene glycol. In Serono Symposia, 1998. Gametes Development and function, LAURIA, A. &
GANDOLFI. F. Editors, Roma, 1998, p.585.
14. OLIVEIRA, A.T.D.:C; FORELL, F.; MEDEIROS, C.M.O. et al. Vitrificao de embries bovinos
produzidos in vitro, usando etilenoglicol e sacarose. ARS Veterinria, 19 (2), p.191-201, 2003.
15. PEREIRA, D.C.; DODE, M.A.M.; CORRA, G.A.; RUMPF, R. Avaliao da sobrevivncia de
embries bovinos produzidos in vitro cultivados em diferentes sistemas e vitrificados pelo mtodo
OPS. Acta Scientiae Veterinariae, v.31, p.524-525, 2003. Suplemento.
16. TAKAHASHI, Y. & KANAGAWA, H. Quick freezing of mouse embryos by direct plunge into
liquid nitrogen vapor: Effects of sugars. Jpn. Vet. Res., n.33, p.141-144, 1985.
17. TAKEDA, T.; ELSDEN, P.; SEIDEL Jr, G. E. Cryopreservation of mouse embryos by direct plunging into liquid nitrogen. Theriogenology, n.21, v.1, p.266, 1984. Abstract.
18. VAJTA, G.; HOLM, P.; KUWAYAMA, M. et al. Open pulled straw (OPS) vitrification: A new way
to reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos. Mol. Reprod. Dev., v.51, p.53-58, 1998.
19. VAJTA, G. Criopreservao de ovcitos e embries produzidos in vitro. Arq. Fac. Vet. da UFRGS.
v.28, n.1, p.85-94, 2000. Suplem.
20. WHITTINGHAM, D.G.; LEIBO, S.P.; MAZUR, P. Survival of mouse embryos frozen to -196C
and -296C. Science, n.178, p.411-414, 1972.
21. WILMUT, I. & ROWSON, L.E.A. Experiments on the low-temperature preservation of cow embryos. Vet. Rec., n.92, v.26, p.686-690, 1973.
82

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

CRIOPRESERVAO DE OCITOS BOVINOS


Vieira, A.D.1; Rodrigues, J.L.2
MV. MSc. Aluno doutorado PPGCV/UFRGS, 2Prof. Dr. Pesquisador CNPq
Laboratrio de Embriologia e Biotcnicas da Reproduo UFRGS
Porto Alegre - RS. Caixa postal 15004. Endereo: vieiraad@bol.com.br

O aumento na demanda de material gentico para emprego nas diferentes biotcnicas de reproduo,
gerou a necessidade da organizao de bancos de germoplasma. Ao mesmo tempo, a crescente utilizao
comercial da produo in vitro de embries bovinos (PIV) exige uma maior disponibilidade de ocitos. Uma
das estratgias que vem sendo levada em considerao o emprego de ocitos criopreservados em funo
da flexibilidade de aplicao e facilidade na programao das atividades. A maioria dos experimentos vem
sendo realizada utilizando ocitos maturados (metfase II), por proporcionarem maiores taxas de desenvolvimento em relao aos ocitos imaturos (vescula germinativa). Entretanto, apesar da obteno de taxas de
25% desenvolvimento embrionrio a partir de ocitos maturados vitrificados (Vajta et al., Mol. Reprod.
Devel., n.51, p.53-58, 1998) e de prenhez com o uso do mesmo tipo de material como citoplastos receptores na fuso nuclear (Booth et al., Theriogenology, n. 51, p. 999-1006. 1999), a ocorrncia de alteraes
genticas determinadas por falhas na reorganizao dos fusos meiticos limitam a viabilidade da criopreservao
destes ocitos. Por outro lado, do ponto de vista logstico os trabalhos com ocitos maturados dificultam o
aproveitamento do potencial de animais criados em locais distantes de centros equipados para PIV, em
funo das limitaes decorrentes da perda de viabilidade determinada pelo tempo de transporte e dependncia do laboratrio equipado para iniciar a maturao in vitro. Desta forma, a busca de solues na
criopreservao de ocitos imaturos justifica-se pelo fato de que neste estdio o sistema de fusos no est
organizado e o material gentico encontra-se descondensado e protegido dentro do envelope nuclear, permitindo contornar os problemas observados com ocitos maturados. Resultados preliminares, com taxas de
15% de desenvolvimento embrionrio at o estdio de blastocisto (YAVIN & ARAV, Cryobiology. n. 43, p.
331. 2001) e nascimentos de produtos normais (VIEIRA et al., Cryobiology, n. 45, p. 91-94. 2002) a partir
de ocitos imaturos vitrificados confirmam a potencialidade da tcnica. O incremento nas taxas de sobrevivncia ps criopreservao de ocitos imaturos em nveis que tornem os resultados comercialmente atrativos, vai depender da adoo de estratgias experimentais, que permitam modificaes e ajustes dos protocolos empregados. O principal direcionamento o da vitrificao com reduo nos efeitos txicos e osmticos
das solues crioprotetoras com o aumento na velocidade de resfriamento. A associao da criopreservao
de ocitos imaturos acondicionados em palhetas, atravs da vitrificao realizada nas condies de propriedade rural, com a aspirao folicular guiada com o auxlio do ultrasom, permitir um melhor aproveitamento
do potencial reprodutivo de animais mantidos em locais distantes dos laboratrios equipados para PIV. O
aumento na viabilidade ps-criopreservao de ocitos imaturos dever tambm possibilitar a expanso da
sua utilizao em outras biotcnicas de reproduo.
Palavras chave: gameta feminino, vitrificao, armazenamento, bancos genticos.
83

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

CRIOPRESERVAO DE EMBRIES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO


Watanabe, Y.F.
Depto de Cincias Bsicas FZEA-USP
Av. Duque de Caxias Norte 225, Pirassununga SP
E-mail: yeda@vitrogen.com.br
A aplicao comercial da produo in vitro de embries bovinos a partir de ocitos imaturos tem
aumentado consideravelmente nos ltimos anos. No entanto, a taxa de prenhez tem apresentado resultados
satisfatrios somente a partir da transferncia a fresco dos embries, deixando muito a desejar a viabilidade
destes aps criopreservao, ou seja, o resultado tem se mostrado inferior e muito inconsistente quando
comparado aos embries produzidos in vivo. Portanto, de suma importncia que os embries possam ser
congelados e descongelados para que esta tecnologia possa ser mais flexvel e amplamente difundida.
Vrios estudos tm divulgado taxa de prenhez e nascimento aps transferncia de embries bovinos
produzidos in vitro ps-congelamento (Agca et al, 1998; Damiani et al, 1997; Hasler et al, 1997; Wright et
al, 1995; Wurth et al 1994), onde tem se observado que a qualidade dos embries produzidos in vitro
inferior daqueles in vivo. Vrios autores relatam que as diferenas verificadas entre os dois grupos de embries
(in vitro versus in vivo) foram verificadas quanto aos aspectos morfolgicos, ultraestruturais, metablicos,
bioqumicos e genmicos (Greve et al, 1993; Holm et al, 1998; Krurana et al, 2000; Khurana & Niemann et
al, 2000).
Recentemente, tem observado que os diferentes sistemas de produo in vitro de blastocistos, como
os diferentes meios de cultivo, a co-cultura, a adio de soro, assim como a atmosfera gasosa utilizada no
processo tem um forte impacto na eficincia da criopreservao dos embries produzidos in vitro. Alem
disso, tem sido demonstrado que o perodo de cultivo ps-fecundao de embries bovinos considerado
um perodo crtico para a criopreservao dos blastocistos (Rizos et al, 2002) onde verificou que o cultivo in
vitro de zigotos produzidos in vivo, resultou em blastocistos com baixa tolerncia a criopreservao.
Entretanto, quando os zigotos produzidos in vitro foram cultivados em oviduto de ovelhas ate o estdio de
blastocistos, estes apresentaram melhor viabilidade apos o congelamento.
Quanto aos processos de criopreservao, as tcnicas mais utilizadas tem sido o congelamento
controlado e a vitrificao. A vantagem da vitrificao que esta evita os efeitos prejudiciais da formao de
cristais de gelo intra e extracelular, os quais danificam a membrana celular e as organelas. No entanto, para
evitar estes cristais necessrio uma alta concentrao de crioprotetores, assim como uma rpida curva de
congelamento e descongelamento, acarretando em danos celulares devido ao stress osmtico e toxicidade
qumica (Papadopoulos et al, 2002; Vagta et al, 1998).
Deste modo, o propsito desta reviso apresentar o efeito da criopreservao de embries bovinos
produzidos em diferentes sistemas de cultivo in vitro, comparando com os embries produzidos in vivo.
Tambm sero relatados os diferentes resultados obtidos a partir de embries in vitro congelados na presena
de vrios crioprotetores e curvas de congelao.

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RESUMOS
SELECIONADOS PARA

APRESENTAES
ORAIS

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SECREO DE INTERFERON-TAU EM EMBRIES BOVINOS PRODUZIDOS


IN VITRO CRIOPRESERVADOS
Araujo, M.C.C.1; Ferreira, A.M.3 ; S, W.F.3; Barreto Filho, J.B.4; Serapio, R.V.3,5;
Camargo, L.S.A.3 ; Silva, M.V.G.B.3; Vale Filho, V.R.2
Universidade Presidente Antnio Carlos UNIPAC, 2Escola de Veterinria da Universidade Federal de
Minas Gerais, 3Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria Embrapa Gado de Leite - Rua Eugnio do
Nascimento 570, Dom Bosco, Juiz de Fora, MG, 4Departamento de Medicina Veterinria da Universidade Federal de Lavras UFLA, 5 Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro - UENF
(Doutoranda) rserapis@yahoo.com.br
1

O interferon tau (IFN-) uma citocina produzida pelo embrio, que possui atividade antiluteoltica,
sendo responsvel pelo reconhecimento materno da gestao em ruminantes. As taxas de gestao obtidas
com embries fertilizados in vitro so menores que aquelas observadas com embries produzidos in vivo,
e decrescem ainda mais quando so congelados. O objetivo do trabalho foi de avaliar a interferncia da
criopreservao, estdio de desenvolvimento do embrio, tempo de ecloso e da qualidade do embrio,
sobre a secreo de IFN- por embries bovinos produzidos in vitro. Foram usados dois tratamentos: I)
embries no criopreservados (a fresco), II) embries criopreservados. Os embries na fase de blastocisto
(a fresco ou imediatamente aps o descongelamento dos criopreservados) continuaram a ser cultivados
individualmente por mais sete dias. Do meio de cultivo em que foram mantidos os blastocistos, retiraram-se
alquotas com 24, 72, 120 e 168 horas do incio do cultivo. Nas alquotas de 72 e 168 horas utilizou-se o
bioensaio de atividade antiviral para quantificar a produo de IFN- pelos embries cultivados pscongelamento e a fresco. Os resultados mostram que os embries congelados secretaram menos IFN- que
aqueles no criopreservados (P<0,05), pois as alquotas de 168 horas dos embries cultivados a fresco
apresentaram mais IFN- (P<0,05) que as de 168 horas dos embries que passaram pela criopreservao
.Verificou-se tambm que as alquotas do meio de cultivo de embries a fresco com 168 horas apresentavam
maior quantidade de IFN- (P<0,05) que aquelas com 72 horas. No houve diferena na secreo de IFN entre os embries que eclodiram at 48 horas e os que eclodiram entre 48 e 72 horas, no havendo
interao na secreo de IFN- entre os tratamentos e o tempo de ecloso. A qualidade dos embries (grau
I e II) e seu estdio de desenvolvimento (blastocisto e blastocisto expandido) no influenciaram na secreo
de IFN- quando avaliados dentro de cada tratamento e entre os tratamentos (P>0,05). Conclui-se que a
secreo de IFN- menor nos embries congelados em relao aos embries frescos. Esta diferena foi
mais acentuada no 14 dia de desenvolvimento (168 horas de cultivo). Este fato pode influenciar no
reconhecimento materno da gestao e o desenvolvimento do embrio ps-descongelamento.

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AUMENTO DA TAXA DE CONCEPO EM RECEPTORAS DE EMBRIO


BOVINO COM MAIORES CONCENTRAES PLASMTICAS DE
PROGESTERONA NO DIA DA INOVULAO
Reis, E.L.1; Marques, M.O.1; Carvalho, N.A.T.1; Nasser, L.F.1;
Costa Neto, W.P.2; Baruselli, P.S.1
1

Departamento de Reproduo Animal, FMVZ-USP, CEP 05508-000, So Paulo-SP, Brasil. 2Embrio


SC, Palmeral-MG, Brasil. - barusell@usp.br

A progesterona fundamental para o estabelecimento da gestao e desenvolvimento do embrio. No


entanto, os efeitos dos nveis plasmticos de progesterona sobre a concepo de fmeas bovinas ainda so
controversos. Este estudo retrospectivo teve como objetivo avaliar o efeito da concentrao plasmtica de
progesterona no dia 7 do ciclo estral sobre a taxa de concepo em receptoras Bos indicus x Bos taurus de
embrio bovino. Foram analisadas 542 transferncias de embries realizadas em 3 propriedades diferentes,
em um total de 4 rplicas. Os animais foram submetidos sincronizao do estro e da ovulao sem a
deteco de cio em todas as rplicas com exceo de uma, em que foram tratados com PGF2 e submetidos
a observao de cio. As receptoras foram submetidas a ultrassonografia ovariana 7 dias aps o estro. Nas
fmeas consideradas aptas a receber um embrio (presena de CL com dimetro >15mm) foram colhidas
amostras de sangue por venopunco para posterior dosagem da concentrao plasmtica de progesterona
por RIA. Os animais foram divididos em 5 grupos de acordo com a concentrao plasmtica de progesterona
(G0: 0 a 0,99; G1: 1,00 a 1,99; G2: 2 a 2,99; G3: 3 a 3,99; G4: 4 ng/ml). A taxa de concepo em cada
grupo foi analisada pelo teste de qui-quadrado, adotando-se 5% de nvel de significncia. No se verificou
interao entre as rplicas e os grupos. A taxa de concepo em cada rplica foi de 50,0% (111/222),
48,7% (79/154), 43,7% (55/126) e 30% (12/40). As taxas de concepo de acordo com a concentrao
plasmtica de progesterona foram 39,2% (40/102)a para o G1, 44,6% (70/157)ab para o G2, 46,0% (52/
113)ab para o G3, 55,7% (34/61)b para o G4 e 52,3%(57/109)b para o G4 (P<0,05). Os resultados indicam
efeito positivo do aumento das concentraes plasmticas de progesterona no dia 7 do ciclo estral sobre a
taxa de concepo em receptoras de embrio bovino. Estratgias para o aumento das concentraes
plasmticas de progesterona durante o diestro podem ser utilizadas para aumentar a eficincia reprodutiva de
programas de transferncia de embries.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

USO DE PROGESTERONA DE LONGA AO NA PREPARAO DE GUAS NOCICLANTES COMO RECEPTORAS DE EMBRIO


Rocha Filho A.N.1; Pessa M.A.2; Gioso M.M.1; Alvarenga M.A.1
1

Departamento de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria, FMVZ/UNESP, Botucatu-SP, 18.618000, Brasil. 2MP Reproduo Eqina, Bauru, SP, Brasil. - arochavet@hotmail.com

A utilizao de receptoras de embrio no-ciclantes tratadas com progestgenos prtica interessante


em programas comerciais, especialmente no incio da estao reprodutiva, quando o nmero de guas ciclantes
limitado. Estudos acerca do uso de progestgenos na preparao de guas ovariectomizadas (Hinrichs et
al., Equine Vet. J. Suppl., v.3, p.74-75) ou intactas em fase transicional (Carnevale et al., Theriogenology,
v.54, p.965-979) como receptoras de embrio se basearam no uso de progestgenos de curta ao e no de
progesterona injetvel de longa ao. O objetivo deste trabalho foi comparar, retrospectivamente, taxas de
prenhez e de morte embrionria precoce entre guas receptoras de embrio ciclantes e no-ciclantes
suplementadas com progesterona (P4) injetvel de curta ou longa ao. Durante trs estaes reprodutivas
consecutivas, de Abril a Outubro, 264 embries foram transferidos para guas ciclantes (controle, n=152)
ou no ciclantes (n=112) em um programa comercial de transferncia de embries no Brasil. Aps dois dias
de administrao de estradiol (10 mg/dia, i.m.; ECP; Pharmacia and Upjohn Co., Kalamazoo, Michigan,
USA), as guas no-ciclantes receberam por via intramuscular 200 mg/dia (Tratamento 1, n=54) ou 400 mg
a cada 2 dias (Tratamento 2, n=13) de P4 de curta ao (P4; Northside Pharmacy, Lexington, USA), ou
1500 mg de P4 de longa ao (P4 LA 150; B.E.T. Laboratories, Lexington, USA) a cada 7 (Tratamento 3,
n=30) ou 6 (Tratamento 4, n=15) dias. Os embries foram transferidos pela tcnica transcervical para
receptoras ciclantes 4 a 8 dias aps a ovulao e 5 a 8 dias aps o incio da suplementao com progesterona
para as guas no-ciclantes. Diagnstico de gestao foi realizado nos dias 12, 25 e 50 por ultra-sonografia
transretal. Os dados foram analisados por Qui-quadrado e a significncia estatstica indicada pela probabilidade
de P<0,05. As taxas de prenhez nos dias 12 (75,0, 75,9, 76,9, 76,6 e 73,3%) e 50 (61,8, 61,1, 61,5, 53,3
e 60,0%), bem como as de morte embrionria (17,5, 19,5, 20,0, 30,4 e 18,2%), foram similares (P>0,05)
para as guas controle e para os tratamentos 1, 2, 3 e 4, respectivamente, e entre as guas controle e todas
as no-ciclantes combinadas. Considerando-se as taxas de prenhez e de morte embrionria em receptoras
no-ciclantes, resultados similares (P>0,05) foram observados aps transferncias para receptoras
suplementadas com progesterona por 5 a 8 dias antes da transferncia, bem como aps transferncias realizadas
durante os meses de primavera e outono ou inverno. Adicionalmente, a administrao diria de P4 injetvel
de curta ao forneceu resultados similares (P>0,05) aos da administrao de uma alta dose (400 mg) em
dias alternados. O presente estudo demonstra a adequao do uso de receptoras no-ciclantes tratadas
com progesterona injetvel de longa ao por 5 a 8 dias antes da transferncia, evitando a grande mo-deobra e estresse animal resultantes das injees dirias de preparaes de curta ao.

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AVALIAO DA COLHEITA TRANSCERVICAL DE EMBRIES


OVINOS DA RAA SANTA INS*
Silva, J.C1; Quintela, A. 1; Andrade Moura, J.C. 1; Resende, J. 1;
Gordiano, H. 1; Martins, L.P.1; Chalhoub, M. 1; Ribeiro Filho, A. de L. 1; Gusmo, A.L1
1

Escola de Medicina Veterinria UFBA. (gusmao@ufba.br)

Um dos fatores que limitam a utilizao da TE em ovinos a dificuldade de serem realizadas colheitas
pelo mtodo no cirrgico, devido ao obstculo da transposio do canal cervical, j que este longo,
sinuoso e de dimetro reduzido nesta espcie (Habert, et al. Theriogenology, v.33, n.5, p. 977-992, 1990).
Com o objetivo de avaliar a eficincia da colheita transcervical de embries em ovelhas da raa Santa Ins,
44 animais foram submetidos a um programa de MOET, sendo superovulados com 200mg de FSHp
(Folltropin-V, Ventrepharm Inc., Canad) em aplicaes decrescentes a partir do 11 dia do programa e
inseminados laparoscopicamente com smen fresco 36 horas aps a retirada do progestgeno. As fmeas
foram divididas em trs grupos. O G1- grupo controle (n= 13) no recebeu nenhum tipo de tratamento para
dilatar o crvix, o G2 (n=17) recebeu uma aplicao de 50g de cloprostenol (Ciosin, Coopers, Brasil) 12
horas antes das colheitas, e no G3 (n=14) foi instilado 200g de misoprostol (Cytotec, Searle, Brasil) no
fundo de saco vaginal, cinco horas antes dos procedimentos. Estes medicamentos tinham como objetivo
provocar uma dilatao cervical, a fim de viabilizar a colheita no cirrgica. O grupo controle (G1) no
permitiu a passagem do cateter e foi dessa forma encaminhado colheita cirrgica, juntamente com as
fmeas que receberam dilatadores cervicais, e que mesmo assim no foi possvel a transposio cervical. Do
G2, 59% das doadoras foram colhidas transcervicalmente enquanto 50% das fmeas do G3 permitiram este
procedimento. Quanto resposta superovulatria, a quantidade de estruturas totais colhidas por doadora foi
de 6,1, 6,5 e 7,0, e a relao de embries viveis nos grupos foi de 3,7, 3,3 e 4,0, respectivamente para os
grupos G1, G2 e G3, mostrando no haver uma diferena significativa entre os grupos trabalhados, de
acordo com o programa de estatstica SPSS 11.0 (P> 0,05). Conclui-se com os trabalhos realizados que a
tcnica de colheita transcervical de embries de ovinos da raa Santa Ins possvel em ovelhas plurparas,
mas que existe uma grande variao individual no grau de complexidade na transposio cervical em um
mesmo grupo racial, mesmo utilizando para isso um dilatador cervical farmacolgico, e que o resultado da
colheita entre os grupos no diferiu, mostrando ser exeqvel a colheita transcervical de embries em ovelhas
Santa Ins em condies de campo.
*. Apoio: JICA Agncia Japonesa de Cooperao Internacional

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CRIOPRESERVAO E CULTIVO IN VITRO DE FOLCULOS


PRIMORDIAIS CAPRINOS ISOLADOS
Rodrigues, A.P.R.1; Costa, S.H.F.1; Santos, R.R.; Lucci, C.M.2; Nunes, J.F. 1;
Ohashi, O.M.3; Rondina, D. 1; Figueiredo, J.R. 1
1

Laboratrio de Manipulao de Ocitos e Folculos Pr-antrais LAMOFOPA, Faculdade de


Veterinria, Universidade Estadual do Cear, Fortaleza, CE, Brasil. 2Universidade de Braslia, Braslia,
DF, Brasil. 3Universidade Federal do Par, Belm, PA
Os objetivos deste estudo foram: 1) analisar a toxicidade do glicerol (GLI) versus etilenoglicol (EG), no
experimento 1, bem como do dimetilsulfxido (DMSO) versus propanodiol (PROH) no experimento 2,
em duas concentraes (1,5 M e 3 M) sobre folculos primordiais; 2) verificar a viabilidade desses folculos
aps os procedimentos de congelao/descongelao e, 3) verificar a viabilidade dos folculos primordiais
criopreservados aps 24 h de cultivo in vitro. Para isso, uma gota de 100 l de suspenso folicular
contendo os folculos primordiais isolados, frescos, expostos (teste de toxicidade) aos crioprotetores
(GLI, EG, DMSO ou PROH) ou criopreservados utilizando-se os crioprotetores anteriormente
mencionados foi adicionada de 5 l de azul de trypan e, observados ao microscpio invertido. A
percentagem de folculos primordiais viveis aps o teste de toxicidade, criopreservao e cultivo in vitro
foi avaliada pelo Qui-quadrado a 5% de probabilidade. Para o experimento 1, a percentagem de folculos
primordiais viveis aps o teste de toxicidade variou de 77,6% (GLI 3 M) a 88,8% (EG 1,5 M) e foi
similar (P>0,05) ao controle ou folculos frescos (97,0%). Resultados similares foram encontrados aps a
criopreservao, exceto para o GLI 3 M (64,8%). Aps 24 h de cultivo in vitro a percentagem de
folculos primordiais criopreservados em EG 3 M (46,8%) foi significativamente inferior aos folculos no
criopreservados (82,8%), bem como aos folculos criopreservados em GLI (64,0%) e EG (64,0%),
ambos a 1,5 M. Para o experimento 2, antes do cultivo in vitro, a percentagem de folculos primordiais
viveis aps o teste de toxicidade (78,0%: PROH 1,5 M a 84,0% : DMSO 3 M) e criopreservao foi
similar (P>0,05) ao controle (92,0%). Por outro lado, aps 24 h de cultivo in vitro, a percentagem de
folculos primordiais criopreservados em DMSO 1,5 M (63,0%) ou PROH 1,5 M (63,0%) foi
significativamente inferior aos folculos no criopreservados, porm expostos (70,0%: DMSO 1,5 M e
78,0% PROH 1,5 M) ou no (81,0%) aos crioprotetores. Concluindo, este estudo mostrou que folculos
primordiais criopreservados em GLI, EG, DMSO ou PROH na concentrao de 1,5 M resulta em
aproximadamente 50% de folculos viveis aps um curto perodo de cultivo in vitro.
Agradecimentos: Este trabalho foi financiado pelo CNPq e FUNCAP

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DESENVOLVIMENTO POTENCIAL DE EMBRIES BOVINOS APS


FERTILIZAO DE OVCITOS IN VITRO COM CATALASE E GnRH
Martins Jnior, A.1; Calegari, R.S.1; Freitas, C.P.1; Zanon, J.E.O.1; Paschoal. D.M.1
1

Departamento de Clnica, Cirurgia e Reproduo Animal, UNESP, Araatuba - SP, Brasil.


amartins@fmva.unesp.br

Estudos anteriores tm mostrado que o GnRH e a catalase adicionados aos meios de maturao e fertilizao,
respectivamente, aumentaram a produo de embries bovinos in vitro. O objetivo deste estudo foi avaliar
se a adio de GnRH e catalase ao meio de fertilizao poderia incrementar os ndices de clivagem e de
blastocisto. Ovcitos imaturos obtidos a partir de folculos com 2 a 7 mm de dimetro foram selecionados
para MIV aps lavagem em meio de maturao base (MM-b), composto de Meio 199 com 2.2 mg/mL de
bicarbonato de sdio, 50 g/mL de piruvato de sdio, 50 g/mL de sulfato de gentamicina, 1 mg/mL de
lcool polivinlico, 1 IU/mL de r-hFSH (Gonal-F; Serono) and 10% de SFB. O preparo do smen e a
inseminao foram realizados em m-DM; grupos de 15 a 20 oovcitos foram co-incubados com
espermatozides em gotas de 50 L de m-DM (modified-defined medium) na presena de catalase (100 g/
mL, Sigma Co.) e GnRH (Profertil, Tortuga), de acordo com o seguinte delineamento experimental: grupos I
= 0 g/mL; II = 0,01 g/mL; III = 0,1 g/mL; IV = 1 g/mL; V = 10 g/mL. Decorridas 5 horas da
inseminao, os zigotos foram cultivados em 3 etapas designadas como horas ps-inseminao; etapa 1 (5 a
72h), etapa 2 (72 a 144h) e etapa 3 (144 a 168h), em meio m-SOF+NEA sem glicose, mas com glutamina
(etapa 1) e com glicose e 5% de SFB, porm sem glutamina (etapas 2 e 3). Os ndices de clivagem (C, 72h)
e percentagens de mrulas/blastocistos (Mo/Bl,144h) e blastocistos/blastocistos expandidos(Bl/Bx, 168h)
so relatados baseados no nmero de ovcitos selecionados para maturao. ANOVA e o teste-t foram
utilizados para as anlises estatsticas. O ndice de clivagem foi maior (p<0,05) para o grupo V (82,1%) do
que para os grupos I ao IV (73,6, 74,1, 71,4 e 73,0%, respectivamente), com resultados similares entre
esses grupos. Nenhuma diferena foi observada no desenvolvimento para Mo/Bl entre os grupos IV e V
(76,6 vs. 77,7%) ou no desenvolvimento para Bl/Bx (42,3 vs. 40,2%). Ambos grupos IV e V produziram
mais (p<0,05) Mo/Bl e Bl/Bx do que os grupos I (61,8 and 27,3%, respectivamente), II (57,1 e 28,6%) e III
(59,8 e 30,3%), sendo que tais resultados no foram diferentes entre esses grupos. Os dados mostraram um
efeito embriotrfico aditivo da catalase e do GnRH quando adicionados ao meio de FIV e fornecem uma til
contribuio para melhorar a produo de embries bovinos in vitro. Contudo, outros experimentos so
necessrios para investigar diferentes combinaes entre esses compostos.
Apoio FAPESP (98/15727-1) e Central AltaVR, Araatuba-SP.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFEITOS DOS RETINIDES E DO IGF-I SOBRE A PRODUO DE


EMBRIES BOVINOS IN VITRO
Oliveira, M.A.L.1; Lima, P.F.1; Reichenbach, H.-D.2; Weppert, M.3; Cavalcanti Neto,
C.C.4; Pina, V.M.R.5; Santos, M.H. B.5; Lima-Verde, I.B.5
1

Departamento de Medicina Veterinria/UFRPE-Recife/PE, (maloufrpe@uol.com.br). 2Bayerische


Landesanstalt fr Landwirtschaft/Poing-OT Grub Germany. 3Bayerisches Forschungszentrum fr
Fortpflanzungsbiologie/ Oberschleissheim Germany. 4Departamento de Zootecnia/UFAL-Macei/AL.
5
Programa de Ps-Graduao em Cincia Veterinria/UFRPE-Recife/PE
Experimentos foram desenvolvidos para investigar os efeitos da adio do retinol e do cido retinico (AR)
no meio de maturao de ocitos e do IGF-I no meio de cultura de embries. A maturao in vitro foi
realizada em meio bsico de maturao (bMM), constitudo de TCM 199, piruvato de sdio (50 g/ml),
bicarbonato de sdio (2.6 mg/ml), sulfato de gentamicina (50 g/ml), lcool polivinlico (1 mg/ml), FSH (10
g/ml), retinol (0,3 M/ml) ou AR (0,5 M/ml). A cultura de embries foi efetuada em meio KSOM
suplementado ou no com IGF-I (50 ng/ml). No Grupo I, o bMM foi enriquecido com retinol e os presumveis
zigotos colocados em gotas de meio KSOM, por dois dias e, a seguir, embries com 2 a 4 clulas foram
transferidos para novo meio KSOM suplementado ou no com IGF-I, por mais nove dias. As propores
de blastocisto foram avaliadas atravs do X2 e o nmero total de clulas pelo t-test. A suplementao do
bMM com retinol e do meio KSOM com IGF-I (Grupo I) resultou no aumento (p < 0,05) do desenvolvimento
dos embries de 2-4 clulas para os estdios de blastocistos (bMM/retinol/KSOM: 20,18%; bMM/retinol/
KSOM/IGF-I: 35.16%), blastocisto expandido (bMM/retinol/KSOM: 15,4%; bMM/Retinol/KSOM/IGFI: 32,62%) e blastocisto eclodido (bMM/retinol/KSOM: 2,75%; bMM/retinol//KSOM/IGF-I: 15,45%)
quando comparado com ocitos/embries tratados com bMM/KSOM (blastocisto: 5,73%; blastocisto
expandido: 2,54%; blastocisto eclodido: zero) and bMM/KSOM/IGF-I (blastocisto 5,62%; blastocisto
expandido: 3,12%; blastocyst eclodido: 0,0%). No Grupo II, a suplementao do bMM com AR e do meio
KSOM com IGF-I elevou (p < 0,05) a porcentagem de embries (2 a 4 clulas) que se desenvolveram at
os estdios de blastocistos (bMM/AR/KSOM: 23,17%; bMM/AR/KSOM/IGF-I: 40,17%), blastocisto
expandido (bMM/AR/KSOM: 14.56%; bMM/AR/KSOM/IGF-I: 37,79%) e blastocisto eclodido (bMM/
AR/KSOM: 4.26%; bMM/AR/KSOM/IGF-I: 19,6%) quando comparado with ocitos/embries tratados
com bMM/KSOM and bMM/KSOM/IGF-I (Grupo I). A adio do retinol ou do AR ao bMM e do IGFI ao KSOM, aumentou (p < 0,05) o nmero de clulas embrionrias (bMM/retinol/KSOM: 71,087.61;
bMM/retinol/KSOM/IGF-I: 94,245.89; bMM/AR/KSOM: 74,915.89; bMM/AR/KSOM/IGF-I:
99,213.64) quando comparado com os grupos de ocitos/embries sem a adio dos retinides e IGF-I
(bMM/KSOM: 48,125.45; bMM/KSOM/IGF-I: 50,467.84). Os resultados permitiram concluir que a
adio de retinides ao meio de maturao de ocitos e de IGF-I ao meio de cultura de embries, aumenta
a produo de embries bovinos in vitro.

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UTILIZAO DE ESTUFA PORTTIL (LIFE) PARA PRODUO IN VITRO


DE EMBRIES BOVINOS
Siqueira-Pyles, E.S.C.1; Pedrazzi, C.A.F.2; Landim-Alvarenga, F.C.1

Departamento de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria FMVZ/UNESP, Botucatu - SP,


18618-000, Brasil. 2Ceafepe Tecnologia Veterinria Indstria e Comrcio Ltda, Brasil.
cesarpedrazzi@globo.com

O presente trabalho teve como objetivo testar um modelo de estufa porttil gaseificada (Life - Ceafepe
Tecnologia Veterinria Ltda -Brasil .) para a maturao de ovcitos e posterior fertilizao e cultivo in vitro
de embries bovinos. Foram utilizados ovrios de abatedouro para a obteno dos ovcitos, os quais foram
divididos aleatoriamente entre trs grupos: Gcontrole em placa, maturado em estufa convencional (Thermo
Forma); Gcontrole em criotubo, maturado em estufa convencional; e GLife em criotubo. Para a maturao in
vitro os ovcitos foram colocados em 400L de meio de maturao em placas Nunc (Gcontrole em placa)
ou em criotubos (Gcontrole em criotubo) em estufa convencional 38,5C em 5%CO2 em ar, ou em criotubos
cobertos com 300L de leo mineral na estufa Life 38,5C em 5%CO2, 5%O2 e 90% N2 durante 22
horas. Os ovcitos foram fertilizados (Dia D0) e aps 18 horas colocados em co-cultivo nas placas ou
criotubos de maturao na estufa convencional at o D7. A anlise estatstica foi realizada pelo teste de
Tukey para comparao de propores, com p<0,05. No D3 foram observadas taxas de clivagem de
69,5% (319/459) no Gcontrole em placa, 68,2% (90/132) no Gcontrole em criotubo e 73,0% (465/637) no
GLife em criotubo, as quais foram estatisticamente semelhantes. No D7 de cultivo foram observadas taxas
de produo de blastocistos de 28,6%a (63/220) no Gcontrole em placa, 40,4%ab (46/114) no Gcontrole em
criotubo e 47,5%b (210/442) no GLife em criotubo. O melhor ndice de produo de blastocistos com a
utilizao da estufa porttil Life pode estar relacionado atmosfera gasosa utilizada (5:5:90) que propicia
uma menor formao de radicais livres no meio de cultivo. Os presentes resultados demonstraram ser vivel
a utilizao da estufa porttil Life para maturao de ovcitos bovinos e posterior produo in vitro de
blastocistos.

Agradecimentos: FAPESP, Frigorfico FRIGOL e Profa. Ldia Raquel de Carvalho (Depto. Bioestatstica
IB/UNESP).

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PRODUO DE EMBRIES EM VACAS NELORE COM A UTILIZAO


ASSOCIADA DE FIV E TE
Nonato Jr., I.1; Rufino, F.A.2; Sanches, B.V.2; Pontes, J.H.F.1;
Uvo, S.1; Ereno Jr., J.C.1; Seneda, M.M.2
In Vitro Brasil Central de Biotecnologia da Reproduo- Mogi Mirim -SP. 2Departamento de Clnicas
Veterinrias , CCA, Universidade Estadual de Londrina, PR, 86051-990;

A produo in vivo de embries (TE) tem sido substituda pelo processo in vitro (FIV), em grande parte dos
programas de vacas zebunas. O objetivo deste trabalho foi analisar o uso associado destes dois mtodos na
obteno de embries na raa Nelore. Vinte e trs doadoras foram submetidas a 85 sesses de aspirao
folicular, com mdia de 3,7 por animal durante 4,6 meses. Foram realizadas 85 sesses de aspirao folicular,
totalizando 2270 ocitos viveis, com 840 embries transferidos. Obteve-se mdia de 26,7 ocitos e 9,9
embries por cada sesso de aspirao. Intercalados aos procedimentos de FIV, foram realizadas 35 colheitas
de embries, sendo em mdia 1,5 por animal em 2,6 meses. Duzentos e vinte e seis embries viveis foram
obtidos, com mdia de 6,4 transferidos por colheita. A taxa de prenhez para a FIV foi de 36,5 %, (310/849)
enquanto que na TE foi de 46,5% (105/226). Os embries obtidos in vivo viabilizaram maior percentual de
prenhez, e os resultados parciais dos exames ultra-sonogrficos tm mostrado uma melhor relao macho/
fmea. Os procedimentos de FIV resultaram em um maior nmero de embries produzidos, considerando o
perodo de tempo. A realizao das aspiraes foliculares aps as colheitas permitiu intervalo pequeno entre
as colheitas, pois a puno dos folculos constitui medida preventiva ao aparecimento de cistos foliculares.
Alm disso, a aspirao folicular constitui mtodo eficiente para controle da dinmica folicular, aumentando a
eficincia dos protocolos de superovulao. Os resultados sugerem que a associao das duas tcnicas
vantajosa, pois h agregao dos aspectos favorveis de cada uma delas.

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AVALIAO DA BIPARTIO COMO ALTERNATIVA PARA MELHORAR


OS NDICES DE GESTAO NA TRANSFERNCIA DE EMBRIES EQINOS
Silveira, L.L.1,2; Souza, R.V.2; Pimentel, C.M.1; Rumpf, R.2
1

Universidade de BrasliaUnB/ Faculdade de Agronomia e Medicina VeterinriaFAV, 70910-900,


Braslia-DF, Brasil; 2 EMBRAPA Recursos Genticos e Biotecnologia, Parque Estao Biolgica, 70770900, Braslia-DF, Brasil. silveiraleo@hotmail.com
A transferncia de embries (TE) j vem sendo utilizada em eqinos h pelo menos duas dcadas, sempre a
partir de ovulao simples. A baixa eficincia dos protocolos de superovulao em eqinos, refora a
necessidade de avaliao de tcnicas capazes de aumentar o nmero de potros por doadora ano. O presente
estudo avaliou a bipartio embrionria neste contexto. Foram utilizadas 21 guas de diferentes padres
raciais, com idade variando entre 4 e 15 anos de idade, pesando entre 270 a 480 kg. A partir da identificao
do cio (rufiao), os animais foram acompanhados atravs de exames ultrassonogrficos trans-retais (Aloka
500) at o momento da ovulao, sendo que as receptoras, 1 vez ao dia e as doadoras 3 vezes ao dia. As
receptoras utilizadas ovularam um dia antes ou at trs dias depois das doadoras. As doadoras foram coletadas
entre 144 e 156 horas aps a ovulao (D0). Foram recuperados 20 mrulas em 29 coletas (68,96%),
sendo que 10 embries foram transferidos inteiros (T1), e 10 embries foram bipartidos (T2), originando 20
hemi-embries e transferidos para 20 receptoras. No houve diferena na taxa de prenhez entre os grupos,
T1, 70% (7/10), e T2, 50% (10/20) (p> 0,05). Em relao ao nmero inicial de embries em cada grupo
(10), houve diferena na taxa de prenhez entre os grupos, T1, 70% (7/10) e T2, 100% (10/10) (p< 0,05).
Estes resultados indicam um incremento no nmero de gestaes obtidas quando utilizada a tcnica de
bipartio embrionria na transferncia de embries eqinos em funo do nmero inicial de embries
coletados. Desta forma esta tcnica pode melhorar os ndices de produo de animais de qualidade superior.
Apoio financeiro: Embrapa/CNPq

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

RESUMOS
SELECIONADOS PARA

COMPETIO DE
ESTUDANTES

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

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INDUO DA PUBERDADE E SINCRONIZAO DO ESTRO COM


PROGESTERONA, BENZOATO DE ESTRADIOL, GNRH E ECG
EM NOVILHAS PR-PBERES DA RAA NELORE
Tetzner, T.A.D.1 ; Diniz, E.G.1; Jacomini, J.O.1; Peres, R.F.G.1; Amorim, L.L.1
1

Faculdade de Medicina Veterinria - FAMEV/UFU, Uberlndia-MG, 38400-714, Brasil.


tatianevet@hotmail.com

O presente trabalho objetivou verificar a induo da puberdade, sincronizao e fertilidade do estro em


novilhas pr-pberes da Raa Nelore. O experimento foi conduzido na fazenda Capim Branco da Universidade
Federal de Uberlndia, no perodo compreendido entre setembro de 2003 a maro de 2004. As novilhas
possuam de 14 a 16 meses de idade, peso mdio de 242,45 Kg e escore corporal entre 4 a 6 (escala de 1
a 9), divididas aleatoriamente em Grupo 1 (G1) (n = 20): insero de DIB (DIB) + aplicao de 2 mg de
benzoato de estradiol (BE) IM (Estrogin) no Dia 0; no Dia 9 remoo do DIB; aps 24 horas aplicao de
1,0 mg de BE IM; IA com observao de estro, Grupo 2 (G2) (n = 20): insero de DIB no Dia 0; no Dia
9 remoo do DIB e aplicao de 50 g de Lecirelina IM, anlogo de GnRH (Gestran Plus); IATF 36 horas
aps; Grupo 3 (G3) (n = 20): aplicao de 200 UI de eCG IM (Novormon 5000) no Dia 0; aplicao de
50 g de Lecirelina IM, no dia 9; IATF 36 horas aps, Grupo 4 (G4) (n = 20): somente observao de estro.
As avaliaes ovarianas e o diagnstico de gestao foram realizados via palpao retal e ultra-sonografia
(Scanner 100 Pie Medical). Baseado nas mensuraes dos dimetros dos ovrios e do maior folculo presente
antes dos tratamentos verificou-se que no houve diferena estatstica entre G1, G2, G3 e G4 (P<0,05), mas
houve diferena aps os tratamentos entre o G4 e os demais grupos. Houve diferena estatstica antes e aps
os tratamentos dentro do mesmo grupo, com exceo do G4. As taxas de estro (Te) e de concepo (Tc)
foram para o G1 de 90% para Te (18/20) e de 65% para Tc (13/20), para o G2 de 65% para Te (13/20) e
de 40% para Tc (08/20), para o G3 de 35% para Te (07/20) e de 15% para Tc (03/20) e para o G4 zero
para Te e Tc. Verificou-se diferena estatstica (P<0,05) para todos os casos, com exceo para Tc entre G1
e G2. Pode-se concluir que possvel antecipar a puberdade de novilhas, com estros frteis e taxas de
concepo satisfatrias.

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OTIMIZANDO O NMERO DE RECEPTORAS SINCRONIZADAS COM


PROTOCOLO OVSYNCH
Beltrame, R.T.1; Barioni, L.G.2; Veloso, R.V.2; Saueressig, M.G.2.
1

Mdico Veterinrio, aluno do curso de Ps Graduao em Produo Animal LMGA CCTA UENF, 2 Pesquisadores da Embrapa Cerrados Rod. Braslia Fortaleza BR 020 Km 18 Planaltina DF - Brasil CEP: 73301-970; Email: beltrame@terra.com.br
A tcnica de transferncia de embries (TE) em bovinos se desenvolveu rapidamente na pecuria nacional
nos ltimos 30 anos. Com ela surgiu uma nova ferramenta de melhoramento, acelerando o ganho gentico
mesmo em pequenas propriedades. Porm, a utilizao da tcnica ainda limitada, visto sua relao custobenefcio. O controle gerencial, visando estabelecimento de banco de dados, e a escassez de receptoras
aptas, essenciais no desenvolvimento da biotcnica, so os principais entraves ao desenvolvimento de ndices
e estgios econmicos mais rentveis. Um meio de melhorar a viabilidade econmica da TE em bovinos
seria explorar o uso das tcnicas de sincronizao de estro e utilizao de receptoras e doadoras bovinas,
atravs da elaborao de um software aplicado a biotcnica da transferncia de embries. Desta forma,
simulaes, usando a tcnica de Monte Carlo e anlises de sensibilidade, foram realizadas para uma avaliao
ex-ante da relao tima entre o nmero de receptoras e doadoras da raa Simental (razo R/D) em programas
de transferncia de embries. O menor custo por prenhez foi adotado como critrio para a deciso sobre o
nmero ideal de receptoras. Considerou-se o protocolo Ovsynch como o protocolo de sincronizao das
receptoras e custos de medicamentos, vacinas, honorrios e outros insumos baseados em preos de mercado
praticados em agosto de 2002. A anlise foi aplicada a dois casos: (1) determinista, no qual considerou-se
o nmero de embries produzidos em cada coleta como igual mdia esperada, isto : = 6,s = 0; (2)
estocstica com congelamento, no qual o nmero de embries por doadora foi gerado para cada coleta
assumindo distribuio normal ( = 6,s= 0) e ausncia de covarincia entre coletas. Para cada caso, adotaramse coletas mensais de embries e um perodo de simulao de 24 meses, considerando um rebanho de 100
receptoras, mantido constante pela aquisio de novos animais. Para o segundo caso as simulaes foram
realizadas 50 vezes, permitindo estimar a mdia, o desvio padro do nmero de prenhezes e o custo
correspondente. Concluiu-se com base nas simulaes do caso (2) que o custo mnimo por prenhez atingido
com a utilizao da razo R/D 16,7 para a situao estudada. A baixa eficincia do protocolo de sincronizao
leva a estimativas minimas de custo, superiores s apresentadas previamente por trabalho similar. Ainda
observou-se que a desconsiderao da variabilidade na produo de embries na anlise determinista (caso
1) repercutiu em: (a) estimativa equivocada da razo R/D tima promovendo potencial aumento do custo por
prenhez; e (b) superestimativa do nmero de prenhezes por doadora, com consequente subestimativa do
custo por prenhez no programa de TE.

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AVALIAO DA MORFOLOGIA CITOPLASMTICA DE OVCITOS EQINOS


MATURADOS IN VITRO EM DIFERENTES CONDIES DE CULTIVO
Fernandes, C.B.1; Siqueira-Pyles, E.S.C.1 ; Peres, K.R.1; Ponchiroli, C.B.1; Cordeiro Jr., F.2;
Alvarenga, M.A.1; Landim-Alvarenga, F.C.1
1

Dep. Reproduo Animal FMVZ - UNESP, Botucatu, Brasil, 2Universidade Estadual de Maring,
Maring, Brasil. fernandescb@yahoo.com.br

O objetivo deste experimento foi avaliar a ultraestrutura de ovcitos eqinos maturados em meio TCM 199,
SOFaa e HTF:BME (1:1) acrescido de FSH eqino (eFSH), bovino (bFSH) e de Hormnio do Crescimento
Eqino (eGH), comparando com ovcitos eqinos imaturos. Cada grupo de 150 ovcitos obtidos de ovrios
de abatedouro foram maturados por 36 a 40 horas 38,5 C em atmosfera de 5% de CO2 em ar (5
repeties) divididos em 5 grupos. GTCM: TCM-199 + L-glutamina, piruvato de sdio, cisteina, taurina,
cisteamina, 8mg/ml BSA, 50ng/ml EGF, 500ng/ml E2 (todos Sigma, St. Louis) and 5g/ml bFSH (FoltropinV, Vetepharm, Canada); GSOF: SOFaa acrescido dos mesmos fatores do GTCM; GbFSH: HTF:BME
(1:1) acrescido dos mesmos fatores do GTCM; GeFSH: HTF:BME (1:1) acrescido dos mesmos fatores do
GTCM + 5 g/ml eFSH (Bioniche, EUA); GeFSH+eGH: HTF:BME (1:1) acrescido dos mesmos fatores
do GTCM + eFSH + 100 ng/ml eGH (EquiGenTM, BresaGen, EUA). A avaliao da maturao nuclear foi
realizada em Hoechst 33342 e analisada por meio da ANOVA. A avaliao da morfologia citoplasmtica foi
realizada em cortes ultra-finos por meio da Microscopia Eletrnica de Transmisso. No houve diferena
estatstica significativa entre as taxas de maturao nuclear para os grupos, sendo 13,8%, 23,8%, 29,2%,
25,8% e 29,8% para GTCM, GSOF, GbFSH, GeFSH e GeFSH+eGH, respectivamente (p=0,095). Na
anlise da ultraestrutura a principal caracterstica dos ovcitos imaturos examinados foi a grande quantidade
de mitocndrias por todo o ovoplasma, associadas gotas de lipdeos, aos complexos de Golgi e ao retculo
endoplasmtico liso. Os complexos de Golgi apresentaram-se na periferia do ovoplasma, circundados por
grnulos corticais. No interior do espao perivitelnico foram observadas junes do tipo gap. Na anlise
ultraestrutural dos ovcitos maturados por 36 a 40 horas nos grupos TCM e SOF os grnulos corticais
foram observados tanto na regio central do ovoplasma como na periferia, com tamanho e eletron-densidade
varivel. Na maioria dos ovcitos estudados nestes grupos, pde-se observar que o espao perivitelnico se
encontrava preenchido por grande quantidade de restos e junes celulares. A anlise citoplasmtica mostrou
que os ovcitos cultivados em HTF:BME acrescido de bFSH, eFSH e eFSH+eGH apresentaram uma
menor quantidade de restos celulares no espao perivitelnico, bem como uma distribuio dos grnulos
corticais mais homognea e alinhada prximo a membrana externa do ovcito, mais evidente no grupo eFSH.
Na anlise ultraestrutural os ovcitos maturados em meio TCM 199 e SOFaa, apresentaram sinais de maturao
citoplasmtica incompleta, e exibiram caractersticas de reao cortical prematura. A utilizao do meio
HTF:BME, aparentemente, foi benfica morfologia citoplasmtica e a adio de eFSH ao meio HTF:BME,
resultou em uma melhora significativa na morfologia citoplasmtica.
Agradecimentos: FAPESP e Frigorfico Rei do Gado, Santa-F-PR, Brasil.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

PRODUO DE EMBRIES BOVINOS POR INJEO INTRACITOPLASMTICA


DE ESPERMATOZIDE LIOFILIZADO. RESULTADOS PRELIMINARES
Martins, C.F.1,2; Dode, M.A.N.2; Pereira, D.C.2; Rumpf, R.2
1- Doutorando do Programa de ps-graduao em Biologia Molecular-UnB, 2- Pesquisador Embrapa
Recursos Genticos e Biotecnologia - fredmartins@yahoo.com
Recentemente, a liofilizao tem sido aplicada para preservar espermatozides mamferos. O processo de
liofilizao ainda agressivo, provocando grandes perdas estruturais nos espermatozides, mas eles podem
gerar embries se utilizados pela tcnica de injeo intracitoplasmtica de espermatozide (ICSI). O objetivo
deste trabalho foi comparar dois tratamentos de liofilizao na produo de embries bovinos por ICSI.
Para isso, espermatozides frescos foram diludos em dois meios de liofilizao: T1 (TCM 199 Hanks +
10% de SFB) e T2 (TCM 199 + 10% de soro fetal + 0.2 M de Threalose). As amostras foram tratadas
como em um congelamento convencional, e em seguida estas amostras permaneceram 12 horas a baixa
temperatura (-43 C) e alto vcuo no liofilizador Labcanco, at a sublimao do gelo. As amostras foram
avaliadas e armazenadas em temperatura ambiente at seu uso. Antes das ICSI, os ovcitos foram maturados
por 22 horas, desnudos e selecionados de acordo com a presena do primeiro corpsculo polar. A ICSI foi
realizada com espermatozides do Tratamento T1(TCM 199 Hanks + 10% de SFB), T2 (TCM 199 + 10%
de soro fetal + 0.2 M de Threalose), congelado (T3=controle) e sem clula (T4=controle). Aps 1 hora da
ICSI, os ovcitos foram incubados em ionomicina por 5 minutos, cultivados em SOF por 3 horas e finalmente
incubados em 6-DMAP por 4 horas.. O cultivo definitivo foi realizado em SOF com cocultura de clulas do
cmulus por 7 dias. Alguns ovcitos de cada tratamento foram fixados overnight em metanol e cido actico
e corados com lacmide 1% para avaliao de descondensao de cabea e formao pr-nuclear. Os
resultados relacionados com a estrutura espermtica aps liofilizao foram semelhantes aos encontrados
por outros autores, porm, em mdia 95% dos espermatozides nos dois tratamentos tiveram sua estrutura
acrossomal preservada. Em todos tratamentos foram observadas descondensao e formao pr-nuclear,
indicando participao do gameta masculino. As taxas de clivagem foram 36,70 %; 48,12%; 51,23% e
40%, respectivamente para ICSI de T1, T2, T3 e T4. A produo de blastocistos foram 9,49%, 15.62%,
17,28% e 10,8%, respectivamente para ICSI de T1, T2, T3 e T4. O destaque destes resultados foi que a
ICSI T2 no apresentou diferena significativa (P<0.05), em relao a ICSI com espermatozide congelado
(controle). Os resultados sugerem que os espermatozides bovinos liofilizados podem gerar desenvolvimento
embrionrio e a threalose parece apresentar efeito benfico neste processo.
Apoio financeiro: Embrapa/ CNPq

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

IDENTIFICAO DA EXPRESSO DIFERENCIAL DA PI3K EM OCITOS


E EMBRIES BOVINOS VIA DIFFERENTIAL DISPLAY PCR (DDPCR)
Ripamonte, P.1; Emanuelli, I.P.1; Mesquita, L.G.1; Cortezzi, S.S.1; Biase, F. H.3;
Merighe, G.K.F.1; Caetano, A.R.2; Meirelles, F.V.1
1

FZEA/USP, Laboratrio de Morfofisiologia Molecular e Desenvolvimento, Pirassununga SP, 13635970 Brasil. 2EMBRAPA Recursos Genticos e Biotecnologia Braslia, DF-Brasil. 3 FMRP/USP
Departamento de Gentica Ribeiro Preto SP Brasil. paular@fzea.usp.br

Visando identificar genes associados ao desenvolvimento, bloqueio ou morte embrionria, trs grupos de
embries bovinos produzidos in vitro foram selecionados: grupo R8 (embries 8 clulas s 48 hpi e alto
potencial de desenvolvimento), L4 (4 clulas s 48 hpi) e L8 (8 clulas s 90 hpi), ambos com baixa taxa de
desenvolvimento a blastocisto. O RNA foi extrado de grupos de 50 embries e foi submetido a anlise via
DDPCR (Differential Display PCR), em triplicata, com 3 primers ncora e 20 aleatrios. Os produtos
amplificados foram separados em gel de poliacrilamida desnaturante 6,5%. Os fragmentos diferencialmente
expressos entre os grupos de embries rpidos e lentos foram isolados do gel, reamplificados e seqenciados.
Foram obtidos 176 fragmentos expressos diferencialmente, sendo 42% presentes em embries R8, 28,2%
em embries L8 e 10,3% em L4, 10,9% presentes somente em embries R8 e L4, e 6,9% e 1,7% apenas
ausentes em R8 e L4, respectivamente. Estes resultados confirmam que um grande nmero de transcritos
est sendo expresso no momento da ativao do genoma embrionrio, em associao ao desenvolvimento
ou bloqueio. Nos 23 fragmentos sequenciados identificou-se um transcrito presente em embries L4,
posteriormente confirmado nos demais grupos, com seqncia similar subunidade cataltica da
Fosfatidilinositdeo 3-Kinase (PI3K). Visando a continuidade da carcterizao do gene identificado via
DDPCR, a presena de mRNA da PI3K foi testada em grupos de 50 ocitos de qualidade A (cumulus
completo e compacto), B (cumulus parcial e compacto), C (cumulus expandido) e D (ausncia de cumulus).
Os ocitos foram desnudados com Hialuronidase aps a separao em cada grupo. O RNA extrado foi
reversamente transcrito e utilizado em reaes de PCR. Foram amplificados um fragmento correspondente
PI3K de 453pb e duas possveis isoformas de 350 e 290pb, aproximadamente. Pde-se observar que com
a diminuio da qualidade do ocito a proporo entre os diferentes fragmentos amplificados alterada,
resultando em um aumento da freqncia relativa da banda de 453pb nos ocitos de qualidade D. As PI3Ks,
so responsveis por vrios processos biolgicos, agindo como mediadores na maturao do ocito e tambm
em processos associados sinalizao anti-apopttica. Nossa hiptese que o nvel de expresso da PI3K
em ocitos pode estar correlacionado com um mecanismo de proteo anti-apopttico. Os fragmentos
esto sendo seqenciados para a melhor caracterizao e avaliao do modelo proposto.
Apoio financeiro: FAPESP.

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AMPLIFICAO DE cDNA DE OCITOS BOVINOS


Biase, F.H.1, Mingoti, G.Z.2, Ripamonte, P.3, Cortezzi, S.S.3, Merighe, G.K.F.3,
Martelli, L.1, Meirelles. F.V.3
1

Departamento de Gentica - FMRP/USP, Ribeiro Preto-SP, 14049-900, Brasil. 2 Departamento de


Apoio, Produo e Sade Animal - FMV/UNESP, Araatuba-SP, 16050-680, Brasil. 3 Departamento de
Cincias Bsicas - FZEA/USP, Pirassununga-SP, 13635-970, Brasil. biase@genbov.fmrp.usp.br
A quantidade de RNA mensageiro (RNAm) presente em ocitos ou embries tem sido limitante em tcnicas
que investigam a expresso gnica em larga escala, como construo de bibliotecas, hibridizao em arranjos
de cDNA, hibridizao subtrativa, entre outras. O objetivo desse trabalho foi aplicar a tcnica de amplificao
de cDNA completo (acDNA) em ocitos bovinos. RNAm foi extrado de 50 ocitos maturados e 50 ocitos
no maturados (~1g de RNAm) e submetido reao de transcrio reversa com primers oligo(dT). A
reao foi purificada por coluna de separao de cidos nuclicos. s extremidades 3 do hbrido cDNA/
RNAm foram adicionados dGTPs (~25nucleotdeos) em reao catalisada pela enzima Terminal Transferase.
O cDNA foi amplificado por PCR com primers oligo(dT12) e oligo(dC12) por 20 ciclos, em 50L de volume
final. O produto amplificado foi dividido em 4 novas reaes com as mesmas condies e primers da anterior,
por mais 20 ciclos, em 50L de volume final. A qualidade do cDNA amplificado foi avaliada por eletroforese
de 15L da reao em gel de agarose, corado com brometo de etdio. Para testar a eficincia do sistema,
uma amostra da reao foi diluda 20 vezes e utilizada para amplificar, por PCR, cDNA de genes de expresso
constitutiva e de baixa ocorrncia. Foi possvel observar amplificao de fragmentos de acDNA variando de
100 a 1800 pares de bases. Os genes GAPDH, BAX, BCL2, PI3K e MATER foram amplificados por PCR
a partir do equivalente a 0,025 ocitos. Esses resultados demonstram a viabilidade da amplificao do
cDNA de ocitos e que esta estratgia pode ser aplicada em tcnicas que avaliam qualitativamente a expresso
gnica em uma amostra limitada de ocitos ou embries. Pretende-se, futuramente, padronizar a amplificao
de cDNA para aplicao em mtodos de avaliao quantitativa da expresso gnica.
Apoio Financeiro: FAPESP:99/12351-3, CAPES e FAEPA/FMRP.

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RESUMOS

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DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE EMBRIES BOVINOS DE M QUALIDADE


EM TRS DIFERENTES MEIOS DE CULTURA*

Alvarez, R.H.2; Pires, R.M.L.2; Martinez, A.C.2; Meirelles, F.V.3


2

Instituto de Zootecnia-APTA, Nova Odessa-SP, 13460-000, Brasil. 3 Depto de Cincias BsicasFZEA-USP, Pirassununga-SP, Brasil. herrera@iz.sp.gov.br

Os embries bovinos de m qualidade (Grau 3) representam, em mdia, de 10 a 15% dos embries produzidos
por vacas superovuladas, sendo normalmente descartados. No caso de serem transferidos, a taxa de prenhez
raramente ultrapassa 15%. O presente estudo objetivou avaliar a capacidade de desenvolvimento desses
embries em trs meios de cultura. Mrulas Grau 3, colhidas de doadoras superovuladas no stimo dia aps
a inseminao, foram cultivadas nos meios CR-2 (n=10), Holding Plus (n=10) e Earle + 10% de soro fetal
bovino (SFB) (n=10) durante 48 horas em estufa com ambiente controlado (38,5 oC e 5% CO2). A taxa de
desenvolvimento at blastocisto, aps 24 horas, foi de 60% no meio CR-2, de 50% no Holding Plus e de
60% no Earle + SFB, respectivamente (P>0,05). Somente os embries que evoluram a blastocisto continuaram
seu crescimento aps 24 horas de cultura. Aps 48 horas de cultura, 40% (CR-2), 30% (Holding Plus) e
50% (Earle + SFB) dos embries eclodiram ou estavam em processo de ecloso. Esses resultados mostram
que aproximadamente 50 a 60% dos embries de m qualidade podem continuar seu desenvolvimento in
vitro, mesmo em meios de cultura mais simples. Falta por demonstrar se esses embries, morfologicamente
normais, so capazes de continuar seu desenvolvimento aps a transferncia para receptoras.

* Apoio FAPESP

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ASSOCIAO DE ROSCOVITINA E ANTIOXIDANTES NA MATURAO


NUCLEAR IN VITRO DE OCITOS BOVINOS
Barretto, L.S.S.1; Tavares, D.C.2; Perecin, F.1; Mingoti, G.Z.3
1

DMVPRA, FCAV-UNESP, Jaboticabal-SP, Brasil. 2 Mdica Veterinria Autnoma, Ribeiro Preto-SP,


Brasil. 3 DAPSA, FMVA-UNESP, Araatuba-SP, Brasil. E-mail: leticiabarretto@ig.com.br

A roscovitina, uma purina conhecida especificamente por inibir a atividade do MPF em numerosos sistemas
celulares, mantm ocitos bovinos no estdio de vescula germinativa. Os antioxidantes (cisteamina e mercaptoetanol) protegem as clulas do estresse oxidativo nos meios de cultivo. Objetivamos avaliar os
efeitos da roscovitina, cisteamina e -mercaptoetanol na cintica da maturao nuclear in vitro de ocitos
bovinos. Ocitos (n=606) foram maturados a 38,7oC em atmosfera de 5% CO2 em ar em meio TCM-199
suplementado com 0,3% BSA, 0,5 g FSH, 100 UI hCG e 1 g estradiol/ml (controle), adicionado de 25
M de roscovitina (Rosc), 25 M de roscovitina + 50 M de cisteamina (Rosc+Cist) e 25 M de roscovitina
+ 50 M de -mercaptoetanol (Rosc+Merc). Os ocitos em meio suplementado com roscovitina foram prmaturados por 24 horas, e depois transferidos para gotas com meio controle para maturao. Aps 8, 16 e
24 horas do incio de maturao, os ocitos foram corados com Hoescht 33342 para avaliao da maturao
nuclear. Os dados foram analisados por ANOVA (P<0,05). Com 8 horas do incio de maturao, os ocitos
apresentaram-se em metfase I em 41,18% (controle), 39,02% (Rosc), 47,06% (Rosc+Cist) e 43,48%
(Rosc+Merc). Aps 16 horas de maturao, observou-se a fase de anfase I/ telfase I em 30,77%
(controle), 31,37% (Rosc), 35,29% (Rosc+Cist) e 36,36% (Rosc+Merc). s 24 horas de maturao, os
ocitos apresentaram-se em metfase II em 58,62% (controle), 51,06% (Rosc), 37,74%ab (Rosc+Cist) e
20%b (Rosc+Merc). O meio suplementado com roscovitina e -mercaptoetanol foi mais eficiente no atraso
da maturao nuclear ao final das 24 horas, sendo semelhante ao meio com roscovitina e cisteamina, que no
diferiu dos meios controle e roscovitina. Verificou-se, portanto, a reverso do bloqueio da progresso da
meiose aps a remoo do meio com roscovitina.
Apoio Financeiro: FAPESP

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AVALIAO DE UM SISTEMA DE CULTIVO DE EMBRIOES BOVINOS


PRODUZIDOS IN VITRO
Miranda, M.S.1; Amarante, M.2; Cordeiro M.S.1; Biondi, F.C.1; Sousa, J.S.; Ohashi, O.M.1
1

Laboratrio de Fertilizao In vitro CCB UFPA Belm-PA; 2 Central Gentica Campo de Boi
Ipixuna PA. moyses@ufpa.br

O objetivo deste trabalho foi avaliar um sistema artesanal de cultivo de embries bovinos para reduzir o
custo de produo. O sistema consiste de um recipiente cilndrico de acrlico com tampa superior, parcialmente
mergulhado em banho Maria 39C, conectado a um cilindro contendo mistura gasosa (5% CO2, 5% O2 e
90% N2). A composio da atmosfera gasosa foi criada pela injeo da mistura durante 5 minutos diariamente
ou quando da abertura do recipiente. No Experimento 1, os ovcitos foram desnudados com hialuronidase
e ativados partenogeneticamente com Ionomicina e 6-DMAP (Susko-Parrish et al.,1994; Susko-Parrish
Dev. Biology, 166, 729). No Experimento 2 os ovcitos foram maturados e fecundados in vitro. Em ambos
os experimentos, os ovcitos foram selecionados e maturados in vitro em TCM-199 suplementado com
FSH, LH e 10 ng/ml de fator de crescimento epidrmico (EGF) em estufa com 5% CO2 e mxima humidade
durante 24h. A fecundao in vitro foi realizada em estufa com 5% de CO2 durante 18h. Aps a ativao ou
a fecundao, os ovcitos de cada grupo foram divididos aleatoriamente em dois grupos: CONVENCIONAL
e EXPERIMENTAL. No grupo CONVENCIONAL, foram cultivados em meio CR2 suplementado com
BSA e 10% de SFB (Wang et al., 1997; Wang, Ani.Repr.Sci 48,37) em estufa com 5% de CO2. No grupo
EXPERIMENTAL, foram cultivados em meio SOF (Holm et al., 1999; Holm Theriogenology, 52, 683)
suplementado com BSA e 5% SFB. Nos quatro grupos, a taxa de clivagem foi avaliada no segundo dia e de
desenvolvimento embrionrio (morulas e blastocistos) no stimo dia de cultivo. Os resultados do Experimento
1 mostraram que no houve diferena estatstica significativa quanto ao desenvolvimento embrionrio entre
os grupos CONVENCIONAL e EXPERIMENTAL (32,5% vs. 37,6% respectivamente; p>0,05), assim
como no Experimento 2 para os grupos CONVENCIONAL e EXPERIMENTAL (32,1% vs. 29,8%
respectivamente; p>0,05). Estes resultados mostram que possvel cultivar eficazmente embries bovinos
produzidos in vitro de forma alternativa e cerca de 20X mais barata que o convencional. Esto realizando
estudos para avaliar a qualidade dos embries produzidos no sistema experimental e a eficcia do sistema
nas outras etapas do processo de produo in vitro de embries, como a maturao e a fecundao.
Apoio Financeiro: FINEP, CAPES, CNPq, SECTAM, Central Gentica Campo de Boi.

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EFEITOS DO IBMX (3 ISOBUTIL, 1 METIL-XANTINA) SOBRE A MATURAO


NUCLEAR DE OCITOS BOVINOS IN VITRO
Tavares, D.C.1; Barretto, L.S.S.2; Mingoti, G.Z.3
1

Mdica Veterinria Autnoma, Ribeiro Preto-SP, Brasil.2 DMVPRA, FCAV-UNESP, Jaboticabal-SP,


Brasil. 3 DAPSA, FMVA-UNESP, Araatuba-SP, Brasil. E-mail: dctavares@aol.com.br

Inibidores da fosfodiesterase, como o IBMX, inibem reversivelmente a maturao nuclear de ocitos, mantendo
estacionado o estdio de vescula germinativa. Desta forma, estes podem ter a oportunidade de adquirir uma
grande competncia no desenvolvimento, j que h mais tempo para aquisio da maturao do citoplasma.
Para avaliar os efeitos do IBMX sobre a maturao nuclear, ocitos bovinos (N=458) foram maturados in
vitro (MIV) em meio TCM199 bicarbonato suplementado com 0,3% de BSA, 100 UI de hCG, 0,5 g de
FSH e 1 g de estradiol/mL (Controle), adicionado de 0,5 mM de IBMX (IBMX), 0,5 mM de IBMX + 50
M de Cisteamina (IBMX+C) ou 0,5 mM de IBMX + 50 M de -Mercaptoetanol (IBMX+ME). Os
ocitos em meio suplementado com IBMX foram pr-maturados por 24 horas e depois transferidos para
gotas com meio controle para maturao. Aps 8, 16 e 24 horas do incio do cultivo de maturao, os
ocitos foram corados com Hoescht 33342 para avaliao da maturao nuclear. Os dados foram analisados
por ANOVA (P<0,05). Aps 8 horas do incio do cultivo de maturao, o nmero de ocitos em Metfase
I foi: C= 43,69%, IBMX = 18,73%, IBMX+C = 16,45% e IBMX+ME = 26,90%. Com 16 horas, o
percentual de ocitos em Anfase I/ Telfase I foi: C = 44,71%, IBMX = 40,83%, IBMX+C = 46,42%
e IBMX+ME = 36,16%. Aps 24 horas, o percentual de ocitos em Metfase II foi: C = 51,58%, IBMX
= 19,16%, IBMX+C = 57,71% e IBMX+ME = 34,57%. Os tratamentos suplementados com IBMX,
IBMX+C e IBMX+ME no apresentaram resultados significativos quando comparados ao controle. Concluise que o inibidor IBMX no interferiu na cintica da maturao meitica mesmo quando associado aos
antioxidantes cisteamina e -mercaptoetanol.
Apoio Financeiro: FAPESP

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AVALIAO DA FRAGMENTAO DE DNA EM EMBRIES BOVINOS


PRODUZIDOS APS FECUNDAO DE OCITOS MATURADOS
IN VITRO EM MEIO SUPLEMENTADO COM DIFERENTES
FONTES DE MACROMOLCULA
Lo Turco, E.G.1; Barretto, L.S.S.1; Perecin, F.1; Soria, G.1; Bertolla, R.P.2, Mingoti, G.Z.3
1

Departamento de Reproduo Animal, FCAV UNESP, Jaboticabal; 2Setor de Reproduo Humana


Hospital So Paulo, UNIFESP, So Paulo; 3Departamento de Produo e Sade Animal, FMVA
UNESP, Araatuba

A avaliao da fragmentao de DNA fita simples tem se mostrado satisfatria para medir a viabilidade de
embries bovinos em diversos estdios de desenvolvimento. O objetivo do presente trabalho foi analisar a
integridade da fita simples de DNA de embries produzidos aps fecundao in vitro de ocitos maturados
em meio suplementado com 3 diferentes tipos de macromolculas: soro fetal bovino (SBF) ou albumina
srica bovina (BSA), sendo estes meios quimicamente indefinidos, ou ainda uma macromolcula quimicamente
definida, o lcool polivinlico (PVA). O ocitos foram colhidos de ovrios provenientes de abatedouro e
maturados por 24 horas em meio de cultivo de maturao (TCM-199, 0,2 mM de piruvato, 25 mM de
bicarbonato de sdio, 75 g/ml de Kanamicina, 1 g de 17? estradiol/ml, 0,5 g de FSH/ml, 100 UI de hCG/
ml), acrescidos de 1% de PVA, ou 1% de BSA ou 10% de SFB (dependendo do grupo experimental), em
atmosfera de 5% de CO2 em ar Aps a fertilizao, os zigotos foram cultivados, todos em mesmo meio, at
.
o estdio de blastocisto (144 horas aps fecundao) e submetidos a tcnica do cometa. Os blastocistos do
grupo SFB apresentaram a maior fragmentao (44,38% 4,8a) diferindo dos grupos BSA e PVA (P<0,05),
respectivamente 19,78 % 4,6b e 27,54 % 4,43b de fragmentao; estes ltimos no diferiram
estatisticamente (P>0,05). A macromolcula adicionada ao meio de maturao parece ter influenciado a
fragmentao de DNA fita simples de embries bovinos cultivados at o estdio de blastocisto, todavia,
ainda existem muitos mecanismos a serem investigados sobre a influncia da macromolcula nos ocitos
durante a maturao.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

ANGIOTENSINA II REVERTE A AO INIBITRIA DAS CLULAS FOLICULARES


NA MATURAO NUCLEAR DE OCITOS BOVINOS INDEPENDENTE
DA PRESENA DE IGF-I
Stefanello, J.R.1; Porciuncula, P.M.1; Costa, L.F.S.1; Oliveira, J.F.C.1; Gonalves, P.B.D.1
1

Universidade Federal de Santa Maria UFSM, Laboratrio de Biotecnologia e Reproduo Animal


BioRep, Santa Maria- RS, Brasil, 97105-900, FAX 55-2208484, e-mail: jeronimo@biorep.ufsm.br

O objetivo deste trabalho foi verificar a interao entre o fator de crescimento semelhante a insulina-I (IGFI) e angiotensina II (Ang II) na reverso do efeito inibitrio das clulas foliculares na maturao nuclear de
ocitos bovinos. Os complexos cumulus-ocitos (CCOs) foram aspirados de ovrios bovinos obtidos em
frigorfico. O meio de maturao utilizado foi TCM-199 com sais de Earle e L-glutamina (Gibco Labs.,
Grand Island, NY), suplementado com 25 mM de Hepes, 0,2 mM de cido pirvico, 2,2 mg/ml de bicarbonato
de sdio, 0,4% de albumina srica bovina livre de cidos graxos (BSA; Sigma Chemical Company, St.
Louis, MO), 100 UI/ml de penicilina e 50 g/ml de estreptomicina. Os CCOs foram maturados em uma
temperatura de 39 C e atmosfera de 5% de CO2 em ar e umidade saturada, contendo oito metades foliculares
(folculos de 2-5 mm) em 200 l de meio, por 7, 12 e 22 h na presena de Ang II (10-11 M; BACHEM,
California); Ang II + IGF-I (10 ng/ml; Sigma) e dois grupos controles, sem Ang II e IGF-I, na presena
(controle com clulas) e ausncia (controle sem clulas) de clulas foliculares. Um segundo experimento foi
realizado na presena de LH (5 g/ml) e FSH (0,5 g/ml; National Institute of Diabetes and Digestive and
Kidney Disease, NIDDK), respeitando o mesmo delineamento experimental anteriormente descrito. Aps
submeter os dados a uma transformao logartmica, a anlise estatstica foi realizada por ANOVA, atravs
de um modelo em blocos casualizados, utilizando o PROC GLM. Os tratamentos foram comparados por
contraste no programa estatstico SAS. Em ambos experimentos, a Ang II reverteu a ao inibitria das
clulas foliculares nos estdios de rompimento da vescula germinativa em 7 h (RVG: 34,8% e 35,2%, sem e
com LH e FSH, respectivamente), metfase I em 12 h (MI: 39,8% e 46,3%) e metfase II em 22 h (MII:
82,8% e 88,4%), observada em comparao ao grupo controle com clulas foliculares (p<0,01; RVG:
11,2% e 13,0%; MI: 6,7% e 8,6%; MII: 17,4% e 22,0%). Os CCOs cultivados na presena de Ang II +
IGF-I e aqueles cultivados na ausncia de clulas foliculares (controle sem clulas) atingiram ndices de
maturao similares aos do tratamento com Ang II. A Ang II capaz de reverter a inibio da maturao
nuclear em ocitos bovinos causada pelas clulas foliculares, independente da presena de IGF-I.
Trabalho realizado com apoio do PRONEX/CNPq e FAPERGS.

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DESENVOLVIMENTO EMBRIONRIO E APOPTOSE EM EMBRIES


BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO
Mesquita, L.G.1; Carambula, S.F.1; Emanuelli, I.P.1; Ripamonte, P.1; Merighe, G.K.F.1; Meirelles, F.V.1
1

Departamento de Cincias Bsicas, Universidade de So Paulo, Pirassununga, So Paulo, Brasil, 13635900. ligiagmesquita@yahoo.com.br

Durante a fase inicial de desenvolvimento a fragmentao de blastmeros e do DNA indicativo de apoptose.


No estudo da cronologia das caractersticas dessa morte celular observou-se que o aparecimento da
condensao do ncleo ocorre em embries bovinos cultivados in vitro a partir de 6 clulas e in vivo a partir
de 8 clulas. No entanto, ensaios de TUNEL indicam que ocorre fragmentao do DNA em embries de 6
clulas produzidos in vitro e somente a partir de 21 dias naqueles in vivo. O presente trabalho objetivou
estudar o desenvolvimento embrionrio e ativao da morte celular programada (apoptose) em embries
com alto potencial de desenvolvimento (grupo rpido) e em embries com elevado ndice de bloqueio (grupo
lento). Os embries foram produzidos in vitro e cultivados em meio CR2 modificado (Watanabe et al.,
1999). Decorridas 48 horas post insemination (hpi), os embries foram separados em dois grupos, lento
(com menos de 5 clulas) e rpido (com 5 clulas ou mais). Embries dos dois grupos foram processados
para a anlise s 48 ou 90 horas de cultura, sendo submetidos tcnica de TUNEL para deteco da
fragmentao do DNA. No foi observada fragmentao do DNA nuclear em nenhum dos grupos avaliados
s 48 hpi. Contudo, s 90 hpi, observou-se um aumento significativo (p<0,05) no aparecimento de ncleos
TUNEL positivos. No entanto, os grupos rpido e lento apresentaram, respectivamente, 9,11% e 11,41%
de clulas TUNEL positivas, no havendo diferena significativa entre os grupos (p>0,05). Estes resultados
sugerem que a inibio da fragmentao durante as primeiras fases de desenvolvimento pode estar relacionada
com a presena de um fator de inibio da caspase, liberao do CAD ou deficincia de protenas como a
BAX , s 48 hpi.
Apoio Financeiro: FAPESP-Brasil

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INFLUNCIA DAS CLULAS DO CUMULUS E DO MEIO DE MATURAO IN VITRO


DE OCITOS BOVINOS SOBRE A MATURAO NUCLEAR E AQUISIO DA
COMPETNCIA DO DESENVOLVIMENTO EMBRIONRIO
Ancioto, K.L.1; Vantini, R.1; Garcia, J.M.1; Mingoti, G.Z.2
1

DMVPRA, FCAV-UNESP, Jaboticabal-SP, Brasil. 2 DAPSA, FMVA-UNESP, Araatuba-SP, Brasil.


E-mail: gmingoti@fmva.unesp.br

O objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos do suplemento do meio de maturao e presena das
clulas do cumulus sobre a maturao nuclear in vitro de ocitos bovinos e subsequente desenvolvimento
embrionrio. Complexos-cumulus-ocito (COC) ou ocitos desnudos (DO) (n=1.383) foram maturados a
38,7oC em atmosfera de 5% CO2 em ar em meio TCM-199 suplementado com 0,5 g FSH, 100 UI hCG
e 1 g estradiol/ml, adicionado de 10% de soro fetal bovino (SFB), 0,6% de albumina srica bovina (BSA)
ou 0,6% de polivinil lcool (PVA). Aps 24 horas do incio do cultivo de maturao, a expanso das clulas
do cumulus foi avaliada nos grupos COC (classificao por escores variando de 0 a 5; escore 0 indica
nenhuma expanso e escore 5 indica mxima expanso, inclusive da corona radiata). Metade dos ocitos
maturados foi corada com Hoescht 33342 para avaliao da maturao nuclear e o restante foi fecundado.
Os zigotos foram cultivados em meio mSOF suplementado com 0,5% BSA e 2,5% SFB, a 38,7C durante
168h. Os dados foram analisados pelo teste de ANOVA (P<0,05). s 24 horas de maturao, os ocitos
apresentaram-se em metfase II em 75,4% (COC-SFB), 74,9% (COC-BSA), 85,6%a (COC-PVA),
85,2% (DO-SFB), 78,0% (DO-BSA) e 73,9%a (DO-PVA). Nos grupos COC, a mdia do escore de
expanso das clulas do cumulus foi de 4,8 (COC-SFB), 4,1b (COC-BSA) e 3,6c (COC-PVA). O
desenvolvimento embrionrio at a fase de blastocisto foi 50,1% (COC-SFB), 47,3% (COC-BSA), 30,9%b
(COC-PVA), 22,7%b (DO-SFB), 25,9%b (DO-BSA) e 6,6%c (DO-PVA). Em concluso, muito embora
os trs meios e a presena ou ausncia das clulas do cumulus tenham proporcionado semelhantes taxas de
maturao nuclear, o desenvolvimento embrionrio foi negativamente afetado quando IVM ocorreu em meio
indefinido e na ausncia de clulas do cumulus. Os dados sugerem a participao das clulas do cumulus
nos processos fisiolgicos do ocito durante a maturao.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

INFLUNCIA DAS CLULAS DO CUMULUS E DA RAA DO TOURO NO


DESENVOLVIMENTO DE EMBRIES BOVINOS, SUBMETIDOS A
ESTRESSE TRMICO CALRICO
Eberhardt, B.G.*; Kapinzaiki, C.R.L.; Satrapa, R.A; Barros, C.M.
Departamento de Farmacologia IBB/UNESP, Botucatu-SP.
Existem evidncias de que os efeitos deletrios do estresse trmico calrico (ETC) so menos pronunciados
se as clulas do cumulus estiverem presentes no cultivo in vitro, devido provavelmente a molculas termoprotetoras produzidas pelas mesmas. O objetivo do presente trabalho foi testar a hiptese de que embries,
nos estgios iniciais de desenvolvimento, cultivados em meio (TCM 199) contendo clulas do cumulus (TCM/
CC) so mais resistentes ao ETC que embries cultivados em meio sem clulas do cumulus (SOF). Alm
disso, avaliou-se a influncia da raa do touro na resistncia dos embries ao ETC. Ocitos de vacas Bos
indicus (Nelore) e Bos taurus x Bos indicus (mestia), provenientes de ovrios de abatedouro foram maturados
22 h a 39 C sob 5% CO2 e fertilizados com smen de 2 touros Bos indicus e 2 Bos taurus. Os embries
foram expostos ou a 39 C continuamente ou a 41 C por 12 h (12 horas ps-inseminao, hpi) e 39 C at
o fim. Os dados foram analisados por Regresso Logstica (Proc GENMOD, SAS). O ETC por 12 h (12
hpi) em meio TCM/CC alterou significativamente a taxa de clivagem de embries Nelore [controle, 175/224
(78,15%) vs ETC, 157/232 (67,8%); p=0,02], mas no de embries mestios [controle, 168/225 (74,65%)
vs ETC, 172/240 (71,75%); p>0,05]. Por outro lado, em meio SOF, a taxa de clivagem para embries
Nelore no foi diminuda pelo ETC [controle, 162/231 (70,1%) vs ETC, 169/234 (72,3%); p>0,05], enquanto
que os embries mestios foram afetados [controle, 192/226 (84,95%) vs ETC, 164/228 (71,9%); p<0,01].
O uso dos dois meios (TCM/CC vs SOF) no alterou o efeito do ETC sobre a taxa de clivagem (p>0,05).
Para os embries submetidos ao ETC 12 hpi durante 12h, o nmero de ocitos que se desenvolveu at
blastocisto (blastocistos/ocito) no dia 8 foi: Nelore [103/224 (45,98%) a 39 C vs 63/232 (27,15%) a 41
C/12 h, TCM/CC p<0,01; 116/231 (50,2%) a 39 C vs 83/234 (35,47%) a 41 C/12 h, SOF p<0,01] vs
mestios [101/225 (44,8%) a 39 C vs 75/240 (31,2%) a 41 C/12 h, TCM/CC p<0,01; 136/226 (60,1%)
a 39 C vs 74/228 (32,4%) a 41 C/12 h, SOF p<0,01]. Tanto o uso do meio TCM/CC quanto do SOF no
alterou o efeito do ETC sobre a taxa de blastocistos, indicando que as clulas do cumulus presentes no meio
TCM no protegeram os embries dos efeitos deletrios do ETC. Alm disso, a raa do touro no teve
efeito significativo na taxa de formao de blastocistos em nenhum grupo (p>0,05). Concluindo, os resultados
acima no confirmam a hiptese de que o meio de cultivo com clulas do cmulus (TCM/CC) tenha uma
ao termo-protetora, em embries submetidos ao ETC. Adicionalmente, o uso de smen de Bos indicus ou
Bos taurus no alterou a taxa de formao de blastocistos nos embries submetidos ao ETC. Bolsista da
CAPES.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

USO DE DIFERENTES MEIOS E TRATAMENTOS HORMONAIS NA


MATURAO DE OCITOS SUNOS
Marques, M. G.; Gerger, R.P.C.; Oliveira, V.P.; Nascimento, A.B.; Visintin, J.A.
Departamento de Reproduo Animal FMVZ/USP, So Paulo - SP, 055508-000, Brasil.
mgroke@usp.br
O objetivo deste estudo foi avaliar a maturao de ocitos sunos em quatro meios: TCM199 com 0,1%
lcool polivinlico (PVA), TCM199 com 10% Fludo Folicular Suno (PFF), NCSU23 com 0,1% PVA e
NCSU23 com 10% PFF. Cada meio recebeu quatro tratamentos hormonais: Tratamento 1 - incubao por
22 horas - 50UI de EGF/ml e 10UI de eCG/ml, seguido de incubao por 22 horas - 50UI de EGF/ml e
10UI de hCG/ml; Tratamento 2 - incubao por 22 horas - 50UI de EGF/ml, 10UI de hCG/ml e 10UI de
eCG/ml, seguido de incubao por 22 horas - 50UI de EGF/ml; Tratamento 3 - incubao por 22 horas 10UI de eCG/ml, seguido de incubao por 22 horas - 10UI de hCG/ml; Tratamento 4 - incubao por 22
horas - 10UI de eCG/ml e 10 UI de hCG/ml, seguido de incubao por 22 horas no respectivo meio de
maturao. As incubaes foram feitas em estufa 38,5C, 5% de CO2 em ar e alta umidade. Ao final do
perodo de maturao (44 horas), cada grupo de ocitos teve as clulas do cumulus oophorus removidas
completamente por exposio soluo de hialuranidase (5 mg/ml). Em seguida os ocitos foram fixados,
corados com 10g de Hoechst 33342/ml em glicerol e avaliados no microscpio de epifluorescncia. Para
analisar os resultados foi empregado o teste do Qui-quadrado (2) com nvel de significncia de 5%. Quanto
aos ocitos em Metfase II, o tratamento 2 apresentou os ndices com maior repetibilidade (54,5% - 61/
112; 65,0% - 63/97; 54,6% - 65/119; 58,1% - 61/105, respectivamente, TCM + PVA; TCM + PFF;
NCSU23 + PVA; NCSU23 + PFF), em comparao aos tratamentos 1 (43,8% - 53/121; 75,2% - 82/109;
39,3% - 46/117; 52,9% - 73/138, respectivamente, TCM + PVA; TCM + PFF; NCSU23 + PVA; NCSU23
+ PFF), tratamento 3 (47,7% - 53/111; 66,4% - 85/128; 63,8% - 67/105; 65,1% - 71/109, respectivamente,
TCM + PVA; TCM + PFF; NCSU23 + PVA; NCSU23 + PFF) e tratamento 4 (49,6% - 56/113; 69,0% 89/129; 53,4% - 62/116; 66,2% - 90/136, respectivamente, TCM + PVA; TCM + PFF; NCSU23 + PVA;
NCSU23 + PFF). Enquanto que o meio TCM 199 apresentou os ndices com maior repetibilidade com PFF
(75,2% - 82/109, 65,0% - 63/97, 66,4% - 85/128, 69,0% - 89/129, respectivamente, para os tratamentos
1, 2, 3 e 4) ou PVA (43,8% - 53/121, 54,5% - 61/112, 47,7% - 53/111; 49,6% - 56/113, respectivamente,
para os tratamentos 1, 2, 3 e 4), em relao aos demais meios. Os ndices de maturao dos ocitos nos
grupos suplementados com PFF foram superiores aos com PVA.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFEITO DE MACROMOLCULAS SOBRE OS COMPLEXOS CUMULUS-OCITO


E SUBSEQENTE DESENVOLVIMENTO DE EMBRIES BOVINOS IN VITRO
Emanuelli, I.P.1; Perecin, F.2 ; Marques, M.G.3 ; Mesquita, L.G.1; Cortezzi, S.S.1;
Merighe, G.K.F.1; Meirelles, F.V.1
1

Departamento de Cincias Bsicas Laboratrio de Morfofisiologia Molecular e Desenvolvimento,


FZEA/USP, Pirassununga-SP, 13635-970 Brasil. isabelevet@hotmail.com 2 Departamento de Medicina
Veterinria Reproduo Animal, UNESP, Jaboticabal-SP 3Departamento de Reproduo Animal,
FMVZ-USP, So Paulo, Brazil

O bloqueio do desenvolvimento embrionrio em bovinos ocorre no quarto ciclo celular quando o controle
embrionrio torna-se evidente. Sabe-se que o potencial de desenvolvimento embrionrio in vitro influenciado
por diversos fatores, entre eles, as diferentes variaes dos meios de maturao e de cultivo. Estes fatores
podem provocar alteraes na maturao dos ocitos e das clulas do cumulus (CC), alm de diferentes
taxas de desenvolvimento. Com base nestas evidncias, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da
suplementao de macromolculas sobre a maturao nuclear dos ocitos, a fragmentao nuclear das CC
e o desenvolvimento embrionrio. Foram selecionados 370 ocitos, distribudos em 3 grupos quanto
suplementao do meio de maturao e de cultivo: grupo SFB (10% de SFB nos meios MIV e CIV); grupo
BSA (6 mg/mL de BSA nos meios MIV e CIV) e grupo PVA (6 mg/mL de PVA no meio MIV e 6 mg/mL
de BSA no meio CIV). Os ocitos foram maturados em meio TCM 199 suplementado conforme os grupos
experimentais. Aps 24h, 192 ocitos foram avaliados para maturao nuclear (experimento1) e grau de
fragmentao do DNA das CC atravs da tcnica de Ensaio Cometa (Takahashi et al., 2000; experimento
2). Os demais ocitos (n=182) foram submetidos fecundao in vitro em meio Fert-TALP por 18h e
cultivados em SOF 38C em 5%CO2 e 5%O2. No experimento 3 foram avaliadas a taxa de clivagem e de
desenvolvimento embrionrio. A anlise estatstica foi realizada atravs dos testes t de Student e qui-quadrado.
No houve diferena significativa entre os grupos SFB, BSA e PVA para maturao nuclear (78,1%, 73,6%
e 71,0%, respectivamente), bem como no grau de fragmentao nuclear das CC independente da
macromolcula utilizada. Na avaliao da taxa de clivagem (85,2%; 55,6% e 54,7%) e de blastocisto (42,6%;
34,4% e 31,6%) obteve-se uma maior percentagem no grupo SFB do que nos grupos BSA e PVA. No
entanto, quando se avaliou a taxa de blastocistos em relao aos embries 8 clulas, o percentual destes que
chegaram ao estdio de blastocisto foi maior (p<0.001) nos grupos BSA e PVA (SFB: 66,9%; BSA: 82,0%
e PVA: 79,0%). Assim, quando o BSA e PVA foram utilizados na suplementao dos meios de cultivo, um
menor nmero de zigotos alcanaram o estgio de oito clulas. Em contrapartida, a maioria dos zigotos que
atingiram 8 clulas ultrapassaram o bloqueio embrionrio, desenvolvendo-se at o estgio de blastocisto. Em
concluso, a suplementao de SFB no meio de cultivo favoreceu o desenvolvimento embrionrio at o
quarto ciclo celular.
Apoio financeiro: FAPESP.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

ANLISE DE PROTENAS POR ELETROFORESE BI-DIMENSIONAL DE OCITOS


BOVINOS MATURADOS IN VITRO NA PRESENA OU AUSNCIA DE
CLULAS DO CUMULUS
Ancioto, K.L.1; Vantini, R.1; Roncoleta, M.2; Mingoti, G.Z.3
1

DMVPRA, FCAV-UNESP, Jaboticabal-SP, Brasil. 2Lagoa da Serra, Sertozinho-SP, Brasil. 3DAPSA,


FMVA-UNESP, Araatuba-SP, Brasil. E-mail: gmingoti@fmva.unesp.br

Objetivamos avaliar os efeitos da presena ou ausncia das clulas do cumulus sobre os padres de protenas
constitutivas em ocitos bovinos maturados in vitro. Complexos-cumulus-ocito (grupo COC) ou ocitos
desnudos (grupo DO) (n=4.409) foram maturados a 38,7oC em atmosfera de 5% CO2 em ar em meio
TCM-199 suplementado com 0,5 g FSH, 100 UI hCG e 1 g estradiol/ml, adicionado de 10% de SFB,
0,6% de BSA ou 0,6% PVA. Aps 24 horas do incio do cultivo de maturao, foi feita a remoo da zona
pelcida dos ocitos dos grupos COC e DO, sendo que os ocitos do grupo COC foram desnudados
anteriormente a este procedimento. Aps, os ocitos foram lisados e as protenas foram solubilizadas e
quantificadas para aplicao em gel de eletroforese. Para eletroforese, foi primeiramente realizada a focalizao
isoeltrica das protenas (IPG strip pH 3-10; Amersham Biosciences), seguida de separao em SDSPAGE (gis 13% de poliacrilamida). Os gis foram corados por nitrato de prata e as imagens foram analisadas
em computador (programa Phoretix 2D, verso 2003.02). Foram determinados o peso molecular em kDa
(PM), o ponto isoeltrico (pI) e o VION (volume dos spots normalizado pelo programa). Os dados foram
analisados pelo teste t-Student (P<0,05). A comparao do VION entre os grupos COC e DO demonstrou
diferenas significativas entre o spot 29 (PM 63,49 e pI 4,86), spot 31 (PM 63,36 e pI 4,94) e spot 99
(PM 68,15 e pI 5,19). O VION mensurado para os grupos COC e DO foi, respectivamente: 832,5a e 90,6b
(P<0,05) para o spot 29; 149,5a e 0,0b (P<0,05) para o spot 31; 1239,0a e 95,1b (P<0,05) para o
spot 99. Os resultados demonstraram que determinadas protenas esto presentes ou so mais intensamente
expressas apenas quando a MIV ocorre na presena das clulas do cumulus. Estudos adicionais so necessrios
para determinar se estas protenas esto relacionadas aquisio da competncia oocitria durante o processo
de maturao.
Apoio Financeiro: CAPES, FUNDUNESP

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

CULTIVO DE EMBRIES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO: EFEITO DO


NMERO DE ZIGOTOS E DO VOLUME DE MEIO
Brum, D.S.1,2; Leivas, F.G.1,2; Fialho, S.S.2, Mozzaquatro, F.D. 1,2, Bernardi, M.L.3;
Rubin, M.I.B.1,2; Silva, C.A.M.1,2
1

Programa de Ps-Graduao em Medicina Veterinria, UFSM, Santa Maria, RS, Brasil. 2 Embryolab
Laboratrio de Embriologia e Reproduo, 97.119-900, Santa Maria, RS.; 3 Departamento de Zootecnia,
Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. danisbrum@yahoo.com.br
Ocitos bovinos recuperados atravs de aspirao folicular in vivo variam em qualidade e, devido ao reduzido
nmero, requerem condies adequadas para se desenvolver in vitro. Para determinar a influncia do nmero
de embries por gota e o do volume de meio sobre o desenvolvimento de embries bovinos in vitro, 1428
zygotos foram distribudos aletoriamente, aps a fecundao, em 3 grupos com 5, 10 e 20 zigotos, nas
propores de 1:1, 1:5 e 1:10 (zigotos:volume in l), em 7 repeties. Os embries foram produzidos a partir
de complexos cumulus-ocitos (CCO) aspirados de folculos de 2-8mm, de ovrios de matadouro. A
maturao in vitro (MIV) foi efetuada em grupos de 20 CCO/200l de meio TCM-199, modificado com rhFSH e 10% de soro de vaca no cio (SVE), por 24h, em estufa com 5% de CO2, em ar, a 38,5C e umidade
saturada. A FIV foi realizada com smen separado por migrao ascendente com 1x106 espermatozides/
ml, em grupos de 20 ocitos/200l de meio Fert-Talp + heparina + PHE, com incubao dos gametas por
18h. O cultivo foi realizado em meio SOFaaci + 5% de SVE, pelo perodo de 8 dias. As avaliaes foram
efetuadas nos dias D2 (clivagem), D7 (blastocisto) e D9 (blastocisto expandido, em ecloso e eclodido),
considerando-se a dia da fecundao como o dia zero (D0). Os dados foram submetidos transformao
arco seno raz quadrada e ANOVA e as mdias comparadas em nvel de 5% de significncia. Os ndices de
ecloso foram comparados pelo teste Qui-quadrado. As percentagens de clivagem e ecloso foram similares
nos grupos com 5, 10 ou 20 zigotos e no D9, a produo de blastocistos nos grupos com 5 zigotos (16,2%)
foi inferior dos grupos com 10 (20,8%) e 20 (24,7%) zigotos. O ndice de clivagem e ecloso entre as
propores de meio de 1:1, 1:5 e 1:10 foram similares. A produo de embries no D9 foi inferior na
proporo 1:1 (15,6%) em comparao com 1:5 (23,1%) e 1:10l (23,0%). O ndice de desenvolvimento
embrionrio afetado negativamente quando o cultivo efetuado com reduzido nmero de embries como
tambm, quando no h suficiente meio por embrio.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

AVALIAO DE UMA BOMBA DE INFUSO CONTNUA COMO GERADORA


DE VCUO PARA OBTENO IN VIVO DE OCITOS BOVINOS
Rubin, K.C.P.1; Rigo, A.G.1; Schroeder, R.V.1; Silva, R.C.P.2;
Marques, M.O.2; Seneda, M.M.1
1

Departamento de Clinicas Veterinrias e Reproduo Animal- Universidade Estadual de Londrina,


Londina PR, 86051-990, Brasil, karinac8@aol.com. 2Geraembryo-Central de transferncia de
embries, Cornelio Procpio-PR, 86300-000, Brasil.

A tcnica de FIV apresenta-se em franca expanso no Brasil, com crescente nmero de veterinrios habilitandose para obteno de ocitos e envio dos mesmos para centrais de produo in vitro de embries. Um fator
limitante para um crescimento mais amplo consiste no alto custo dos equipamentos para a aspirao folicular
transvaginal. O objetivo deste trabalho foi avaliar um equipamento alternativo para a gerao de vcuo, que
fosse capaz de permitir a recuperao de ocitos em quantidade e qualidade compatveis com bombas feitas
especificamente para este fim. Utilizou-se uma bomba de infuso contnua, cuja aplicabilidade para fins de
aspirao foi possvel graas ao modo inverso de utilizao do equipo de infuso. A extremidade que deveria
ficar ligada ao frasco de infuso foi acoplada no tubo de aspirao folicular, enquanto que a extremidade do
equipo destinada ao catter do paciente foi mantida livre. Desta forma, foi possvel a manuteno constante
de presso negativa capaz de promover a aspirao dos folculos. Utilizando doadoras Nelore livres de
problemas reprodutivos, foram realizados 28 procedimentos de aspirao folicular com a bomba de infuso
contnua. Obtve-se um total 704 ocitos, com mdia de 25,14 ocitos viveis por sesso de aspirao
folicular. Estes nmeros foram similares aos citados na literatura, com a utilizao de equipamentos delineados
especificamente para aspirao folicular. Como aspectos favorveis da bomba de infuso, alm de seu menor
custo, ressaltamos seu reduzido tamanho, controle eletrnico da vazo, e bateria com capacidade para seis
horas de trabalho. Estes resultados preliminares sugerem que o equipamento proposto pode ser uma alternativa
vivel para obteno in vivo de ocitos bovinos.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

ADIO DE RETINIDES E DE FSH AO MEIO DE MATURAO DE OCITOS


E SEUS EFEITOS NA PRODUO DE EMBRIES BOVINOS IN VITRO
Lima, P.F.1; Oliveira, M.A.L.1; Reichenbach, H.-D.2; Weppert, M.3; Cavalcanti Neto, C.C.4;
Pina, V.M.R.5; Santos, M.H.B.5; Loureiro, B.5
1

Departamento de Medicina Veterinria/UFRPE-Recife/PE, 2Bayerische Landesanstalt fr Landwirtschaft/


Poing-OT Grub Germany, 3Bayerisches Forschungszentrum fr Fortpflanzungsbiologie/
Oberschleissheim Germany, 4Departamento de Zootecnia/UFAL-Macei/AL, 5Programa de PsGraduao em Cincia Veterinria/UFRPE-Recife/PE

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da adio de retinol ou cido retinico (AR), com ou sem FSH,
no meio de maturao de ocitos bovinos em condies quimicamente definidas. Um total de 936 ocitos
foram selecionados para MIV, sendo incubados a 39 C em atmosfera mida, com 5% de CO2, durante 24
horas. Em ambos experimentos a MIV foi realizada em meio bsico (bMM) constitudo de TCM 199,
piruvato de sdio (50 g/ml), bicarbonato de sdio (2.6 mg/ml) e sulfato de gentamicina (50 g/ml). No
experimento 1 (Exp.1), este meio foi suplementado com lcool polivinlico (1 mg/ml), retinol (0.3 M) ou AR
(0.5 M). No experimento 2 (Exp.2), o bMM foi suplementado com lcool polivinlico (1 mg/ml), retinol
(0.3 M) ou AR (0.5 M) e FSH (10 g/ml). A FIV foi realizada em mDM e para a cultura dos presumveis
zigotos e embries foi utilizado o meio KSOM. Os dados foram avaliados atravs do X2. No Exp.1, a adio
de retinol e AR ao bMM no aumentou (p> 0,05) as porcentagens de ocitos que evidenciaram maturao
citoplasmtica (10,0% e 10,0%, respectivamente) quando comparadas com as do grupo controle (0%),
todavia, a clivagem do grupo controle (1,24%) foi menor (p < 0,05) do nos grupos com retinol (27,4%) e
AR (28,0%). No grupo controle no houve produo de blastocisto e as porcentagens de blastocistos e
blastocistos expandidos obtidas, respectivamente, com retinol (4,57% e 1,30%) e AR (4,45% e 1,91%) no
diferiram (p > 0,05) entre si. No exp.2, a adio de retinides e de FSH ao bMM aumentou (p < 0,05) a
porcentagem de ocitos que evidenciaram maturao citoplasmtica depois do tratamento com retinol (70,0%)
e AR (80,0%) quando comparada com do grupo controle (40,0%). O tratamento com retinol e AR
resultou em aumento das porcentagens de clivagem (retinol - 42,8%; AR - 39,3%), blastocisto (retinol 24,1%; AR - 22,1), blastocisto expandido (retinol - 9,7%; AR - 9,2%) e blastocisto eclodido (retinol 1,3%; AR - 1,9%) quando comparado com os percentuais obtidos com o grupo controle (17,8%, 8,3%,
1,3% e 0,0%, respectivamente). Os resultados permitiram concluir que a adio de retinides e FSH ao
bMM promovem um efeito positivo sobre o desenvolvimento de embries bovinos, nas condies aqui
testadas, e potencialmente pode ser utilizada para incrementar a produo de embries in vitro.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

UTILIZAO DA INSULINA NA CO-CULTURA DE EMBRIES BOVINOS


Lima-Verde, I.B.3; Pina, V.M.R.3; Santos, M.H.B3.; Loureiro, B3.; Cavalcanti Neto, C.C2.; IunesSouza, T.C.4; Moura, R.T.N.3; Bartolomeu, C.C.5; Oliveira, M.A.L1.
1

Departamento de Medicina Veterinria/UFRPE-Recife/PE, , 2Departamento de Zootecnia/UFALMacei/AL; 3Programa de Ps-Graduao em Cincia Veterinria/UFRPE-Recife/PE; 4Curso de /
Graduao em Medicina Veterinria/UFRPE-Recife-PE; 5Departamento de Cincia Agrrias e Ambientais
UESC Ilhus- BA
Este trabalho teve como objetivo verificar a eficincia da PIV de embries bovinos em meio KSOM acrescido
de insulina. Foram utilizados 310 ocitos provenientes de ovrios bovinos colhidos em abatedouro no municpio
de Jaboato dos Guararapes-PE. Folculos medindo de 2 a 8 mm foram aspirados com agulha 18G acoplada
a seringa de 10 mL. Aps lavagem em OWM e posterior seleo, os ocitos foram postos em TCM-199
para maturao em estufa a 39 C por 24 horas em atmosfera mida com 5% de CO2. Para a FIV, utilizouse smen bovino congelado em palhetas de 0,5 mL, o qual aps descongelao por 3 minutos a 37oC, foi
submetido ao swim-up. Aps exposio aos espermatozides na concentrao final de 1x106, os ocitos
foram incubados por 18 horas em gotas de mDM. Posteriormente, os presumveis zigotos foram desnudados
e distribudos aleatoriamente nos grupos experimentais KSOM/controle (n=154) e KSOM+insulina (n=156)
para a co-cultura com monocamada de clulas da granulosa. Depois de 48 horas foi efetuada uma leitura
para avaliar a taxa de clivagem e no stimo dia da co-cultura foi realizada nova leitura para avaliao qualiquantitativa dos embries. Os resultados foram comparados pelo teste exato de Fischer, utilizando o nvel de
significncia de 5%. Foram obtidas 20,8% e 15,4% de estruturas no fecundadas, 57,8% e 66,6% de
degenerados e 21,4% e 18,0% de embries nos estdios de mrula e blastocisto, respectivamente, nos
grupos KSOM/controle e no KSOM+insulina. Os resultados permitem concluir no existir necessidade da
adio de insulina ao KSOM para incrementar a PIV de embries bovinos, pelo menos no delineamento
experimental adotado neste trabalho.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

UTILIZAO DA GUA DE COCO NO MEIO DE MATURAO IN VITRO


DE OCITOS DA ESPCIE CANINA
Pina, V.M.R1.; Oliveira, M.A.L2; Lima, P.F.2; Moura, R.T.N.2; Alves, J.R.2;
Arajo, S.S.3; Melo, A .N.4; Aguiar Filho, C.R.4
1

Programa de Ps-Graduao em Cincia Veterinria/UFRPE. 2Deapartamento de Medicina Veterinria/


UFRPE. 3Centro de Vigilncia Ambiental da Cidade do Recife PE. 4Curso de Graduao em Medicina
Veterinria. maloufrpe@.com.br
Este trabalho teve o objetivo de avaliar o efeito da gua de coco no meio de maturao in vitro de ocitos
da espcie canina. Foram utilizadas 53 cadelas sem raa definida, entre 2 a 7 anos de idade e em diferentes
fases do ciclo estral provenientes do Centro de Vigilncia Ambiental da Cidade do Recife PE. Os ovrios
foram obtidos aps ovariosalpingohisterectomia (OSH) e transportados em soluo salina acrescida de 50g
ml de gentamicina, a 35C. No laboratrio, obteve-se o complexo cumulus/ocito, em um perodo mximo
de duas horas aps a colheita. Foram utilizados 453 ocitos, com ooplasma escuro, homogneo, contendo
uma ou mais camadas de clulas do cumulus. Uma vez selecionados, os ocitos foram colocados em gotas
de 100 l sob leo de parafina, contendo o meio de maturao TCM 199/25 mM (Grupo Controle GI).
De acordo com o grupo experimental este mesmo meio foi acrescido de 25% (GII), 50% (GIII) e 75%
(GIV) da soluo de gua de coco (SBAC), constituda de 50% de gua de coco, 25% de gua destilada e
25% de citrato de sdio a 5%. Os ocitos foram maturados por 48 horas em atmosfera de 5% CO2, a 37C.
Subseqentemente foram retirados, colocados em soluo de citrato de sdio por 10 minutos e levados ao
vrtex para remoo das clulas do cmulus. Para a avaliao da citogentica, os ocitos foram fixados em
cido actico/metanol (1:3) e corados com aceto-orcena a 2%. Os resultados obtidos em estgio de vescula
germinativa imatura, em Metfase I/Anfase I/Metfase II e em degenerao foram, respectivamente, para
os grupos: GI (Controle) - 31,3%, 11,3% e 57,4%; GII - 33,6%, 10,3% e 56,1%; GIII - 32,7%, 13,3% e
54,0%; e GIV - 19,3%, 5,5% e 75,2%. Houve uma certa equivalncia entre os grupos GI, GII e GIII,
enquanto que o grupo GIV, apresentou resultados pouco satisfatrios. No sendo, portanto, evidenciada a
influncia da gua de coco no aumento dos ndices de maturao dos ocitos. Todavia, de acordo com o
teste de Tukey, no houve diferena significativa entre os grupos. Sendo assim, recomenda-se mais estudos
para avaliar a contribuio da gua de coco e a sua eficcia na maturao de ocitos da espcie canina.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

UTILIZAO DO SISTEMA POST HATCHING DEVELOPMENT (PHD) NO


MONITORAMENTO DO DESENVOVLIMENTO DE EMBRIES BOVINOS PIV
Brando, D.O.1,2,3; Vajta, G.2; Callesen, H.2; Rumpf, R.3
1

Universidade de BrasliaUnB/ Programa de Ps-graduao em Biologia Molecular, 70910-900,


Braslia-DF, Brasil; 2Dept. Anim. Breeding and Genetics, Danish Inst. Agricultural Sciences, 8830 Tjele,
Denmark; 3EMBRAPA Recursos Genticos e Biotecnologia, Parque Estao Biolgica, 70770-900,
Braslia-DF, Brasil. dobrandao@uol.com.br
Apesar das elevadas taxas de blastocisto conseguidas na produo in vitro de embries bovinos, cerca de
40% das perdas embrionrias ocorrem entre 8 e 17 dias de gestao. Portanto, possvel que mesmo
aparentemente normais e de boa qualidade, os blastocistos transferidos apresentem defeitos decorrentes de
problemas prvios no detectados. A investigao do desenvolvimento embrionrio durante o perodo de
implantao poderia, portanto, ser uma importante fonte de informao sobre o status embrionrio. Objetivando
testar a viabilidade do monitoramento do perodo ps-ecloso, blastocistos cultivados at o dia 7 sob leo
de parafina, conhecidamente txico, continuaram o cultivo in vitro no sistema PHD (Brando et al., 2004)
at o dia 14. Para isto, ovcitos de vacas mestias de abatedouro foram maturados, fecundados (dia 0) e
cultivados em SOFaaci coberto com leo mineral testado ou leo de parafina txico (Brando et al., 2003).
No dia 8, os embries degenerados foram removidos e foram adicionados 400l de meio PHD em cada
poo (SOFaaci adicionado 0,5% glicose e 10% soro fetal bovino). No dia 11, 25 blastocistos foram
selecionados (0,5 1,0 mm , trofoblasto claro, com poucos pontos escuros, clulas da massa celular
interna compactas) e cultivados em sistema PHD e incubados a 38,5C e 5% CO2 5% O2, 90% N2. A
,
morfologia e comprimento embrionrios foram avaliados diariamente sob estereomicroscpio. No dia 14, foi
observado elongamento de 75% (10/12) dos embries originados de leo mineral e 38% (5/13) de leo
parafinado. Os embries de leo mineral apresentarem trofoblasto claro, com poucos pontos escuros, massa
celular interna compacta e definida, e 6 embries elongaram alm de 1 mm. J os embries do leo parafinado
apresentaram vrios pontos escuros no trofoblasto, massa celular interna espalhada ou no identificvel, e
apenas 3 embries elongaram alm de 1mm. Os embries elongados foram ento processados para histologia.
Nos embries do leo mineral foram identificados o hipoblasto e um epiblasto penetrante (Camada de
Rauber), definindo assim o disco embrionrio. Os embries do leo parafinado apresentaram hipoblasto
incompleto, vrios pontos de extruso celular no trofoblasto (correspondente aos pontos escurecidos), e os
componentes do disco embrionrio no puderam ser identificados. Os resultados apresentados mostram
pela primeira vez o uso do cultivo prolongado no sistema PHD e a deteco de consequncias advindas do
sistema de cultivo, mas no reveladas no estgio de blastocisto. Este estudo refora a importncia do
monitoramento do desenvolvimento embrionrio e destaca como fundamental a investigao do embrio
ps-ecloso na superao do principal perodo das perdas de gestaes de embries bovinos produzidos in
vitro.
Apoio financeiro: Danish Institute of Agricultural Sciences, Tjele, Dinamarca.
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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

AVALIAO MORFOLGICA DE OCITOS SUNOS EXPOSTOS


EXPERIMENTALMENTE AO VRUS DA PARVOVIROSE SUNA (PPV)
DURANTE PERODO DE MATURAO IN VITRO*
DAngelo, M.; Athayde, C.S.; Souza, R.J.; Carvalho, J.F.; Zerio, N.M.C.;
Melo, G.M.; Galuppo, A.G.; Bersano, J.G.
Centro de Sanidade Animal do Instituto Biolgico de So Paulo Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252,
CEP 04014-002- So Paulo, BR dangelo@biologico.sp.gov.br
A parvovirose suna considerada uma das doenas que mais causam reabsoro embrionria, fetos
mumificados e diminuio da leitegada. O vrus tem afinidade por tecidos de alta atividade mittica, replicase preferencialmente em tecidos fetais, embrionrios e linfides em adultos. Nesse estudo foram avaliadas
alteraes morfolgicas em ocitos expostos experimentalmente ao vrus Porcine parvovirus (titulo 1:256
em H.A.), durante o perodo de maturao in vitro. Complexos ocitos cumulus (COCs) foram coletados
atravs de aspirao de ovrios provenientes de abatedouro. Aps identificao, COCs foram divididos em
grupos controle e exposto s concentraes de 10l e 30l da suspenso viral. COCs foram ento maturados
durante 44 horas em meio NCSU23 em estufa 39oC, 5% CO2 e 90% de umidade. Tanto o grupo controle,
quanto o exposto a 10l da suspenso viral, apresentaram expanso normal das clulas do cmulus. O grupo
exposto a 30l apresentou citoplasma granuloso e enegrecido, expanso irregular das clulas do cmulus,
culminando em individualizao celular, com clulas esparsas e os ocitos quase desnudos. Sabe-se que, em
sunos, a expanso das clulas do cumulus no usada como parmetro na avaliao da maturao in vitro,
porm alteraes em sua morfologia so representativas em estudos sobre tais interaes. Sendo assim, tais
resultados nos mostram que, possivelmente, o PPV interage de alguma forma com o ocito, penetrando e se
multiplicando nas clulas do cumulus, ou no ocito. Contudo, h a necessidade de estudos utilizando-se
tcnicas mais especficas sobre interaes ocito/embrio/patgeno na rea de sanidade em FIV para obteno
de resultados mais fidedignos a fim de, futuramente, contribuirmos na preveno de doenas infecciosas que
podem estar sendo disseminadas biotecnologias na reproduo de animais.
* Suporte financeiro: Embriocare/Cultilab

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

AO CLASTOGNICA DO HERPESVRUS BOVINO TIPO 1 (BHV-1)


EM OCITOS BOVINOS MATURADOS IN VITRO.
DAngelo, M.; Melo, G.M.*; Athayde, C.S.; Souza, R.J.; Zerio, N.M.C.;
Rojas, N.; Carvalho, J.F.; Suzuki, M.F.
Centro de Sanidade Animal do Instituto Biolgico de So Paulo Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252,
CEP 04014-002- S.P., BR dangelo@biologico.sp.gov.br
Inmeras biotcnicas ligadas reproduo animal tm sido desenvolvidas com o objetivo de otimizar a
produo animal. Tal fato levou-nos a uma preocupao com a transmisso de doenas infecciosas como a
rinotraquete infecciosa bovina, doena causada pelo BHV-1. Devido vulnerabilidade do material gentico
agresses impostas por agentes qumicos, fsicos e biolgicos, surgiu a necessidade de se avaliar o dano
ocorrido no DNA de diversas clulas submetidas a tais fatores, atravs de tcnicas que permitem a deteco
do dano, como por exemplo, o teste do Cometa (single-cell gel eletrophoresis). Esse trabalho avaliou as
possveis alteraes clastognicas no DNA de ocitos bovinos maturados in vitro, expostos ao vrus, pelo
teste do Cometa. Na maturao dos ocitos, 160 foram expostos concentrao de 30L do BHV-1
(amostra Los Angeles, com ttulo de 105.5 TCID50/mL) e 160 mantidos sem o vrus, ambos os grupos
permanecendo em estufa de CO2 37oC por 24, 48 e 72h (sendo 40 ocitos em cada perodo). Os ocitos
foram submetidos ao ensaio do Cometa, no qual foram colocados em lminas histolgicas com agarose
normal melting e foram cobertos com agarose low melting. Foram tratados com soluo de lise por 2 h e
submetidas a corrida eletrofortica por 30 minutos a 4oC. As lminas foram coradas com 50l de brometo
de etidio e examinadas em microscpio de fluorescncia. A avaliao da alterao nuclear foi realizada pela
categoria de dano, onde foi observado 70, 50 e 40% de cometa-0 e 8, 20 e 26% de cometas grau 4,
respectivamente nos ocitos dos grupos de 24, 48 e 72h independente da presena ou no do vrus; indicando,
possivelmente, a no interferncia do vrus no DNA da clula. Estamos complementando esses estudos
utilizando ocitos in natura, e at o momento pudemos verificar um nmero irrelevante de cometas,
demonstrando que, provavelmente, isso possa estar refletindo as mutaes espontneas que ocorrem nos
organismos quando h falhas no DNA de reparo; assim, os mesmos sero utilizados como controles positivos.
Com base nesses dados, podemos supor que, nem sempre alteraes morfolgicas em ocitos de PIV so
decorrentes de infeco por patgenos.
* Bolsista do CNPq.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

CONGELAMENTO E ESTOQUE DE MEIOS PRONTOS PARA USO: A ROTINA


SIMPLIFICADA DA PIV DE EMBRES BOVINOS

Brando, D.O.1; Pereira, D.C.2; Dode, M.A.N.3; Rumpf, R.3


1

Universidade de BrasliaUnB/ Faculdade de Agronomia e Medicina VeterinriaFAV, 70910-900,


Braslia-DF, Brasil; 2 Universidade de BrasliaUnB/ Programa de Ps-graduao em Biologia
MoleculaVeterinriaFAV, 70910-900, Braslia-DF, Brasil; 3 EMBRAPA Recursos Genticos e
Biotecnologia, Parque Estao Biolgica, 70770-900, Braslia-DF, Brasil. dobrandao@uol.com.br

A rotina da produo in vitro (PIV) de embries exige uma crescente racionalizao de trabalho, tempo e
constncia de resultados, aliados a reduo de custos para maior eficincia da tcnica. Neste sentindo, uma
possibilidade interessante seria o estoque das solues prontas para uso, j incluindo hormnios e soro
bovino. Entretanto, este procedimento foi at o momento desencorajado por diminuir a eficincia dos
componentes dos meios por hipoteticamente desnaturar protenas e/ou precipitar minerais, levando a uma
menor produo de embries in vitro. Para confirmar esta hiptese, foram comparadas as taxas de blastocisto
produzidos in vitro com meios frescos (feitos na semana de uso) ou meios prontos congelados e estocados.
No congelamento, os meios de maturao (MIV) e cultivo (SOF) foram aliquotados (2 ml), acondicionados
em tubos plsticos de 15 ml e estocados em freezer a 80C. O descongelamento foi realizado overnight em
geladeira de 4-5oC e o meio estabilizado em estufa at 4 horas antes do uso. Ovcitos de vacas mestias de
abatedouro foram ento coletados e distribudos aleatoriamente em 4 grupos: Grupo 1 (MIV fresco, SOF
fresco), Grupo 2 (MIV congelado, SOF fresco), Grupo 3 (MIV fresco, SOF congelado) e Grupo 4 (MIV
congelado, SOF congelado). Os meios e procedimentos de maturao, fecundao e cultivo foram realizadas
de acordo com a rotina do laboratrio e as taxas de blastocisto (%) no dia 7 foram comparadas. Os dados
de 5 rplicas foram analisados pelo mtodo por Genmod-procedure (SAS Institute Inc.). As taxas de blastocisto
foram similares no Grupo 1 (50 5; 87/169), Grupo 2 (5012; 83/167), Grupo 3 (489; 83/168) e Grupo
4 (4610; 77/168). No foram observados nos meios congelados qualquer sinal de alterao de cor, pH ou
precipitao, bem como o aspecto morfolgico dos embries no diferiu entre os grupos. Os resultados
encontrados mostram que o congelamento dos meios, quando processados segundo o protocolo previamente
descrito, no prejudicam a qualidade e as taxas de blastocisto. Em concluso, o uso de meios congelados
deve ser considerado como uma nova alternativa para racionalizao e uniformidade do trabalho, contribuindo
para a reduo de custos e maior eficincia na produo in vitro de embries bovinos.
Apoio financeiro: Embrapa/ CNPq

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OBTENO DE CLULAS DA GRANULOSA BOVINAS POR ASPIRAO


GUIADA POR ULTRA-SOM: RESULTADOS PARCIAIS
Vireque, A.A.1; Viana, J.H.M.2; Rosa e Silva , A.A.M.1; S W.F.2;
Ferreira , A.M.2; Camargo, L.S.A.2
1

Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto, USP, So Paulo, SP


2
Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG

A recuperao, in vivo, de clulas da granulosa (CG) permite o cultivo de clulas somticas ovarianas de
diferentes fases do ciclo estral e de folculos em diferentes estdios de desenvolvimento, como o folculo
dominante. O estabelecimento de parmetros mais precisos quanto a bioatividade in vitro destas clulas,
cultivadas em meio quimicamente definido, de grande relevncia no estudo da fisiologia ovariana e na
utilizao em protocolos de produo in vitro de embries (PIV). Foram utilizadas vacas holandesas (n=6),
sincronizadas pela associao de prostaglandina e progesterona (CIDR) e pr-estimuladas com 300 UI de
FSH (Foltropin, Vetepharm). A puno foi realizada por via transvaginal, utilizando-se um aparelho porttil
de ultra-som (Scanner 100s, Pie-Medical) equipado com um transdutor setorial de 5,0/7,5 MHz. Folculos
ovarianos de 5 a 8 mm foram puncionados e o fluido folicular (FF) recuperado em tubos de 15 mL contendo
meio -MEM acrescido de antibiticos e hormnios, mantido a 37C. A suspenso celular obtida foi
centrifugada a 500G durante 10 minutos e as clulas contadas por meio do mtodo de excluso do Trypan
Blue para determinao do nmero de clulas viveis a serem cultivadas. Em seguida, as CG foram semeadas
em placas de 4 fossas na densidade de 5 x 105 clulas viveis/fossa/ml de meio completo, contendo bicarbonato
de sdio, hepes PVA a 1%, selenito de sdio, transferrina, Androstenediona, aminocidos no-essenciais,
IGF-I recombinante humano, insulina e antibiticos e cultivadas em atmosfera de 5% de CO2 a 38,5C. As
amostras de FF e dos meios de cultura retirados nos tempos 0h, 48h e 96h foram estocados a 20C para
as dosagens de esterides. Foram aspirados 90 folculos em trs coletas. A concentrao mdia de clulas
da granulosa viveis, por folculo aspirado, foi de 8,4 x 104. O perfil esteroidognico das CG aps o cultivo
ser determinado aps dosagem de esterides no FF e meios de cultura nos tempos preconizados no
procedimento experimental.
Suporte Financeiro: FAPESP e Embrapa Gado de Leite

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

UTILIZAO DE DOIS MEIOS DE MATURAO in vitro (MIV) EM


OCITOS DE OVINOS IMPBERES E PBERES
Capezzuto, A.1 ; Meirelles, F.V.; Merighe, G.K.F., Traldi, A.S.1
1

Departamento de Reproduo Animal FMVZ/USP, Pirassununga SP, 13630-000, Brasil.


2
Departamento de Cincias Bsicas FZEA/USP Pirassununga SP, 13630-000, Brasil.
astraldi@usp.br

Condies de maturao, fertilizao e cultivo in vitro tm sido estudadas em pequenos ruminantes, estimulando
a busca de novos protocolos que otimizem a tcnica em caprinos e ovinos. A maturao dos ocitos representa
a primeira etapa desse processo. Os objetivos do presente trabalho foram avaliar a competncia ao
desenvolvimento (taxa de maturao nuclear) de ocitos de ovinos de abatedouro, de acordo com o meio de
maturao, a categoria animal, e a classificao dos ocitos. Os resultados foram analisados pelo teste quiquadrado (2) segundo programa JMP, verso 2.0.4 SAS Institute (Carry, NC, EUA). Foram utilizados 107
ocitos obtidos por aspirao folicular que aps trs lavagens foram selecionados e classificados em G1
(cmulus compacto), G2 (mais de 3 camadas de cmulus) e G3 (2 a 3 camadas), e levados maturao em
meios denominados ovino (M199 + 10% de Lquido Folicular (caprino ou ovino) + 100ng de FSH/ mL Sigma) ou bovino (M199 + 0,5g de FSH/mL + 50g de LH/mL + 1g estradiol/mL - Sigma + 10% SFB
Gibco), em microgotas de 90L sob leo mineral, uma atmosfera mida com 5% de CO2 em ar e
temperatura de 38,5C por 24 horas. Aps avaliao da expanso do cmulos e eliminao do mesmo, os
ocitos foram fixados com paraformoldedo/triton10% e corados com Hoechst 33342, verificando-se a
progresso meitica em microscopia epifluorescente. Os resultados no demonstraram diferena estatstica
na taxa de maturao entre os meios testados (49,18% x 58,70%, bovino e ovino, respectivamente),
quanto a origem do lquido folicular (44,44% e 88,46% para o lquido folicular, caprino e ovino,
respectivamente), ou quanto ao nmero de camadas de cmulus. A taxa de maturao dos ocitos de fmeas
impberes foi significativamente superior em relao a de fmeas pberes (77,78% x 48,31%, respectivamente;
p<0,05). Concluiu-se que os meios ovino e bovino podem ser utilizados na rotina de MIV de ocitos de
ovinos impberes e pberes e que a presena de clulas do cmulus, mesmo que em baixo nmero, permite
sua maturao nuclear in vitro.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

USO DA GUA DE COCO VAPORIZADA NA CAPACITAO ESPERMTICA


IN VITRO EM SUNOS
Nascimento, A.B.1; Visintin, J.A.2; Oliveira, V.P.2; Marques, M.G.2;Gerger, R.P.C.2;
Toniolli, R.1; Seneda, M.M.3
1

Lab. de Reproduo Suna e Tecnologia de Smen UECE, Fortaleza, Cear, Brasil, e-mail:
aballarotti@yahoo.com.br 2Departamento de Reproduo Animal FMVZ-USP, So Paulo, Brasil
3
Departamento de Clnicas Veterinrias UEL, Londrina, Paran, Brasil
Vrios trabalhos j demonstraram o sucesso da gua de coco em biotecnologias da reproduo animal,
como diluidor do smen de animais domsticos e meio de maturao e cultivo in vitro de ocitos e de
embries bovinos. Este estudo objetivou avaliar uma soluo base de gua de coco vaporizada (ACP105)
sobre a capacitao espermtica in vitro em sunos. Foram colhidos 18 ejaculados de trs varres mestios
das raas Landrace e Duroc. As amostras de smen foram diludas em ACP105 e em Beltsville Thawing
Solution (BTS). O smen foi centrifugado 400 g por 8 minutos e as amostras padronizadas para 2x107
espermatozides/mL, sendo submetidas a capacitao espermtica em meio TALP sem (controle) e com
5mM de cafena (CAF) e incubadas em estufa a 38,5C, 5% de CO2 e alta umidade por trs horas. Foram
avaliados quatro tratamentos: T1 (ACP105), T2 (ACP105+CAF), T3 (BTS) e T4 (BTS+CAF). Para
avaliao da capacitao espermtica foram utilizados esfregaos com 5l de smen corados com Coomansie
Blue G, observando que os espermatozides capacitados apresentaram colorao azul tnue e os no
capacitados azul intenso. No houve diferena (p>0,05) nos ndices de capacitao espermtica entre os
tratamentos T1 e T3 (4,6% e 4,8%, respectivamente) e entre T2 e T4 (22,3% e 23,4%, respectivamente).
Quanto presena ou ausncia de cafena, houve diferena significante entre os tratamentos T1 e T2 (ACP105)
e entre os tratamentos T3 e T4 (BTS) (p<0,05). Assim, concluiu-se que a soluo ACP105 uma boa
opo para diluio do smen de sunos para capacitao espermtica in vitro, sendo otimizada com o
acrscimo de cafena.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

AVALIAO DA CAPACITAO ESPERMTICA INDUZIDA PELA


HEPARINA EM CES
Lucio, C.F.1; Vannucchi, C.I.1; Oliveira, V.P.1; Gonalves, J.S.A.1; Visintin, J.A.1;
Nichi, M.1; Assumpo. M.E.O. A.1
1

Departamento de Reproduo Animal FMVZ USP, So Paulo Brasil - Visintin, J. A.,


So Paulo-SP, Brasil. visintin@usp.br

As biotcnicas em bovinos tm proporcionado grandes avanos na esfera reprodutiva, o que no ocorre em


ces, portanto o desenvolvimento destas biotecnologias so importantes para a espcie canina. O objetivo
deste estudo foi investigar a capacitao espermtica em ces, empregando a heparina como agente capacitor.
Foram utilizados dez animais com idade entre 11 meses e 6 anos, realizando duas colheitas de cada animal.
Aps cada colheita foi avaliada a viabilidade dos espermatozides atravs de parmetros microscpicos.
Foram utilizadas 4 concentraes de heparina em meio TALP-STOCK (0g/ml, 5g/ml, 10g/ml ou 20g/
ml) e dois tempos de incubao (4 ou 7 horas) dos espermatozides em estufa a 39oC, 5%CO2 em ar e alta
umidade. A avaliao da capacitao espermtica foi realizada pela colorao Spermac e pelas sondas
fluorescentes iodeto de propdio e diacetato de carboxifluorescena (IP/CFDA). A anlise estatstica foi
realizada pelo teste t-Student. O ndice de capacitao espermtica detectado pelo IP/CFDA foi de 54,65,
55,75, 56,10 e 48,95 para 4 horas de incubao e 64,90, 62,20, 67,70 e 64,30 para 7 horas, respectivamente
para 0, 5, 10 e 20 g/ml de heparina. J o Spermac detectou 63,26, 61,97, 58,28 e 60,94 para 4 horas de
incubao e 75,56, 70,91, 75,81 e 74,53 para 7 horas, respectivamente para 0, 5, 10 e 20 g/ml de
heparina. Tanto na colorao com IP/CFDA quanto no Spermac, as diferentes concentraes de heparina
no apresentaram diferena significante, mas os melhores resultados de capacitao espermtica foram
observados no tempo de incubao de 7 horas. Os resultados apontam uma tendncia de aumento da
capacitao, quando os espermatozides so submetidos a elevado tempo de incubao, no sendo possvel
inferir o aumento da capacitao com a adio de heparina no meio. Adicionalmente aos resultados deste
trabalho, sero necessrios mais estudos para melhor entender os eventos reprodutivos em ces.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

PR-TRATAMENTO DE ESPERMATOZIDES BOVINOS COM DITIOTREITOL


(DTT) E HEPARINA PARA A INJEO INTRACITOPLASMTICA DO
ESPRMATOZIDE (ICSI)
Cortez, C.1, Fontes, R.S. 1, Matos, L.F. 1
1

Lab. de Melhoramento Gentico Animal Setor de Reproduo Animal CCTA / UENF, Campos dos
Goytacazes / RJ, Brasil - cortez@uenf.br

As taxas de formao de proncleo e de clivagem aps a Injeo Intracitoplasmtica de Espermatozide


(ICSI) em ocitos bovinos so freqentemente baixas. O ditiotreitol (DTT) e a heparina tm sido empregadas
para o tratamento dos espermatozides antes da ICSI, por sua capacidade de induzir a descondensao dos
espermatozides in vitro. O presente trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos de diferentes tratamentos
qumicos, empregando-se DTT e heparina, na permeabilidade da membrana e alteraes morfolgicas de
espermatozides bovinos. Smen de um touro da raa Guzer foi coletado a cada repetio e os
espermatozides viveis separados por meio da tcnica de swim-up. Em um primeiro experimento, os
espermatozides foram submetidos a quatro grupos de tratamento qumico: controle (sem tratamento);
incubao com heparina (100g/ mL por 15min); incubao com DTT (5mM por 1h); e incubao com
heparina (100g/ mL por 15min) seguindo-se a incubao com DTT (5mM por 1h). Para a avaliao da
viabilidade espermtica utilizou-se a tcnica de colorao de azul de tripan (integridade da membrana). Em
um segundo experimento, os espermatozides foram incubados por 1 hora em meio Sp-TALP com as
seguintes concentraes de DTT: 0mM, 5mM, 10mM e 50mM. Aps a incubao, o DTT foi removido por
centrifugao em meio sem DTT, e as amostras avaliadas em diferentes perodos: imediatamente, 1, 3 ou 5
horas aps a centrifugao. Os espermatozides foram classificados de acordo com as alteraes morfolgicas
encontradas, como normais (sem alterao visvel), com alterao na cabea (dobra ou aumento de volume),
com alterao na cauda (dobra, quebra, ou aumento de volume da pea intermediria) ou alteraes na
cauda e na cabea. O nmero de espermatozides com membrana lesionada foi maior para os grupos de
espermatozides tratados quimicamente (49,3%; 45,1% e 53,0%, para heparina, DTT e DTT + heparina,
respectivamente) que no grupo controle (29,5%, ANOVA, P<0,05). No foram encontradas diferenas no
nmero de espermatozides com alteraes entre os perodos aps a incubao com DTT (ANOVA, P>0,05).
Contudo, a porcentagem de espermatozides com alteraes morfolgicas foi significativamente maior para
as concentraes de 50mM (71,0%), em relao a 5mM e 10mM (29,5% e 42,2%). A porcentagem de
espermatozides com alteraes do grupo controle 0mM (3%) foi menor que a dos grupos tratados (ANOVA,
P<0,05). Conclumos que os tratamentos dos espermatozides com heparina e/ ou DTT resultaram em uma
elevada porcentagem de espermatozides com alterao da membrana, o que poderia permitir o acesso de
substncias do ocito responsveis por promover a descondensao do espermatozide microinjetado. As
alteraes morfolgicas de cauda e cabea ocorreram de forma dose-dependente, com um maior nmero de
espermatozides com alteraes quando se utilizou a concentrao mais alta de DTT. Mais estudos so
necessrios sobre os efeitos desses pr-tratamentos espermticos no desenvolvimento embrionrio e na
viabilidade aps a ICSI.
Financiamento: FENORTE, FINEP CAPES.
132

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

TAXAS DE FORMAO DE PRONCLEOS E DESENVOLVIMENTO NOPARTENOGENTICO DE EMBRIES BOVINOS PRODUZIDOS POR ICSI
Matos, L.F.1,2; Fontes, R.S.1; Quirino, C.R.1; Buitkamp, J.2; Weppert, M.3;
Reichenbach, H.-D.2
1

Lab. de Melhoramento Gen. Animal, CCTA-UENF, Campos / RJ, Brasil; 2Bav. State Res. Center for
Agri., Inst. Anim. Breed. Poing/ Grub, Alemanha; 3Bav. Res. Center for Biol. of Reprod. (BFZF),
Oberschleissheim, Alemanha lmatos@uenf.br

O presente trabalho teve por objetivo avaliar as taxas de formao de proncleos e de desenvolvimento
no-partenogentico de embries bovinos, aps a Injeo Intracitoplasmtica de Espermatozide (ICSI).
Complexos cumulus-ocito (COCs) obtidos de ovrios de matadouro foram maturados in vitro (18-20h),
desnudados, e apenas os ocitos apresentando o primeiro corpsculo polar (metfase II) foram selecionados
e centrifugados a 7000g/ 5 min. Os ocitos foram microinjetados com espermatozides sem pr-tratamento
ou pr-tratados com ditiotreitol-DTT (5mM/ 30 min), em combinao ou no com ativao qumica (5M
ionomicina/ 5 min + 1.9mM 6-dimetilaminopurina/ 3 h). Utilizou-se para a microinjeo uma pipeta de vidro
(dimetro interno aproximado de 7 m), acoplada a um piezo-micromanipulador (PiezoDrill, Burleigh).
Ocitos submetidos apenas ao protocolo de ativao ou fertilizados in vitro serviram como grupos controle.
Para avaliar a taxa de formao de proncleos, uma parte dos supostos zigotos foi mantida em meio de
fertilizao (Fert-TALP), por 18-22h aps ICSI, FIV ou ativao, e fixados em cido actico/ etanol. Outra
parte dos ocitos foi cultivada por 9 dias em meio SOF para obteno de blastocistos. Para a avaliao da
taxa de desenvolvimento partenogentico aps a ICSI, seqncias de microssatlites do DNA dos embries
e do smen utilizado para a FIV e para a ICSI foram amplificadas com os primers BM1824, BMS2113,
ETH225 e TGLA227. As amostras foram processadas por um analisador gentico (ABI Prisma 310 Genetic
Analyser, UK) e utilizando o programa GeneScanTT-35. No houve diferenas significativas das taxas de
formao de 2 proncleos (2PN), entre os grupos de ocitos microinjetados com espermatozides notratados, espermatozides tratados com DTT e espermatozides tratados com DTT + ativao (64% vs
49% vs 62%, respectivamente) (ANOVA, P>0,05). Contudo estas taxas foram superiores quela obtida
para ocitos apenas ativados (20%, ANOVA, P<0,05). A taxa de formao de trs proncleos foi
significativamente maior no grupo de ocitos microinjetados com espermatozides tratados com DTT e
ativados (25%, ANOVA, P<0,05) em relao aos demais grupos. Os embries produzidos por FIV foram
classificados como fertilizados (18/18, 100%), por apresentarem pelo menos um dos dois alelos igual ao do
touro e no serem homozigotos para os 4 primers. Os embries de partenognese foram classificados como
no-fertilizados, por apresentaram-se homozigotos para os quatro primers, podendo ou no os alelos serem
idnticos ao do touro (17/ 17, 100%). A anlise de microsatlites dos embries obtidos por ICSI (n=19),
revelou que a maior parte dos embries de ICSI (16/19, 84%) havia sido corretamente fertilizados, sendo
os demais classificados como no determinado ou partenogentico (3/19, 16%). Estes resultados mostram
que o ocito bovino pode ser eficientemente fertilizado por meio da ICSI com um Piezo-manipulador.
Financiamento: FENORTE, DAAD, FINEP e CAPES.

133

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAES DO CIDO 3-INDOL-ACTICO


NO CULTIVO DE FOLCULOS PR-ANTRAIS OVINOS
Andrade, E.R.1; Seneda, M.M.2; Alfieri, A.A.2; Oliveira, J.A.3; Boselli, C.C.2;
Rubin, K.C.P.2; Figueiredo, J.R.1; Toniolli, R.1
1

Faculdade de Medicina Veterinria, PPGCV, Universidade Estadual do Cear, Fortaleza-CE, CEP


60740-000, Brasil. 2 Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR, CEP 86051-990, Brasil. 3
Universidade Estadual Paulista, FCAV, Jaboticabal-SP, CEP 14884-900, Brasil.
evelyn_andrade@yahoo.com

O objetivo deste trabalho foi avaliar a ativao e crescimento de folculos pr-antrais ovinos aps o cultivo in
vitro do crtex ovariano em vrias concentraes de cido 3-indol actico (IAA). O crtex ovariano foi
dividido em fragmentos de aproximadamente 3x3mm (1 mm espessura). Um fragmento foi imediatamente
fixado em Bouin (controle dia 0) e os demais foram cultivados por dois ou seis dias em Meio Essencial
Mnimo (MEM) suplementado com ITS (insulina-transferrina-selnio), piruvato, glutamina, hipoxantina,
albumina srica bovina e antibiticos (MEM+) ou em MEM+ acrescido de 10, 40, 100, 500 ou 1000 ng/ml
de IAA. Aps dois ou seis dias de cultivo em cada tratamento, os fragmentos ovarianos foram fixados em
Bouin, desidratados em etanol, diafanizados em xilol e includos em parafina. Para cada fragmento de crtex,
seces teciduais de 5m foram montadas em lminas e coradas pelo mtodo hematoxilina-eosina. Os
folculos foram classificados de acordo com o estgio de desenvolvimento como primordiais ou em crescimento
(primrios e secundrios). O teste de Tukey (P<0,05) foi usado para comparar a taxa de viabilidade folicular
e a porcentagem de folculos primordiais ou em crescimento entre o controle e aps cultivo por dois ou seis
dias nos diferentes tratamentos. Os resultados mostraram que aps seis dias de cultivo in vitro, a porcentagem
de folculos primordiais e em desenvolvimento permaneceu inalterada em relao ao controle, exceto no
tratamento MEM+ suplementado com 40 ng/ml de IAA, em que foi observada uma reduo de folculos
primordiais e aumento de folculos em desenvolvimento (P<0,05). Tambm foi constatado que o cultivo
ovariano por seis dias, em todos meios testados, reduziu a porcentagem de folculos pr-antrais normais
quando comparados ao controle. Ao contrrio, aps dois dias de cultivo in vitro, esta reduo somente foi
observada nos tratamentos suplementados com 500 ou 1000 ng/ml de IAA. Com base nestes resultados
conclumos que folculos pr-antrais ovinos podem ser ativados in vitro com sucesso aps o cultivo em
MEM+ suplementado com 40 ng/ml de IAA e que altas concentraes de IAA podem ser prejudiciais a
estes folculos.

134

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFEITO DA SOLUO SALINA 0,9% E TCM 199 EM DIFERENTES


TEMPERATURAS E TEMPOS DE INCUBAO SOBRE A MORFOLOGIA
DE FOLCULOS PR-ANTRAIS BOVINOS
Celestino, J.J.H.; Santos, R.R.; Matos, M.H.T.; Costa, S.H.F.; Silva, J.R.V.;
Martins, F.S.; Silva, G.A.; Figueiredo, J.R.
Laboratrio de Manipulao de ocitos Inclusos em Folculos Ovarianos Pr-Antrais, UECE,
Fortaleza-CE, Brasil
O objetivo do presente trabalho foi investigar a eficincia da soluo salina 0,9% e TCM 199 na conservao
de folculos pr-antrais bovinos in situ em diferentes temperaturas (4, 20 ou 39C) e tempos de incubao
(2, 4, 12 ou 24h). No abatedouro, o par ovariano de cada animal foi dividido em 25 fragmentos. Um
fragmento foi escolhido aleatoriamente e imediatamente fixado em Carnoy para avaliao morfolgica (controle
tempo zero tratamento 1). Os outros 24 fragmentos foram aleatoriamente distribudos em tubos contendo
soluo salina 0,9% ou TCM 199 a 4, 20 ou 39 C, por 2, 4, 12 ou 24h (tratamentos 2-25). Os efeitos das
solues, temperaturas e tempos de incubao sobre a porcentagem de folculos normais e degenerados
foram analisados pelo teste Qui-quadrado. Os valores foram considerados estatisticamente significativos
quando P < 0,05. A anlise histolgica mostrou que a conservao de fragmentos ovarianos em soluo
salina 0,9% a 20 C por 12 ou 24h, TCM 199 a 20 C por 24h e em ambas as solues a 39 C j a partir
de 2h de conservao aumentou significativamente (P < 0,05) a porcentagem de folculos pr-antrais
degenerados quando comparados ao controle. Ao contrrio, a conservao a 4 C em ambas as solues
manteve a porcentagem de folculos pr-antrais morfologicamente normais similar ao controle (69,36 %). Em
ambas as solues, independente do tempo de incubao, a porcentagem de folculos morfologicamente
normais observada a 39 C foi significativamente inferior quela a 4 e 20 C. Ao comparar a Soluo Salina
com TCM 199, foi observada uma porcentagem superior (P < 0,05) de folculos normais em TCM 199
conservados a 20 C por 12 e 24h e a 39 C por 12h. Em concluso, este estudo mostra que folculos prantrais bovinos podem ser conservados eficientemente a 4 C por at 24h em ambas as solues e a 20 C
por 4 e 12h em soluo salina 0,9% e TCM 199, respectivamente. Alm disso, folculos pr-antrais bovinos
so bastante sensveis temperatura de 39 C mesmo por um perodo de conservao de 2h.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

DESENVOLVIMENTO DE FOLCULOS PR-ANTRAIS CAPRINOS EM


SOLUO BASE DE GUA DE COCO
Martins, F.S.1; Santos, R.R.1; Celestino, J.J.H.1; Matos, M.H.T.1; Silva, G.A.1;
Ferreira, F.V.A.2; Figueiredo, J. R.1
1

LAMOFOPA UECE e 2 Departamento de Patologia UFC, Fortaleza-CE fabriciosm@fortalnet.com.br

O desenvolvimento de sistemas de cultivo para ativar folculos primordiais (FP) importante para estudar os
fatores ligados ao inicio da foliculognese. Avaliou-se o Meio Essencial Mnimo (MEM), Soluo Base de
gua de Coco (SBAC) e MEM adicionado de SBAC sobre a morfologia e crescimento de FP caprinos
aps o cultivo de crtex ovariano. Fragmentos de crtex foram cultivados por 1 e 5 dias em MEM, SBAC
ou MEM adicionado de 5, 10, 20, 50, 80, 90 ou 95% de SBAC na presena de BSA, ITS, antibiticos,
antifngico, glutamina, piruvato e hipoxantina. No dia 0 e aps 1 e 5 dias de cultivo, os fragmentos foram
destinados a histologia clssica. Os folculos foram classificados em FP ou FD (desenvolvimento), bem como
em normais ou atrsicos de acordo com a sua morfologia. O percentual de folculos normais e dimetro
folicular foram comparados entre os tratamentos. A atividade mittica das clulas da granulosa (CG) foi
avaliada por imunolocalizao do antgeno nuclear de proliferao celular (PCNA). Teste do Quiquadrado,
ANOVA e Kruskal-Wallis foram utilizados com P<0,05. Concomitante com o aumento dos FD, o percentual
de FP foi reduzido (P<0,05) aps 5 dias de cultivo em todos os meios. A reduo de FP ocorreu com o
aumento do perodo de cultivo de 1 para 5 dias. Aps 5 dias, as maiores taxas de ativao foram observadas
aps cultivo em MEM e MEM adicionado de 5 e 10% de SBAC. Contudo, a adio de SBAC reduziu
progressivamente o percentual de folculos normais. Independentemente do meio, houve aumento (P<0,05)
do dimetro folicular no dia 5 em relao aos dias 0 e 1. Anlise imunohistoqumica mostrou que o PCNA
est geralmente ausente em FP de crtex no-cultivado, mas foi observado aps 5 dias de cultivo no ocito
e nas CG da maioria dos FD. Em concluso, FP caprinos podem ser ativados e crescidos in vitro em MEM,
SBAC ou MEM adicionado de SBAC. A substituio do MEM por at 10% de SBAC mantm as taxas de
ativao e viabilidade similar ao MEM. Alm disso, propores mais elevadas de SBAC aumentam a atresia
folicular.

136

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

ANLISE CITOGENTICA DE EMBRIES BOVINOS E MURINOS


Marques, D.M.1; Carelli, J.B.2; Goldschmidt, B.3
1

Mestranda em Reproduo Animal, UFF, debvet@ig.com.br. 2Aluna de Graduao, UFF. 3Professora


Laboratrio de Citogentica Animal. Faculdade de Veterinria-UFF.

Os avanos das tcnicas citogenticas permitiram a deteco de anomalias cromossmicas em embries


(OCAA-QUERO, et al. The Veterinary Journal, 58: 228-233). Anormalidades cromossmicas so as
causas mais comuns de mortalidade embrionria e fetal em mamferos, tratando-se de uma das maiores
causas de perdas econmicas na produo animal (LONG, S. E. Journal of Reproduction and Fertility,
58: 197-201; REICHENBACH, O embrio, p.3-6 Out/Nov/Dez). A maioria dos relatos de anomalias
crossmicas em embries de animais domsticos descreve aberraes numricas que compreendem
aneuploidia, haploidia, poliploidia e mixoploidia (LONG, S. E. Journal of Reproduction and Fertility, 66:
645-648; KAWARSKY S. J. et al. Biology of Reproduction, 54, 53-59). Entretanto, dificuldades na obteno
de cromossomos de embries no estgio de pr-implantao ocorrem devido ao nmero limitado de clulas
que podem ser avaliadas (McCAULEY, T. C. et el. Theriogenology, 60: 1569-1580; KING. W. A. Veterinary
Science Communications, 3, 51-56), e a necessidade da sincronizao dos blastmeros em metfase
(BOOTH, P. J. et al. Biology of Reproduction, 68: 922-928). A partir da padronizao das tcnicas de
obteno e identificao de cromossomos, ser possvel revelar a existncia de mais rearranjos cromossmicos
(LONG, S. E. Journal of Reproduction and Fertility, 58: 197-201). Neste trabalho, foram estudados 35
embries viveis de camundongos e 22 embries bovinos degenerados, submetidos a trs protocolos diferentes.
Em 30 embries murinos e 17 embries bovinos foi realizado o mtodo para obteno de cromossomos
descrito por BENEVIDES-FILHO I. M. (Rev. Brasil. Genet. 11(3): 661-670) e TARKOWSKY, A. K.
(Cytogenetics, 5: 394-400; KING. W. A. Veterinary Science Communications, 3, 51-56) com
modificaes. Utilizou-se incubao em estufa a 37C por 1-2 horas em meio RPMI 1640, suplementado
com 15% de soro fetal bovino e 200 g/mL de colchicina. Aps a incubao, os embries foram transferidos
para uma soluo hipotnica de citrato de sdio 1%, onde permaneceram por 30-40 minutos. Foram fixados
em lmina com soluo de metanol e cido actico glacial 3:1. A tcnica direta, sem cultivo foi aplicada em 5
embries murinos, utilizando-se somente hipotonizao por 8 a 10 minutos e fixao. Em 5 embries bovinos,
foi utilizada incubao em meio Emcare (Auckland - New Zeland) acrescido de 200 g/mL de colchicina e
mantido junto ao corpo por 1:30 horas, seguida de hipotonizao em citrato de sdio 1% por 40 minutos e
fixao em lmina. Dos 17 embries bovinos e 30 murinos que foram submetidos ao processamento com
cultivo em estufa, obteve-se somente uma metfase de embrio bovino. Dos 5 embries murinos que foram
processados sem cultivo foram obtidas 3 metfases de 2 embries. Dos 5 embries bovinos incubados junto
ao corpo foi obtida uma metfase. Os resultados sugerem que o grau de degenerao dos embries bovinos
est diretamente relacionado no obteno de metfases e que a tcnica que no utiliza incubao, alm de
tornar o procedimento mais prtico, forneceu melhores resultados.

137

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

FSH AUMENTA A EXPRESO GNICA DO RECEPTOR DE FATOR DE


CRESCIMENTO FIBROBLSTICO 3c (FGFR-3c) EM CLULAS
DA GRANULOSA BOVINAS CULTIVADAS
Buratini Jr., J.1; Cao, M.2; Castilho, A.C.S.1; Andrade, P.B.1; Price, C.A.2
1

Departmento de Fisiologia, IB, UNESP, Botucatu, Brasil; 2Centre de Recherche en Reproduction


Animale, Faculty of Veterinary Medicine, University of Montreal, St. Hyacinthe, Canada.
buratini@ibb.unesp.br

O receptor para fator de crescimento fibroblstico 3c (FGFR-3c) ativado por vrios FGFs, incluindo o
FGF-2 (bFGF) e FGF-8. A expresso gnica do FGF-8 foi relatada em ocitos de folculos em crescimento
de camundongos e em clulas da teca (CT) e clulas da granulosa (CG) de folculos antrais bovinos pelo
nosso laboratrio. O FGF-2 majoritariamente expresso em CT de folculos estrognicos na vaca. Ns
recentemente demonstramos a expresso do FGFR-3c em CT e CG bovinas, sendo que os nveis de RNAm
em CG aumentam com o tamanho do folculo e contedo de estradiol. Tendo em vista as mudanas na
expresso gnica do FGFR-3c durante o desenvolvimento folicular, de interesse identificar os fatores
reguladores. Portanto, este estudo testou a hiptese de que o FSH aumenta a expresso gnica do FGFR-3c
em CG bovinas. Folculos pequenos (2-5 mm de dimetro) foram isolados de ovrios obtidos em matadouro
e as CG foram colocadas em meio sem soro suplementado com insulina e 0; 0,1; 1; 10 ou 100ng/ml de FSH
bovino. As clulas foram cultivadas por 6 dias, com troca de meio a cada 2 dias. No dia 6, as clulas foram
recuperadas em Trizol para extrao de RNA total. A expresso do FGFR-3c foi examinada por RT-PCR
semiquantitativo com oligonucleotdeos iniciadores espcie-especficos. O RT-PCR semiquantitativo foi
validado pela escolha de nmeros de ciclos de PCR e quantidade de RNA dentro da fase linear da curva de
amplificao. A intensidade das bandas foi analisada por densitometria computadorizada. Os experimentos
foram realizados em trs pools independentes de clulas. A amplificao do RNAm da histona 2a (H2a) foi
usado como controle interno no PCR e as mdias comparadas pelo teste de Tukey-Kramer HSD. A expresso
do FGFR-3c (RNAm FGFR-3c/RNAm H2a; unidades arbitrrias) foi maior em clulas tratadas com 1; 10
ou 100ng/ml de FSH (9,12,9; 9,43,4 e 12,93,5; respectivamente) do que em clulas tratadas com 0 ou
0,1ng/ml de FSH (1,10.1 e 0,60,1; respectivamente). Em concluso, os dados presentes indicam que o
FSH aumenta a expresso do FGFR-3c em folculos antrais bovinos. Ns propomos que este receptor
regulado pelo FSH pode desempenhar um papel importante durante a diferenciao e proliferao das CG
em folculos antrais bovinos.
Financiado pela FAPESP, Brasil e NSERC, Canad.

138

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EXPRESSO GNICA DO FATOR DE CRESCIMENTO FIBROBLSTICO


10 (FGF-10) EM FOLCULOS ANTRAIS BOVINOS
Pinto, M.G.L.1; Price, C.A.2; Giometti, I.C.1; Costa, I.B.3; Teixeira, A.B.1;
Barros, C.M.3; Buratini Jr., J.4
1

Departamento de Reproduo Animal, FMVZ, UNESP, Botucatu, Brasil; 2Centre de Recherche en


Reproduction Animale, Faculty of Veterinary Medicine, University of Montreal, St. Hyacinthe, Canada;
Departamentos de 3Farmacologia e 4Fisiologia, IB, UNESP, Botucatu, Brasil. mglp@fmvz.unesp.br
Os fatores de crescimento fibroblsticos (FGF)-7 e 10, tambm conhecidos como fatores de crescimento
dos queratincitos 1 e 2, so reconhecidos como mediadores parcrinos de interaes entre clulas
mesenquimais e epiteliais que regulam proliferao e diferenciao celular. H evidncias de que o FGF-7 e
FGF-10 regulam a morfognese glandular endometrial na ovelha. Ambos os ligantes ativam uma nica isoforma
de receptor para FGF, o FGFR-2b. No ovrio, o FGFR-2b predominantemente expresso em clulas da
granulosa (CG) e o FGF-7 em clulas da teca (CT), embora o ocito no tenha sido investigado. Nada se
sabe sobre o padro de expresso do FGF-10 no folculo. Para melhor caracterizar o padro de expresso
gnica do FGF-7 no folculo e determinar se o FGF-10 pode desempenhar papel na regulao do
desenvolvimento folicular bovino, foi investigado se o FGF-7 e 10 so expressos pelo ocito e mensurada a
expresso gnica do FGF-10 por RT-PCR semiquantitativo em CG e CT de folculos antrais em distintos
estgios de desenvolvimento. Ovrios bovinos foram obtidos em matadouro. Complexos cumulus-ocito
foram recuperados por aspirao folicular, as clulas do cumulus removidas e o RNA total extrado de
grupos de 50 ocitos. Para a anlise de CG e CT, folculos com dimetro maior que 5mm foram dissecados,
os tipos celulares separados e o RNA total extrado. As concentraes de esterides no fluido folicular foram
determinadas por RIE. Folculos com progesterona acima de 100ng/ml foram considerados atrsicos e
excludos da anlise. Os folculos restantes foram agrupados de acordo com a concentrao de estradiol (E2)
como se segue: (1) <5; (2) 5 and <20; (3) 20 and <100; and (4) 100ng/ml.. A expresso do FGF-10,
mas no do FGF-7, foi detectada em ocitos bovinos. A expresso do FGF-7 e do FGF-10 foi detectada
em CT, porm no em CG. A expresso do FGF-10 diminuiu com o aumento da concentrao de E2, tendo
sido maior no grupo 1 (17219 unidades; P<0,05) comparado aos grupos 2 (10521) e 3 (10614), os
quais, por sua vez, apresentaram valores maiores que o do grupo 4 (5412; P<0,05). Em concluso, os
dados presentes sugerem um papel para o FGF-10 como mediador na sinalizao parcrina do ocito ou
CT para CG. Alm disso, a diminuio no sinal do FGF-10 com o contedo de E2 indica que a transcrio
do FGF-10 regulada ao longo do desenvolvimento folicular bovino. Financiado pela FAPESP, Brasil e
NSERC, Canad.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

DETECO DA EXPRESSO DE RNA MENSAGEIRO (mRNA) IMPRINTED EM


CLULAS DO CUMULUS, FIBROBLASTOS, PLACENTA E EMBRIES BOVINOS
Franco, M.M.1; Melo, E.O.1; Mundim, T.C.D.1; Pereira, D.C.1;
Iguma, L.T.1; vila, F.F.1; Rumpf, R.1

Laboratrio de Reproduo Animal, EMBRAPA Recursos Genticos e Biotecnologia, Braslia,


DF, Brasil. Avenida W/5 Norte Final, PqEB, Prdio Biotecnologia, Sala 7B, 70770-900.
mfranco@cenargen.embrapa.br

As tecnologias reprodutivas so importantes para a multiplicao de animais de alto mrito gentico e para
otimizar o uso da fmea bovina. Embora a transferncia de embries, a produo in vitro de embries e
principalmente a clonagem apresentarem baixa eficincia, elas so importantes para assistir o melhoramento
animal. O imprint uma modificao epigentica estabelecida durante a gametognese de forma sexo
especfica, transmitida para o zigoto e mantida no embrio, mas apagada na linhagem germinativa para ser
novamente reestabelecida (Pedone, P.V., FEBS Letters, 458, 45-50). A metilao no DNA est envolvida
no processo de imprinting controlando a expresso de genes (Reik, W., Science, 293, 1089-1093; Li, E.,
Nature Reviews, 3, 662-673) dentre eles o IGF2 e IGF2R que so importantes para o ovcito e o
desenvolvimento embrionrio. O cultivo in vitro pode alterar os padres de metilao no DNA, alterando a
expresso destes genes (Khosla, S., Biology of Reproduction, 64, 918-926). Estudos de expresso de
genes imprinted podem contribuir para o incremento da eficincia da TE, PIV e clonagem. O objetivo deste
estudo foi detectar a expresso dos genes IGF2 e IGF2R em clulas do cumulus, fibroblastos, placenta e
embries. RNA total foi isolado de clulas do cumulus retiradas de 50 e 70 complexos cumulus-ovcitos no
maturados e maturados in vitro, respectivamente, de 106 fibroblastos de pele cultivados in vitro, de 700 mg
de placenta de um animal clone (Vitoriosa da Embrapa) e de 43 blastocistos PIV usando TRIzol Reagent
(Invitrogen, USA) de acordo com recomendaes do fabricante. A transcrio reversa foi feita usando o kit
EZ-First Strand cDNA Synthesis Kit (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel) de acordo com
recomendaes do fabricante e 1-2 g de RNA total. O gene da -actina foi usado como controle constitutivo
e as reaes de PCR foram feitas em um termociclador PTC-100 MJ Research. Aps um passo de 93C
por 4 min, a amplificao foi realizada usando 40 ciclos de 93C por 40 seg, 56C por 40 seg e 72C por 1
min, terminando com uma extenso final de 72C por 5 min. As condies de reao foram: 2 U de Taq
DNA polimerase, Tampo da enzima 1X, 2 mM MgCl2, 200 M de cada dNTP, 0.5 M de cada primer,
e 10 L of cDNA em um volume final de 20 L. 12 L de cada amostra foi utilizada para a eletroforese em
gel de agarose 1,5%. A -actina foi detectada em todas as amostras, IGF2 em clulas de cumulus maturadas,
fibroblastos e placenta e IGF2R em todas as amostras exceto em clulas do cumulus no maturadas. Estes
resultados so muito importantes pois pouco conhecido sobre expresso de mRNA imprinted em bovinos,
sendo que apenas o gene IGF2R est descrito at o momento. Alm disso, estudos de deteco de expresso
gnica so a base para qualquer experimento quantitativo e/ou comparativo.

140

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

CARACTERIZAO DE FIBROBLASTOS FETAL E ADULTO DE BOVINOS


NELORE PARA TRANSFERNCIA NUCLEAR
Caetano, H.V.A.1; Milazzotto, M.P.1, Assumpo, M.E.O.A.1, Visintin, J.A.1
1

Departamento de Reproduo Animal FMVZ/USP So Paulo-SP, Brasil.-hvac@bol.com.br

As biotcnicas reprodutivas mais atuais empregam a tcnica de transferncia nuclear na produo de animais
transgnicos, objetivando produzir protenas de interesse humano e rgos para xenotransplantes. Este estudo
tem como objetivo, padronizar linhagens primrias estveis de fibroblastos fetal e adulto de bovinos da raa
Nelore como fontes doadoras de ncleos na reconstruo de embries. Os fibroblastos foram caracterizao
por aspectos morfolgicos, ultra-estructurais e imunocitoqumicos. Os fibroblastos fetal foram obtidos a
partir de pele de feto com 60 dias de idade e os fibroblastos adulto da pele auricular de animal adulto da raa
Nelore. As culturas primrias foram mantidas em condies estreis em meio TCM199, 10% SFB e
gentamicina a 39oC, 5% de CO2 e alta umidade. As culturas foram observadas em microscpio de contraste
de fase diariamente, sendo identificadas as fases mitticas e estabelecido as curvas de crescimento celular.
Para confirmao da natureza das culturas, fibroblastos foram colhidos nas passagens 5, 10 e 15, detectouse a protena vimentina, pela tcnica de imunocitoqumica indireta, utilizando-se os anticorpos primrios antivimentina (cloneV9-1:40 Sigma) e anti citoqueratina (cloneV11 1:400 Sigma) e como anticorpo
secundrio igG anti camundongo conjugado com fluorescena (1:3000 Sigma). As culturas primrias de
fibroblastos fetal e adulto na 2o passagem tiveram marcao positiva para citoqueratina em algumas clulas
uma protena de filamento intermedirio tpica de clulas epiteliais, no se repetetindo nas passagens
subsequentes. Nas passagens 5, 10 e 15, os fibroblastos fetal e adulto responderam positivamente marcao
anti vimentina e no houve marcao anti-citoqueratina (controle negativo). Ficou demonstrado que os
fibroblastos continuam expressando vimentina e mantendo em cultivo as caractersticas morfolgicas, apesar
das vrias passagens celulares. Fibroblastos adulto e fetal foram colhidos, processados e analisados em
microscpio eletrnico de transmisso. A anlise ultra - estrutural revelou a presena de organelas envolvidas
na sntese de protenas, retculo endoplasmtico granular bem desenvolvido, cisternas do Golgi dilatadas e
presena de poliribossomos. Tambm foi observada a presena de mitocndrias alongadas dispostas ao
redor desse complexo, sugerindo alta atividade metablica. Ficou demonstrado que apesar das condies
impostas pelo cultivo, os fibroblastos continuam desenvolvendo atividades biolgicas e mantendo as
caractersticas que os tornam aptos como doadores de ncleo para transferncia nuclear. Essas foram utilizadas
com sucesso na reconstruo de ocitos e obteno de dois bovinos clonados.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

POTENCIAL DE DESENVOLVIMENTO DE EMBRIES BOVINOS


SUBMETIDOS TRANSFERNCIA NUCLEAR MEDIANTE
INIBIO MEIOTICA COM ROSCOVITINA
Merighe, G.K.F.1; Watanabe, Y.F.2; Leal, C.L.V.1; Meirelles, F.V.1
1

Laboratrio de Morfofisiologia Molecular e Desenvolvimento Departamento de Cincias Bsicas FZEA/USP, Pirassununga-SP, Brasil. 2Vitrogen - Pesquisa e Desenvolvimento em Biotecnologia da
Reproduo S/C Ltda. gkrempel@usp.br

A roscovitina, um potente inibidor da atividade da quinase cdk2 componente do fator promotor da meiose
(MPF), foi utilizada para facilitar a rotina de manipulao de transferncia nuclear. Os ocitos foram
selecionados e divididos em dois grupos: (1) grupo controle, submetidos apenas maturao e (2) grupo
bloqueado, submetidos pr-maturao com 25 M roscovitina durante 8 horas e, em seguida, maturao.
Foi avaliado o grau de maturao nuclear de ambos os grupos, sendo que 93,3% dos ocitos do grupo
controle encontravam-se em MII aps 18 horas de maturao. Uma taxa similar (80%) foi observada no
grupo bloqueado, 18 horas aps liberao do bloqueio. Os ocitos enucleados e reconstrudos com clulas
somticas de animal adulto foram fundidos aps 23 horas de maturao e as taxas de fuso no diferiram
entre os grupos (65,3 3,0% e 65,7 2,9% para o grupo controle e grupo bloqueado, respectivamente).
Aps 24 horas de maturao, os ocitos foram ativados com ionomicina (5,0 M) durante 5 minutos e por
mais 3 horas em 6-DMAP (2,0 mM). A taxa de desenvolvimento at o estdio de blastocito foi maior para
o grupo controle que para o bloqueado (21,6 2,7% vs 7,1 3,0%; p < 0,01). Embora no tenha sido
observada diferena entre as taxas de fuso, ntida a diversidade na produo de blastocistos, evidenciando
uma falha no desenvolvimento dos ocitos bloqueados. A taxa de blastocistos observada nos ocitos ativados,
tambm diferiu entre os grupos (31,6 3,4% para os ocitos no bloqueados e 19,3 4,5% para aqueles
bloqueados; p < 0,05). Apesar da baixa taxa de desenvolvimento, os embries produzidos por TN que
alcanaram o estdio de blastocistos no apresentaram diferena na taxa de prenhez aos 30 dias (50%, n = 3
e 50% n = 1 para os grupos no bloqueados e bloqueados, respectivamente). Maiores estudos esto sendo
realizados para esclarecer a perda de competncia dos ocitos bloqueados com roscovitina. O bloqueio
uma ferramenta importante na melhoria da eficincia da clonagem bovina.
Apoio: VITROGEN e Pr-Reitoria de Pesquisa da USP

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

ATIVAO PARTENOGENTICA DE OCITOS BOVINOS UTILIZANDO


CITOCALASINA B OU D EM ASSOCIAO COM CICLOHEXIMIDE
Forell, F.; Feltrin, C.; Vieira, A.D.; Antoniolli, C.B.; Rodrigues, J.L.
Laboratrio de Embriologia e Biotcnicas de Reproduo, FAVET, UFRGS - CP 15004, CEP 91501970, Porto Alegre, RS, Brasil - fforell@ufrgs.br
A ativao do ocito uma das etapas crticas para o sucesso das tcnicas de clonagem. O objetivo deste
trabalho foi comparar a eficincia da cictocalasina B (CB) e D (CD) em associao com cicloheximide
(CHX), na induo da ativao partenogentica de ocitos, usando dois diferentes perodos de incubao.
Ocitos foram coletados de ovrios de abatedouro atravs da escarificao da crtex ovariana. Os ocitos
bovinos foram maturados em TCM199 com 10% de SVE, 0,5 g/mL de FSH e 0,03UI de hCG em atmosfera
mida contendo 5% CO2, em ar, durante 17 h. Aps a remoo das clulas do cumulus oophorus em
vortex em meio contendo 0,1% de hialuronidase, os ocitos em MII foram transferidos para gotas de meio
HSOF com 0,4% de BSA sob leo mineral, mantidos a 37C (mesa aquecedora) durante 7 h. Todos os
ocitos foram expostos durante 5 min a 5 M de ionomicina em HSOF sem protena. Em seguida foram
transferidos para o meio SOFaa com 10% de SVE (SOFaaSVE) suplementado com 10 g/mL de CHX e
citocalasina de acordo com os tratamentos: T1) 5 g/mL CB por 3 h; T2) 5 g/mL CB durante 5 horas; T3)
2,5 g/mL CD durante 3 h; ou T4) 2,5 g/mL CD durante 5 h. Ao final da induo da ativao, os ocitos
foram transferidos para gotas de 80L de meio SOFaaSVE sob leo mineral e cultivados em cmara de
cultivo a 39C em atmosfera mida contendo 5% CO2, 5% O2 e 90% N2. Aps trs replicaes, os dados
foram analisados pelo teste de qui-quadrado. A taxa de clivagem do T1 (37,2%-38/102) foi significativamente
mais baixa (p<0,05) do que T2 (63,7%-65/102), T3 (53,1%-52/98) e T4 (56,4%-57/101), no havendo
diferena significativa entre os T2, T3 e T4. Entretanto, quando analisamos a taxa de blastocistos, observamos
que os T1 (13,7%-14/102) e T3 (20,4%-20/98) diferiram significativamente dos T2 (36,3%-37/102) e T4
(35,6%-36/101), no havendo diferena significativa entre T1 e T3, e entre T2 e T4. As citocalasinas B e D
em associao com a CHX promovem ativao partenogentica em taxas similares. O perodo de incubao
de 5 h foi mais eficiente do que o de 3 h.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

PRODUO DE EMBRIES PRONUCLEARES PARA MICROINJEO DE DNA


EXGENO EM OVELHAS PELIBUEY SUPEROVULADAS COM FSH-P E GnRH.

Solano, R.F.1; De Armas, R,T.2; Castro, F.O.2; Aguilar, A.P.


1

Escola de Medicina Veterinria do Maranho (UEMA). 2Centro de Investigacin de Ingeniera Gentica e


Biotecnologa Habana, Cuba. solanoferro@.com.br

O presente trabalho teve por objetivo a obteno de embries em estgio de proncleo, de ovelhas Pelibuey.
Vinte e duas fmeas foram sincronizadas durante a estao reprodutiva com esponjas vaginais de acetato de
flurogestona (FGH), 40 mg divididas em dois grupos (A=10 e B=12 ovelhas respectivamente). A superovulao
foi obtida aplicando 18 mg de FSH (Folltropin-v) em doses decrescentes (4-4; 3-3; 2-2) Adicionalmente, o
grupo B recebeu 100 g de GnRH, 24 horas aps a retirada das esponjas.Os animais foram acasalados por
carneiros frteis. As ovelhas apresentaram estro entre 30 e 35 horas aps a remoo das esponjas e cobertas
entre 42 s 48 horas. O crescimento folicular e as ovulaes foram monitorados por laparoscopia, monitorandose 24 horas aps a retirada das esponjas, continuando a cada 3 horas durante o estro. A colheita das
estruturas foi obtida pela tcnica cirrgica da linha mdia e o lavado dos oviductos foi realizado com 20 ml de
PBS. (A anlise de varincia no revelou diferena significativa P>0,005) entre protocolos A e B (P>0,05).
O nmero mdio de folculos > 5 mm nos grupos A e B foram, 8,52 0,61; 10,5 0,53; de corpos lteos
6,52 1,30; 8,351,08; de estruturas colhidas 4,05 0,51; 7,70 2,01. As primeiras ovulaes aconteceram
s 54,2 6,41; 62,1 3,50 horas aps a retirada das esponjas, nos grupos A e B, respectivamente. O
nmero mdio de embries em estgio de proncleo no momento da colheita foi de 1,70 2,90; 2,171,20;
6 horas aps das ovulaes. A demais estrutura foi cultivada em meio TCM-199 acrescido de 20 % SFB; a
37 o C; 100 % umidade relativa e 5 % de.CO2 Um total de 2,351,50 e 3,251,20 estruturas atingiram a
.
fase de proncleo aps 3 horas de cultivo. Conclui-se que a maior taxa de embries em estgio de proncleo
pode-ser obtida entre 68,53,02 e 72,32,50 horas aps a retirada das esponjas. O tratamento com GnRH
sincronizou as ovulaes, mas no aumentou o nmero de ovulaes.

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PRODUO DE EMBRIES BOVINOS QUIMRICOS UTILIZANDO-SE


CLULAS DA MASSA CELULAR INTERNA OU CLULAS SEMELHANTES
S TRONCO EMBRIONRIAS (ES-LIKE-CELLS) DE BOVINO*
Wolf, A.1; Gabaldi, S.H.2; Garcia, J.M.3
1

Dep. de Rep. An. e Rad. Vet. - FMVZ - UNESP - Botucatu, Brasil alexandrewolf@hotmail.com ; 2
Dep. de Rep. An. - FMVZ - USP - So Paulo, Brasil; 3 Dep. de Med. Vet. Prev. e Rep. An. - FCAV UNESP - Jaboticabal, Brasil
A produo de embries bovinos quimricos com a utilizao da massa celular interna (MCI) de embrio
bovino ou de clulas semelhantes s tronco embrionrias (ES-like-cells) bovinas uma alternativa para a
obteno de bovinos transgnicos. O objetivo deste trabalho foi verificar a competncia das clulas da MCI
bovina na produo de embries quimricos, pela tcnica da microinjeo em embrio de 16 clulas (E16), e
das ES-like-cells, em blastocisto (Bl). Todos os embries utilizados foram produzidos in vitro (PIV) a partir
de ovrios de abatedouro e cultivados em meio SOF+BSA, em estufa mida (39C e 5% de CO2, 5% de O2
e 90% de N2). No experimento I (Exp. I), as MCIs de blastocistos expandidos (Blx) PIV foram isoladas
mecanicamente com pipeta de Pasteur de vidro. No experimento II (Exp. II), as linhas de ES-like-cells
foram isoladas da MCI de Blx PIV, implantadas e repicadas mecanicamente sobre uma monocamada de
fibroblasto de murino inativada com mitomicina C, e cultivadas em meio KnockoutTM D-MEM+15% de
KnockoutTM SR+suplementos, em estufa mida (39C e 5% de CO2 em ar). No 3o repique, trs linhas foram
classificadas como ES-like-cells, morfologicamente (Stice et al., Biol. Reprod., 54:100-10, 1996) e pela
colorao da fosfatase alcalina. As mitocndrias das MCIs e das ES-like-cells foram coradas com Mito
Tracker Red CMXRos por 10 min. As MCIs foram microinjetadas em 77 embries no estdio E16, e as ESlike-cells foram desagregadas com colagenase (0,25% em PBS) e microinjetadas na blastocele de 60 Blx.
Estes embries micromanipulados foram cultivados em meio SOF+BSA+SFB, durante 48h, e avaliados por
microscopia ptica e de fluorescncia. No Exp. I, 77,9% dos E16 microinjetados apresentaram desenvolvimento
a Blx ou eclodido e, 100% destes blastocistos apresentaram clulas fluorescentes na MCI, e poucas no
trofoblasto. No Exp. II, 70% dos Blx apresentaram clulas fluorescentes na MCI, 20% no trofoblasto, 1,7%
soltas na blastocele, 3,3% no apresentaram clulas fluorescentes e 5% degeneraram; porm, 36,7%
apresentaram clulas fluorescentes tanto na MCI quanto no trofoblasto. Concluiu-se que a maioria dos
embries microinjetados com MCI ou ES-like-cells tornou-se quimera, pois as ES-cells presentes na MCI
e as ES-like-cells cultivadas mostraram elevada afinidade em se agregar preferencialmente MCI dos embries
microinjetados.
Suporte Financeiro: FAPESP - So Paulo, Brasil.

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ENUCLEAO QUMICA DE OCITOS BOVINOS COM COLCHICINA

Saraiva, N.Z.; Perecin, F.; Costa, P.F.; Ferreira, C.R.; Mo, S.C; Garcia, J.M
DMVPRA-FCAV-UNESP, Via de acesso Prof. Paulo D. Castellane s/n, CEP 14884-900, Jaboticabal
SP, Brasil. naiaravet@hotmail.com
A enucleao qumica permite superar alguns importantes problemas da micromanipulao, permitindo uma
produo rpida e fcil de citoplastos receptores para a transferncia nuclear (ELSHEIKH, J. Vet. Res.,
v.45, p.217-220). Este experimento objetivou avaliar as taxas de enucleao promovidas pela colchicina, um
agente anti-mittico, capaz de interferir na ao da tubulina, uma protena que constitui os microtbulos e
fusos e responsvel pela segregao cromossmica. Ocitos obtidos de ovrios de vacas de abatedouro e
apresentando citoplasma homogno e cumulus compacto eram selecionados e transferidos para placas com
quatro poos Nunc com 500L de meio de maturao [TCM 199 com sais de Earle (GibcoBRL) e
bicarbonato de sdio (2,2mg/mL), suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1g/mL FSH, 50g/mL
hCG, 1g/mL estradiol, 0,25mM piruvato de sdio e 75g/mL amicacina] (50-60 ocitos/poo) e cultivados
a 38,5C e 5% CO2 em ar. Aps 12 horas de MIV, os ocitos foram submetidos aos seguintes tratamentos:
A) 0,5M colchicina, B) 0,75M colchicina, C) 1M colchicina e D) grupo controle. Aps 24 horas de
MIV, as clulas do cumulus eram removidas com hialuronidase 0,2%. Os ocitos eram corados com Hoechst
33342 (10g/mL) e as taxas de enucleao avaliadas sob microscpio de epifluorescncia. Os resultados
foram analisados por ANOVA e as mdias pelo teste de Duncan. A anlise estatstica revelou diferena
(P<0.05) entre o grupo controle [3 enucleados espontaneamente em 198 ocitos (1,16 1,66%)] e tratados,
onde observou-se: 41 enucleados em 244 ocitos tratados no grupo A (17,10 3,59%), 58 enucleados em
277 ocitos tratados no grupo B (21,19 3,64%) e 46 enucleados em 275 ocitos tratados no grupo C
(16,56 4,69). Em estudos anteriores, observamos que concentraes mais elevadas de colchicina levaram
a grande fragmentao do DNA. Em murinos, a enucleao qumica est bem estabelecida, mas a razo para
esta diferena espcie-especfica no conhecida. Mais esforos so necessrios para se compreender o
processo biolgico que conduz a segregao cromossmica, especialmente em bovinos.

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TRANSFECO IN VITRO DE MIOBLASTOS BOVINOS PARA


TRANSFERNCIA GNICA MEDIADA POR CLULAS
Milazzotto, M.P.1; Caetano, H.V.A.1; Niccio, A.C.1; Simes, R.1; Yamada, C.1; Visintin, J.A.1
1

Depto de Reproduo Animal, FMVZ, USP 05508-900 So Paulo, Brasil - mazamila@terra.com.br

Mioblastos adultos so clulas mononucleadas localizadas entre a lmina basal e o sarcolema do msculo e
contribuem para a reparao e hipertrofia muscular. A transferncia gnica para essas clulas uma importante
ferramenta para o estudo do crescimento e desenvolvimento muscular. Alm disso, o msculo um excelente
tecido para a transferncia de protenas recombinantes devido a sua habilidade de incorporar e expressar
DNA exgeno. No entanto, estratgias eficientes para a manipulao gentica de mioblastos bovinos ainda
no foram desenvolvidas. O objetivo desse estudo foi determinar o mtodo mais eficiente in vitro para
incorporao e expresso de gene reprter em clulas musculares bovinas. Mioblastos foram isolados dos
msculos semitendinoso e semimembranoso de feto bovino de 6 meses. Cultura primria foi estabelecida em
meio mnimo essencial Dulbelco DMEM (Sigma, Missouri-USA) contendo 10% de soro fetal bovino
(Sigma, Missouri-USA) e 1% de antibiticos. Linhagens celulares miognicas foram identificadas por ensaio
de fuso de miotubos e presena de marcador msculo especfico, miostatina, por RT-PCR. Quatro diferentes
protocolos para transfeco (Fosfato de Clcio, eletroporao e dois lipdeos catinicos comerciais Effectene;
Qiagen California-USA e FuGENE 6; Roche, Indiana-USA) foram testados para sua eficincia em transfectar
mioblastos com o gene reprter GFP (green fluorescent protein) sob controle do promotor do CMV
(citomegalovrus) em culturas semiconfluentes. Resultados de microscopia de fluorescncia mostraram lipdeos
catinicos como a mais eficiente metodologia para transferncia gnica em mioblastos bovinos, tornando-se
uma importante ferramenta em estudos de crescimento e desenvolvimento muscular.
Agradecimentos: FAPESP 03/0156-9

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EXPRESSO DO GENE DA MIOSTATINA EM MSCULO ESQUELTICO


DE FETOS NELORE (BOS PRIMIGENIUS INDICUS)
Milazzotto, M.P.1; Martins, L.1; Caetano, H.V.A.1; Feitosa, W.B.1;
Assumpo, M.E.O.A.1; Visintin, J.A.1
1

Depto de Reproduo Animal, FMVZ, USP 05508-900 So Paulo, Brasil - mazamila@terra.com.br

A superfamlia dos fatores de crescimento transformantes beta compreendem um grande nmero de fatores
de crescimento e diferenciao que apresentam importantes papis na regulao do desenvolvimento fetal e
na manuteno da homeostase em animais adultos. A miostatina um membro dessa superfamlia com papel
no controle e manuteno da massa muscular esqueltica. Ela uma protena secretada que age como
regulador negativo do crescimento muscular esqueltico. Durante a embriognese, a miostatina expressa
pelas clulas no miotomo e age regulando o nmero final de fibras musculares que sero formadas, tornandose um importante fator no estudo do desenvolvimento corporal de animais de produo. O objetivo desse
estudo foi caracterizar o padro de expresso gnica da miostatina na musculatura esqueltica durante o
desenvolvimento fetal em animais Nelore, a raa mais adaptada no Brasil. Fetos Nelore de diferentes estgios
de desenvolvimento (20, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 dias de gestao) foram obtidos de abatedouro.
Fragmentos de aproximadamente 5mm3 foram retirados do msculo semitendinoso e estocados em N .
2
RNA total foi extrado desses fragmentos com TRIZOL (Invitrogen, Califrnia-USA) and RT-PCR foi
conduzido com a utilizao de 5ng de RNA total, oligo dT e Superscript II first strand synthesis for RTPCR (Invitrogen, Califrnia-USA). Reaes de PCR semi- quantitativo foram padronizadas para o gene da
miostatina e da gliceraldedo-3-fosfato desidrogenase - GAPDH (controle interno). As amostras foram
submetidas ao PCR semiquantitativo e os resultados mostraram que a expresso da miostatina ocorre desde
os primeiros estgios do desenvolvimento muscular (20 dias) at os estgios finais (240 dias) mostrando que
o controle do desenvolvimento muscular necessrio durante todos os estgios da vida fetal. O aumento no
padro de expresso foi observado nos dias 210 e 240 sugerindo que o controle mais acurado deve ser
requerido ao final do perodo de desenvolvimento.
Agradecimento: FAPESP 03/0156-9

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EXTRAO SIMULTNEA DE RNA, DNA E PROTENAS DE TECIDO


OVARIANO E TESTICULAR DE FETOS BOVINOS
Siqueira, F.1,2; Grisolia, A.B.1,2; Santos, S.E.C.2; Nunes, C.M.2; Lopes, C.R.1;Garcia, J.F.2
1

Instituto de Biocincias Departamento de Gentica UNESP Botucatu SP Brasil.;


Departamento de Apoio, Produo e Sade Animal LBBMA UNESP Araatuba SP Brasil.
biasiqueira@hotmail.com

Tcnicas de biologia molecular esto sendo utilizadas para anlise de tecidos reprodutivos bovinos para
identificar componentes moleculares e mecanismos envolvidos na expresso diferencial de genes. Anlises
do transcriptoma e proteoma necessitam de preparao de alta qualidade das macromolculas e, em alguns
casos, a grande quantidade de amostras biolgicas fator limitante. Para extrao simultnea de RNA, DNA
e protenas, 100mg de ovrio e testculo de fetos bovinos foram utilizados para 1ml de fenol isotiocianato de
guanidina (TRIzol, Invitrogen Life Technologies). Os tecidos foram fragmentados em pequenos pedaos e
imediatamente colocados em TRIzol e homogeneizados. Depois da completa remoo da fase aquosa, que
continha o RNA, a interfase e a fase fenlica foram isoladas. Protenas foram extradas do sobrenadante fenol
etanol obtido aps precipitao do DNA com etanol utilizando hidrocloreto de guanidina em etanol 95%.
Concentrao de RNA, DNA e a razo A260/280nm foi determinada por espectrofotometria. A concentrao
de protenas foi determinada por BCA protein assay. As quantidades de RNA, DNA e protenas foram,
respectivamente, 1,5g/ml, 0,5g/ml e 198g/ml. Eletroforese em gel de formaldedo foi realizada para amostras
de RNA e gel de agarose 2% para DNA. As protenas foram observadas em gel SDS page 7,5%. A
qualidade do RNA e do DNA foi determinada por RT-PCR (Reverse Transcriptase Polimerase Chain
Reaction) e por PCR (Polimerase Chaim Reaction), respectivamente. Genes GAPDH, FSHR, LHR, e
GnRH foram empregados para essas anlises. Embora a sensibilidade deste mtodo seja mais baixa que o
isolamento direto de RNA, DNA e protenas, foi observado benefcios em reduo de tempo e custo como
tambm possibilita a preparao de RNA, DNA e protenas de mesma amostra biolgica.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EXPRESSO DE MOLCULAS MHC NO CLSSICAS EM PLACENTAS


DE BOVINOS CLONADOS OU NO.
Puelker, R.Z.1; Kfouri Jr., J.R.2; Verechia, F.T. 3; Meirelles, F.V.1
1

Departamento de Cincias Bsicas FZEA/USP, PirassunungaSP, Brasil. 2Departamento de


Anatomia e Cirurgia FMVZ/USP, So PauloSP, Brasil. 3UNESP Unidade Diferenciada de
DracenaSP, Brasil. raeduardo@ig.com.br
Em humanos e camundongos, estudos mostraram que molculas MHC classe Ib que se ligam a receptores
inibidores de clulas NK protegem o trofoblasto da ao ltica destas clulas. Em camundongos, a expresso
de um gene denominado Ped conhecida por estar correlacionada com o desenvolvimento e sobrevivncia
do embrio no perodo de pr-implantao e tambm no perodo de gestao. Este gene pertence ao MHC
e tem como produto uma protena classe Ib, o antgeno Qa-2. No bovino, pouco se sabe sobre o papel de
genes do complexo BoLA nos mecanismos que envolvem a biologia do desenvolvimento embrionrio e fetal.
Desta forma, este trabalho tem como objetivos a identificao e o estudo da expresso de molculas no
clssicas do MHC classe I em placentas de bovinos, podendo contribuir para a compreenso de um fator
crucial para o sucesso da produo de conceptos nesta espcie. Neste estudo, amostras de placentas de
camundongos e bovinos provenientes de transferncia nuclear ou no foram colhidas de forma assptica,
preservando-se a interface materno-fetal. Todas as amostras foram fixadas e includas em parafina. Os
cortes em lminas de vidro foram desparafinados, lavados em PSB e incubados por 30 minutos em soluo
de leite desnatado a 5% em PBS a 37oC. A seguir, os cortes foram lavados em soluo de Twenn 20 a
0,05% em PBS e incubados com anticorpo monoclonal de camundongo anti-Qa-2 marcado com FITC
(clone 69h1-9-9, eBioscience, San Diego, CA). Aps lavagem com PBS os cortes foram incubados com
anticorpo secundrio anti- FITC produzido em coelho (Alexa Fluor 488, Molecular Probes, Oregon, USA)
e a seguir lavados em PBS para ento serem montados com glicerina e visualizados sob um filtro especfico
em microscpio de epifluorescncia. A anlise das clulas que expressam ou no antgenos MHC classe Ib
foi realizada em amostras de placentas murinas (controle) e bovinas pela tcnica de citometria de fluxo. Todo
o procedimento de lavagem e separao celular foi realizado a 20C com o meio RPMI 1640 de cultura a
37C. A suspenso celular foi incubada com o anticorpo anti-Qa-2 marcado com FITC e em seguida com
anticorpo anti- FITC. Para controle negativo as clulas foram incubadas somente com anticorpo anti- IgGs
de camundongo marcado com FITC. A leitura das lminas submetidas a imunohistoqumica com anticorpo
anti-Qa-2 mostrou a presena de poucas clulas positivas na poro materno-fetal dos tecidos controles e
de bovinos coletados em matadouro. No entanto, foi possvel visualizar um aumento no nmero de clulas
apresentando sinal positivo para a presena de antgeno MHC classe Ib nos tecidos oriundos de bovinos
produzidos por TN. Dados qualitativos da anlise por citometria de fluxo mostraram uma maior expresso
de antgenos Qa-2 nas clulas presentes das populaes encontradas no segundo tero (19,54%) da gestao
de bovinos quando comparado ao primeiro (14%) e terceiro teros (14%).
Apoio FAPESP.
150

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PLACENTAO EM BOVINOS CLONADOS


Pereira, F.T.V.1; Braga, F.C.2; Assis Neto, A.C.1; Ambrsio, C.E.2; Kfoury Jr., J.R.2; Oliveira,
L.J.2; Papa, P.C.2; Carvalho, A.F.3; Santos, T.C.2; Visintin, J.A.2; Mello, M.B.2; Garcia, J.M.4;
Yamazaki, W.4; Rumpf, R.5; Iguma, L.T.5; Carter, A.M.6; Leiser, R.7; Miglino, M.A.2
1

Universidade Estadual Paulista (UNESP-Dracena/SP); 2Universidade de So Paulo (FMVZ-USP);


UNIFEOB (So Joo da Boa Vista-SP); 4 Universidade Estadual Paulista (UNESP-Jaboticabal/SP);
5
Embrapa-Cenargen (Braslia DF); 6University of Southern Denmark, Odense, Denmark; Justus-Liebig
Universitt Giessen, Germany. fverechia@dracena.unesp.br
3

A fisiologia reprodutiva de animais clonados, incluindo as alteraes que podem ocorrer na placenta, necessitam
ser melhor esclarecidas. O objetivo deste experimento foi o de comparar a morfologia de placentas bovinas
normais e de bovinos clonados atravs da macroscopia, microscopia de luz, microscopia eletrnica de
transmisso e de varredura. Fetos clonados foram produzidos por transferncia de clulas somticas ou
fetais. Dados de gestaes normais serviram como controle. Placentnios, regies interplacentomais e
membranas fetais foram examinadas para macroscopia e microscopia de luz (hematoxilina e eosina, azul de
Toluidina, Tricromo de Gomori + paraldedo-fucsina, Picrossrius, azul de metileno + fucsina bsica e soluo
de nitrato de prata), microscopia eletrnica de transmisso e de varredura. Os placentnios (39) mostraram
reas hemorrgicas no corioalantide. O dimetro dos placentnios (21cm), a espessura (3,31cm) e o peso
(150g) foram mensurados. No lado fetal, o tronco de poucas rvores vasculares formado por uma nica
artria e duas veias. Elas possuem um vilo de origem inserido em criptas vasculares na superfcie materna. A
artria de origem difere da gestao normal e o sistema capilar no parece ser um complexo muito denso de
convolues capilares fetais e dilataes sinusoidais, como em placentao normal. Os capilares fetais (510m dimetro) eram menores do que o observado em bovinos normais (7 a 12 m tero mdio de
gestao). O sistema de capilares maternos aparece mais ramificado, rodeando as criptas maternas. Dilataes
sinusoidais dos capilares maternos foram observados e seu dimetro (9-14 m) significativamente menor
do que em gestaes normais (14-28 m, 6 meses de gestao). Os vilos parecem ser mais curtos quando
deixam o eixo materno, e um arranjo desorganizado das rvores vilosas pde ser observado, bem como a
interface materno-fetal, sugerindo uma falta de arquitetura capaz de suportar o crescimento fetal. Entre o
topo do eixo materno e a base dos vilos fetais havia uma grande rea hemfaga contendo pigmento hematgeno
e conseqentemente eritrofagocitose pelas clulas epiteliais da camada trofoblstica. A regio interplacentomal
mostrou reas hemorrgicas tambm no endomtrio, prximo s glndulas endometriais. As membranas
fetais eram edematosas e as fibras colgenas mostraram um grande espao entre elas, devido ao hidralantide.
O epitlio trofoblstico do crioalantide possua ncleo basal bem corado e muitas clulas trofoblsticas
mostraram ncleos alterados. Ento, podemos concluir que os placentnios de bovinos clonados exibiam
alteraes no padro vascular e arranjo dos vilos maternos e fetais. O dimetro dos capilares (9-14 m) era
menor que o da gestao normal (14-28 m, seis meses de gestao Pfarrer, 2001) e o nmero total de
placentnios (39) inferior que o da gestao normal (84 em Bos taurus - Miglino, 1991 e 89 em Bos
indicus Pereira da Silva, 2002). A mdia da mensurao dos placentnios foi 21cm (dimetro), 3,31cm
(espessura), e o peso foi de 150g em contraste gestao normal onde a mdia de peso foi 89,87g. As reas
hemorrgicas na interface materno-fetal e nas glndulas endometriais da placenta de bovinos clonados eram
discrepantes em relao placenta bovina normal.
151

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

ERITROFAGOCITOSE PLACENTRIA EM BFALAS


Pereira, F.T.V.1; Braga, F.C.2; Kfoury Jr., J.R.2; Oliveira, L.J.2; Papa, P.C.2; Carvalho, A.F.3;
Kohayagawa, A.4; Hamlett, W.C.5; Miglino, M.A.2
1

Universidade Estadual Paulista (UNESP-Dracena/SP); 2Universidade de So Paulo (FMVZ-USP/SP);


3
UNIFEOB (So Joo da Boa Vista-SP); 4Universidade Estadual Paulista (UNESP-Botucatu/SP);
5
Indiana University School of Medicine. fverechia@dracena.unesp.br

A funo da eritrofagocitose observada aps o extravasamento de sangue na interface materno-fetal indefinida


em vrias espcies, incluindo a bufalina. Na ovelha, este processo foi muito estudado, e ocorre na zona
arcada do placentnio (topos dos septos maternos e base dos vilos fetais), regio onde realizado pelo
trofoblasto. possvel que o ferro seja transferido para o feto mediante a eritrofagocitose trofoblstica nesta
rea hemfaga da placenta e nas glndulas endometriais. Para este estudo foram utilizadas placentas de
bfalas entre 2-3, 4-5, 6-7, 8-9 e 10 meses de prenhez, fixadas por perfuso com soluo aquosa de
formaldedo a 10% e paraformaldedo a 4%, para microscopia de luz, e glutaraldedo a 2,5%, para microscopia
eletrnica de transmisso, processadas e coradas para microscopia de luz (HE, azul de Toluidina, tricromo
de Gomori, Hematoxilina-floxina, Azul de metileno - fucsina bsica), histoqumica (reao de Perls, PAS e
fosfatase cida) alm de microscopia eletrnica de transmisso. A metodologia utilizada permitiu-nos observar
que as reas hemfagas estavam presentes em determinadas regies do placentnio, nas quais se identificavam
reas hemorrgicas entre o epitlio uterino e o trofoblstico, nas placentas de 4 a 10 meses de prenhez.
Eritrcitos foram encontrados nas clulas trofoblsticas, elucidando, deste modo, a eritrofagocitose. A reao
de PAS foi positiva, marcando substncia mucide, principalmente na base dos vilos fetais, clulas trofoblsticas
binucleadas e nas glndulas endometriais da regio interplacentomal. A reao de Perls foi negativa nos
placentnios e positiva nas glndulas endometriais. A reao de fosfatase cida foi positiva tanto nos
placentnios, quanto na regio interplacentomal. A ultraestrutura da regio das reas hemfagas revelou
eritrcitos ingeridos dentro das clulas trofoblsticas epiteliais em diferentes fases de digesto e
eletrondensidades, vrias vesculas endocticas, cavola, muitas gotculas lipdicas, retculo endoplasmtico
rugoso bem desenvolvido e a presena de grande quantidade de mitocndrias. O epitlio das glndulas
endometriais da regio interplacentomal do tipo colunar com a presena de microvilos em seu pice, e
ncleos basais.

152

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

DESENVOLVIMENTO MICROSCPICO DAS MEMBRANAS FETAIS DE BOVINOS


Assis Neto, A.C.1; Miglino, M.A.2; Verechia, F.T.1; Garcia, J.M.3
1

Unidade Diferenciada de Dracena Faculdade de Zootecnia/UNESP, Dracena-SP, 17900-000;


2
Universidade de So Paulo (FMVZ-USP); 3Universidade Estadual Paulista (FCAV/UNESPJaboticabal), Brasil. antonioassis@dracena.unesp.br

O objetivo do presente estudo foi de caracterizar o desenvolvimento dos anexos embrionrios em bovinos
normais e assim estabelecer um padro microscpico, contribuindo com futuras investigaes na rea de
biotecnologia aplicada a reproduo animal. Foram analisados os aspectos microscpicos do crio, alantide,
mnio e saco vitelnico em diferentes fases da gestao e mensurou-se o Crown-rump de 28 animais.
Aps, foram estabelecidas as idades aproximadas de acordo com a metodologia de Evans; Sack (1973). As
membranas fetais foram fixadas em paraformoldedo a 4% e glutaraldedo a 2,5% e rotineiramente processadas
e includas em Histosec (Merck). As amostras foram coradas em HE e submetidas reao de PAS. A
membrana crio-alantide apresentou-se constituda por clulas globosas uni e binucleadas com arranjo
desordenado e formando trs a quatro camadas. Os ncleos apresentaram-se bem delimitados e com formato
ovide, o citoplasma claro com limites bem precisos. Os embries com 10 dias de idade apresentavam
clulas com ncleos e citoplasma, respectivamente com 10,3m e 19,6m. Aos 15 dias as clulas uninucleadas
mediam 18,9m e as binucleadas 22,9m, os ncleos apresentavam 10,4m e 10m respectivamente. Nos
animais de 20 dias as clulas binucleadas mediam 19,3m e as uninucleadas 28,5m. Aos 30 dias mostravam
clulas com 17.9m e ncleos com 13,9m. Aos 40 dias as clulas mediam 22,5m e o ncleo, 9,8m. Em
contato com a poro celular, observou-se tecido conjuntivo embrionrio, formado por mesnquima extraembrionrio, no qual foram observados vasos sanguneos de diversos dimetros. Em alguns cortes observouse clulas que constituam a camada de crio, com a presena de grnulos citoplamticos positivos para a
reao de PAS. O mnio estava constitudo por clulas achatadas ou pavimentosas contnuas organizadas
em epitlio pavimentoso simples. O saco vitelnico apresenta-se formado por clulas cbicas e colunares
organizadas de forma contnua. O epitlio forma dobras que esto projetadas para a luz do saco. Nas fases
estudadas ainda observou-se a transio da transmisso de troca materno-fetal de metablitos e o incio da
formao das vilosidades corinicas.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

O TRATO REPRODUTIVO DA FMEA E A PLACENTA DE SUDEOS


SUL AMERICANOS (Tayassu tajacu E Tayassu peccari)
Santos T.C. 1; Oliveira M.F.2; Miglino M.A.1; Dantzer V.3
1

Departamento de Cirurgia, FMVZ/USP, So Paulo, Brasil 05508-000. miglino@usp.br 2Escola Superior


de Agricultura de Mossor, Brasil, 3 Institute of Anatomy and Physiology, Department of Anatomy, The
Royal Veterinary and Agricultural University, Copenhagen, Denmark.

O Tayassu tajacu (cateto) e o Tayassu peccari (queixada) pertencem a Famlia Tayassuidae, a superfamlia Suoidea e a ordem Artiodactila. Com 90 cm de comprimento e 30 kg o cateto o menor dos pecaris
com um colar de plos esbranquiados ao redor do pescoo. O queixada o maior deles, com 110 cm de
comprimento e 40 kg de peso e possui plos brancos na mandbula. Estes animais so muito bem adaptados
em todo o territrio brasileiro e reproduzem-se em todas as estaes do ano. O perodo gestacional varia de
144-148 dias no cateto e de 156-162 no queixada (Sowls, The peccaries, 1984). Estudos sobre morfologia
e a fisiologia reprodutiva so necessrios para o desenvolvimento da explorao zootcnica e a preservao
destas espcies. Estes animais podem ser excelentes modelos reprodutivos experimentais em estudos em
sudeos devido a sua similaridade morfolgicas com os sunos domsticos e particularmente nos processos
reprodutivos das espcies. Os animais foram obtidos na Fazenda So Pedro, So Paulo e no CEMAS, Rio
Grande do Norte. Dezesseis placentas oriundas de fmeas prenhes em final de gestao (T. tayassu n=13,
and T. pecari n=3) foram preparadas para macroscopia, histologia de luz e eletrnica de transmisso. A
imunolocalizao de um dos mais potentes fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF) e seus receptores
VGFR-1 e VEGFR-2 ou Flt-1 e KDR, respectivamente, fizeram parte deste estudo. A morfologia dos
rgos genitais destes animais mostrou aspectos interessantes. O trato reprodutivo feminino est composto
por ovrios ovalados (1,6 cm), longas tubas uterinas (9,2 cm) e um tero bicornuado. O tero possui dois
cornos uterinos curtos (11,5 cm) que voltam-se ventralmente em forma de hlice, um curto corpo uterino e
uma longa crvix, com pregas circulares que projetam-se para o canal cervical. A placenta dos pecaris
epiteliocorial e difusa. O saco alantocorinico fusiforme e o padro geomtrico das interdigitaes difuso
e mutuamente pregueado. A placenta em ambas as espcies indeciduada com sub-unidades glndulaarola para absoro das secrees glandulares. O VEGF, o Flt-1 e o KDR apresentam intensa
imunoreatividade no epitlio uterino, no epitlio glandular uterino e no trofoblasto. As clulas endoteliais e
musculares lisas dos vasos maternos e fetais tambm apresentam imunoreatividade. O sistema VEGF-receptor
participa da regulao da placentao em sunos (Winther et al. Placenta, 20, 35-43, 1999), e nossos resultados
mostram que na placenta dos pecaris isto pode estar ocorrendo da mesma forma.

154

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

ESTUDO DA ANGIOARQUITETURA VENOSA DOS RGAOS


GENITAIS DE FMEAS BOVINAS.
Gioso M.M.1; Costa E.P.2; Fernandes C.A.C.3; Paula T.A.2; Bittencourt, V.L.4;
Guimares J.D.2; Siqueira, L.G.B.5
1-Mestre em Reproduo Animal - LRA/DVT/UFV. Viosa-MG, 36570-000, Brasil. 2- DVT/UFV,
Viosa-MG, 3- Ps-Doutorando, Bolsista Fapesp DRARV, UNESP-Botucatu, SP. 4- Setor Morfologia DVT/UFV, Viosa-MG. 5- Discente- DVT /UFV - Viosa-MG. mmgioso@yahoo.com.br.
O objetivo deste trabalho foi estudar a angioarquitetura venosa de rgos genitais de fmeas bovinas e
possveis anastomoses existentes entre os vasos provenientes da vulva e vagina com outros relacionados ao
tero e ovrio e tentar determinar o mecanismo pelo qual doses reduzidas de agentes luteolticos possam
alcanar o ovrio quando administrados via submucosa vulvar (IVSM). Foram utilizados cinco rgos genitais
coletados em matadouro, sem patologias evidentes ou gestao inicial. No laboratrio foram dispostos em
bandejas, temperatura ambiente, e um ramo da veia vaginal caudal (prximo regio caudal da vagina) foi
localizado na superfcie ventral do rgo e canulado com sonda uretral n 6 recebendo cerca de 100 mL de
soro fisiolgico (0,9% NaCl) para a retirada completa de sangue. Posteriormente, este vaso foi infundido, no
sentido cranial ao rgo, com contraste radiogrfico intravascular (Hipaque M60% - ScheringPlough,
Brasil) em volumes que variaram de 50 a 70mL. A injeo foi contnua at que as veias ficassem preenchidas
e comeando a se distender. Em seguida, os rgos foram submetidos radiografias e analisadas para a
verificao de possveis anastomoses venosas existentes entrem a regio da vagina e tero. Observou-se que
a veia vaginal forma uma intensa rede de anastomoses na superfcie ventral do tero entre os antmeros direito
e esquerdo (como descrito por Ginther, 1976; Veterinary Scope, v.20, n.1, p.1-17). Adicionalmente,
anastomoses foram identificadas entre as veias que drenam a vagina e crvix com as veias do corpo, cornos
uterinos e veia tero-ovariana (drenagem principal uterina). Vale ressaltar que as infuses foram realizadas
em um nico sentido (cranial), no apresentando barreiras (ocasionadas pelas fortes valvas venosas) na
passagem do contraste, sugerindo que o sangue venoso da vagina e crvix drenado do rgo genital no
apenas pela veia vaginal, mas tambm pela veia tero-ovariana. Estes dois vasos desembocam na veia ilaca
interna. Por este experimento, concluiu-se que os rgos genitais de fmeas bovinas apresentam anastomoses
entre os ramos da veia vaginal e as veias que drenam a crvix, corpo e cornos uterinos, sugerindo que parte
da dose de agentes luteolticos administrados via submucosa vulvar pode ser transportada diretamente ao
tero e, por conseguinte ao ovrio por uma rota local sem atingir a circulao sistmica.

155

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

CRIOPRESERVAO DE EMBRIES DE COELHOS (Oryctogulus cuniculus)


COM SACAROSE, GLICEROL E ETILENO-GLICOL
Solano, R.F.1; Solano.G.O.3; Chow, L.A.2
Prof. PhD. Mdico Veterinrio da UEMA.; 2Mdico Veterinrio autnomo. 3Acadmico bolsista de
Iniciao Cientfica - solanoferro@hayoo.com.br
Escola de Medicina Veterinria - Universidade Estadual do Maranho (UEMA)

O objetivo deste estudo foi avaliar a eficincia de trs crioprotectores no congelamento controlado de
mrulas e blastocistos jovem de coelhas, utilizando glicerol l,4 M (G-1 n=40); etileno-glicol 1,5 M (G-II
n=41) e glicerol 1,4 M + sucrose 0,25 M (G-III n=45). Os embries foram obtidos atravs de lavado
dos oviductos e tero, trs dias aps do estro, com uma soluo buferada (PBS+BSA 0,4%).Avaliados
segundo a morfologia estabelecida pela IETS e lavados em 10 gotas de PBS+BSA 0,4 % (Embryo
holding, ENCARE) e posteriormente imersos nas solues crioprotectoras (G-1; G-2 e G-3
respectivamente) para seu equilbrio durante 15 minutos temperatura ambiente (28-30 C), envasados
em palhetas de 0,25 ml, aps foram imersas num equipamento (Freezing L-5000, Cryobiologic, LTD) a
temperatura de 6 C, imediatamente imersa em nitrognio lquido, iniciando o decrscimo da temperatura
de acordo a programao (0,3 oC/min at atingir 32 oC). Os embries foram descongelados no ar por
10 segundos e na gua a 37o C, por 20 segundos, e imerso no meio criopreservador em que foram
congelados em ordem decrescente (6,6; 3,3 e 0,0 M) lavados em sucrose ao 0,50 % M, posteriormente
em meio Holding (ENCARE) e cultivados em TCM-199 + 20 % SFB, a 37oC; 5 % CO2 e alta umidade
relativa. Foram considerados viveis os embries que alcanaram o estgio de blastocisto expandido
aps um perodo de 24 a 48 horas de cultivo in vitro. A taxa de viabilidade foi significativamente maior
(P< 0,05) nos G-II e G-III (80,5 % e 82,2%) do que G-I (72,5 %). Conclui-se que a associao de
Sucrose com Glicerol demonstrou ser superior ao uso do Glicerol e Etileno-glicol puros.

156

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

AVALIAO DA MORTE CELULAR EM EMBRIES FRESCOS E


CRIOPRESERVADOS, EM CAMUNDONGOS
Coutinho, A.R.S.1; Mendes, C.M.1; Dagli, M.L.Z.2; Sinhorini, I.L.3;
Visintin, J.A.1; Assumpo, M.E.O.A.1
1

Laboratrio de Fecundao in vitro, Clonagem e Transgenia Animal, Departamento de Reproduo Animal.


2
Laboratrio de Oncologia Experimental, Departamento de Patologia Animal. 3 Laboratrio de Microscopia
Eletrnica, Departamento de Patologia Animal, Universidade de So Paulo SP, 05508-000, Brasil.
nanicout@usp.br

Pesquisas na rea de criopreservao de embries mamferos tm importncia fundamental na aplicao de


biotecnologias reprodutivas. A congelao controlada e vitrificao tem proporcionado grandes avanos no
estudo da Criobiologia, porm a sobrevivncia mxima de embries, aps a descongelao ainda no foi
atingida. Deste modo o presente trabalho teve como objetivos comparar diferentes tcnicas de deteco de
injria celular e quantificar e diferenciar o tipo de morte celular em embries frescos e criopreservados.
Embries de camundongos foram coletados, selecionados e divididos em 3 grupos: fresco, congelao
controlada e vitrificao. Para o grupo fresco os embries foram fixados e destinados diferentes anlises.
No mtodo de congelao controlada, os embries foram expostos em 10% de etileno glicol (EG) por 10
minutos e congelados na velocidade de 0,5C/ minuto de 7 a 31C, quando as palhetas foram imersas e
armazenadas em nitrognio lquido. Para a vitrificao (EFS) adotou-se duas etapas de equilbrio. Os embries
foram equilibrados em 10% de EG (EG10) e em 20% de EG (EG20), ambas etapas por 5 minutos. Aps
este perodo, os embries foram expostos em soluo de 40% de EG + 18% de Ficoll + 10% de sacarose
(EFS) por no mximo 30 segundos, incluindo envase e imerso direta em nitrognio lquido. O aquecimento
foi realizado em ar (10 segundos) e em gua a 25oC (20 segundos) para o grupo congelao controlada e
diretamente em gua a 25oC (20 segundos) para o vitrificao. Aps o aquecimento, os embries foram
avaliados quanto a sua qualidade e destinados marcao dupla com Hoechst e Iodeto de Propdeo (H/IP),
colorao com Hematoxilina e Eosina (HE), Microscopia Eletrnica de Transmisso (MET) e Cultivo in
vitro (CIV). A porcentagem de embries grau I ps descongelao foi superior para o grupo congelao
controlada (61,5%) em relao ao vitrificao (29,5%). Pela marcao com H/IP, o grupo vitrificao
apresentou maior quantidade de clulas mortas (69,7%) em relao ao congelao controlada (48,4%) e ao
fresco (13,8%) (p<0,05 Wilcoxon). A avaliao morfolgica pela colorao com HE revelou que o grupo
vitrificao e o congelao controlada causaram picnose, com diminuio nuclear e condensao da cromatina.
Figuras de mitose estavam presentes nos grupos fresco e congelao controlada, porm no foram visualizadas
no vitrificao. A avaliao citoplasmtica indicou alteraes caractersticas de oncose no grupo vitrificao
(rarefao do citoplasma e clulas degeneradas), enquanto que no grupo congelao controlada as alteraes
so caractersitcas de apoptose (condensao e eosinofilia do citoplasma). A MET confirmou os resultados
descritos pela colorao com HE. A colorao com HE mostrou ser um mtodo eficiente detectando oncose
e apoptose em embries criopreservados. Por estas anlises podemos concluir que o mtodo de vitrificao
utilizado provocou mais injrias celulares, com predominncia de oncose e conseqentemente menor
desenvolvimento in vitro.
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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

INFLUNCIA DO NMERO DE EMBRIES POR COLETA NAS TAXAS DE


GESTAO DE EMBRIES BOVINOS CONGELADOS EM ETILENOGLICOL
Oliveira, E.R. 1; Fernandes, C.A.C. 2; Figueiredo, A.C.S.3; Gioso, M.M.4
1

Biotran LTDA, R. Tatuin, 93, 37130-000-Alfenas-MG- Brasil-eduardo@biotran.com.br. 2Prof. Med.


Vet.-Unifenas, Bolsista Fapesp. 3Profa. Inst. Cincias Agrrias-Unifenas. 4Doutoranda FMVZ-Unesp.
Botucatu.

Este trabalho foi elaborado para determinar a influncia do nmero de embries viveis produzidos por
coleta na taxa de gestao destes. Foram utilizados 416 embries de qualidade excelente (grau 1) produzidos
numa mesma Central (Embryo Plusfrica do Sul), coletados de doadoras da raa Simental. De acordo
com o nmero de embries produzidos por coleta, estes foram divididos em 4 grupos: Grupo 1 at 5
embries (n=97), Grupo 2 - de 6 a 9 embries (n=111), Grupo 3 de 10 a 15 embries (n=109) e Grupo
4 mais de 15 embries (n=99). Para o congelamento foi utilizado o etilenoglicol 1,5 M sem sacarose (AB
Technology-USA). Para o descongelamento as palhetas foram deixadas no ar por 10 segundos e colocadas
em banho-maria a 32C por 30 segundos. Foram utilizadas como receptoras, novilhas mestias, com escore
corporal entre 3 e 4 (escala 1-5), selecionadas pelo dia do ciclo estral (entre 6 e 8) e pelas caractersticas do
genital. As avaliaes e inovulaes foram feitas por um mesmo tcnico, utilizando aplicador modelo Hannover
e camisas sanitrias (IMV). O embrio foi depositado o mais cranialmente possvel no corno ipsilateral ao
corpo lteo. O diagnstico de gestao foi feito por palpao retal e ultra-sonografia (Scaner Falco-Pie
Medical) entre 50 e 60 dias aps as inovulaes. A taxa de gestao mdia foi de 35,10%. A taxa de
gestao foi de 30,93a %; 42,34a%; 41,28a% e 24,24b% para os grupos 1, 2, 3 e 4, respectivamente
(P<0,05 - 2). Embora a classificao morfolgica dos embries utilizados seja a mesma, quando o numero
de embries produzidos por coleta muito elevado (acima de 15 embries), a taxa de gestao dos mesmos
inferior, como tambm ocorre em inovulaes a fresco. Provavelmente a simples avaliao morfolgica no
seja suficiente para avaliar a viabilidade dos embries nestes casos.
Palavras-chave: Bovino, embrio congelado, taxa de gestao.

158

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

ESTGIO DE DESENVOLVIMENTO E TAXA DE GESTAO DE EMBRIES


BOVINOS CONGELADOS EM ETILENOGLICOL
Fernandes, C.A.C.1; Oliveira, E.R. 2; Figueiredo, A.C.S.3; Gioso, M.M.4
1

Prof. Med. Vet.-Unifenas, Bolsista Fapesp. R.Tatuin, 93, 37130-000-Alfenas- cacf@biotran.com.br,


MG. 2Biotran LTDA. 3Profa. ICA-Unifenas. 4Doutoranda FMVZ-Unesp. Botucatu.

O presente trabalho teve como objetivo comparar a taxa de gestao de embries bovinos congelados em
diferentes estgios de desenvolvimento. Foram utilizados 416 embries de qualidade excelente (grau 1)
classificados quanto ao estgio de desenvolvimento em Mrula (Mn=79); Blastocisto Inicial (Bi-n=136),
Blastocisto (B-n=103) e Blastocisto expandido (Bex-n=98). Os embries utilizados foram produzidos numa
mesma Central (Embryo Plus Brits frica do Sul), sendo coletados de doadoras da raa Simental,
superovuladas pelos mtodos convencionais. Para o congelamento foram utilizadas palhetas finas (0,25ml) e
o etilenoglicol 1,5 M sem sacarose (AB Technology). Para o descongelamento as palhetas foram removidas
do N2, deixadas no ar por 10 segundos e colocadas em banho-maria a 32C por 30 segundos. Foram
utilizadas como receptoras, novilhas mestias, com escore corporal entre 3 e 4, selecionadas previamente
pelo dia do ciclo estral (entre 6 e 8) e pelas caractersticas do genital. As avaliaes e inovulaes foram
feitas por um mesmo tcnico, utilizando aplicador modelo Hannover e camisas sanitrias (IMV). O embrio
foi depositado o mais cranialmente possvel no corno ipsilateral ao corpo lteo. O diagnstico de gestao foi
feito por palpao retal e ultra-sonografia (Scaner Falco-Pie Medical) entre 50 e 60 dias aps as inovulaes.
A taxa de gestao mdia foi de 35,10%. Para embries nos diferentes estgios este valor foi de 44,30%a;
31,07% b; 40,44%ab; 24,49%c (P<0,05-2), para embries classificados como M; Bi; B e Bex,
respectivamente. O trabalho mostra que embries em estgio menos avanados de desenvolvimento, como
as mrulas, apresentam melhores resultados ao congelamento quando comparados a outros mais avanados,
como os blastocistos expandidos.
Palavras-chave: Bovino, embrio congelado, taxa de gestao.

159

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFEITO DA INTERAO ENTRE CONGELAO E OUTRAS FONTES DE VARIAO


NA TAXA DE GESTAO DE EMBRIES F2 HOLANDS X GIR
Freitas, C.1; Palho, M.P.1; Viana, J.H.M.1; Arashiro, E.K.N.2; Nogueira, L.A.G.2; S W.F.1
1

Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG, 36038-330,


2
Universidade Federal Fluminense, Niteri, RJ, 24230-300
Os fatores que afetam a sobrevivncia embrionria podem ser intrnsecos do embrio, ou relacionados ao
ambiente intra-uterino da receptora. A interao desses fatores essencial para que ocorra o estabelecimento
da gestao. Objetivou-se, com este estudo, comparar-se as taxas de gestao obtidas utilizando-se embries
F2 (Gir x Holands) criopreservados em etilenoglicol ou no, de diferentes graus de qualidade e sincronia
com a fase do ciclo da receptora. Durante o perodo de fevereiro de 2002 a maio de 2003, foram realizadas
um total de 347 inovulaes, sendo transferidos embries (180 descongelados e 167 a fresco) coletados de
vacas sangue Holands-Gir, previamente classificados de acordo com o estdio de desenvolvimento e
qualidade. As transferncias foram realizadas pelo mtodo no cirrgico, nos dias 6, 7 ou 8 do ciclo, tomando
como dia 0 o dia da observao do cio das receptoras. Diferenas nas taxas de gestao foram determinadas
pelo mtodo do 2. A taxa de gestao obtida pela transferncia de embries a fresco no diferiu da taxa
obtida com embries previamente criopreservados (60,5% vs. 55,6%; P>0,05). Para os embries transferidos
fresco, no se observou efeito significativo da qualidade (64,7% vs. 57,4% para graus I e II, respectivamente;
P>0,05), do estdio de desenvolvimento (48,6%, 65,2% e 65,4% para mrula, mrula compacta e blastocisto,
respectivamente; P>0,05) ou sincronia da receptora (54,4%, 60,6% e 62,2% para embries transferidos
nos dias 6, 7 ou 8 do ciclo estral, respectivamente; P>0,05) nas taxas de gestao. Para embries descongelados,
contudo, foram obtidas maiores taxas de gestao com embries de grau I (57,3% vs. 33,3%; P<0,05), com
embries jovens (60,2%a, 52,4%ab e 37,5%b para mrulas, mrulas compactas e blastocistos,
respectivamente; P<0,05) e com uma sincronia de 0 ou - 24h (60,4% e 60,8% vs. 37,8% para transferncia
nos dias 6, 7 ou 8, respectivamente; P<0,05). Estes resultados demonstram a interao entre a congelao e
os diferentes fatores que podem afetar os resultados da transferncia de embries.

160

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

TAXA DE CONCEPO DE EMBRIES FRESCOS E CRIOPRESERVADOS


TRANSFERIDOS EM VACAS HOLANDESAS DE ALTA PRODUO
Rodrigues, C.A.1; Ayres, H.2; Reis, E.L.2; Nichi, M.2; B, G.A.3; Baruselli, P.S.2
1

Clnica Veterinria SAMVET de So Carlos, So Carlos-SP, Brasil. 2Departamento de Reproduo


Animal, FMVZ-USP, So Paulo-SP, Brasil. 3Instituto de Reproduccin Animal Crdoba (IRAC),
Crdoba, Argentina. barusell@usp.br

Vacas de leite criadas em condies tropicais freqentemente apresentam decrscimo na taxa de prenhez
quando submetidas a inseminao artificial (IA). Dessa forma a transferncia de embries (TE) pode ser uma
alternativa para se minimizar esse efeito. O presente trabalho foi realizado em uma propriedade leiteira (Agrindus
S/A, Descalvado SP) e teve como objetivo comparar as taxas de concepo de vacas Holandesas de alta
produo (28,4 2,3 kg/dia) submetidas TE utilizando embries frescos (n=654) ou criopreservados
(n=1406) durante os anos de 2000, 2001, 2002 e 2003. Os animais foram submetidos observao de cio
e subsequente TE sete dias depois. Os embries utilizados (frescos ou criopreservados) foram obtidos por
MOET. Os dados foram analisados pelo teste de Qui-quadrado. No foi verificada interao entre ano e
tipo de embrio (frescos e congelados) Encontrou-se maior taxa de concepo (P<0,05) para embries
frescos (45,6%; 296/654)a que para criopreservados (38,8%; 545/1406)b. Analisando as taxas de concepo
de acordo com estgio de desenvolvimento do embrio, encontrou-se respectivamente para embries frescos
e criopreservados: 45,2% (196/434)a e 40,2% (422/1050)b para Mrula (reduo de 5% na taxa de concepo
de embries congelados; TCEC; P<0,05); 48,7% (19/39)a e 31,5% (29/92)b para Blastocisto inicial (reduo
de 17,2% na TCEC; P<0,05); 48,5% (66/136)a e 36,3% (77/212)b para Blastocisto (reduo de12,2% na
TCEC; P<0,05) e 33,3% (15/45) e 32,7% (17/52) para Blastocisto expandido (reduo de 0,6% na TCEC;
P>0,05). Os resultados sugerem que, em vacas Holandesas de alta produo criadas em condies tropicais,
o uso de embries frescos apresenta maior taxa de concepo que embries congelados. O estgio de
blastocisto expandido apresentou taxa de concepo semelhante para embries frescos e criopreservados.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

UTILIZAO DE ETILENOGLICOL, DIMETILSULFXIDO E DIMETILFORMAMIDA


NA VITRIFICAO DE EMBRIOES BOVINOS EM OPEN PULLED STRAWS
Siqueira-Pyles, E.S.C.1; Fernandes, C.B.1, Landim-Alvarenga, F.C.1
1

Departamento de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria FMVZ/UNESP, Botucatu - SP, 18618000, Brasil. elenscs@zipmail.com.br

Com o objetivo de se avaliar o efeito dos agentes crioprotetores na viabilidade embrionria ps vitrificao,
blastocistos bovinos produzidos in vitro foram vitrificados em Open Pulled Straws (OPS) utilizando-se
etilenoglicol (EG), dimetilsulfxido (DMSO) e dimetilformamida (DF). A Citocalasina B (CitB) foi adicionada
ou no ao meio de vitrificao para ser analisado o seu efeito estabilizador de citoesqueleto. Para a obteno
dos blastocistos, ovcitos bovinos foram aspirados de ovrios de matadouro e maturados (dia D-1), fertilizados
(dia D0) e cultivados in vitro. No D7 de cultivo, 481 blastocistos foram divididos ao acaso em oito grupos,
sendo: EG+DMSO, EG+DMSO+CitB, EG+DF, EG+DF+CitB, DF+DMSO, DF+DMSO+CitB, GC
(controle de embries no vitrificados) e GC+CitB (controle de embries expostos CitB e no vitrificados).
De acordo com o grupo, os embries foram expostos ou no a soluo com 5g/ml de CitB durante 20
minutos antes de serem expostos aos crioprotetores. A soluo de vitrificao foi composta por H-TCM
199 acrescido de 20% de soro fetal bovino (SFB), 20% de cada crioprotetor, de acordo com o grupo, e
0,5M de trealose. Cada embrio foi envasado em palheta esticada (OPS) a qual foi imediatamente imergida
em nitrognio lquido.O aquecimento foi realizado em soluo de 0,25M trealose aquecida 39C, por cinco
minutos. Os embries foram transferidos para uma soluo de 0,15M trealose por mais cinco minutos, sendo
ento transferidos para o meio H-TCM 199+20%SFB. Foram verificadas as taxas de re-expanso dos
blastocistos aps o aquecimento e retorno dos mesmos ao cultivo por mais dois dias (at o D9). A anlise
estatstica foi realizada pelo teste de Tukey para comparaes mltiplas, com P<0,05, onde grupos seguidos
de pelo menos uma letra igual no diferem estatisticamente. As taxas de re-expanso dos grupos EG+DMSO
(0/61, 0%d), EG+DMSO+CitB (0/57, 0%cd), EG+DF+CitB (0/61, 0%d), DF+DMSO (4/54, 7,4%d) e
DF+DMSO+CitB (0/64, 0%d) no diferiram estatisticamente entre si e foram estatisticamente inferiores s
dos grupos GC (38/70, 54,3%ab) e GC+CitB (17/57, 29,8%ab). As taxas de re-expanso de EG+DF (6/57,
10,5%bc) diferiram de EG+DMSO, EG+DF+CitB, DF+DMSO e DF+DMSO+CitB, mas foram semelhantes
as do grupo GC e GC+CitB. Estes resultados mostram que a exposio dos embries bovinos Citocalasina
B aparentemente diminui as taxas de re-expanso quando comparado aos embries no expostos essa
soluo. Entre os grupos estudados pode-se observar que as taxas de re-expanso dos grupos no vitrificados
(GC e GC+CitB) no diferem estatisticamente do grupo EG+DF, no qual a associao destes agentes
crioprotetores mostrou efeito benfico ao embrio no processo de vitrificao. Contudo, busca-se ainda
melhores taxas de re-expanso de blastocistos aps a vitrificao atravs do estudo de diferentes protocolos
de criopreservao de embries bovinos.
Agradecimentos: FAPESP, Frigorfico FRIGOL e Profa. Ldia Raquel de Carvalho (Depto. Bioestatstica
IB/UNESP).

162

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

CRIOPRESERVAO E CULTIVO IN VITRO DE FOLCULOS PR-ANTRAIS OVINOS


Santos, R.R.; Rodrigues, A.P.R.; Costa, S.H.F.; Silva, J.R.V.; Martins, F.S.; Matos,
M.H.T.; Celestino, J.J.H.; Silva, G.A.; Figueiredo, J.R.
1

Laboratrio de Manipulao de Ocitos e Folculos Ovarianos Pr-Antrais LAMOFOPA FAVET UECE, Fortaleza-CE, 60740-000, Brasil.

Este estudo avaliou a viabilidade de folculos pr-antrais (FOPA) ovinos cultivados a fresco ou aps exposio
e/ou congelao com DMSO e EG 1,5 M. Cada par ovariano ovino foi submetido ao isolamento folicular.
Dividiu-se a suspenso em 15 partes, sendo uma imediatamente avaliada com azul de trypan (controle). Das
14 alquotas restantes, 02 foram cultivadas por 1 e 5 dias, 6 foram somente expostas ao crioprotetor (ACP)
e no congeladas, e 6 foram congeladas. Aps exposio ou congelao, uma alquota foi analisada (D0) e
as demais cultivadas por 1 e 5 dias. Ao fim dos tratamentos, os FOPA foram classificados em viveis ou no
viveis e o dimetro folicular mensurado. O percentual de FOPA viveis, bem como os dimetros mdios
foram comparados utilizando o teste Qui-quadrado e Turkey, respectivamente, a 5% de probabilidade.
Antes e aps 1 dia de cultivo, houve uma reduo significativa de FOPA viveis aps exposio (65 e 62%)
e congelao (51 e 52%) em relao aos frescos (91 e 71%). Aps 5 dias, houve uma reduo significativa
de FOPA congelados viveis (42%) em relao aos frescos (60%) e aos somente expostos aos ACP (56%).
Houve uma reduo significativa e progressiva do percentual de FOPA viveis aps os Dias 1 e 5 nos FOPA
frescos. Comparando-se os FOPA somente expostos, bem como os congelados antes e aps cultivo,
observou-se uma reduo significativa do percentual de FOPA viveis aps 1 e 5 dias. Ao cultivar FOPA
somente expostos, o aumento do dimetro foi observado aps o Dia 1 e manteve-se inalterado at o Dia 5.
Entretanto, analisando-se os FOPA congelados cultivados, verificou-se que no houve crescimento folicular
significativo. Comparando-se os tratamentos dentro de cada dia, observou-se que FOPA cultivados frescos
ou somente expostos apresentaram taxas similares de crescimento, sendo superiores quelas de FOPA
previamente congelados. Em concluso, o procedimento de congelao afeta a capacidade dos folculos
pr-antrais ovinos de serem cultivados in vitro.

163

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

TRANSFERNCIA DE EMBRIES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO:


EFEITO DA VITRIFICAO E DO TRANSPORTE.
Mezzalira, A.; Santos, R.M.; Barreta, M.; Cucco, D.; Mezzalira, J.C.;
Wentz, K.C.; Cruz, F.B.

Laboratrio de Reproduo Animal Prof. Assis Roberto de Bem CAV Universidade do


Estado de Santa Catarina UDESC Lages SC Brasil. E-mail mezzalira@cav.udesc.br
Para avaliar a viabilidade da vitrificao e do transporte, embries produzidos in vitro frescos (n=30) ou
vitrificados (n=30) foram transferidos para receptoras sncronas. Ovrios de seis vacas Devon, quatro delas
estimuladas com 70mg de FSH (Folltropin) foram submetidos ao slicing, seguindo-se a busca e seleo dos
ovcitos, em meio TCM 199 adicionado de Hepes e 10% SFB. Obteve-se 39 ovcitos/vaca nas tratadas
com hormnio e 17 ovcitos/vaca nas no tratadas. A maturao foi efetuada em meio TCM 199 sais de
Earle com soro de vaca em estro (SVE) em estufa a 39C, com atmosfera de 5% de CO2 e 95% de
umidade relativa, por 24 horas. A fecundao foi realizada com 1 x 106 espermatozides/mL, selecionado
pelo processo de migrao ascendente (Swim-up), em meio Talp-Sperm. A incubao dos ovcitos e
espermatozides foi realizada por 18-22 horas em 400l de Talp-Fert, com 30g de Heparina. O cultivo foi
realizado em meio SOFaaci, por 192 horas, avaliando-se a taxa de embries em D7 e D8 do cultivo. Quinze
embries nos estgios de Blastocisto (Bl) e Blastocisto expandido (Bx) foram transportados por 6 horas
temperatura ambiente (22 - 25C), em TCM-Hepes +10% SVE, e transferidos para receptoras. Outros
quinze embries nos estgios de Bl e Bx foram vitrificados em palhetas estiradas e abertas (OPS), atravs da
exposio a uma soluo de equilbrio composta por 400l de meio TCM-Hepes + 10% de SVE) acrescido
de 50l de EG e 50l de DMSO, por 60 segundos. Em seguida foram transferidos para soluo de vitrificao
composta por 300l de meio de manuteno acrescido de 100l de EG e 100l de DMSO, por 20 segundos.
O reaquecimento foi realizado a 37-38C, pela exposio (5 minutos) a solues decrescentes de sacarose
(0.30M e 0,15M). Todos os embries (15 frescos e 15 vitrificados) foram transferido aps 6 horas de
transporte. O diagnstico de gestao, realizado aos 35 dias, por ultra-sonografia, revelou taxa de prenhez
de 33,3% (5/15) nos dois grupos. Os resultados permitem concluir que possvel transportar embries
produzidos in vitro, vitrificados ou no, por perodos de at 6 horas, obtendo-se resultados satisfatrios, e
que a vitrificao um mtodo eficiente de criopreservao para estes embries.

164

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

VIABILIDADE DE OCITOS BOVINOS MATURADOS IN VITRO


EXPOSTOS A SOLUO DE TREALOSE
Martins, R.P.; Dias, A.J.B.; Quirino, C.R.
Setor de Reproduo Animal, Laboratrio de Melhoramento Gentico Animal-CCTA - Universidade
Estadual do Norte Fluminense, Campos dos Goytacazes - RJ,Brasil - E-mail:roseane@uenf.br
Durante os procedimentos de criopreservao as clulas ficam expostas a solues crioprotetoras, que
apesar de necessrias, podem causar efeitos txicos e osmticos. Na busca de crioprotetores menos txicos,
vrias substncias tm sido testadas. Ultimamente a trealose tem sido utilizada na criopreservao de tecidos,
clulas e gametas, produzindo resultados promissores devido a sua capacidade de estabilizao da membrana
plasmtica. Mas, por ser um crioprotetor no penetrante, este dissacardeo pode causar efeitos osmticos
por desidratao excessiva dos ocitos. Para avaliar a capacidade de ocitos bovinos suportarem a
desidratao provocada por solues hipertnicas de trealose, estes gametas foram expostos a solues de
diferentes concentraes deste acar. Para isso, ocitos aspirados de ovrios de matadouro e classificados
como grau I e II foram maturados in vitro ( meio199 com sais de Earle com 20mM NaHCO3, 5,0g/mL de
LH, 0,5g/mL de FSH, 100UI/mL de penicilina, 100g/mL de estreptomicina e 10% de soro fetal bovinoSFB) por vinte e duas horas. Posteriormente foram separados em trs grupos e expostos por um perodo de
10 min a cada uma das solues de trealose: 0,15M (466mOsm); 0,35M (654 mOsm) e 0,5M (724 mOsm)
em TCM 199, com 25mM de Hepes e 10% de SFB. Ocitos colocados em concentraes mais elevadas
passaram previamente pelas concentraes mais baixas. A reidratao foi feita em concentraes decrescentes
de trealose, de forma inversa a desidratao, tambm durante 10 min. A cada dois minutos, a imagem dos
ovcitos foi capturada e realizada a medida do dimetro (distncia horizontal), com auxlio do programa
computacional AnalySIS. A reduo mxima dessa medida foi de 14,5%; 21,0% e 29,1% para ocitos
expostos aos tratamentos s concentraes de 0,15M; 0,35M e 0,50M respectivamente. Aps a reidratao,
395 ocitos foram corados pelo azul de Tripan (0,4%) em PBS por 5 min, para avaliao da integridade da
membrana plasmtica. Ocitos com membrana ntegra foram observados em 95,0% (n=99); 91,0%(n=89);
86,0% (n=103) e 80,0% (n=104) para os grupos controle (sem exposio); 0,15M; 0,35M e 0,50M de
trealose, respectivamente. Para verificar a capacidade de desenvolvimento in vitro, 154 ocitos maturados,
foram expostos a soluo de 0,35M de trealose, conforme acima, enquanto 162 ocitos foram utilizados
como controle, fertilizados e cultivados in vitro. Os resultados foram analisados pela ANOVA (PROC
GLM, SAS, 1996). As mdias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey, com nvel de
significncia de 5%. Nesta concentrao, valores mdios da taxa de clivagem (66,4% 10.6 e 68,3% 8,7)
e taxa de blastocistos em D7 (33,9% 9,8 e 33,3% 12,2), no apresentaram diferena significativa (P>0,05),
respectivamente para o grupo tratado (trealose) e o grupo controle. Nas condies deste trabalho, a trealose
no apresentou efeitos deletrios para ocitos bovinos maturados in vitro, em solues at 0,35M. Abordagens
da sua capacidade crioprotetora e alternativas que permitam sua introduo no citoplasma dos ocitos devem
ser testadas, visando definir protocolos mais eficientes para a criopreservao destas clulas.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

UTILIZAO DE OCITOS VITRIFICADOS DE SUNOS NO TESTE DE


PENETRAO ESPERMTICA IN VITRO
Macedo Jr., M.M.1; Deschamps, J.C.; Lucia Jr., T.; Bordignon, J.; Serret, C.G.;
Rambo, G.; Rheingantz, M.G.T.
Centro de Biotecnologia Universidade Federal de Pelotas - 1e-mail: macedo@ufpel.edu.br
O teste de penetrao espermtica in vitro (TPIV) pode avaliar o potencial de penetrao e capacidade
fertilizante de amostras de smen suno utilizando ocitos estocados em NL2. O objetivo deste experimento
verificar alteraes no potencial da capacidade fertilizante estimada atravs da motilidade espermtica e
morfologia, choque hipo-osmtico (CHIPO), teste de termo resistncia (TTR) e TPIV usando amostras de
smen estocadas a 17 oC, avaliadas em 4 diferentes perodos de armazenamento (0, 24, 48 e 72 h). O TPIV
foi baseado na taxa de penetrao in vitro (TxPIV) de ocitos vitrificados de sunos incubados em estufa de
CO2 com espermatozides homlogos. Estes teste foram realizados conforme descritos na literatura para a
espcie suna (Macedo M.C Jr et al 2002, Pelotas: Faculdade de Veterinria da UFPel, Dissertao). A
motilidade, CHIPO e TTR foram avaliados atravs do teste LSD e a patologia espermtica e o TPVI foram
avaliados pelo teste de X2. Os testes de motilidade, morfologia espermtica, CHIPO e TTR, no identificaram
alteraes na qualidade espermtica, durante o perodo de estocagem do smen, nos dois machos estudados.
Contudo quando se realizou o TPIV, foi verificado que o smen de ambos os machos diminuram (P<0,05)
suas taxas de penetrao espermtica in vitro (TxPIV) durante o perodo de estocagem. Porm esta diminuio
foi verificada em momentos diferentes para cada macho. Para o macho A, as TxPIV no diferiram (P>0,05)
entre 0 h e 24 h de estocagem do smen (100, % e 98,1% respectivamente) bem como entre 48 h e 72 h
(66,0%, 53,3% respectivamente), embora as TxPIV tenham sido maiores (P<0,05) no perodo de 0-24 h de
estocagem do smen que durante o perodo de 48-72 h. Para o macho B, a TxPIV na 0 h (50,6%) foi maior
(P<0,05) que nas 24 h, 48 h, e 72 h de estocagem do smen (34,3 %, 28,3% e 24,0% respectivamente), no
sendo observado diferenas (P>0,05) aps 24 h de estocagem. O TPIV utilizando ocitos homlogos
vitrificados foi o nico teste capaz de verificar alteraes na qualidade espermtica durante as avaliaes
realizadas no perodo de 72 horas de armazenamento do smen.

166

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

INFLUNCIA DO MTODO DE COLHEITA SOBRE OS PARMETROS SEMINAIS


DE CARNEIROS DA RAA SANTA INS
Alves, S.G.G.1; Chalhoub, M.1; Bittencourt, R.F.1; Almeida, A.K.1; Portela, A.P.M.1;
Freitas, D.S.1; Meneses, M.A.2; Ribeiro Filho, A. de L.1
1

Escola de Medicina Veterinria UFBA, Salvador-BA, 40.170-110, Brasil. 2Veterinrio autnomo.


alvessgg@ufba.br

A inseminao artificial, pela sua facilidade de difuso das caractersticas desejveis de um reprodutor, tem
sido utilizada como ferramenta necessria ao melhoramento gentico de um rebanho. Entretanto, o mtodo
de colheita do smen pode interferir negativamente sobre os parmetros seminais, diminuindo assim a sua
viabilidade. A colheita de smen pode ser efetuada por meio da eletroejaculao (EE) ou com o uso de uma
vagina artificial (VA). A no necessidade de uma fmea em cio ou de um manequim a principal vantagem da
EE sobre a VA, contudo, a colheita utilizando a VA a que mais se assemelha ao coito natural, propiciando
um ejaculado com parmetros seminais mais prximos do fisiolgico. Desta forma, este estudo teve como
objetivo comparar a influncia desses dois mtodos de colheita de smen sobre o volume (VOL), motilidade
(MOT), vigor (VIG), turbilho (TURB), concentrao (CONC), defeitos maiores (DMA), defeitos menores
(DME) e defeitos totais (DT) do ejaculado de carneiros da raa Santa Ins; alm disso, verificar as correlaes
entre os mtodos de colheita e os parmetros seminais citados anteriormente. Para tanto, foram utilizados
125 reprodutores dos quais 81 tiveram seu smen colhido por EE e 44 com o uso da VA. As anlises
estatsticas foram realizadas utilizando o pacote estatstico SAS 1996 verso 6.1. Ao se comparar os mtodos
de colheita (VA x EE) observou-se diferena estatstica nos seguintes parmetros: VOL (1,22 0,51 x 1,51
0,77mL), MOT (77,5 10,81 x 72,9 11,20%), TURB (3,5 0,65 x 3,1 0,97), CONC (3.373x106
1.876,70 x 641x106 1.015,15sptz/mL) e DT (5,18 3,87 x 8,83 10,66%). No foram observadas
diferenas (P>0.05) para o VIG (3,46 0,55 x 3,28 0,65), DMA (3,43 4,01 x 4,92 4,23%) e DME
(1,75 1,41 x 2,44 2,58%). As correlaes estatisticamente significativas entre os parmetros seminais
quando se colheu o smen com VA foram: VOL/DME (r=0,32; P<0,05), CONC/TURB (r=0,30; P<0,05),
MOT/VIG (r=0,85; P=0,0001), MOT/TURB (r=0,54; P=0,0001), MOT/DMA (r=-0,30; P<0,05),
MOT/DT (r=-0,34; P<0,05), VIG/TURB (r=0,57; P=0,0001) e DMA/DT (r=0,93; P=0,0001); j na
colheita por EE essas correlaes foram: VOL/CONC (r=-0,31; P<0,005), VOL/DME (r=0,28; P>0,005),
MOT/VIG (r=0,75; P=0,0001), MOT/TURB (r=0,53; P=0,0001), MOT/DMA (r=-0,32; P<0,005),
MOT/DME (r=-0,23; P<0,05), MOT/DT (r=-0,34; P<0,005), VIG/TURB (r=0,52; P=0,0001), VIG/
DMA (r=-0,25; P<0,05), VIG/DME (r=-0,30; P>0,005), VIG/DT (r=-0,36; P>0,0005), DMA/DT
(r=-0,25; P<0,05) e DME/DT (r=-0,38; P=0,0005). A EE exerceu grande influncia sobre o parmetro
CONC o que pode ser justificada pelo coeficiente de variao (158,13%) observado. Esses resultados
demonstram, que os parmetros seminais obtidos por meio da colheita de smen com VA em carneiros da
raa Santa Ins esto dentro dos valores fisiolgicos para a espcie ovina. Esse mtodo de colheita deve ser
eleito quando se desejar um ejaculado para a criopreservao ou para ser utilizado em programas de
superovulao para transferncia de embries.

167

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

CONCENTRAO DE CLCIO INTRACELULAR EM ESPERMATOZIDES


TRATADOS COM BLOQUEADORES DE CANAIS DE ONS CLCIO *
Gabaldi, S.H.1; Esper, C.R. 2; Tedesco, A.C.3; Wolf, A.4; Oliveira, J.A.5
1

Dep. de Reprod. An. - FMVZ-USP, So Paulo, shgabaldi@hotmail.com; 2 Dep. de Med. Vet. Prev. e
Reprod. An. - FCAV-UNESP, Jaboticabal; 3 Dep. de Qumica - FFCLRP-USP, Ribeiro Preto, Brasil; 4
Dep. de Reprod. An.e Radiol. Vet. - FMVZ-UNESP, Botucatu, Brasil; 5 Dep. de Cincias Exatas FCAV-UNESP, Jaboticabal, Brasil
H relatos que bloqueadores de canais de ons clcio, utilizados na terapia anti-hipertensiva, podem levar
infertilidade masculina, pois o on clcio importante na capacitao espermtica e na reao acrossomal.
Este experimento teve como objetivo verificar a influncia dos bloqueadores de canais de ons clcio voltagemdependentes do tipo-L, verapamil, nifedipina e diltiazem, na concentrao de clcio intracelular em
espermatozide de hamsters. A colheita dos espermatozides foi segundo Bavister (Gam. Res., 23:139-58,
1989). Os gametas foram transferidos para o meio TALP sem clcio (pH 7,4), a 37oC e, aps a verificao
da viabilidade espermtica, a sua concentrao foi ajustada para 35 x 106 sptz/mL. Os espermatozides
foram incubados por 30 minutos com 10M de Fluo 3-AM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, F-6142) em
estufa mida a 37oC com 5% de CO2 em ar. Aps o carregamento da sonda nos gametas, a mistura foi
centrifugada por 4min a 300xg (1500 rpm) e descartado o sobrenadante. Os espermatozides foram
ressuspendidos em 6mL de meio TALP livre de clcio (aproximadamente 6x106 sptz/mL), acrescido de
BSA (3mg/mL) e de PHE (10L/mL). Em 2mL desta suspenso, a intensidade da fluorescncia foi mensurada
durante 720seg no espectrofluormetro (Hitachi F-4500, Japan) (excitao 496nm e emisso 525nm) com
temperatura controlada a 37oC, sob agitao magntica. Neste sistema, foi adicionado 50M do bloqueador
de canais de clcio (verapamil, nifedipina ou diltiazem) aps 120seg, 2M de on clcio aps 280seg e 3M
de clcio ionforo A23187 (Sigma-Aldrich, C-7522) aps 200seg. No grupo controle no foi adicionado os
antagonistas de clcio. Foram realizadas cinco repeties (animais) para cada experimento, sempre se
comparando Grupo Controle x Grupo Bloqueador de Clcio. A dosagem de clcio intracelular foi calculada
segundo a equao de GRYNKIEWICZ et al. (J. Biol. Chem., 260:3440-50, 1985). Os resultados foram
analisados por ANOVA (p<0,05) no tempo de 100seg aps administrao do clcio exgeno. A concentrao
mdia de clcio intracelular nos espermatozides do grupo controle (3,62M) foi significativamente maior
que nos grupos verapamil (0,45M), nifedipina (0,46M) e diltiazem (0,40M). Todos os bloqueadores de
canais de ons clcio inibiram a entrada do clcio exgeno pelos canais de clcio voltagem-dependentes.
Concluiu-se que os espermatozides possuem em sua membrana plasmtica canais de ons clcio sensveis
aos bloqueadores de canais de clcio voltagem-dependentes do tipo-L, podendo, a terapia anti-hipertensiva,
reduzir a taxa de capacitao e reao acrossomal e, conseqentemente, a fertilidade masculina.
Suporte financeiro:
FAPESP - So Paulo, Brasil.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

AJUSTE NA CONCENTRAO DE ESPERMATOZIDES UTILIZADOS NA


INSEMINAO DE VACAS NELORE SUPERESTIMULADAS, PARA EVITAR
DIMINUIO DA PRODUO DE EMBRIES
Nogueira, M.F.G.*; Barros, C.M.
Depto. de Farmacologia, Instituto de Biocincias, UNESP, Botucatu-SP, 18618-000, Brasil.
marcelo@femanet.com.br
A quantidade e qualidade do smen podem afetar a taxa de concepo aps a inseminao artificial (IA), e
a concentrao de espermatozides com movimento total ps-descongelao varia de acordo com a partida
de smen e com o reprodutor utilizado. A concentrao mnima de espermatozides presentes numa palheta
de smen foi determinada tendo em mente a fertilizao de uma fmea durante o ciclo estral normal. Entretanto,
a superestimulao de doadoras de embries resulta na disponibilidade de maior nmero de ocitos (cerca
de 10 a 20) para a fertilizao, do que em uma simples IA (1 ocito). Neste trabalho objetiva-se verificar se,
por meio do ajuste da concentrao final de espermatozides, possvel utilizar palhetas com baixa concentrao
espermtica e obter taxas de embries viveis semelhantes quelas resultantes da utilizao de palhetas com
alta concentrao. Vacas da raa Nelore foram superestimuladas com o protocolo P36 (Barros, Porto e
Nogueira, Theriogenology, 59:524, 2003), no qual a ovulao induzida com LH (25 mg, Lutropin),
administrado 36 h aps a PGF2. Uma amostra de cada partida de smen foi analisada pelo mtodo CASA
(Computer-Assisted Semen Analysis) e a concentrao final de espermatozides, com motilidade total psdescongelao, foi ajustada para um mnimo de 25x106, que corresponde a aproximadamente 3x a
concentrao de espermatozides usada na IA de um animal no superovulado. A IA com tempo fixo
(IATF) foi realizada 12, 24 e, quando aplicvel, 36 h ps LH exgeno. O nmero de palhetas de smen
necessrio para atingir a concentrao desejada variou entre 2 e 6 (Grupos 2, 3, 4, 5 e 6). O nmero de
IATFs foi ajustado para o nmero total de palhetas utilizadas, isto , 2 palhetas (IATF 12 e 24 h ps LH), e
3 ou mais palhetas (12, 24 e 36 h ps LH). A mdia de estruturas totais (ocitos, embries viveis e
degenerados), mdia de embries viveis obtidas por colheita e a taxa de viabilidade (porcentagem de
embries viveis/estruturas totais) foram de 12,2; 8,9 e 73,6% (Grupo 2, n=19 colheitas); 13,5; 9,6 e 70,9%
(Grupo 3, n=104); 13,3; 9,4 e 70,9% (Grupo 4, n=22); 5,5; 4,0 e 72,7% (Grupo 5, n=4) e 24,0; 13,0 e
54,2% (Grupo 6, n=1). Quando os resultados dos grupos 4, 5 e 6 foram agrupados, a mdia de estruturas
totais, de embries viveis obtidos e a taxa de viabilidade foram de: 12,5; 8,7 e 69,8% (n=27). Estes resultados
foram similares aos obtidos nos grupos 2 e 3 (p=0,61), e no houve diferena significativa entre os resultados
dos grupos 2 a 6 (p=0,17). Conclui-se que, apesar da utilizao de palhetas de smen com baixa concentrao
de espermatozides, foi possvel, mediante o ajuste da concentrao final de espermatozides, obter taxas
de viabilidade e de embries viveis semelhantes quelas observadas quando utilizou-se smen com alta
concentrao espermtica.
*
Bolsista da Fapesp.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

INFLUNCIA DO NMERO DE ESPERMATOZIDES, LOCAL DE DEPOSIO DO


SMEN E SELEO ESPERMTICA EM GRADIENTE DE PERCOLL SOBRE A
RESPOSTA INFLAMATRIA UTERINA APS INSEMINAO UTILIZANDO SMEN
CONGELADO DE GARANHO
Gomes, G.M.1; Leo, K.M. 1; Macedo, L.P.1; Jacob, J.C.F.2; Papa, F.O.1;
Oliveira, J.V.1; Alvarenga, M.A.1
1

Departamento de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria/ FMVZ-UNESP, Botucatu, Brasil


Departamento de Reproduo e Avaliao Animal/ I Z/ UFRRJ, Brasil. bigugomes@fmvz.unesp.br

Sabidamente, o espermatozide mais do que a contaminao bacteriana responsvel pela instalao de um


processo inflamatrio agudo ps-inseminao. O presente estudo teve como objetivo avaliar a influncia do
nmero de espermatozides na dose inseminante e da seleo espermtica em gradiente de Percoll sobre a
resposta inflamatria uterina. Foi tambm estudado, a influncia do local de deposio do smen (corpo do
tero versus juno uterotubrica) em relao endometrite provocada aps as inseminaes com smen
congelado de garanhes. Foram utilizadas um total de 20 guas para o estudo. Quando o folculo provulatrio atingia 35 mm de dimetro em mdia, 2500 UI de hCG (Vetecor, Calier-SP) i.v. eram administradas
para induo de ovulao. A partir deste momento era realizado acompanhamento ultra-sonogrfico a cada
6 horas. Assim que se detectavam as ovulaes as guas eram inseminadas (15 inseminaes - corpo do
tero e 10 inseminaes - juno terotubrica por endoscopia) de forma aleatria, entre os grupos
experimentais: Grupo R1 (n=5) Inseminao com a dose usual de smen congelado (800 x106 de
espermatozides totais) no corpo do tero; Grupo R2 (n=5) Inseminao com 40 x 106 espermatozides
mveis no corpo do tero. Grupo R3 (n=5) Inseminao com 40 x106 espermatozides mveis por
histeroscopia na juno terotubrica. Grupo R4 (n=5) Inseminao com 40 x106 espermatozides mveis
previamente selecionados em colunas de 45/90% de gradiente de Percoll (centrifugao a 300g por 15
minutos) por histeroscopia. Grupo R5 (n=5) Inseminao no corpo do tero com 40 x106 espermatozides
mveis previamente selecionados em gradiente de Percoll. A avaliao da resposta inflamatria do tero
frente s inseminaes foi realizada atravs de citologia uterina 8h e 24hs aps cada inseminao artificial. Foi
utilizada a Anlise de Varincia de Perfil, seguida do teste de Tukey-Kramer para comparaes mltiplas
entre os grupos os dois momentos. Atravs da porcentagem de neutrfilos encontrados nos materiais verificouse que a dose inseminante convencional de smen criopreservado de garanho causou uma exacerbada
resposta inflamatria uterina. Quando do uso de uma baixa dose inseminante, no foi observada diferena
estatstica (p>0.05) em relao intensidade de resposta inflamatria ao utilizar smen selecionado depositado
no corpo do tero (Grupo-R5) quando comparado com a deposio de smen sem prvia seleo no
mesmo local (Grupo-R2), bem como, na papila uterotubrica (Grupo-R3). No houve influncia (p<0.05)
em utilizar-se smen selecionado ou no, em relao reao inflamatria uterina, tanto quando da deposio
no corpo do tero quanto na papila uterotubrica. A inseminao histeroscpica (Grupo-R3) levou a uma
menor (p<0.05) resposta inflamatria comparada inseminao com a dose convencional. No houve diferena
estatstica (p<0.05) em relao intensidade da resposta inflamatria, ao depositar um baixo nmero de
espermatozides no corpo do tero ou sobre a juno terotubrica. Baseado nesses achados, a histeroscopia
demonstrou ser um procedimento no agressivo e que, provavelmente no prejudique a fertilidade, como
demonstrado por Gomes et al.,2003 (Rev. Bras. Reprod. Anim. v.28, n.4, p.287-288). Podemos concluir
tambm que o nmero de espermatozides interfere na resposta inflamatria e que a seleo espermtica por
Percoll no minimiza a reao inflamatria ps-inseminao. Apoio: FAPESP
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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFEITO DO TOURO NA TAXA DE PERDA DE GESTAO EM VACAS


HOLANDESAS LACTANTES
Lima, F.S.1; Vasconcelos, J.L.M.1; Garcia, P.H.2
1

DPEA FMVZ/UNESP, Botucatu SP, 18600-000; 2Fazenda So Joo, Inhama, M.G.


vasconcelos@fca.unesp.br

Vacas mais produtivas so as que apresentam maior produo de leite por dia de intervalo entre partos. A
taxa de perda de gestao entre os dias 28 e 98 em vacas Holandesas aproximadamente 20%
(VASCONCELOS et al., Biol. of Reprod., suppl.1; v.56; p.140; 1997). O objetivo deste trabalho foi avaliar
se raa do touro ou touro influenciam a taxa de perda de gestao. Este estudo foi realizado na Fazenda So
Joo, Inhama, MG (janeiro e fevereiro de 2004), e foram utilizados dados de 279 vacas (25,3 8,94 Kg
de leite/dia e 259,9 152,30 dias ps-parto no dia da IA) gestantes de 3 touros da raa Gir (201 gestaes)
e dois touros da raa Holandesa (78 gestaes), diagnosticadas gestantes por ultra-sonografia entre os dias
28 e 35 aps a IA e submetidas a novo diagnstico de gestao, por palpao retal, entre os dias 70 e 84
aps a IA. Foi considerada perda de gestao quando as vacas foram observadas em estro ou diagnosticadas
vazias na palpao retal. Os dados foram analisados pelo GLM, sendo includas no modelo as variveis
touro, raa do touro (Gir vs. Holands), dias ps-parto, produo de leite nos sete dias anteriores IA,
ordem de lactao, tipo de inseminao (IATF vs. IA 12 horas aps a deteco do estro). No foi detectado
efeito de raa do touro na taxa de perda de gestao (15,38 3,93% para touros Holandeses vs. 13,43
2,45% para touros Gir). interessante observar que foi detectado efeito de touro (P<0,05) na taxa de perda
de gestao, sendo que os touros da raa Gir apresentaram taxa de perda de gestao de: 18,6 5,24%
(touro 1); 8,13,99% (touro 2) e 15,47 3,75% (touro 3) e os touros da raa Holandesa: 10,0 4,44%
(touro 1) e 33,3 8,10% (touro 2). No foi detectado efeito do tipo de inseminao (16,9 3,45% na
IATF vs. 17,2 2,95% na IA 12 horas aps deteco estro) na taxa de perda de gestao. As variveis dias
ps-parto, produo de leite nos sete dias anteriores IA e ordem de lactao tambm no influenciaram a
perda de gestao. Estes dados indicam que alguns touros tm maior efeito na manuteno da gestao,
independente da raa. Estes touros devem ser detectados e utilizados estrategicamente para aumentar a taxa
de pario de vacas Holandesas lactantes.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFEITO DO TOURO NA PRODUO IN VITRO DE EMBRIES BOVINOS GIROLANDO


Brum, D.S.1,2; Leivas, F.G.1; Palma, G.A.2,3; Olivier, N.2
1

Programa de Ps-Graduao em Medicina Veterinria, UFSM, Santa Maria, RS, Brasil. 2 Embryo Tech,
Carmelo, Uruguay. 3 Reprobiotec, 7600 Mar del Plata, Argentina. danisbrum@yahoo.com.br

A Raa Gir de grande importncia para a produo de leite em pases tropicais, sendo que a utilizao da
produo in vitro de embries (PIV) , pode aumentar a intensidade de seleo da raa, alm de encurtar o
intervalo entre geraes. Este estudo teve como objetivo avaliar a eficincia do smen de seis reprodutores
da raa Gir na PIV. Neste trabalho foram realizadas 4 repeties, os ocitos (n=5256) foram obtidos atravs
da puno de folculos com dimetro entre 2-8mm de ovrios de vacas Holandesa abatidas em frigorfico,
sendo descartados apenas os ocitos degenerados. A maturao in vitro (MIV) foi realizada em 400l de
meio MPM + rFSHh+ 5%SVE, por 24h em estufa com 5% de CO2 em ar, 39C e umidade saturada. O
smen aps descongelado foi submetido a gradientes de Percoll (30,60,90%), sendo a fecundao in vitro
(FIV) com 1 x 106 espermatozides/ml. A FIV foi realizada em meio FERT TALP, adicionado de BSA,
piruvato e 10g de heparina/ml , por um perodo de 18-22h, nas mesmas condies atmosfricas da MIV. O
cultivo in vitro (CIV) foi conduzido em meio CR1 com 10% de soro de vaca em estro (SVE) por 6 dias em
estufa com 5% de O2, %5 de CO2, 39C e umidade saturada. Os ndices de clivagem (D2) e blastocistos
(D7), considerando dia zero (D0) o dia da fecundao foram analisados pelo teste do qui-quadrado. As
taxas de clivagem foram de 74% (401/540), 55% (843/1519), 51% (1003/1954); 48% (225/466); 42%
(204/484) e 26% (77/293) para T1, T2, T3, T4, T5 e T6, respectivamente, sendo semelhante entre os
touros T3 e T4, assim como entre T4 e T5, diferindo entre os demais. Os ndices de desenvolvimento
embrionrio foram de 25%, 11%, 16%, 10%, 6% e 6% para os touros T1, T2, T3, T4, T5 e T6,
respectivamente. O desenvolvimento embrionrio foi semelhante apenas entre os touros T2 e T4 e T5 e T6,
evidenciando o efeito do touro nos ndices de produo. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que
reprodutores destinados a programas de produo in vitro de embries devem ser previamente testados, a
fim de se otimizar os ndices de produo embrionria.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

AVALIAO DE DIFERENTES TCNICAS DE INSEMINAO ARTIFICIAL EM


GUAS UTILIZANDO UM BAIXO NMERO DE ESPERMATOZIDES
Leo, K.M.1; Puoli Filho, J.N.P.2; Alvarenga, M.A.1
Departamento de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria, 2Departamento de Produo e
Explorao Animal, FMVZ/UNESP, Botucatu-SP, 18618-000, Brasil. karenleao@lycos.com

Existe um grande interesse no desenvolvimento de tcnicas que possam melhorar os ndices de fertilidade em
eqinos, com a utilizao de um pequeno nmero de espermatozides, principalmente para a aplicao do
smen congelado. O objetivo deste trabalho foi avaliar a taxa de fertilidade obtida utilizando diferentes tcnicas
de inseminao artificial e um baixo nmero de espermatozides. Foram utilizadas vinte guas, sendo as
mesmas inseminadas em todos os seguintes grupos: Grupo I (GI; n=20), inseminao convencional (corpo
do tero); Grupo II (GII; n=20), inseminao na extremidade do corno uterino ipsilateral ovulao; Grupo
III (GIII; n=20), inseminao histeroscpica, com a deposio do smen sobre a juno tero-tubrica
ipsilateral ovulao, com auxlio de um colonoscpio; Grupo IV (GIV; n=20), inseminao intrafolicular,
atravs de um sistema para ultra-sonografia trans-vaginal, munido de agulha descartvel, em que por manipulao
retal o ovrio era posicionado at que o folculo aparecesse na linha de puno no monitor do ultra-som e
ento o fundo de vagina era perfurado e o smen depositado dentro do folculo pr-ovulatrio; Grupo V
(GV; n=20), inseminao intraperitoneal, atravs do mesmo equipamento utilizado no GIV, onde o ovrio era
posicionado sob a linha de puno e aps perfurado o fundo de vagina, o smen foi depositado sobre o
ovrio. As inseminaes de GI, GII, GIII e GIV foram realizadas com 20x106 espermatozides mveis
(0,5mL), oriundos do smen congelado de um nico garanho. O smen era descongelado a 46oC/20 segundos.
As inseminaes de GV eram realizadas com 100x106 espermatozides mveis (2,0mL), oriundos do smen
fresco do garanho utilizado nos demais grupos. Aps a colheita o smen era diludo 1:1 com meio Emcare
(ICPbio Limited, Auckland, Nova Zelndia) centrifugado (10 minutos/600g) e o pellet final ressuspendido
com meio Emcare para uma concentrao final de 50x106/mL. Quando os folculos atingiam 35mm de
dimetro, as guas recebiam uma aplicao endovenosa de 2500UI de hCG (Vetecor, Callier, So PauloSP, Brasil), sendo que aps 30 horas da induo da ovulao o controle folicular era realizado a cada seis
horas. As inseminaes de GI, GII e GIII eram realizadas assim que detectado as ovulaes, e nos grupos
GIV e GV quando detectvamos a proximidade da ovulao. Pelo fato das guas utilizadas terem sido
inseminadas em todos os grupos experimentais, utilizou-se do teste estatstico de Cochran para comparar as
porcentagens de prenhez entre os grupos. As taxas de prenhez de GI, GII e GIII foram respectivamente de
15%, 40% e 45%. A despeito da diferena numrica no houve diferena estatstica entre GI, GII e GIII.
Nos grupos GIV e GV nenhuma gestao foi observada. Conclumos que as inseminaes histeroscpica e
na extremidade do corno uterino so eficientes quando se utiliza uma baixa dose de smen congelado de
garanhes e que mais estudos so necessrios para determinar os motivos do insucesso e aprimoramento das
tcnicas de inseminao intrafolicular e intraperitoneal.
Apoio: FAPESP

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFEITO DE DIFERENTES COMPONENTES SANGNEOS NA


MOTILIDADE ESPERMTICA EQINA.
Arajo, E.B.1; Silva, J.F.S.1; Souza, G.V.1; Detmann, E.2; Cunha, I.C.N.1;
Fagundes, B.1; Carvalho, C.S.P.1
1

Laboratrio de Melhoramento Gentico Animal Biotecnologia do Smen - CCTA/UENF Campos dos


Goytacazes RJ 28013-602 Brasil 2 Laboratrio de Engenharia Agrcola - CCTA/UENF Campos dos
Goytacazes RJ 28013-602 Brasil e-mail: eder.vetuenf@bol.com.br

A hemospermia ou hematospermia caracterizada pela presena de sangue no smen dando-lhe um aspecto


achocolatado, rosado ou mesmo avermelhado. O efeito da hemospermia em programas de reproduo so
devastadores, e garanhes com sangramento evidente no ejaculado so considerados infrteis ou altamente
sub-frteis. Algumas patologias como danos no processo uretral, defeitos vasculares no trato genital, clculos
prostticos ou de ductos ejaculadores, obstruo dos ductos deferentes e vesculas seminais, cistos prostticos
ou de condutos deferentes, carcinoma de clulas escamosas e infeces bacterianas aparentemente causadas
por Streptococcus ssp., E. coli e Pseudomonas aeuroginosa tm como conseqncia a hemospermia.
Portanto, pelo fato da hemospermia estar presente numa grande variedade de patologias que afetam o aparelho
reprodutor masculino e causar srios problemas na fertilidade do garanho que foi escolhido este tema de
pesquisa. O objetivo o de identificar o componente sanguneo que causa a diminuio da motilidade e em
qual concentraes sanguneas este efeito comea a ser observado. Neste estudo utilizou-se sangue e smen
de 2 garanhes. Aps serem processados e misturados o smen foi analisado com relao a motilidade total
e a progressiva utilizando o programa HTM-Ceros verso 10.8 da Hamilton Tom Research (HTR). As
anlises estatsticas mostraram que a adio dos componentes sangneos causou diminuio da motilidade
espermtica com relao ao grupo controle, exceto no momento 4, 6 e 7 do segundo garanho analisado,
possivelmente pela reduo do volume ejaculado ou inconsistncia dos dados analisados de forma objetiva
devido a presena das hemcias. Os componentes sangneos (sangue total, hemcias, plasma, soro, soro
decomplementado e soro decomplementado sem IgG) adicionados mostraram-se na anlise estatstica
significativa reduo da motilidade no momento 0 com a adio de 10 % de todos os componentes comparados
com a adio de 1%. A adio do sangue total e das hemcias no momento 0 mostraram maior efeito na
perda da motilidade comparado com o soro decomplementado e soro decomplementado sem IgG. Neste
trabalho foram verificados que a adio do sangue total e das hemcias mostraram maior efeito na perda da
motilidade comparado aos demais componentes e a adio destes na concentrao de 10% foi a que apresentou
maior efeito. At o momento no foram realizados testes visando identificar quais substncias poderiam
minimizar os efeitos deletrios do sangue.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

AVALIAO ESTRUTURAL E FUNCIONAL DA CLULA ESPERMTICA EQINA


FRENTE A DIFERENTES SUBSTNCIAS CRIOPROTETORAS
Neves Neto, J. R.1; Fernandes, C.B.2; Landim-Alvarenga, F.C.2; Papa, F. O.2
1

Universidade Paulista-UNIP. 2Departamento de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria


FMVZ/UNESP Botucatu SP Brasil

Muitas so as substncias crioprotetoras utilizadas para a congelao do smen eqino. O objetivo deste
estudo foi comparar dois crioprotetores, o glicerol (G) a Dimetil-formamida (DF) e a associao entre estes
atravs de diferentes metodologias de avaliao laboratorial: Avaliao da integridade de membrana plasmtica
(IM), anlise ultra-estrutural do espermatozide (UE), teste de ligao monocamada de clulas de oviduto
eqino (LO) e ensaios de fertilizao em ocitos homlogos, livres de zona pelcida (EF). Para a congelao
do smen, trinta e dois ejaculados de quatro garanhes, entre 4 e 10 anos de idade foram processados nos
diluidores: (1) FR-4 com 4% DF (Theriogenology, v.58 p. 273-276, 2002), (2) BME-adaptado com 5% de
G (In: Society for Theriogenology 1998; Baltimore, p. 140-141) e (3) MP-50 com 3% de G mais 2% de DF
(Vet. Bras. Reprod. Anim., v.26, n.3, 2002). Para avaliar a fertilidade, sessenta inseminaes foram feitas
com smen congelado utilizando os mesmos trs diluidores. Aps as colheitas, o smen foi envasado em
palhetas de 0,5 ml com concentrao de 100 x 106 de espermatozides totais, congelado, e armazenado em
nitrognio liquido. O smen foi descongelado a 40C por 30 segundos e avaliado nas diferentes metodogias
laboratoriais. O diluidor MP-50 foi superior (p<0,05) em relao aos diluidores FR-4 e BME-adaptado
para, IM (55,4%, 44,5% e 43,7%) e em relao ao FR-4 para EF (81,25%, 98,75% e 39,58%); e similar
para UE (47%, 35% e 49%) e LO (82%, 73% e 63%) respectivamente. Para avaliar as taxas de prenhez
com smen congelado, foram utilizados vinte ciclos estrais por grupo, inseminados com 400 x 106
espermatozides totais, antes e aps a deteco da ovulao atravs de palpao retal e ultra-sonografia. A
taxa de prenhez para as guas inseminadas com MP-50 (60%, 12/20) apresentou tendncia a superioridade
em relao aos diluidores BME-adaptado (45%, 9/20) e FR-4 (40%, 8/20). Baseado nas metodologias de
avaliao laboratorial e fertilidade campo, a associao do glicerol mais dimetil-formamida mostrou ser
uma alternativa para a criopreservao do espermatozide eqino.
Pesquisa financiada pela Fapesp.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFICIENCIA DE NOVO DILUENTE NA CONGELABILIDADE DE SMEN BOVINO


Alberti, K.1; Carmo, M.T.1; Oba, E.1; Mendona, A.L.Z.1; Souza, D.B.1; DellAqua Jr.,
J.A.1; Vianna, F.P.1; Papa, F.O.1
1

Departamento de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria, FMVZ UNESP Botucatu, SP.


karinaalberti@hotmail.com

Os bovinos por se tratarem de animais de produo, movimentam uma indstria altamente eficiente movida
por nmeros, desta forma quaisquer avanos em seus ndices refletem um grande retorno aos investimentos
iniciais. A congelao de smen na espcie bovina apresenta resultados satisfatrios h muito tempo, assim
sendo poucas modificaes foram efetuadas em sua metodologia no decorrer dos anos. Diluidores que
promovam boa congelabilidade e tragam resistncia aos espermatozides podem contribuir para melhores
taxas de fertilidade. O objetivo deste trabalho foi comparar a eficincia de uma nova proposta de diluidor
denominado de MC desenvolvido na rea de Reproduo Animal da FMVZ-UNESP-Botucatu-SP, com o
diluidor convencional glicina-gema (MG) (BICUDO et al., anais V SIRA, 173-179, 1993) em relao a
congelabilidade e resistncia espermtica com smen de bovinos. Dezenove ejaculados de treze touros da
raa nelore (Bos taurus indicus) foram submetidos a congelao utilizando-se os diluidores: glicina gema
(MG) e o diluente MC composto basicamente de aucares, aminocidos, solues tampes, OEP (ovus est
paste) e gema de ovo. Os ejaculados foram divididos em duas alquotas e diludos no meio I (sem crioprotetor)
de ambos diluentes (MG e MC), posteriormente o volume obtido foi dobrado com a diluio do meio II
(com crioprotetor) dos mesmos diluentes e envasado em palhetas francesas de 0,5 mL. As palhetas foram
submetidas estabilizao em geladeira a 5oC/4h, em seguida levadas caixa de isopor permanecendo por
20 minutos a 3 cm acima do nvel do nitrognio liquido e finalmente submergidas no nitrognio. As amostras
foram descongeladas a 46oC/20 segundos e tiveram seus parmetros avaliados por meio da anlise
computadorizada (CASA) e a integridade da membrana plasmtica aferida pelo microscpio de epifluorescncia. Estas palhetas foram lacradas e submetidas ao teste de termorresistncia rpido (TTR) a
46oC/30 minutos (ARRUDA et al., Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci.,v.29, n.1, p.131-137, 1992) e aps este
perodo tiveram seus parmetros novamente aferidos. A anlise estatstica foi efetuada pelo teste de Tuckey,
havendo significncia quando p<0,05. Os resultados mostraram haver diferena estatstica ps-descongelao
entre os meios MC e MG quanto aos parmetros: VAP (7411 vs. 638), VSL (607 vs. 558) e VCL
(11629 vs. 9018), entretanto a motilidade total (6014 vs. 5614), motilidade progressiva (4410 vs.
4111) e a integridade de membrana atravs da fluorescncia (411 vs. 383) no apresentaram diferena
estatstica entre seus valores. Durante o TTR o diluente MC promoveu uma proteo significativa aos
espermatozides em relao a motilidade total (5022 vs. 3022) e a motilidade progressiva (4022 vs.
2016) quando comparado ao MG respectivamente. O presente trabalho demonstrou que o diluente MC
apresentou uma melhor taxa de resistncia dos espermatozides aps o TTR quando comparado ao MG,
podendo estes resultados contribuir na melhora dos ndices de fertilidade em programas de IA com smen
congelado bovino. Apoio: FAPESP.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

RECONGELAO DO SMEN DE GARANHES PANTANEIROS


Zccari, C.E.S.N.1; Nunes, D.B.2; dePaula, F.A.L.3; Ferreira, C.S.3; Costa e Silva, E.V.4
1

Departamento de Produo Animal UFMS, Cx Postal 549, CEP: 79070-900. Campo Grande - MS;
Mestranda em Cincia Animal UFMS; 3Bolsista Iniciao Cientfica/CNPq UFMS; 4Departamento
de Medicina Veterinria UFMS. nunesdb@nin.ufms.br

As doses de smen eqino congelado possuem, em geral, uma concentrao de 400x106 espermatozides/
ml. Contudo, para inseminaes sobre ou ao redor da papila tero-tubrica, concentraes bem inferiores
tm sido usadas com sucesso. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a taxa de recuperao da motilidade
e de clulas ntegras aps submeter o smen ao fracionamento e a recongelao. Foram analisados 45
ejaculados provenientes de seis garanhes da raa Pantaneira, sendo 26 congelados com o diluidor Merck e
19 com meio M-9, em palhetas de 0,5 ml. As amostras foram descongeladas a 37C/30 segundos e aps
cerca de 15 minutos, re-envasadas em palhetas de 0,25 ml e submetidas a dois tratamentos: TMTI colocadas
diretamente no vapor de N2 lquido / 20 minutos seguida de imerso e; TMTII mantidas por 1 hora sob
refrigerao a 5C, antes da recongelao conforme o mesmo procedimento do primeiro tratamento. As
variveis analisadas ps-1a. descongelao foram motilidade espermtica (MOT1) e percentagem de clulas
com membrana plasmtica ntegra (INT1), avaliada pela colorao com diacetato de
carboxifluorescena+iodeto de propdio. Aps a 2a. descongelao, alm da MOT2 e INT2, calculou-se as
taxas de recuperao da motilidade (RMOT) e do percentual de espermatozides ntegros (RINT), utilizandose uma regra de trs simples. Os dados foram transformados em arcoseno (X/100) antes de serem submetidos
anlise de varincia utilizando o procedimento GLM do SAS, considerando como variveis fixas: Tratamento
(TMT I e II), Garanho (G1...G6), Diluidor (D1 e D2) e a interao TMT*D. As mdias foram comparadas
por teste t de Student. Foi observado efeito de garanho (p<0,05) para todas as variveis estudadas e de
diluidores (p<0,05) para MOT1, MOT2, INT2 e RINT. No houve efeito significativo (p>0,05) da interao
TMT*D em nenhuma das variveis estudadas. A motilidade e percentagem mdias de ntegros a 1a.
descongelao foram de 39,56 1,14% e 35,22 1,13%, respectivamente. A motilidade e percentagem
mdias de espermatozides ntegros alcanadas para os diferentes tratamentos foram significativamente maiores
(p<0,05) para o TMTII: MOT2 = 12,00 1,00 vs 14,78 0,94% e INT2 = 9,69 0,64 vs 13,44
0,86%, para os tratamentos I e II, respectivamente. A taxa de recuperao da motilidade e do percentual de
clulas ntegras foi significativamente superior (p<0,05) para o TMTII: RMOT = 29,85 1,76 vs 37,54
1,91% e RINT = 30,19 2,61 vs 41,75 3,13%, para os tratamentos I e II, respectivamente. De acordo
com os resultados conclui-se que a refrigerao do smen pr-recongelao foi benfica para a preservao
da qualidade seminal ps-2a. descongelao e resultou em melhor taxa de recuperao da motilidade.
Palavras-chave: criopreservao; eqino; smen

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

CRIOPRESERVAO DO SMEN DE Leopardus tigrinus : COMPARAO


ENTRE DOIS CRIODILUENTES.
Tebet, J.M.1; Martins, M.I.M.1,2; Chirinea, V.H.1; Souza, F.F.1,3; Adania, C.H.4; Lopes, M.D.1
1

Departamento de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria FMVZ/UNESP, Botucatu,


SP, 18618-000. 2 UEL, Londrina, PR. 3 UNIRP, S.J. Rio Preto, SP. 4 Associao Mata Ciliar,
Jundia, SP. jmtebet@uol.com.br

O smen criopreservado de felinos selvagens tem mostrado baixa eficincia quando utilizado em biotcnicas
reprodutivas, principalmente devido aos danos sofridos durante o resfriamento at 5C (Pukazhenthi et al.,
Biol. Reprod., 61, 135-41, 1999) e pela ao txica dos crioprotetores (Nelson et al., Theriogenology, 51,
290, 1999). Neste trabalho, com auxlio do teste de Wilcoxon, comparamos a eficincia de dois diluentes
com diferentes concentraes de crioprotetores, o TEG (tris-gema, SDS, 7% glicerol) e o MP-50 (3%
glicerol, 2% dimetilformamida) (Papa et al., Rev. Bras. Reprod. Anim, 26, 184-5, 2002) para congelar
smen de gato-do-mato-pequeno (Leopardus tigrinus, n=5, 15 ejaculados), utilizando uma curva lenta de
resfriamento (0,4C/min). O smen foi colhido por eletroejaculao (Howard et al., J. Androl., 11, 204-15,
1990), avaliado para motilidade, vigor, concentrao e morfologia espermtica em microscopia ptica (Pope
et al., J. Zoo Wild. Med., 22, 87-95, 1991) e de transmisso. O volume foi dividido em duas alquotas que
foram centrifugadas (300g/10min) e os pellets diludos nos criodiluentes (20 x 106 espermatozides/mL). O
smen acondicionado em palhetas (0,25 mL) foi mantido sob refrigerao por 60 minutos, permaneceu em
vapor de nitrognio (6 cm da coluna) por 20 minutos e foi imerso. Aps a descongelao (42C/15 seg), foi
reavaliado. No houve diferena estatstica entre a eficincia dos diluentes (p=0,05). A queda mdia na
motilidade foi de 55% e de 34,7% no vigor espermtico, com elevao de 52% na incidncia de defeitos
maiores, especialmente relacionados a alteraes de acrossomo. A avaliao ultraestrutural dos
espermatozides confirmou leses em acrossomo em diferentes graus decorrentes da criopreservao. A
alta taxa de contaminao dos ejaculados com urina (53%) somada ao tempo de exposio aos crioprotetores
durante o equilbrio foram provveis fatores relevantes para o agravamento das leses acrossmicas.
Apoio: CNPq e FAPESP.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

TEMPERATURA RETAL, ESCROTAL E INTRATESTICULAR E DENSIDADE DE


GLNDULAS SUDORPARAS EM ESCROTO DE BFALOS (Bubalus bubalis).
Satrapa, R.A.1; Satrapa, R.2; Diniz, E.G.2; Beleti, M.E.2; Eberhardt, B.G.1
1

Mdico Veterinrio Av. Petrarca Bachi, 213 Vila Maria Botucatu SP rsatrapa@yahoo.com.br .
Professor adjunto IV da Faculdade de MedicinaVeterinria da Universidade Federal de Uberlndia.

Para a maioria dos mamferos adultos a temperatura testicular mais baixa que a corporal, o que garante um
ambiente trmico adequado para o curso normal da espermatognese (MACDONALD, Theor. Biol., v.
145, n. 4, p. 430). O mecanismo de termorregulao testicular envolve a participao do plexo pampiniforme,
do escroto com suas glndulas sudorparas e sua tnica dartos (DAHL, E. V., Surg. Gynec. Obstet., v. 108,
p. 697-705). Objetivou-se determinar as temperaturas retal (TR), escrotal (TE) e intratesticular (TI) e o
nmero de glndulas sudorparas em escroto de bfalos. Foram utilizados 52 bfalos da raa Murrah, separados
em 2 grupos de igual nmero, sendo o grupo I constitudo de animais com idade de 12 a 15 meses e o grupo
II de 18 a 24 meses, criados extensivamente. As determinaes das TR foram feitas com termmetro clnico
e as TE e TI com termmetro digital. Para identificao histolgica das glndulas sudorparas, preparou-se
lmina de um fragmento de pele da regio distal do escroto de cada animal coradas por hematoxilina-eosina
e examinadas em microscopia ptica (nmero de glndulas por mm linear de epitlio). Os dados foram
analisados atravs do teste t de student. A mdia (desvio padro) da TR, TE e TI do grupo I foi 38,63C0,44,
35,67C0,80 e 36,90C0,85, respectivamente e para o grupo II, 39,12C0,65, 36,03C0,96 e
37,73C0,74, respectivamente. As TR, TE e TI foram diferentes (p<0,05) dentro de cada faixa etria, bem
como entre elas, exceto para a TE entre as duas faixas (p=0,25). A mdia do nmero de glndulas sudorparas
do grupo I (1,14) foi diferente (p<0,05) da do grupo II (1,42). Conclui-se que: a TE e TI foram inferiores
TR nos dois grupos estudados; o nmero de glndulas sudorparas no escroto dos animais do grupo II foi
maior.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

CIRCUNFERNCIA ESCROTAL EM CARNEIROS DA RAA SANTA INS EM DEZ


CATEGORIAS DE IDADE E SUA RELAO COM PESO CORPORAL, IDADE E
MEDIDAS CORPORAIS
Bittencourt, R.F.1; Chalhoub, M.1; Alves, S.G.G.; Portela, A.P.M.1; Almeida, A.K.1;
Biscarde, C.E.A.1; Freitas, D.S.1; Ferreira, A.B.C.2; Ribeiro Filho, A. de L.1
Escola de Medicina Veterinria UFBA, Salvador-BA, 40170-110, Brasil. 2Veterinrio autnomo. Email: rbittencourt_vet@hotmail.com

Diversos estudos tm demonstrado a importncia da utilizao da circunferncia escrotal (CE) como critrio
na seleo de reprodutores. Esta caracterstica apresenta correlaes significativas com parmetros
espermticos, alm disso, verifica-se que animais mais precoces tendem a apresentar maiores CE, fato
comprovado pela correlao significativa entre CE e a idade a puberdade em carneiros da raa Santa Ins.
Deve-se considerar tambm, que ao usar a CE como critrio de seleo estar-se- agregando as prximas
geraes esse atributo, e consecutivamente todas as caractersticas reprodutivas e produtivas que apresentam
afinidades genticas com a mesma, considerando ser esta uma caracterstica de boa herdabilidade. Foram
coletados os dados de circunferncia escrotal (CE), peso corporal (PC) e as medidas corporais, altura de
garupa (AG), altura de cernelha (AC), comprimento corporal (CC) e permetro torcico (PT) de 415 carneiros
da raa Santa Ins, de vrias idades, apresentados em exposies entre 2002 e 2004. O objetivo desse
estudo foi observar as mdias e desvios padro para as variveis estudadas nas diferentes faixas etrias, e
tambm verificar a relao entre CE e PC e entre CE e as medidas corporais em diferentes categorias de
idade, atravs de uma anlise de correlaes entre essas caractersticas. Observaram-se, tambm, correlaes
simples entre CE x PC e CE x idade, considerando-se a populao como um todo. As categorias, em meses,
foram: 4-6 (C1), 6-8 (C2), 8-10 (C3), 10-12 (C4), 12-15 (C5), 15-18 (C6), 18-24 (C7), 24-30 (C8), 3036 (C9) e acima 36 (C10). Para a anlise estatstica das caractersticas avaliadas, foi empregado o pacote
estatstico Statistical Analysis System (SAS) verso 6.1. As mdias e desvios padro para a CE (cm),
nas dez categorias, foram 28,44 3,77 (C1), 31,41 2,49 (C2), 32,26 1,76 (C3), 32,86 2,39 (C4),
33,43 2,33 (C5), 33,33 2,67 (C6), 34,38 2,60 (C7), 34,65 2,21 (C8), 35,04 1,85 (C9), 36,19
2,8 (C10). As correlaes entre CE e PC foram significativas nas categorias C1 (r=0,42; P<0,05), C2
(r=0,41; P<0,01), C5 (r=0,40; P<0,01), C6 (r=0,52; P<0,0001), C7 (r=0,35; P<0,05), e C10 (r=0,64;
P<0,005) e as correlaes simples entre CE x PC e CE x idade, considerando-se todos os animais estudados,
foram respectivamente r=0,63 (P<0,001) e r=0,49 (P<0,001). A utilizao da CE na predio da PC,
para a seleo de reprodutores ovinos pode ser recomendada nas categorias C1, C2, C5, C6, C7 e C10.
As correlaes simples entre a CE e CC, AC, AG e PT para toda a populao foram respectivamente,
r=0,49; r=0,56; r=0,54 e r=0,61 (p< 0,0001). Com base na correlao significativa entre CE e PC em
algumas categorias de idade, conclui-se que ao utilizar-se a CE como um dos critrios de avaliao de
carneiros da raa Santa Ins, ser favorecida a seleo de animais com alto ganho de peso e com melhor
potencial reprodutivo. Esse estudo tambm mostrou a existncia de uma alta correlao entre CE e as
medidas corporais, o que significa que animais com maior CE apresentam um maior potencial produtivo e
reprodutivo.
180

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

IDENTIFICAO DE CLULAS DE LEYDIG EM TESTCULO DE CAPIVARA


(Hydrochoerus hydrochaeris) ATRAVS DA LOCALIZAO DE STIOS DE
AO DA AROMATASE CITOCROMO P450
Batalha, L.M.1; Oba, E.2; Laufer Amorim, R.3
1- PUCPR, Rod. BR376, km14, Costeira, Cx. Postal 129 CEP83010-500, So Jos dos Pinhais, PR,
Brasil. lbmvet1@aol.com; 2- Department of Animal Reproduction and Veterinary Radiology, FMVZ/
UNESP Botucatu, Distrito de Rubio Jr, s/n, SP, CEP18618-000; 3- Centro Universitrio de So Jos do
Rio Preto
Em esfregao testicular de capivara obtido atravs de citologia aspirativa com agulha fina, observamos a
presena de grande quantidade de clulas arredondadas uniformes, no - identificadas. Estas clulas, embora
ainda no descritas, apresentavam-se morfologicamente muito semelhantes entre si, com ncleos isolados
de contorno regular, contendo um ou dois nuclolos, cromatina finamente granular com pontos de
condensao distribudos regularmente; o ncleo mostrava-se aproximadamente trs vezes menor que o da
clula de Sertoli. Sugerimos, na ocasio, que as clulas no - identificadas pertencessem populao
presente no interstcio, baseado em estudos que descrevem a proporo de interstcio X tbulos seminferos
em capivaras. Suspeitamos serem estas clulas de Leydig, mas no pudemos identific-las com segurana
pelas diferentes morfologias apresentadas por esta em diferentes espcies, e pelo seu contedo citoplasmtico
com grnulos de colesterol, que pode ser degradado pelo mtodo de colorao. Para caracterizar estas
clulas como Leydig, utilizamos a tcnica de imunoistoqumica para colorao de stios de atividade da
enzima microsomal aromatase citocromo P450; esta se localiza no retculo endoplasmtico liso e catalisa a
converso de andrgenos em estrgenos. Blocos de parafina com fragmentos de testculo serviram como
base para obteno de cortes, e o material foi preparado segundo protocolo utilizado no Laboratrio de
Imunoistoqumica do Departamento de Patologia Veterinria da FMVZ, UNESP / Botucatu. Para execuo
da tcnica, foi utilizado anticorpo policlonal de coelho anti - aromatase placentria humana citocromo P450
(Hauptman Woodward Medical Research Institute, Inc. Buffalo, New York ). As lminas foram montadas
com lamnulas utilizando-se o Permount (Fisher Scientific cod. UN1294), e avaliadas quanto a
imunomarcao em aumentos de x100 e x400. A tcnica de imunoistoqumica permitiu caracterizar as
clulas de Leydig presentes no interstcio testicular pela precipitao de imunocomplexos no citoplasma das
mesmas. Estas apareceram em grande quantidade formando uma massa quase compacta entre os tbulos
seminferos. As clulas imunopositivas apresentaram diferena de intensidade de marcao, o que pode ser
explicado pela diferena de atividade celular no momento da fixao ou pela modulao da atividade destas
clulas pela atividade das clulas do epitlio seminfero adjacente. Houve precipitao de imunocomplexo
na membrana do tbulo seminfero, e esta constitui reao inespecfica, j que o anticorpo utilizado policlonal.
Suporte Financeiro: FAPESP

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

MASSA MOLAR DAS PROTENAS DE PRSTATA E GLNDULA DE COAGULAO


DE CAPIVARA (Hydrochoerus hydrochaeris).
Batalha, L.M.1; Oba, E.2; Souza, F.F. de3
1

PUCPR, Rod. BR376, km14, Costeira, Cx. P. 129 - 83010-500, So Jos dos Pinhais, PR, Brasil.
lbmvet1@aol.com; 2Departamento de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria - FMVZ/UNESP,
Botucatu-SP, 18618-000, Brasil; 3Centro Universitrio de So Jos do Rio Preto
Existe uma grande variao entre as diferentes espcies com relao anatomia, biologia e funo das
glndulas sexuais acessrias e, embora presente em todos os mamferos, a prstata apresenta diferentes
caractersticas anatmicas e bioqumicas entre as espcies. Atualmente, a classificao estrutural desta
consiste em prstata ventral, dorsolateral, duas pores laterais, e glndula de coagulao, considerada um
lobo adicional da prstata localizada anteriormente. A principal funo do plasma seminal servir como
meio de transporte e sustentao para os espermatozides; o estudo deste fluido desperta interesse uma
vez que os diluidores seminais atuais tentam, de alguma forma, substitu-lo. Secrees prostticas de cinco
animais, e de glndula de coagulao de oito animais foram colhidas, aps inciso das mesmas, em no
mximo 15 minutos aps o abate em matadouro comercial. As amostras foram acondicionadas em criotubos,
identificadas e mantidas em nitrognio lquido at o momento da avaliao. O protocolo para execuo da
eletroforese foi efetuado segundo o descrito por Souza & Lopes (Rev. Bras. Reprod. Anim., 26: 75-7,
2002), utilizando-se uma concentrao de 12% de poliacrilamida no gel de separao. As imagens dos gis
foram digitalizadas (VDS - Image VDS Amersham Biosciences), e um programa analisador de imagens
(Gel Pro-Analyzer v. 3.0 - Amersham Biosciences - Departamento de Fsica e Biofsica, Instituto de
Biocincias, UNESP, Botucatu, SP) foi utilizado para determinar o peso molecular para cada banda de
cada amostra no gel. Os gis foram montados entre papel celofane permevel com gelatina incolor, sobre
uma placa de vidro. As anlises indicaram um total de 42 bandas, variando de 250 a 10 kDa, na secreo
de glndula de coagulao e apenas 10 (63 kDa, 41 kDa, 31 kDa, 24 kDa, 21 kDa, 19 kDa, 17 kDa, 15
kDa, 14 kDa e 11 kDa) estavam presentes nas oito amostras. A quantidade de bandas nas amostras variou
entre 22 e 31. Na prstata foram identificadas 37 bandas de protena e 14 (53 kDa, 49 kDa, 39 kDa, 35
kDa, 34 kDa, 33 kDa, 31 kDa, 29 kDa, 24 kDa, 22 kDa, 19 kDa, 17 kDa, 16 kDa e 13 kDa) apareceram
em todas as amostras. A quantidade de bandas nestas amostras variou entre 26 e 35. Acima do limite
mximo do marcador de peso molecular (250 kDa) foram observadas outras duas bandas para glndula de
coagulao e uma banda para prstata. Abaixo do limite mnimo (10 kDa) do marcador de peso molecular
foram encontradas outras 48 pequenas bandas em glndula de coagulao e 20 em prstata. A anlise
comparativa entre as protenas identificadas no gel de eletroforese da secreo de prstata e de glndula de
coagulao de cada animal demonstrou no existir diferena significativa (p<0,05) na composio protica
das secrees destas glndulas para cada animal, ou seja, a composio protica da prstata bastante
similar composio protica da glndula de coagulao. Entre os animais a diferena de composio
tambm no foi significativa. Estes resultados so os primeiros sobre descrio de perfil protico de glndula
de coagulao e prstata de capivara e servem como comparao para estudos futuros na espcie.
Suporte Financeiro: FAPESP
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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

OTIMIZAO DO PROTOCOLO DE POLIMERASE CHAIN REACTION ( PCR )


PARA SEXAGEM DE EMBRIES BOVINOS EM DIFERENTES ESTGIOS
DE PR - IMPLANTAO
Polisseni, J.1; Camargo, L.S.A.1; S, W.F.1; Machado, M.A.1; Ferreira, A.M.1;
Oliveira, R. S.1; Ramos, A.1
1

Embrapa Gado de Leite - Juiz de Fora - MG, 36038330, Brasil. - bioqju@bol.com.br

Objetivou-se elaborar um protocolo animal para estudo da sexagem de embries bovinos, em diferentes
estgios de desenvolvimento embrionrio. Padronizou-se a tcnica de PCR para avaliao da proporo do
sexo dos embries. Complexos cumulus-ocitos (CCOS), obtidos de folculos de ovrios coletados de
animais abatidos, foram maturados in vitro, em meio TCM199, enriquecido com soro de vaca em cio e
FSH, durante 24h, em 5% de CO2 a 38,8 C. Em seguida, foram fecundados in vitro, por 18h, com 2,0 x
106 espermatozides/ml obtidos atravs da tcnica de swim up. Os possveis zigotos foram colocados em
meio de cultivo definido, CR2aa, no mesmo ambiente atmosfrico da maturao. Aps a avaliao da taxa
de clivagem (n=78), e do desenvolvimento a estgio de blastocisto (n=44), 72h e 8 dias, respectivamente, os
embries foram colocados em contato com soluo cida Tyrodes para a retirada da zona pelcida. Em
seguida os embries foram lavados em meio PBS com 0,4% de BSA e congelados em tubos de PCR a 20C, contendo 11l da soluo tampo (PCR10X e 1,5mg/ml proteinase K). Para posterior realizao da
sexagem pela tcnica de PCR, os tubos foram incubados a 50C, por 1h, visando a extrao do DNA. Aps
a digesto dos embries, adicionou-se 9l de uma mistura, contendo PCR10X, 25mM Mgcl2, 200M
dNTP, 1U taq polimerase e 0,5M dos primers (Y=213pb e controle=269pb). O protocolo adaptado da
Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia utilizou como parmetro 40 ciclos, consistindo de desnaturao,
ligao dos primers e polimerizao. Aps o PCR, os produtos da amplificao foram submetidos a
eletroforese em gel de poliacrilamida 8%, por 40 min a 500 voltes. Para melhor visualizao da proporo
dos sexos, dividiu-se os embries em grupos: grupo 1 = 2-8 clulas (n=61), grupo2 = 9-16 clulas (n=17) e
grupo3 = blastocisto (n=44).Os resultados foram analisados pelo teste do Qui-quadrado. A proporo dos
sexos dos embries, em diferentes estgios celulares, no diferiu entre os grupos 1, 2 e 3, apesar de parecer
haver uma tendncia para deteco de um nmero maior de fmeas (n= 37) no grupo1, e um nmero maior
de machos no grupo 3 (n= 24), quando comparado com os demais. Os resultados comprovam que o protocolo
utilizado tecnicamente vivel, j que os dados da literatura relatam que, em experimentos in vitro, os
embries masculinos se desenvolvem a estgios mais avanados do que os embries femininos (Avery, B.;
Molecular Reproduction and Development, 32: 265- 270) , sendo necessrio futuros estudos para o
entendimento deste mecanismo, possivelmente influenciado por hormnios sexuais masculinos.

183

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

AVALIAO DA VIABILIDADE IN VITRO DA MICROMANIPULAO DE EMBRIES


BOVINOS PRODUZIDOS IN VIVO, VISANDO A IDENTIFICAO DO SEXO E A
OTIMIZAO DA TRANSFERNCIA DE EMBRIOES
Melo, L.F.1,2; Souza, R.V.2; Dode, M.A.N.2; Rumpf, R.2
Universidade de BrasliaUnB/ Faculdade de Agronomia e Medicina VeterinriaFAV, 70910-900,
Braslia-DF, Brasil; 2 EMBRAPA Recursos Genticos e Biotecnologia, Parque Estao Biolgica, 70770900, Braslia-DF, Brasil. leonardofmelo@hotmail.com
1

A micromanipulao de embries envolve vrias tcnicas, entre elas a bisseco e a sexagem de embries,
assunto deste trabalho. O objetivo foi avaliar a viabilidade in vitro da bisseco e bipsia de embries
produzidos in vivo e cultivados individualmente em sistema WOW modificado (WOWm; Pereira et al.,
2003) por 24 hs. O experimento foi realizado no Laboratrio de Reproduo Animal da Embrapa Recursos
Genticos e Biotecnologia. Dez fmeas cruzadas Simental x Nelore foram superovuladas quatro vezes, com
intervalo de 60 dias entre as superovulaes, segundo o protocolo de cio base induzido com reforo de
Progesterona (CIDR) e oito aplicaes de FSH (PLUSET) com doses decrescentes. As coletas foram
realizadas sete dias aps a inseminao artificial e os embries obtidos foram classificados segundo os
parmetros definidos pela IETS. Apenas os embries Mc, Bi e Bl qualidade I foram utilizados neste
experimento. Aps a classificao, os embries foram reunidos, lavados e mantidos em meio holding (DPBS
+ 0,4%BSA) temperatura ambiente, sendo distribudos aleatoriamente em trs tratamentos: T1 (controle);
T2 (bipartido) e T3 (bipartido e biopsiado). A bisseco foi feita em gota de DPBS em placa de petri, com
o auxilio de um estreomicroscopio, micromanipulador e lmina prpria. Os embries e hemi-embries
foram cultivados em gotas de 200 l de meio SOFaaci , em placas de petri de 60 mm preparadas previamente
com o sistema WOWm, imerso em leo de silicone em estufa 39C, 5% de CO2 e umidade saturada por
24 hs. A sexagem foi feita pela tcnica da PCR (Polimerase Chain Reaction). Os resultados foram analisados
pelo programa SigmaStat para Windows verso 3.0, Jandel Scientific Corporation, pelo teste de Qui-quadrado
(2). Comparando T1, T2 e T3, as diferenas foram significativas quanto ao nmero de embries degenerados
aps 24hs de cultivo (P0,001), considerando cada hemi-embrio como uma unidade embrionria (1, 25 e
36, respectivamente). No foram encontradas diferenas significativas quando comparados os tratamentos
T2 e T3 (P=0,159). Quanto aos embries e hemi-embries que se desenvolveram aps o cultivo em relao
ao nmero de embries iniciais, foi encontrado diferena entre T1 e T2 (69/70 e 92/60; P=0,081). No
foram encontradas diferenas entre os tratamentos T1 e T3 (69/70 e 83/60; P=0,195) e os tratamentos T2
e T3 (92/60 e 83/60; P=0,752). Quanto a sexagem, no houve diferena entre a proporo macho e fmea
(28 e 19; P=0,35). Concluiu-se que a tcnica da bisseco associada bipsia e cultivo in vitro por 24 hs
de embries Mc, Bi e Bl de qualidade 1 podem contribuir para o aumento nos ndices de transferncia de
embries, alm de possibilitar a identificao do sexo.
Apoio financeiro: Embrapa/CNPq

184

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

SEXAGEM FETAL EM OVINOS


Andrade, J.C.O.1; Guido, S.I.2; Sousa, B.P.A.1
1

Av. Caxang, 205, Sl 605, Madalena, Recife-PE, 50.610-230, Brasil. 2Programa de Ps-Grad. em
Cincia Veterinria/UFRPE, Recife-PE, Brasil. E-mail: jcorreaoa@uol.com.br

A sexagem fetal por ultra-sonografia tem sido bastante aplicada em bovinos, atravs da identificao e
localizao do tubrculo genital (TG). Todavia, em pequenos ruminantes tem sido implementada de maneira
incipiente. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a acurcia da sexagem fetal em ovinos por ultrasonografia transretal atravs da identificao e localizao do TG. Receptoras Santa Ins (n=163), de um
programa de descongelamento de embries da raa DORPER, foram submetidas ao diagnstico de gestao
e posteriormente, a sexagem fetal (n=73). Para realizao dos exames foi utilizando um aparelho Aloka SD
500 equipado com um transdutor linear de 5,0 MHz acoplado a um cabo de PVC, para permitir seu
direcionamento interno atravs de manipulao externa. Os animais foram contidos em estao e foi utilizado
gel de contato para facilitar o exame. A determinao do sexo fetal foi realizada entre o 50 e o 72 dia de
gestao. Os fetos foram diagnosticados como machos quando o TG localizava-se imediatamente caudal ao
cordo umbilical e como fmeas quando estava prximo a cauda, sendo posteriormente, confirmados ao
parto. A taxa mdia de prenhez obtida foi de 44,8% (73/163). O sexo fetal foi determinado em todas as
receptoras (100%), sendo os diagnsticos corretos em 100% (38/38) dos fetos machos e em 94,3% (33/
35) dos fetos fmeas. Portanto, conclui-se que a sexagem fetal por ultra-sonografia transretal em ovinos
apresenta uma elevada acurcia no perodo de gestao observado.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

UTILIZAO PRVIA DO PLUSET NA ASPIRAO FOLICULAR: IMPACTO NA


PRODUO IN VITRO DE EMBRIES EM VACAS Bos indicus
Blaschi, W.1; Andrade, E.R.1; Nonato Jr., I.2; Pontes, J.H.F.2; Ereno Jr., J.C.2;
Uvo, S.2; Seneda, M.M.1
1

Departamento de Clnicas Veterinrias , CCA, Universidade Estadual de Londrina, PR, 86051-990; 2In
Vitro Brasil Central de Biotecnologia da Reproduo- Mogi Mirim -SP

A utilizao do Pluset mostrou-se mais efetiva que Folltropin para a produo in vitro de embries, considerando
sua aplicao prvia aspirao folicular (Nonato Jnior, Acta Sci Vet 2003; 31, 512). Baseado nesta
citao, o objetivo deste trabalho foi avaliar o impacto da aplicao do Pluset antes da aspirao folicular,
quanto ao nmero de ocitos e embries produzidos in vitro. Foram realizadas 50 aspiraes foliculares com
utilizao de Pluset e 44 sem o uso da gonadotrofina (Grupo Controle, GC). Todos as vacas utilizadas eram
da raa Nelore (Bos indicus), aleatoriamente designadas para cada procedimento. Para sincronizar o
crescimento folicular, os folculos > 5 mm foram aspirados em um momento aleatrio do ciclo estral denominado
Dia Zero (D0). Aps 24 horas (D1), procedia-se aplicao do FSH, atravs de injeo intramuscular nica
de 100 UI de Pluset. Depois de dois dias da aplicao do FSH (D3), procedia-se nova aspirao folicular,
sendo estes ocitos considerados para avaliar o impacto do FSH quanto ao nmero de embries obtidos. O
GC foi submetido recuperao de ocitos em um estgio aleatrio do ciclo estral. Nas vacas que receberam
Pluset obtve-se um total de 740 ocitos e 216 embries, com mdias respectivas de 14,8 e 4,32. Os
animais do GC apresentaram totais de 810 ocitos e 238 embries, com respectivas mdias de 18,4 e 4,76.
No foi observado diferena na qualidade e nas mdias de ocitos recuperados e de embries produzidos in
vitro. De acordo com estes resultados, a utilizao do Pluset no incrementou a produo in vitro de
embries em vacas Nelore. Estes dados so contraditrios a outros trabalhos presentes na literatura.
Consideramos como provvel explicao o fato deste trabalho ter sido conduzido com vacas zebunas,
contrastando com outros estudos realizados em gado europeu. De acordo com nossas observaes, vacas
zebunas apresentam naturalmente maior nmero de folculos por onda, em comparao ao gado europeu.
Talvez por este motivo o FSH tenha tido um impacto menor no crescimento folicular e conseqente
disponibilizao de ocitos para a produo de embries. Ressalta-se que esses resultados so preliminares,
e melhor uma avaliao destes resultados ser possvel com a continuidade dos trabalhos.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

PR-SINCRONIZAO DE VACAS PARA COLETA DE COMPLEXOS


CUMULUS-OCITO: RESULTADOS PARCIAIS
Viana, J.H.M.1; Palho, M.P.1; Arashiro, E.K.N.2; Ferreira, A.M.1;
Fonseca, J.F.3; Fernandes, C.A.C.4
1

Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG 36038-330. 2 Universidade Federal Fluminense, Niteri, RJ
24230-300. 3 Embrapa Caprinos, Sobral, CE 62011-970. 4 Universidade de Alfenas, Alfenas, MG
37130-000

A tcnicas de puno folicular orientada por ultra-sonografia possibilita a recuperao de complexos cumulusocito (COC) para a produo in vitro de embries. Contudo, a qualidade dos ocitos recuperados e,
consequentemente, seu potencial de desenvolvimento, dependem do status do crescimento folicular no momento
da coleta. Objetivou-se neste trabalho avaliar o efeito da pr-sincronizao do crescimento folicular sobre o
nmero e qualidade dos COCs recuperados. Foram utilizadas 16 vacas da raa Gir, previamente selecionadas
em funo da populao folicular mdia ao longo do ciclo. Quatro animais foram utilizados como grupo
controle, sendo coletados sem qualquer tratamento prvio, e os demais divididos em trs grupos, prsincronizados pelo uso de um dispositivo intravaginal de progesterona (CIDR) e prostaglandina e submetidos
aspirao folicular em semanas alternadas. Aps a retirada do dispositivo, foi feita a induo da ovulao
pela administrao de 0,1mg de gonadorelina. Os tratamentos foram programados de forma a que as sesses
de coleta nos animais pr-sincronizados fossem realizadas 84 a 96h aps a ovulao. Os COCs recuperados
e considerados viveis foram levados ao laboratrio de fertilizao in vitro, onde foram maturados por 24h
em TCM199. Os resultados esto apresentados na forma de mdiaD.P. Foram realizadas 24 coletas nos
grupos controle e pr-sincronizado, com a obteno de 15,837,09 e 21,748,70 COCs por doadora,
respectivamente. No houve diferena no percentual de estruturas classificadas como viveis entre os grupos
(70,0% vs. 69,24%; P>0,05). O percentual de ocitos maturados aps 24h de cultivo, contudo, foi maior no
grupo pr-sincronizado (85,20% vs. 76,32%, P<0,01). Estes resultados parciais sugerem que o uso da prsincronizao do crescimento folicular uma alternativa para a obteno de COCs com maior potencial de
desenvolvimento no cultivo in vitro.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

SUPLEMENTAO DE DIETAS COM LEO DE SOJA E TRATAMENTO


COM rBST NA PRODUO IN VITRO DE EMBRIES BOVINOS
Pivato, I.1,2; Sartori, R.2; Cavalieri, F.B.3; Pereira, D.C.2; Rumpf, R.2
1

CIDASC, Indaial-SC, 89130-000, Brasil. 2 Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, Braslia-DF,


70770-900, Brasil. 3 Universidade Estadual de Maring, Maring-PR, 87020-900, Brasil.
pivatotche@lycos.com

A adio de gordura na dieta e a aplicao de somatotropina bovina recombinante (rBST) auxiliam no


crescimento folicular em bovinos. Este trabalho objetivou avaliar a taxa de formao de blastocistos bovinos
in vitro aps aspirao folicular (AF) em novilhas superestimuladas com FSH, alimentadas com diferentes
nveis de gordura e recebendo ou no rBST. Quinze novilhas (Bos indicus x Bos taurus; 450 kg PV)
mantidas em pastagem de braquiria foram divididas aleatoriamente em 3 grupos de 5 animais cada (Controle;
leo de soja [OS]; e OS+rBST). Foi fornecida uma dieta suplementar (4 kg MS/animal/d) entre 25 d antes
da primeira sesso de AF e o final do experimento. No grupo Controle, a dieta continha 2,4% de extrato
etreo (EE). Nos outros 2 grupos a dieta possua 9,0% de EE devido adio de leo de soja. Alm do leo
de soja, o grupo OS+rBST recebeu aplicaes de rBST (250 mg; sc) a cada 7 d. As fmeas foram
superestimuladas com uma injeo de FSH (180 UI; im) 72 h antes da AF, e receberam GnRH (50 g; im)
20 h antes da AF. Foram realizadas 5 sesses de AF com intervalo de 7 d cada. Os dados foram analisados
pelo procedimento GLM do SAS. Durante o experimento, os animais ganharam em mdia 950 g PV/d. No
grupo Controle houve um maior (P < 0,01) nmero de folculos aspirados (151) e de ovcitos recuperados
(117), quando comparado aos grupos OS (122 folculos e 88 ovcitos) e OS+rBST (114 folculos e 80
ovcitos). A porcentagem de ovcitos de qualidade superior no diferiu (P = 0.11) entre os grupos Controle
(22,3%), OS (22,3%) e OS+rBST (31,6%). Alm disso, nos 3 grupos o nmero e porcentagem de ovcitos
que chegaram ao estgio de blastocisto foi baixa e similar (P > 0,05). Foram obtidos 6,8% de blastocistos no
grupo Controle, 11,4% no grupo OS e 13,4% no grupo OS+rBST. Em concluso, a adio de leo de soja
dieta, associado ou no ao rBST, no aumentou a produo de blastocistos. Alm disso, o excesso de
nveis nutricionais parece ter comprometido essa produo nos 3 grupos experimentais.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

CONCENTRAO PLASMTICA DE PROGESTERONA E TAXA DE GESTAO


EM RECEPTORAS DE EMBRIO
Fernandes, C.A.C.1; Oba, E.2; Figueiredo, A.C.S.3
1

Prof. Med. Veterinria-Unifenas, Bolsista Fapesp. Rua Tatuin, 93, 37130-000-Alfenas, MG.
2
FMVZ-Unesp-Botucatu. 3Profa. Inst. Cincias Agrrias-Unifenas. cacf@biotran.com.br

O presente trabalho foi desenvolvido no sentido de correlacionar a concentrao plasmtica de progesterona


no dia da transferncia, em receptoras de embrio bovino com a taxa de gestao. Foram utilizadas 676
novilhas mestias, com escore corporal entre 3 e 4 (escala 1-5), inovuladas entre o 6 e 8 dia do ciclo estral.
Foram utilizados embries a fresco, qualidade 1 e 2, transferidos por um mesmo tcnico, utilizando sempre
mesmo equipamento. No dia da inovulao o sangue foi colhido com tubos heparinizados. As amostras de
plasma foram estocadas a -20C e analisadas posteriormente por RIA, utilizando Kits comerciais para
determinao de progesterona (DPC-Medlab). De acordo com a concentrao de progesterona as receptoras
foram distribudas em 5 grupos. Grupo A: at 1,5 ng/ml (n=21); B: de 1,6 a 3,0 ng/ml (n=159); C: de 3,1 a
4,5 ng/ml (n=248); D: de 4,6 a 6,0 ng/ml (n=179) e E: acima de 6,0 ng/ml (n=69). O diagnstico de gestao
foi feito entre 30 e 40 dias por ultra-sonografia. As taxas de gestao dos diferentes grupos foram comparadas
pelo teste de 2. A taxa de gestao mdia foi de 55,03%. Para os diferentes grupos as taxas de gestao
foram 38,01a; 50,31b; 61,69b; 55,31b e 46,38a%, para os grupos A,B,C,D e E, respectivamente. Os
resultados demonstraram receptoras com nveis de progesterona intermedirios, entre 1,6 a 6,0ng/ml
apresentaram melhores taxas de gestao. Aquelas com concentraes muito elevadas deste esteride
(>6,0ng/ml) tiveram reduo na taxa de gestao (p<0,05). Apenas 3,1% das receptoras utilizadas
apresentavam no dia da transferncia concentraes de progesterona 1,5ng/ml.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

ESTRUTURAS OVARIANAS EM DOADORAS DE EMBRIO E SUA RELAO


COM O INTERVALO PGF-ESTRO
Fernandes, C.A.C.1; Viana,J.H.M.2; Oba, E.3; Figueiredo, A.C.S.4 Oliveira, E.R.5
Prof. Med. Veterinria-Unifenas, Bolsista Fapesp. Rua Tatuin, 93, 37130-000-Alfenas, MG; 2Embrapa
Gado de Leite, Juiz de Fora, MG; 3FMVZ-Unesp, Botucatu, SP; 4Profa. Inst. Cincias AgrriasUnifenas. 5Biotran LTDA cacf@biotran.com.br

Objetivou-se avaliar o nmero dos folculos no dia do estro e o de corpos lteos no dia da colheita dos
embries e correlacionar estas variveis com o intervalo deste a aplicao de prostaglandina at o incio das
manifestaes de estro. O presente trabalho foi desenvolvido de fevereiro de 2003 a maro de 2004 em trs
propriedades localizadas na regio Sul do Estado de Minas Gerais, em 89 colheitas de embries em fmeas
das raas Simental, Angus e Nelore. Os animais foram avaliados utilizando-se um equipamento de ultrasonografia com probe transretal bifreqencial de 8/6 MHz (Scaner Falco Pie Medical), no dia do estro
aps a superovulao e tambm no dia da colheita dos embries. Para os animais que no manifestaram
estro aps a superovulao, esta avaliao foi feita trs dias aps o final do tratamento de superovulao e
sete dias mais tarde. Todos os animais foram superovulados com protocolo convencional, utilizando implantes
de progesterona (D0) (CIDRPfizer) e doses decrescentes de FSH (D5-8 PGF D8) (FolltropinV
Vetrepharm). Os animais foram divididos em 5 grupos, de acordo com o intervalo PGF-Estro: Grupo A: at
36 horas; B: de 37 a 48 horas; C: de 49 a 60 horas; D: mais de 60 horas e E: sem estro. O nmero de
estruturas identificadas, em cada avaliao, foi comparado pelo teste de Tukey. O nmero mdio de folculos
com dimetro >7mm no dia do estro foi de 21,46,2a; 14,25,7b; 10,14,5b; 5,43,2c e 2,61,5c (p<0,05),
e de corpos lteos no dia da colheita foi de 17,56,3a; 12,86,6ab; 7,94,2b; 4,33,8c e 1,91,8c (p< 0,05)
para os grupos A,B,C,D e E, respectivamente. Os resultados mostraram que o nmero de folculos de maior
dimetro existentes nos ovrios est diretamente relacionado como o intervalo aplicao de PGF-estro, e
existe correlao positiva entre o nmero destes folculos e o nmero de ovulaes.

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PROTOCOLO P36 NO DELETRIO PARA OCITOS DE VACAS


NELORE (Bos indicus) DOADORAS DE EMBRIES
Melo, D.S.1a; Ferreira, M.M.G.1; Monteiro, F.M.1a; Potiens, J.R.2; Barros, C.M.1c.
1

Departamento de Farmacologia, Instituto de Biocincias, UNESP, Botucatu - SP. 2Central Bela Vista,
Pardinho SP.
c
Correspondncia: cmbarros@ibb.unesp.br

O presente experimento foi realizado com o objetivo de avaliar se nveis sub-luteais de progesterona (P4)
seriam prejudiciais ao ocito de vacas Nelore submetidas ao protocolo superestimulatrio (SE) denominado
P36.Este protocolo consiste na colocao de um dispositivo intravaginal contendo P4 (1,0g; DIB) associada
administrao IM de benzoato de estradiol (2,5 mg; Estrogin). Cinco dias mais tarde (D5) inicia-se o
tratamento SE com pFSH (Folltropin-V, dose total = 200 mg). No D7 (8:00 h) administra-se PGF2
(Prolise) e a retirada do DIB feita 36 h mais tarde (D8). A induo da ovulao feita por meio da
aplicao de LH (25,0 mg, Lutropin) no dia 9 s 8:00 h. Os animais so inseminados em tempo fixo, sem a
observao de cio, 12 e 24 h aps a aplicao de LH. Vacas Nelore (n=6) foram submetidas ao protocolo
P36, exceto que aps a retirada DIB (D8), os ocitos foram aspirados (OPU) e encaminhados para o
laboratrio de PIV (Grupo P36-OPU). Como controle interno do laboratrio foram utilizados ocitos de
ovrios provenientes de abatedouro (Grupo PIV-Controle). As taxas de clivagem (27/36 = 75%) e de
blastocisto (10/36 = 28%), obtidas a partir de ocitos provenientes de animais mantidos sob nveis subluteais de P4 por 36 h aps a administrao de PGF2 (Grupo P36-OPU), foram prximas das encontradas
rotineiramente no laboratrio (149/188 = 79% e 68/188 = 36%, respectivamente, Grupo PIV-Controle).
Conclui-se que a manuteno de nveis sub-luteais de P4 (protocolo P36), no afetou a viabilidade dos
ocitos, uma que vez os mesmos se desenvolveram at o estgio de blastocisto.
Bolsitas da aCAPES.

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RESULTADO DA RELAVAGEM UTERINA NA TAXA DE RECUPERAO


EMBRIONRIA EM CABRAS BOER

Machado, E.A.; Silva, A.P.; Farias Jnior, N.A.


Genoma Animal, Bahia, Brasil, genoma.animal@ig.com.br
Visando aumentar a taxa de recuperao de estruturas embrionrias, doadoras Boer foram submetidas a
uma segunda lavagem uterina 30 minutos aps a primeira. Foram realizadas 31 colheitas. Todas as doadoras
eram da raa Boer, primparas ou multparas, obedecendo ao mesmo programa supeovulatrio. No D0 foi
colocado o dispositivo vaginal de progesterona. Entre o D10 e D12 os animais receberam o FSHp, em
doses decrescentes, IM (total de 200 mg NIH-FSH-P1, em 6 aplicaes). No D12 foi retirado o dispositivo
vaginal de Progesterona e realizada a aplicao da PGF2. As coberturas aconteceram entre D13 e D14.
Para a colheita dos embries no D19, foram consideradas quatro etapas: 1) conteno do animal; assepsia
da regio vaginal; e anestesia regional e epidural, com 10 ml de lidocana 2%. 2) a crvix foi pinado e
tracionada com pina de Allis, sendo passada a sonda1 com auxlio de um mandril de ponta romba; 3) os
cornos esquerdo e direito foram lavados, com DPBS, separadamente, usando-se uma seringa de 20 ml,
repetidamente, at completar 200 ml por corno; e 4) aps 30 minutos em espera, os animais foram submetidos
segunda lavagem uterina, aps assepsia, repetindo as etapas 2) e 3), totalizando, na relavagem, 100 ml de
DPBS. Os lavados foram avaliados separadamente. Obteve-se na 1a lavagem, mdia de 9,65 6,06 estruturas;
e na 2a lavagem, mdia de 1,22 1,78 estruturas. Foi observado, que o resultado negativo se repete quando
na 1a lavagem no ocorrer recuperao de estruturas. Em alguns animais, o nmero de estruturas obtidas na
segunda lavagem, foi de 50 a 100% em relao 1a lavagem. Conclui-se que a dupla lavagem uterina
incrementa a taxa de recuperao embrionria em cabras Ber.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

ASSOCIAO ENTRE AS TCNICAS DE PUNO FOLICULAR E


COLETA DE EMBRIES EM VACAS GIR
Viana, J.H.M.1; Arashiro, E.K.N.2; Freitas, C.1; Palho, M.P.1; Fonseca, J.F.3
1

Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG 36038-330. 2 Universidade Federal Fluminense, Niteri, RJ
24230-300. 3 Embrapa Caprinos, Sobral, CE 62011-970

A associao das tcnicas de superovulao e aspirao folicular para produo in vitro de embries
constituem alternativas para a obteno de embries bovinos, sendo ambas largamente utilizadas na pecuria
nacional. Uma das limitaes de ambas as tcnicas a identificao de animais com potencial de resposta,
particularmente na superovulao. Objetivou-se neste trabalho estudar o grau de associao entre a recuperao
de complexos cumulus-ocito (COC) por puno folicular e a produo de embries in vivo pela
superovulao em doadoras Gir. Foram analisados resultados de nove animais que foram utilizados na
superovulao para produo de embries in vivo e, posteriormente, submetidos coleta de ocitos para
produo in vitro. As superovulaes foram realizadas pelos mtodos convencionais, i.e., oito aplicaes de
FSH em doses decrescentes, seguida de IA e coleta no stimo dia. As aspiraes foliculares foram realizadas
utilizando-se um equipamento porttil de ultra-sonografia equipado com uma guia para aspirao folicular.
Os resultados esto apresentados na forma de mdiaD.P. A produo mdia de embries in vivo (33
coletas, estruturas totais e viveis) foi de 6,746,10 e 3,914,17, respectivamente, e de COCs (203 coletas)
foi de 10,409,69 e 7,837,05. Como era esperado, o nmero de COCs recuperados apresentou uma alta
correlao com o nmero de folculos presentes antes da coleta (r=0,97; P<0,001). O nmero de estruturas
totais recuperadas por puno e por coleta de embries apresentaram uma correlao positiva (r=0,65;
P<0,05). Resultado semelhante foi obtido quando se considerou apenas os resultados da primeira puno ou
coleta de cada animal (r=0,66, P<0,05). Uma correlao mais baixa foi observada quando se computou as
estruturas viveis obtidas pelas duas tcnicas (r=0,57, P=0,054). Estes resultados demonstram que a populao
folicular a principal fonte de variao na recuperao de embries e ocitos, e deve ser utilizada como
critrio de seleo de doadoras. No caso da produo in vivo de embries, variaes na resposta ao FSH,
na ovulao, no desenvolvimento embrionrio e na eficincia de coleta respondem pelo restante da variao.

193

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

PRENHEZ EM BOVINOS APS TRANSFERNCIA DE EMBRIES


BIPARTIDOS E DE HEMI-EMBRIES CULTIVADOS in vitro *
Amaral, J.B.1; Oba, E.2; Pires, R.M.L.1
1

Instituto de Zootecnia APTA/SAA - SP. Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Gentica e


Reproduo Animal. Rua Heitor Penteado, 56. Centro. Nova Odessa -SP. CEP: 13460-000, Brasil.
jackson@iz.sp.gov.br 2 Departamento de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria - FMVZ/UNESP,
Botucatu-SP, 18618-000, Brasil.
A bipartio uma das principais biotcnicas complementares transferncia de embries. O presente
estudo tem como objetivo avaliar a eficincia do mtodo de bipartio de embries bovinos, descrito por
Reichenbach et al. (1998), com modificaes, associando ou no ao cultivo in vitro dos hemi-embries, na
taxa final de prenhez aps transferncia em receptoras. Avaliou-se ainda os fatores fisiolgicos e ambientais
que influenciam a taxa de prenhez, eliminando os efeitos capazes de modificar os resultados. A resposta aos
tratamentos superovulatrios, em termos de produo de estruturas embrionrias transferveis e notransferveis, foi avaliada em funo dos grupos genticos dos touros (Nelore e Caracu), grupos genticos
(Nelore, Caracu, Mantiqueira e mestios) e idade das doadoras (maiores que 7 e menores ou iguais a 7
anos) bem como tipos de acasalamentos (natural ou artificial). A taxa de prenhez nas receptoras foi analisada
em funo da transferncia de embries (intactos, bipartidos frescos e biparidos cultivados in vitro), grupos
genticos (Nelore, Caracu, Mantiqueira e mestios), idade (menores que 7 e maiores ou iguais a 7 anos),
nmero de transferncias de embries na reutilizao de receptoras (1, 2 ou 3), estao do ano (seca ou
chuvosa), sincronia do estro com as doadoras (igual, 24h antes ou 24h depois), stio de deposio do
embrio (corno uterino direito ou esquerdo) e estgio de desenvolvimento embrionrio (mrula ou blastocisto).
Os dados foram analisados no GLM do SAS (1996). A produo mdia total de estruturas embrionrias foi
de 2,510,71. Das estruturas embrionrias transferveis, o nmero mdio de mrulas foi de 0,02 0,01,
enquanto que a obteno de blastocistos foi de 1,30 0,39. As estruturas no transferveis apresentaram
uma mdia de 1,54 0,65. Para as anlises da taxa de prenhez, em funo das causas utilizadas, empregouse o Teste do X2 a 5%de probabilidade. Evidenciou-se que no houve efeito significativo na taxa de prenhez
em funo das variveis estudadas. A tcnica de bipartio mostrou ser eficiente na obteno de prenhez
aps a transferncia de hemi-embries frescos ou cultivados in vitro. No entanto, o cultivo in vitro, nos
moldes realizados, no melhorou a taxa de prenhez de hemi-embries transferidos. Quando avaliada aos 60
dias, essa taxa foi de 28%. Aps transferncia de 36 hemi-embries frescos, a taxa de prenhez, avaliada aos
60 dias, foi de 30%, sendo diagnosticado dois pares de gmeos monozigticos.
* Suporte financeiro: FAPESP e FMVZ/UNESP.

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EFICINCIA DE DIFERENTES PROTOCOLOS PARA SINCRONIZAO DE


CIO EM RECEPTORAS DE EMBRIO EM BOVINOS
Barreiros, T.R.R.1; Borsato, E.A.2; Ludwig Jr., H.E.2; Marques, M.O.3;
Ribeiro Jr., M.3 ; Silva, R.C.P.3; Seneda, M.M.4
1.

Faculdades Integrado, Campo Mouro, PR; 2. Embriogen, Campo Mouro, PR, 3.Geraembrio, Cornlio
Procpio, PR; 4. Departamento de Clnicas Veterinrias, CCA, UEL, PR, 86051- 990
thalesrigo@grupointegrado.br

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficincia de diferentes protocolos de sincronizao de estro. Foram
utilizadas 524 novilhas Bos taurus X Bos indicus. No primeiro grupo (G-PGF), 180 animais foram previamente
examinados por ultra-sonografia transretal (Aloka SSD 500, 5 MHz) e aqueles com CL receberam 150 g
de Cloprostenol (Prolise, Tecnopec, Brasil), por via IM e permaneceram sob observao de cio nas prximas
72 horas. Sete dias aps a manifestao do estro, os animais foram reavaliados por ultra-sonografia para
identificao do CL, sendo 115 aproveitados(63,8% - 115/180). No segundo tratamento (G-P4), 105 novilhas
receberam, em estgios aleatrios do ciclo estral, um dispositivo intravaginal de 1,9 g de P4 (CIDR, Pfizer,
Brasil) simultaneamente aplicao intramuscular (IM) de 2 mg de BE (Estrogin, Farmavet, Brasil). No
oitavo dia os dispositivos foram retirados e os animais receberam 150 g de Cloprostenol (Prolise, Tecnopec,
Brasil) por via IM. Aps 24h todos os animais receberam uma aplicao de 1 mg de BE, por via IM. Todos
os animais foram examinados por ultra-sonografia transretal dezoito dias aps o incio do tratamento, para
identificao do CL, sem o emprego prvio de mtodos para observao de cio. Foram aproveitados 85
dos 105 tratados perfazendo 80,9% de aproveitamento. No terceiro grupo (G-P4+eCG), 239 novilhas
receberam tratamento semelhante ao G-P4, antecipando aplicao de 150 g de Cloprostenol para o quinto
dia, mais uma aplicao por via IM de 400 UI de eCG (Folligon, Intervet, Brasil). Neste grupo foram
aproveitadas 172 receptoras das 239 tratadas, com aproveitamento de 71,9% aps novo exame ultrasonogrfico para identificao do CL, tambm sem o emprego prvio de mtodos para observao de cio.
No foram consideradas as taxas de concepo obtidas neste estudo em razo dos embries serem
provenientes de diferentes mtodos de obteno, ou seja, embries TE a fresco, congelados e produzidos in
vitro. Os tratamentos com os anlogos da PGF implicam na observao de estro, em razo da variao
entre aplicao e manifestao do mesmo, alm da identificao de corpo lteo por palpao retal ou ultrasonografia no incio do tratamento. Em relao aos tratamentos com PGF, protocolos com P4 e BE associados
ou no ao eCG, podem ser realizados em estgios aleatrios do ciclo estral e no necessitam de observao
de estro, permitindo a transferncia de embries em tempo fixo, aps a identificao do CL. O presente
resultado portanto, demonstra a possibilidade de se aumentar o nmero de receptoras aptas para transferncia
de embries com a utilizao de protocolos com P4 e BE.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

PRODUO EMBRIONRIA E TAXA DE PRENHEZ EM DOADORAS DA


RAA NELORE SUPERESTIMULADAS E TRATADAS COM
hCG E LH COMO INDUTORES DA OVULAO
Nogueira, M.F.G. 1*; Buratini Jr., J.2; Barros, C.M.1
Departamentos de 1Farmacologia e 2Fisiologia, Instituto de Biocincias, UNESP, Botucatu-SP, 18618000, Brasil. marcelo@femanet.com.br
O receptor do LH (LHr) presente nas clulas do folculo ovariano bovino fundamental para a resposta
biolgica decorrente da sua ligao com o ligante (LH). Os eventos subseqentes ao pico pr-ovulatrio de
LH esto relacionados presena do LHr e sua afinidade pelo LH. Estudos de expresso gnica do LHr em
clulas da teca e granulosa de folculos bovinos tm demonstrado a presena de 4 isoformas de mRNA para
o mesmo gene do LHr. Duas isoformas, das 4 detectadas, poderiam ser traduzidas em protenas funcionais
(receptores acoplados protena G) com afinidades distintas em relao aos ligantes. Uma das isoformas
(completa ou full) tem afinidade pelo LH e hCG, enquanto que a segunda isoforma (com a deleo do exon
10) somente pelo hCG. Com base nessas informaes, o presente estudo testou a hiptese de que, em vacas
superestimuladas com FSH, a administrao simultnea de LH e hCG, como uma tentativa de estimular
qualquer variedade de LHr, resultaria em melhora na qualidade dos ocitos e/ou aumento nas taxas de
ovulao. Vacas Nelore foram superestimuladas com o protocolo P36 (Barros, Porto e Nogueira,
Theriogenology, 59:524, 2003) e os embries colhidos aps 7 a 8 dias da administrao do indutor da
ovulao. A ovulao foi induzida apenas com LH (pLH, 12,5 mg, im, Lutropin, Grupo 1) ou com LH (12,5
mg) e hCG (1.500 UI, im, Pregnyl, Grupo 2). Ambos os grupos foram contemporneos quanto
superestimulao e inovulao dos embries. As mdias (EPM) de estruturas totais, embries viveis e
taxa de viabilidade foram: 12,42,36; 10,02,38 e 80,8% (grupo 1, n=8 colheitas) e 12,22,03; 8,91,66
e 73,1% (grupo 2, n=14), no havendo diferena estatstica significativa (p=0,96; p=0,71 e p=0,18,
respectivamente). Em um subgrupo de embries (qualidades excelente, boa e regular) inovulados a fresco, a
taxa de prenhez foi de: 43,8% (14/32; grupo 1) e 67,7% (21/31; grupo 2, p=0,077). Conclui-se que a
administrao simultnea de hCG e LH, como indutores da ovulao em animais superestimulados, no
alterou a produo de embries viveis ou a taxa de viabilidade. Contudo, houve uma tendncia de aumento
na taxa de prenhez de embries inovulados a fresco, oriundos de animais tratados com hCG e LH, quando
comparados aos embries obtidos de doadoras tratadas apenas com LH. Essa informao poder ser
confirmada brevemente, quando o diagnstico de gestao for realizado nas 114 receptoras inovuladas com
embries produzidos pelos animais do grupo 2 (LH+hCG). *Bolsista da FAPESP.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

AVALIAO DA RESPOSTA OVARIANA DE NOVILHAS E VACAS DOADORAS


DE EMBRIO POR PALPAO RETAL E ULTRA-SONOGRAFIA
Leal, L.S.1; Oba, E.1; Fernandes, C.A.C.1; S Filho, O.G.1
1

Departamento de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria Faculdade de Medicina Veterinria e


Zootecnia UNESP Botucatu. Distrito de Rubio Jr., s/n CEP: 18618-000

A alta variabilidade de resposta superestimulao ovariana pode ser decorrente do dia do incio do tratamento
hormonal, atividade biolgica e dose da gonadotrofina utilizada, fatores individuais, idade e raa da doadora.
O objetivo do presente trabalho foi analisar a resposta ovariana superestimulao hormonal de novilhas e
vacas doadoras de embrio por exames de palpao retal e ultra-sonografia, no dia da colheita dos embries.
Para isto, foram realizadas 78 colheitas de embries de 19 novilhas e 36 vacas doadoras das raas Limousin
(12), Red Angus (16) e Simental (27). O protocolo de estimulao ovariana utilizado foi de oito doses
decrescentes de FSH (Folltropin-V), intervaladas de 12 horas, totalizando 160 ou 200 NIH-FSH-P1. A
dose luteoltica de cloprostenol sdico (Ciosin) foi administrada 96 e 108 horas aps o incio da aplicao
de FSH. Os embries foram colhidos pelo mtodo no cirrgico, sete dias aps as inseminaes. Os nmeros
mdios de corpos lteos (CL) palpados nos ovrios direito e esquerdo e a mdia do nmero total de CL
palpao retal em novilhas foram de 7,35 3,26 (n=26), 7,19 3,30 (n=26) e 14,54 5,96 (n=26),
respectivamente. Para as vacas, estes valores foram de 7,10 3,63 (n=52) para o ovrio direito, 6,72
3,40 (n=51) para o ovrio esquerdo e 13,86 6,80 (n=51) para ambos os ovrios. Os nmeros mdios de
CL ao exame ultra-sonogrfico nos ovrios direito e esquerdo e a mdia do nmero total de CL identificados
ao ultra-som em novilhas foram de 8,17 4,21 (n=24), 7,74 3,60 (n=23) e 16,22 4,86 (n=23). Para as
vacas, estes valores foram de 8,24 4,15 (n=45) para o ovrio direito, 7,43 3,71 (n=44) para o ovrio
esquerdo e 15,75 7,40 (n=44) para ambos os ovrios. O grupo das vacas apresentou diferena estatstica
(p <0,05) entre o nmero mdio de CL no ovrio direito e esquerdo ao ultra-som. No foram encontradas
diferenas significativas (p >0,05) entre os valores de CL para novilhas e vacas palpao retal e ao ultrasom, concluindo que a determinao do nmero de CL palpao retal pde ser utilizada para determinar a
resposta ovariana ao tratamento superovulatrio.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

MORTALIDADE EMBRIONRIA EM RECEPTORAS (BOS INDICUS x BOS


TAURUS) SUPEROVULADAS COM eCG
Reis, E.L.; Nasser, L.F.; Nichi, M.; Baruselli, P.S.
Departamento de Reproduo Animal, FMVZ-USP. R. Prof. Orlando Marques de Paiva, 87, CEP
05508-000, So Paulo-SP, Brasil. vetreis@usp.br
O corpo lteo (CL) a principal fonte de produo de progesterona em fmeas bovinas gestantes. O embrio
e o feto dependem da progesterona para a manuteno da gestao nos primeiros 200 dias. Lpez-Gatius et
al. (Theriogenology 2002;57:125161) encontraram relao negativa entre corpos lteos adicionais e
mortalidade embrionria em vacas de leite. O objetivo do presente trabalho analisar o efeito da mltipla
ovulao, pelo uso de eCG, em receptoras de embrio bovino produzidos in vitro sobre as perdas embrionrias
entre 30 e 60 dias de gestao. Foram analisadas 238 gestaes resultantes de 495 transferncia de embries,
diagnosticadas aos 30 e confirmadas aos 60 dias de gestao em receptoras Bos indicus x Bos taurus. As
novilhas foram tratadas com Benzoato de estradiol (2 mg; BE) associado a progesterona (50 mg) IM (Index)
no D0, dispositivo intravaginal de progesterona (DIB, Syntex) do D0 ao D8, PGF2 (0,15 mg d-cloprostenol,
Prolise, ARSA) associado a 400, 500 ou 600 UI de eCG (Novormon, Syntex) no D5 ou no D8 e 1 mg de
BE no D9. Os resultados foram analisados pelo programa estatstico SAS for Windows e no se observou
interao entre dose e dia de aplicao de eCG sobre a varivel analisada. Observou-se 17,5% (33/189) de
perdas embrionrias em animais com 1 CL e 10,2% (4/49) para animais com 2 ou mais CLs (P= 0,1097).
Agrupando-se os animais de acordo com o nmero de CLs observou-se uma tendncia (P<0,1) para a
diminuio das perdas embrionrias em animais com 4 ou mais CLs. Observou-se mortalidade embrionria
de 17,5% (33/189)a para 1 CL, 14,3% (4/28)ab para 2 CLs, 7,7% (1/13)ab para 3 CLs e 0% (0/8)b para
animais com 4 ou mais CLs. Em um grupo de animais gestantes (n=110) foi mensurada a concentrao
plasmtica de progesterona (CPP) no dia da inovulao (Dia 7). Encontrou-se mortalidade embrionria de
15,2% (5/33) para CPP entre 0 e 1,99 ng/ml, 17,9% (7/39) entre 2 e 3,99 ng/ml, 17,4% (4/23) entre 4 e
5,99 ng/ml, 14,3% (1/7) entre 6 e 7,99 ng/ml e 12,5% (1/8) para 8 ng/ml. Os resultados mostraram
tendncia de reduo da mortalidade embrionria em receptoras de embrio bovino de acordo com o aumento
do nmero de CLs. Estratgias para o aumento das concentraes plasmticas de progesterona durante o
diestro podem ser utilizadas para diminuir as perdas embrionrias em fmeas bovinas com o objetivo de
aumentar a eficincia reprodutiva de programas de transferncia de embries.
Agradecimentos: Syntex e Tecnopec

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

SINCRONIZAO DE RECEPTORAS PARA TRANSFERNCIA DE


EMBRIES POR TEMPO FIXO(TETF)
Beltrame, R.T.1; Cavalca, L.G.2; Verneck, W.C.3; Santos, L.M.4; Detoni, A.L.4;
Quirino, C.R.5; Fontes, R.S.5
1

Mdico Veterinrio, aluno do curso de Ps Graduao em Produo Animal LMGA CCTA - UENF;
Mdico Veterinrio, professor da disciplina Fisiopatologia e Biotecnologia da Reproduo-CCA-UFES; 3
Acadmico em Medicina Veterinria CCA - UFES; 4Acadmico em Medicina Veterinria UVV-ES;
5
Professor associado do LMGA CCTA - UENF; Email: beltrame@terra.com.br

Na transferncia de embries (TE), o descarte de receptoras aps terem sido sincronizadas com insucesso
representa uma grande parcela dos custos inseridos na atividade e a deciso quanto ao nmero adequado de
receptoras a serem usadas, de grande importncia para a eficincia econmica da TE. Fatores como
nmero insuficiente de receptoras, impedem que todos embries coletados sejam inovulados, reduzindo o
nmero de animais gerados e diminuindo, consequentemente, o retorno ao investimento no programa. Por
outra parte, um nmero excessivo de receptoras onera a TE, devido aos altos custos de aquisio e manuteno
desses animais. Assim, mais da metade do custo operacional de programas de TE podem ser devidos s
despesas com receptoras. No presente trabalho objetivou-se avaliar a resposta a um protocolo de
sincronizao e a taxa de aptido ao momento da inovulao em programas de TETF. Foram utilizados
dados de campo envolvendo receptoras mestias de duas propriedades do Estado do ES (P1=80; P2=48),
em diferentes estgios do ciclo estral, com condio corporal de moderada a boa (2-4, escala de 1-5) e
manejadas exclusivamente a pasto. O protocolo utilizado consistiu em: Dia 0 - DIB + Estrogin (2ml IM)
Dia 5 Novormon (1,5ml IM) Dia 8 retira DIB Tecnopec+ Eurosin (Pearson{2ml IM}) Dia 9
Estrogin (1ml IM) Dia 17 - Inovulao. A taxa de aptido das receptoras foi determinada atravs de
palpao retal e posterior caracterizao do ovrio, levando-se em conta a presena ou no de CL no
momento da inovulao, visto a no necessidade de observao de estro. Utilizou-se o teste qui-quadrado
onde foi avaliada a presena ou no, do CL aps o tratamento nas duas propriedades. Observou-se diferena
na presena de CL no momento da inovulao dentro de cada propriedade (P < 0,05) antes e depois de
aplicado o protocolo ( P1 antes 33%, P1 depois 80%; P2 antes 58%, P2 depois 81%). O diagnstico de
gestao foi realizado cerca de 60 dias aps inovulao atravs da palpao retal ( P1=56 %; P2 = 48%).
Concluiu-se que a reduo de custo gerada pela no necessidade de observao de estro somada a relevante
resposta ao protocolo, so fatores importantes na biotcnica. Entretanto as estimativas de custo devem ser
melhor avaliadas visto as taxas de gestao encontradas.

199

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

INCIDNCIA DE MORTE EMBRIONRIA APS TRANSFERNCIA


TRANSCERVICAL EM RECEPTORAS DE EMBRIO EQINO
Castro, R.P.R.1; Pinho, T.G.2; Queiroz, F.J.R.3; Oliveira, G.D.M.3;
Costa, A.C.3; Monteiro, A.B.S.

Mestranda em Reproduo Animal - UFF, Niteri- RJ. raperica@censanet.com.br. 2 Departamento de


Fisiopatologia da Reproduo- UFF, 3 Mdico Veterinrio

A morte embrionria um fator limitante para o sucesso de programas de transferncia de embries, e pode
ocorrer por diversas causas. Fatores inerentes tanto s doadoras como s receptoras de embries tm sido
cada vez mais estudados com intuito de minimizar estas perdas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a
influncia de fatores como a viabilidade dos embries, dia da transferncia na receptora e sincronia entre
doadora e receptora sobre os ndices de morte embrionria aps a transferncia transcervical de embries
eqinos. Foram utilizadas 92 guas receptoras de embrio, da raa Campolina, no perodo de outubro de
2003 a maro de 2004. Os embries foram recuperados de doadoras, nos dias sete, oito, ou nove aps a
ovulao, e somente os classificados em graus 1 e 2, segundo McKinnon (The Veterinary Clinics of North
America Equine Practice, v. 4, p. 305-334) foram transferidos. As transferncias de embries foram
realizadas nas receptoras nos dias 2 a 8 aps ovulao, que ocorreram dois dias antes at seis dias aps a
ovulao da doadora (ou seja, +2 at -6 dias). O diagnstico de gestao nas receptoras inovuladas foi
realizado no dia dez aps a ovulao, e a gestao acompanhada nos dias 17, 24, 31, 38 e 45. O ndice de
morte embrionria encontrado foi de 43,5% (40/92), sendo 41,3% (38/92) ocorrido entre a transferncia e
o dia 10 aps a ovulao da receptora, e 2,2% (2/92), entre os dias 11 e 45. A incidncia de morte embrionria
foi de 53,5% (23/43) quando os embries foram transferidos do dia 2 at o dia 4 aps ovulao da receptora
e, de 36,7% (17/49) do dia 5 at 8 aps ovulao. Quanto sincronia entre doadora e receptora, a morte
embrionria encontrada foi 35,4% (17/48) para assincronia de +2 a -3 dias, e 52,3% (23/44) de -4 a -6
dias. Embries classificados como grau 1 e grau 2 apresentaram taxa de morte embrionria igual a 41,6%
(37/89) e 100% (3/3), respectivamente. Conclui-se que tanto os fatores relativos aos embries quanto das
receptoras so de fundamental importncia para o sucesso da transferncia de embries.

200

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

INFLUNCIA DA POCA DO ANO SOBRE A EFICINCIA DE DOADORAS


E RECEPTORAS DE EMBRIES BOVINOS NA REGIO
MEIO-NORTE DO BRASIL
Souza, J.A.T.1; Carter, J.A.2; Bacelar, F.H.2; Portela, F.J.A.2; Corra, C.A.2;Santos, P.A.C.3
1

Depto. Clnica Veterinria CCA/UFPI adalmir@ufpi.br. 2 Profissionais Autnomos; 3 PsGraduando CCA/UFPI

Objetivou-se neste trabalho avaliar a influncia da poca do ano sobre a eficincia de doadoras e receptoras
de embries bovinos na regio Meio-Norte do Brasil. Foram utilizados dados obtidos na Fazenda Lago
Azul, municpio de Santa Ins MA (latitude 03o08S, longitude 45o42W). As mdias anuais de precipitao
e de temperatura na regio, nos ltimos cinco anos, foram 1.938 mm e 27oC, respectivamente. As mdias
dirias de temperatura e a precipitao total mdia nos quatro trimestres do ano, correspondentes a esse
perodo, foram de 26, 26, 28 e 27 oC e 922, 588, 106 e 322 mm, respectivamente. Entre dez/98 e mar/04,
foram realizados 17 programas de TE, com um total de 183 coletas, sendo 50, 22, 49 e 62 nos respectivos
trimestres, envolvendo 96 doadoras bovinas da raa Nelore. Destas, 39 foram submetidas a um, 21 a dois e
36 a trs ou mais superovulaes. As doadoras foram superovuladas com protocolos convencionais de FSH
(Folltropin-V ou Pluset) e sincronizadas com progestgenos (CIDR ou Crestar) ou com PGF2. Foram
feitas duas ou trs inseminaes por doadora e as coletas realizadas no stimo dia aps a primeira inseminao.
Todas as atividades tcnicas inerentes coleta, classificao e inovulao das estruturas foram procedidas
pelo mesmo profissional. Os dados mdios registrados nos respectivos perodos, por coleta, foram: estimativa
de ovulaes (por palpao retal) = 11,35; 10,95; 13,24 e 12,44; estruturas coletadas = 15,34; 11,18;
13,82 e 14,05; estruturas viveis = 9,66; 7,18; 5,57 e 8,89; estruturas no fertilizadas = 3,30; 1,73; 5,16 e
3,24; estruturas degeneradas = 2,38; 2,27; 2,69 e 1,92; e embries transferidos a fresco = 8,80; 6,64; 4,98
e 6,58. Foram utilizadas 777 receptoras mestias holands-zebu (girolandas) e 461 zebunas sem grau de
sangue definido (azebuadas), sincronizadas com progestgenos ou PGF2 e inovuladas com apenas um
embrio, em um sincronismo de 48 horas. No primeiro trimestre, sob maior precipitao e menor temperatura,
o nmero de estruturas viveis foi maior que no segundo e terceiro trimestre (p<0,05); j neste ltimo, sob
menor precipitao e maior temperatura, o nmero de estruturas no fertilizadas e degeneradas foi maior que
nos demais trimestres (p<0,05). A taxa de gestao aos 60 dias, de 62,62% para receptoras girolandas
(53,05; 56,71; 45,54 e 43,51% nos respectivos trimestres) e de 37,38% para receptoras azebuadas
(48,02; 58,33; 54,72 e 50,30% nos respectivos trimestres), teve diferena significante entre os grupos; no
segundo trimestre, sob condies ambientais ainda favorveis, a taxa de gestao foi superior aos demais
perodos (p<0,05), em ambos os grupos. Conclui-se que a poca do ano influenciou a eficincia das doadoras
e receptoras de embries.

201

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

INFLUNCIA DA RAA, SINCRONISMO DO ESTRO, TIPO DE CORPO LTEO E


CONCENTRAES DE P4 SOBRE A TAXA DE GESTAO DE RECEPTORAS DE
EMBRIES BOVINOS
Souza, J.A.T.1; Carter, J.A.2; Bacelar, F.H.2; Portela, F.J.A.2; Corra, C.A.2; Santos, P.A.C.3
1

Depto. Clnica Veterinria CCA/UFPI adalmir@ufpi.br. 2 Profissionais Autnomos; 3 PsGraduando CCA/UFPI.

Nos ltimos cinco anos a Fazenda Lago Azul, Santa Ins, MA (latitude 03o08S, longitude 45o42W),
realizou 183 coletas de embries, em 96 doadoras bovinas da raa Nelore, as quais foram superovuladas
com protocolos convencionais de FSH, inseminadas duas ou trs vezes e coletadas no stimo dia aps a
primeira inseminao. Receptoras e doadoras foram sincronizadas com progestgenos ou PGF2. De 2.561
estruturas coletadas, 1.465 (57%) foram viveis, das quais, 1.238 (48%) transferidas, a fresco, para 777
receptoras girolandas e 461 para receptoras azebuadas, na maioria novilhas, obtidas da prpria regio. As
atividades tcnicas ligadas a TE foram procedidas pelo mesmo profissional. O sincronismo doadora / receptora,
com base no incio dos sintomas de estro, se concentrou em +24 a -24 horas, sendo 38% no momento 0
e 36% em -12, correspondendo ao momento da inovulao. Todas as receptoras foram previamente
avaliadas por palpao retal para diagnosticar o CL e inovular no corno correspondente. De 1.238 receptoras
inovuladas, independendo do padro racial, 280 tiveram registrado palpao, o tipo de CL (incluso=28 ou
excluso=252) e ultrassonografia, o dimetro (mdia =1,9mm), rea (mdia =2,9cm2) e a presena de
cratera (53%), estas, com rea mdia de 0,6cm2. Entre as receptoras palpadas e com CL incluso, 7 (25%)
foram descartadas US, pela ausncia de CL. As concentraes mdias de P4 (0,8 ng/ml) nessas receptoras
foram inferiores (p<0,05) s que apresentaram CL (6,3 g/ml) e, entre estas, no houve diferena em funo
da estrutura do CL. A P4 no interferiu na taxa de gestao (p>0,05), esta de 63 e 37 % para receptoras
girolandas e azebuadas, respectivamente (p<0,05). Independendo da raa, as taxas de gestao, de
acordo com o grau de sincronismo, foram de 3, 9, 36, 39 e 13%, para os grupos +24, +12, 0, -12, e -24,
respectivamente. Conclui-se que as receptoras girolandas foram mais eficientes e que os ndices de gestao
foram maiores quando inovuladas em sincronismo 0 e -12 (P<0,05). A avaliao ultrassonogrfica foi
determinante no descarte de receptoras de embries.

202

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

INDUO DO PARTO EM OVELHAS DA RAA SANTA INS, UTILIZADAS COMO


RECEPTORAS EM UM PROGRAMA DE TRANSFERNCIA DE EMBRIES
Chalhoub, M.1; Bittencourt, R.F.1; Portela, A.P.M.1; Alves, S.G.G.; Almeida, A.K.1;
Freitas, D.S.1; Ribeiro Filho, A. de L.1
1

Escola de Medicina Veterinria UFBA, Salvador-BA, 40170-110, Brasil. e-mail: chalhoub@ufba.br

A morbidade e mortalidade perinatal dos indivduos produzidos por biotcnicas da Reproduo Animal,
recentemente desenvolvidas, so fatores que interferem negativamente no resultado final referente ao nmero
de produtos viveis nascidos. Com a utilizao destas tcnicas h uma maior possibilidade de ocorrncia de
partos distcicos. Um procedimento passvel de reduzir essas perdas perinatais a assistncia apropriada
durante o parto. A induo do parto torna-se uma opo de manejo importante, por possibilitar a sincronizao
dos nascimentos no rebanho, reduzindo o perodo de observao dos partos. Com isso, reduz-se a
possibilidade de morte da cria no parto. Nas ovelhas os glicocorticides podem ser usados para a induo
do parto e alm de induzirem o nascimento, asseguram a maturao fetal. Este estudo teve por objetivo,
avaliar a eficcia da utilizao de glicorcoticide para a induo do parto em ovelhas. Alm disso, verificouse a correlao do intervalo de tempo entre a induo e nascimento (IND), com o sexo, peso e tipo de parto
(simples ou gemelar). Para tanto, 31 receptoras da raa Santa Ins gestantes de embries da raa Dorper,
importados da frica do Sul, tiveram seus partos induzidos com 10 mg de dexametasona (DEXA), administrada
por via intramuscular aos 146 dias de gestao. Vinte e quatro horas aps a administrao, os animais foram
observados a cada hora, at o momento do parto. Os neonatos foram classificados quanto ao sexo, pesados
e os nascimentos agrupados como simples ou gemelares. Para a anlise estatstica foi empregado o programa
Statistical Analysis System (SAS), verso 6.1. O peso mdio (Kg) ao nascimento foi de 3,9 0,8. O
intervalo mdio entre a administrao da DEXA e o parto foi de 45,6 10,1 horas. O peso ao nascimento
foi influenciado pelo tipo de parto, onde os neonatos provenientes de partos gemelares eram significativamente
mais leves, em relao aos de parto simples (r=-0,43; P<0,05). No foram observadas correlaes entre
IND, peso e sexo das crias. No houve reteno de envoltrios fetais aps o perodo de oito horas psparto, tempo considerado fisiolgico para a espcie. A estimulao hormonal com DEXA tambm possibilitou
a sincronizao dos nascimentos, que se distriburam entre 25 e 60 horas aps a sua administrao. Quatro
animais (12,9%) no pariram nesse intervalo e foram submetidas a cesariana. Concluiu-se que a administrao
de 10 mg de dexametazona eficaz na induo do parto em ovelhas utilizadas como receptoras de embries.

203

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

MOMENTO DA PRIMEIRA INSEMINAO ARTIFICIAL EM VACAS


SUPEROVULADAS PARA TRANSFERNCIA DE EMBRIES
Sales, J.N.S.1; Souza, J.C.1
1

Departamento de Zootecnia, Universidade Federal de Lavras, Lavras-MG, CEP: 37200-000,


Cx Postal 37, Brasil. logan@navinet.com.br.

O momento ideal para iniciar as inseminaes em programas de transferncia de embries assunto ainda
controverso, de acordo com a literatura. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do momento da
primeira inseminao no nmero de embries viveis, degenerados e no fertilizados de doadoras da raa
holandesa. Vacas (n=22) e novilhas (n=50) holandesas foram sincronizadas utilizando Crestar (Intervet
International B.V., Boxmeer, Holanda) que consiste na aplicao de implante auricular subcutneo de 3 mg
de norgestomet, associado aplicao intramuscular de 6 mg de norgestomet e 10 mg de valerato de estradiol
(D0), no quinto dia iniciou-se o protocolo superovulatrio com 8 aplicaes decrescentes de FSH/LHp
(Pluset, Calier S.A., Barcelona, Espanha) em intervalos de 12 horas. No stimo dia aplicou-se 0,5 mg, i.m.,
de cloprostenol sdico (Sincrosin,Valle S.A., Montes Claros, Brasil) retirando-se o implante no nono dia.
A coleta foi realizada sete dias aps a 1 inseminao artificial. Aps a coleta, os embries foram avaliados
segundo o padro IETS (1999). Os animais foram alocados aleatoriamente para um de dois tratamentos,
sendo T1(n=27) inseminados 0 e 12 horas e T2 (n=45) 12 e 24 horas aps a observao do cio. As mdias
de embries viveis, degenerados e no fertilizados foram analisadas pelo PROCGENMOD (SAS), sendo
comparadas por contrastes. No houve diferena entre os dois tratamentos (T1 vs T2) para viveis (5.211.13
vs 5.670.73), no fertilizados (1.090.48 vs 1.100.31) e degenerados (1.190.44 vs 1.210.29). Podese concluir que a 1 inseminao pode ser feita no momento em que se observa o cio sem trazer prejuzos
para a fertilizao em programas de transferncia de embries.
Palavras chaves: Inseminao; transferncia de embries; bovinos.

204

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

PRODUO DE EMBRIES EM OVELHAS MORADA NOVA (VARIEDADE


BRANCA) SUBMETIDAS AO TRATAMENTO SUPEROVULATRIO
COM pFSH
Maia, E.L.M.M.1; Souza, A.L.1; Arruda, I.J.1; Lima, I.M.T.1; Almeida, K.C.1; Lopes-Jnior,
E.S.1; Paula, N.R.O.1; Teixeira, D.I.A.1; Rondina, D.1; Villarroel, A.B.S.2; Freitas, V.J.F1.
1

Laboratrio de Fisiologia e Controle da Reproduo - FAVET/UECE, 60740-000, Fortaleza-CE, Brasil.


2
Centro de Cincias Agrcolas - FZ/UFC, 60455-760, Fortaleza-CE, Brasil. lilitoffee@bol.com.br

Objetivando avaliar a produo de embries em ovelhas Morada Nova (variedade branca) submetidas a um
tratamento superovulatrio com pFSH, vinte ovelhas cclicas apresentando (mdia e.p.) 2,6 0,2 anos de
idade e 31,2 1,1 kg foram utilizadas como doadoras de embries. As ovelhas tiveram o estro sincronizado
pelo uso de esponjas vaginais impregnadas com 60 mg de acetato de medroxiprogesterona (Progespon,
Syntex, Buenos Aires, Argentina) por 14 dias. O tratamento superovulatrio iniciou-se 48 horas antes da
retirada da esponja e consistiu na aplicao intramuscular de 200 UI de pFSH (Pluset, Calier, Barcelona,
Espanha), divididas em seis doses decrescentes (50/50, 25/25 e 25/25 UI), em intervalos de 12 horas. Um
carneiro frtil da mesma raa foi utilizado para detectar o estro das ovelhas a partir de 12 horas da remoo
da esponja e a cada quatro horas, at que as fmeas no apresentassem sinais de estro. A monta natural foi
realizada no incio do estro e 24 horas aps. Seis dias aps a primeira monta, as ovelhas foram submetidas a
uma laparoscopia para avaliao ovariana, sendo seguida da colheita de embries por laparotomia. A ocorrncia
de superovulao foi considerada quando da existncia de, pelo menos, cinco corpos lteos. Os embries
recuperados foram procurados e avaliados sob estreomicroscpio (SMZ-1B, Nikon, Tquio, Japo) a um
aumento de 20 a 40X, sendo classificados quanto ao seu estdio de desenvolvimento e qualidade, obedecendo
aos critrios morfolgicos da IETS. Os dados so apresentados de forma descritiva, sendo expressos como
mdia e.p. ou valor percentual. O estro foi observado em 90% das fmeas tratadas e uma resposta
superovulatria em 75% (15/20), com uma taxa mdia de ovulao de 7,35 0,91. A taxa de recuperao
embrionria foi 64,63% (5,00 0,68 estruturas por ovelha). Aps a avaliao, foi observada uma proporo
de 89,47% (85/95) de estruturas fecundadas e 10,53% (10/95) de no fecundadas. Dentre os embries
recuperados, 69,51%, 21,95%, 4,88% e 3,66% foram mrulas/blastocistos de graus I, II, III e IV,
respectivamente. Em concluso, ovelhas Morada Nova (variedade branca) apresentaram boa resposta ao
tratamento superovulatrio com pFSH, podendo ser utilizadas como doadoras em um programa de preservao
e formao de banco de embries.

205

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

MANUTENO DE NVEIS SUB-LUTEAIS DE PROGESTERONA, APS


TRATAMENTO SUPERESTIMULATRIO, PODE DIMINUIR A TAXA DE
RECUPERAO DE EMBRIES
Melo, D.S.1a; Ferreira M.M.G.1; Nogueira, M.F.G.1b; Barros, C.M.1c.
1

Departamento de Farmacologia, Instituto de Biocincias,UNESP, Botucatu - SP.


c
Correspondncia: cmbarros@ibb.unesp.br

Neste experimento objetivou-se avaliar se a manuteno de nveis sub-luteais de progesterona (P4) at o


momento da colheita de embries promoveria alteraes no oviduto e/ou tero que poderiam comprometer
a fertilizao e/ou desenvolvimento embrionrio inicial de vacas Nelore submetidas a tratamento
superestimulatrio (SE). Em dia aleatrio do ciclo estral (D0) vacas da Nelore (n=6) foram submetidas ao
seguinte protocolo SE: colocao de um dispositivo intravaginal contendo P4 (1,0g; DIB) associada
administrao IM de benzoato de estradiol (2,5 mg; Estrogin). Cinco dias mais tarde (D5) pFSH (FolltropinV) foi administrado durante 4 dias consecutivos (dose total = 200 mg). No D7 (8:00 h) administrou-se
PGF2 (Prolise) e 48 h mais tarde a ovulao foi induzida com LH (25,0 mg, Lutropin, via IM, D9). As
vacas foram inseminadas, sem observao de cio, 12 e 24 h aps a aplicao de LH. A fonte de progesterona
(DIB) foi removida somente no dia da colheita de embries (D16), isto , 216 h aps a aplicao de PGF2
(Grupo P216). Mesmo com a administrao de 25 mg de LH poucos folculos ovularam, resultando na
recuperao de apenas 2 estruturas no clivadas (D16). Devido a este resultado inesperado o protocolo foi
modificado, isto , o DIB foi retirado no dia 8 (20:00 h) e o LH aplicado no dia 9 (8:00 h). Um novo DIB foi
colocado 8 h aps a aplicao de LH e retirado apenas no dia da colheita de embries (Grupo P216modificado). Esta alterao no protocolo foi eficaz em aumentar a taxa de ovulao, como indica a presena
de um total de 64 corpos lteos em 6 vacas, no dia da colheita de embries. Entretanto, do total de 47
estruturas recuperadas apenas 3 eram embries viveis. Levando-se em considerao experimento anterior
no qual concluiu-se que a manuteno de nveis sub-luteais de P4 por 36 h aps a administrao de PGF2,
no afeta a viabilidade dos ocitos, uma vez que os mesmos so capazes de se desenvolver in vitro at o
estgio de blastocisto (veja resumo nestes anais), os resultados acima so indicativos de que a manuteno
prolongada de nveis sub-luteais de P4, promove alteraes no oviduto e/ou tero, prejudicando a fertilizao
e/ou desenvolvimento embrionrio inicial.
Bolsitas da aCAPES ou bFAPESP.

206

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFEITO DO PROTOCOLO DE SINCRONIZAO DO CICLO ESTRAL


SOBRE A RESPOSTA SUPEROVULATRIA EM UM PROGRAMA
DE TRANSFERNCIA DE EMBRIES ZEBUNOS.
Ribeiro Filho, A. de L.1, Bittencourt, R.F. 1; Portela, A.P.M.1, Freitas, D.S.1; Almeida, A.K.1;
Silva, A.A.B.1; Santana, R.C.M.1; Chalhoub, M.1
1

Escola de Medicina Veterinria UFBA, Salvador-BA, 40170-110, Brasil. E-mail: alisboa@ufba.br

A superovulao um dos elementos chaves da tecnologia da TE. Contudo, uma marcada variabilidade na
resposta superovulatria e na taxa de recuperao embrionria, so os fatores que mais afetam a eficincia
desta tecnologia. Um dos principais aspectos que contribuem para essa variao, o status do desenvolvimento
folicular quando a superovulao iniciada. Assim, o controle da emergncia das ondas foliculares tem se
tornado uma importante ferramenta para a melhoria dos resultados obtidos na tcnica da TE. Porm, 80%
do rebanho bovino brasileiro composto por animais zebus, sendo importante que os protocolos de
sincronizao da onda folicular e superovulao sejam testados e ajustados s caractersticas intrnsecas
destes animais. Com o objetivo de avaliar a eficcia, de dois protocolos de sincronizao do ciclo estral,
sobre a resposta superovulatria em vacas zebus, 26 animais, em estgio aleatrio do ciclo estral, foram
submetidos aos seguintes protocolos: P1 (n=16) - os animais tiveram a onda folicular sincronizada com um
implante intravaginal contendo 1,9g de progesterona no Dia 1 e aplicao de 3mg de Benzoato de Estradiol
IM no Dia 2, neste grupo o tratamento superovulatrio foi iniciado no Dia 5 pela manh. P2 (n=10) - os
animais receberam duas injees de 75mg de D+Cloprostenol via submucosa-intravulvar, intervaladas por
14 dias, e a superovulao foi iniciada nos dias nove ou dez aps deteco do estro. O tratamento
superovulatrio consistiu de uma quantidade total de 250UI de gonadotropina hipofisria suna (Pluset,
Calier, Brasil) divididos em oito doses decrescentes (50UI Bid; 37,5UI Bid; 25UI Bid e 12,5UI Bid), com a
quinta aplicao de FSH foi administrado 150mg de D+Cloprostenol IM e com a sexta dose de FSH as
vacas receberam 75mg de D+Cloprostenol IM e no P1 os animais tiveram os implantes vaginais retirados.
As inseminaes foram realizadas 12 e 24 horas aps o incio do estro e os embries colhidos sete dias aps
a primeira IA. A resposta ovariana foi avaliada de acordo com o nmero de corpos lteos diagnosticados na
palpao retal. Os embries recuperados foram classificados, quanto qualidade e estdio de desenvolvimento
de acordo com a IETS. Os dois grupos experimentais foram comparados com base em um delineamento
inteiramente casualizado. Desta forma, foram confrontadas as variveis, corpos lteos (CL), estruturas colhidas
(EC), embries viveis (EV), qualidade (QE) e estgio de desenvolvimento embrionrio (EDE). Para as
anlises estatsticas foi empregado o pacote estatstico SAS, utilizando-se o teste de Student Newman
Keuls (SNK). As mdias verificadas (X DP) para as variveis CL, EC, EV, QE e EDE para o P1 foram
respectivamente, 11,80 2,48; 12,50 4,28; 8,00 3,68; 2,64 1,05 e 4,62 1,46; enquanto, para o P2
foram respectivamente, 8,50 2,58; 4,30 2,79; 1,90 1,66; 2,56 1,19 e 3,12 1,91. Diferiram
(P<0,0001) as seguintes variveis: EC, EV, e EDE. Conclui-se, que o protocolo P1 obteve melhor desempenho,
com maior nmero de estruturas recuperadas e embries viveis, e apresentou embries em estgio de
desenvolvimento mais adiantado (entre mrula e blastocisto inicial).

207

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

TRATAMENTO SUPEROVULATRIO ASSOCIADO A APLICAES


FREQENTES DE GnRH
Melo, D.S.1a; Monteiro, F.M.1a; Nogueira, M.F.G.1b; Eberhardt, B.G.1a; Carvalho, L.M.1b;
Sartorelli, E.S.1a; Trinca, L.A.1; Barros, C.M.1c
1

Departamentos de Farmacologia e Bioestatstica, IBB/UNESP,Botucatu,SP-Brasil. cCorrespondncia:


cmbarros@ibb.unesp.br

Este experimento foi realizado com a finalidade de restabelecer os pulsos de LH, que se encontram diminudos
devido a superestimulao (SE) ovariana com FSH (Theriogenology, v.51, p.37-46, 1999), por meio de
aplicaes freqentes de GnRH, na expectativa de se aumentar a taxa de ovulao e, conseqentemente, a
produo de embries. Vacas da raa Nelore (n=9) foram distribudas aleatoriamente em 2 grupos: P36Salina (controle) e P36-GnRH. Numa segunda etapa os animais foram trocados de grupo de maneira que
todas as doadoras foram submetidas aos dois tratamentos. Tanto os animais do grupo controle como do
P36-GnRH foram tratados com o protocolo P36, que consiste na insero de um dispositivo intravaginal
contendo progesterona (1,9g; CIDR-B) associada administrao IM de benzoato de estradiol (2,5 mg;
Estrogin). Cinco dias mais tarde (D5) inicia-se o tratamento SE com pFSH (Folltropin-V, dose total = 200
mg). No D7 (8:00 h) administra-se PGF2 (Prolise) e 36 h mais tarde (D8) o CIDR removido. A
ovulao induzida com LH (25,0 mg, Lutropin, via IM, D9 s 8:00 h) e as vacas so inseminadas, sem
observao de cio, 12 e 24 h aps a aplicao de LH. Durante o protocolo P36 foram realizadas vrias
administraes IV de soluo salina (1,0 ml, Grupo controle) ou GnRH (5 g de gonadorelina, Fertagyl,
Grupo P36-GnRH) nos dias 5 (s 14 e 24 h), 6 (s 8,12,16,20 e 24 h), 7 e 8 (s 4,8,12,16,20 e 24 h) e 9
(s 4 h). O crescimento folicular foi acompanhado por meio de ultra-sonografia a partir do incio da SE (D5)
at a induo da ovulao com LH (D9). As colheitas de embries foram realizadas 7 dias aps a administrao
de LH (D16). Apesar do nmero mdio de folculos no dia da administrao de LH (18,84,6 e 21,23,6),
da quantidade de corpos lteos (10,31,5 e 12,22,1) e estruturas totais (5,60,6 e 8,31,1) no diferirem
significativamente entre os grupos controle e P36-GnRH, respectivamente, houve uma tendncia de aumento
no nmero embries viveis nas doadoras tratadas com GnRH, quando comparadas as que receberam
soluo salina (5,80,7 vs 3,50,7; respectivamente, P=0,07). Estes resultados so indicativos de que
administraes freqentes de GnRH durante tratamento SE podem aumentar o nmero de embries viveis.
Os resultados acima devero ser confirmados em futuro experimento, no qual ser utilizado um sistema de
liberao contnua ou intermitente de GnRH.
Bolsistas da CAPESa ou FAPESPb.

208

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

AVALIAO DA DINMICA FOLICULAR EM GUAS SUPEROVULADAS COM


EXTRATO DE PITUITRIA EQINA E FSH EQINO PURIFICADO.
Machado, M.S.1; Carmo, M.T.1; Squires, E.L.2; Roser, J.F.3 ; Alvarenga, M.A.1
1

Departamento de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria - UNESP-Botucatu/SP, 18618-000-Brasil 2


Animal Reproduction and Biotecnology Laboratory, Colorado State University, Fort Collins, C.O.,USA 3
Animal Science, Endocrinology Laboratory, California University, Davis, USA.misima@bol.com.br

O extrato de pituitria eqina (EPE) um preparado parcial de gonadotrofina eqina, sendo o nico composto
que regularmente induz ovulaes mltiplas em guas. Contudo, a resposta superovulatria e a taxa de
embries recuperados tm sido baixas, quando comparadas com outras espcies. Devido aos baixos ndices
obtidos at o momento com superovulao em guas, a proposta do nosso trabalho foi de caracterizar a
dinmica de crescimento folicular em guas tratadas com dois diferentes protocolos de EPE (doses constantes
e decrescentes) e FSH eqino purificado (Bioniche-Canad). Foram utilizadas seis guas em bom estado
nutricional e reprodutivo. Essas guas passaram por quatro tratamentos: GI (EPE 25mg/IM, duas vezes ao
dia), GII (EPE em doses decrescentes 40, 35, 30, 25, 20, 15 e 10mg/IM, diariamente, duas vezes ao dia),
GIII (FSH eqino purificado 12,5mg/IM, duas vezes ao dia) e GIV (Controle). Essas guas foram monitoradas
diariamente por ultra-sonografia para a deteco da ovulao e os tratamentos iniciados no stimo dia psovulao. Nos trs grupos, o tratamento foi interrompido quando a maioria dos folculos atingiu dimetro de
35mm, neste momento foi administrado 3000UI de hCG. Os resultados foram analisados pelo Coeficiente
de Correlao de Pearson e Anlise de Varincia. No houve diferena estatstica no nmero mdio de
folculos de diferentes tamanhos (10-15, 16-20, 21-30 e >30mm de dimetro) entre os primeiros quatro dias
de tratamento. No entanto, no quarto dia de tratamento, os grupos II e III apresentaram valores numricos
superiores aos demais grupos quanto ao nmero mdio de folculos de 21-30mm de dimetro (1,71,6,
3,22,4, 3,21,6 e 1,21,5 para os grupos GI, GII, GIII e GIV, respectivamente). Os grupos II e III foram,
estatisticamente, superiores ao GIV, e GI apresentou valor intermedirio quanto ao nmero de folculos que
alcanaram 30mm de dimetro ao longo do tratamento (3,51,2ab, 4,21,6b, 5,01,5b, 1,01,0a, para GI,
GII, GIII e GIV, respectivamente). Os nmeros de ovulaes foram de 3,31,6ab, 5,02,1a, 4,81,3a, 1,00b
para GI, GII GIII e GIV, respectivamente. Foi observada uma correlao positiva (r=0,77; p=0,06) entre a
populao de folculos de 16-20mm de dimetro 48horas aps o incio do tratamento e o nmero de ovulaes
em todos os grupos tratados. No houve diferena estatstica na taxa de crescimento dirio folicular, entretanto,
o GIII foi semelhante numericamente ao GIV (2,20,5, 2,20,8, 2,60,4, 2,50,2mm/dia para GI, GII,
GIII e GVI, respectivamente), sendo superiores aos demais. Baseados nos resultados do presente estudo,
conclumos que no houve diferenas na dinmica folicular entre animais superovulados ou no, at o quarto
dia de tratamento; os tratamentos superovulatrios avaliados so capazes de aumentar o nmero de folculos
de 30mm e ovulaes em relao ao grupo controle; a taxa de crescimento folicular observada nos animais
tratados com eFSH purificado foi similar ao controle, sendo assim, o que mais se aproximou das condies
fisiolgicas. Apoio: FAPESP e Laboratrio Bioniche.
209

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

COMPARAO ENTRE DOSES CONSTANTES E DECRESCENTES DE EXTRATO DE


PITUITRIA EQUINA NA INDUO DE SUPEROVULAO EM HAMSTER
Carmo, M.T1.; Siqueira-Pyles, E.S.C.; Landim-Alvarenga, F.C1.; Alvarenga, M.A1.
Departamento de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria, UNESP, Botucatu, SP1.
mtc.vet@uol.com.br
Estudos realizados em bovinos demonstraram que altos nveis de LH presentes no preparado contendo FSH
afetam adversamente a resposta superovulatria, a taxa de fertilizao e a qualidade dos embries, fazendose necessrio administrao gradativa do FSH e LH em doses decrescentes. O presente experimento
objetivou comparar o efeito da estimulao ovariana em hamster, utilizando-se o extrato de pituitria eqina
(EPE) atravs das administraes de doses constantes e decrescentes, utilizando um modelo animal de baixo
custo. Objetivou tambm verificar a eficincia do EPE produzido em nosso laboratrio, e se esta espcie
utilizada um bom modelo experimental para os estudos com o EPE. Foram utilizados 84 fmeas hamsters
com idade entre 60 a 85 dias de vida, pesando entre 120 a 150gr e submetidas a fotoperodo de 14 horas de
luz ao dia em temperatura mdia de 22o C. Foram avaliados sete grupos (N=12/Grupo), em um delineamento
inteiramente casualizado em trs repeties por grupo, com a utilizao do eCG em dose nica e do EPE em
dose constante ou dose decrescente, duas vezes ao dia durante quatro dias consecutivos, distribudos nos
seguintes grupos: G1-: EPE constante (0,01 mg / aplicao), G2-: EPE decrescente (0,016 mg, 0,012 mg,
0,008 mg, 0,004 mg / aplicao), G3-: eCG (25UI), G4-: EPE constante (0,01 mg / aplicao) + hCG
(25UI), G5-: EPE decrescente (0,016 mg, 0,012 mg, 0,008 mg, 0,004 mg / aplicao) + hCG (25UI), G6: eCG (25UI) + hCG (25UI), G7-: controle (soluo fisiolgica). O hCG foi administrado via subcutnea em
dose nica para todos os grupos, sendo que o mesmo foi aplicado 48h aps a administrao do eCG e 12h
aps a ltima aplicao dos grupos tratados com o EPE. Todos os animais foram eutanasiados 15h aps a
administrao do hCG. Com o auxilio de um esteroscpio os ovidutos foram dilacerados com agulha permitindo
a sada dos ocitos em massa celular do cumulus ophorus, sendo ento avaliados e quantificados. Os
ovrios foram pesados e tendo sido computados o nmero de estruturas lteas e folculos 1 mm. Foi
utilizada para a avaliao estatstica, a anlise de varincia seguido do mtodo de Tukey. O nmero mdio de
folculos contados foi em G1) 74,315,1ab; G2) 89,06,3a; G3) 39,026,1b; G4) 34,0 26,1c; G5) 36,73,8b;
G6) 22,012,1c; G7) 8,30,6c; o nmero mdio de corpos lteos observados foi em G1) 49,719,5b; G2)
29,39,7c; G3) 145,374,8ab; G4) 105,330,8abc; G5) 87,316,2abc; G6) 166,062,2a; G7) 24,04,0c. O
nmero de ocitos recuperados foi em G1) 8,73,5ab; G2) 14,312,4ab; G3) 30,026,2ab; G4) 18,711,5ab;
G5) 54,05,5ab; G6) 56,733,2a; G7) 6,70,6b. O peso dos ovrios (gr) foi para G1) 0,140,01c; G2)
0,120,01d; G3) 0,200,009abc; G4) 0,200,02bc; G5) 0,200,03bc; G6) 0,300,05a; G7) 0,090,01d. Os
resultados do presente experimento demonstraram que o uso de doses constantes de EPE induziu a distrbios
na ovulao, levando a uma conseqente reduo do nmero de ocitos recuperados.
Apoio: FAPESP/CAPES

210

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

VIABILIDADE IN VITRO E ANLISE ULTRA-ESTRUTURAL DE EMBRIES


EQINOS PROVENIENTES DE TRATAMENTO SUPEROVULATRIO
Peres, K.R.1; Fernandes, C.B.1; Siqueira-Pyles, E.S.C.1; Landim-Alvarenga, F.C.1;
Alvarenga, M.A.1; Squires, E.L.2
1

Departamento de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria Universidade Estadual Paulista,


Botucatu, SP, Brasil, 18618-000. 2 Animal Reproduction Biotechnology Laboratory - Colorado State
University, Fort Collins, CO, USA, 80523. krperes@ig.com.br
Apesar dos recentes avanos obtidos nos tratamentos superovulatrios em eqinos, no existem estudos que
comparam a qualidade e a morfologia de embries obtidos atravs desta biotcnica com embries obtidos
de guas no tratadas. Vinte e sete guas em transio de primavera foram distribudas aleatoriamente em um
dos dois grupos experimentais: Grupo Controle (n=13) e Grupo Tratamento (n=14), onde as guas foram
tratadas com 12,5 mg de FSH eqino purificado (eFSH - Bioniche Animal Health Inc., Canad), IM, duas
vezes ao dia, a partir da deteco de um ou mais folculos 25 mm. O tratamento foi realizado at que a
maioria dos folculos apresenta-se tamanho pr-ovulatrio ( 35mm). Neste momento foi administrado 2.500
UI de hCG (Vetecor - Lab. Calier do Brasil, SP, Brasil), intravenosamente, e as guas foram inseminadas
com 1 x 109 espermatozides mveis, em dias alternados, at a deteco da ovulao (D0). Tambm foi
realizada a induo da ovulao e a inseminao artificial nas guas do grupo controle. A recuperao dos
embries foi realizada pelo mtodo no-cirrgico sete a oito dias aps a deteco da ovulao. Foram
recuperados 9 embries do grupo controle (0,69 embries/gua), sendo: 2 Bi (22,2%), 3 Bl (33,3%) e 4 Bx
(44,4%). No grupo submetido ao tratamento foram recuperados 28 embries (2,0 embries/gua) sendo 1
mrula (3,6%), 5 Bi (17,9%), 8 Bl (28,6%), 11 Bx (39,2%) e 3 embries degenerados (10,71%), alm de
6 ocitos. Aproximadamente 89% (8/9) dos embries do grupo controle e 75% (21/28) dos embries do
grupo tratado foram classificados como excelentes ou bons aps exame visual por microscpio esteroscpico,
e, 11,1% e 14,3%, respectivamente, apresentavam pequenas imperfeies. Posteriormente, embries de
ambos os grupos foram avaliados atravs de microscpio invertido de fluorescncia aps serem incubados
por soluo de DPBS + 0,4% BSA acrescida de 125g/ml de Iodeto de Propdeo, por 10 minutos, e serem
transferidos para lmina histolgica contendo uma gota da soluo de 10g/ml de HOECHST 33342. Todos
os embries do grupo controle (7/7) e 70% (7/10) dos embries do grupo tratado mostraram-se viveis pela
colorao com sondas fluorescentes. Os embries inviveis pelo exame de fluorescncia, do grupo tratamento,
foram os mesmos classificados como degenerados aps o exame visual. Para a anlise da ultra-estrutura, em
microscpio eletrnico de transmisso, foram utilizados 2 embries do grupo controle e 3 do grupo tratado,
colhidos aleatoriamente, sem seleo prvia da sua morfologia. Eles foram fixados em 2,5% de glutaraldedo
em tampo fosfato e ps-fixados em 1% de tetrxido de smio no mesmo tampo. Aps a desidratao em
sries crescentes de acetona os embries foram includos em Epon. Os cortes ultra-finos foram obtidos com
navalha de diamante e corados com acetato de uranila e citrato de chumbo. No foram detectadas diferenas
morfolgicas entre os embries. Desta forma, o estudo da viabilidade celular e a anlise ultra-estrutural
demonstrou que embries oriundos de tratamento superovulatrio apresentam caractersticas e qualidade
similar a embries oriundos de colheitas convencionais.
Agradecimentos: Bioniche Animal Health Inc., Canad; Laboratrios Calier do Brasil, So Paulo, Brasil
211

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

ANTECIPAO DA ESTAO REPRODUTIVA E INDUO DE MLTIPLAS


OVULAES EM GUAS TRANSICIONAIS COM HORMNIO FOLCULO
ESTIMULANTE EQINO PURIFICADO (eFSH).
Peres, K.R.1; Fernandes, C.B.1; Siqueira-Pyles, E.S.C.1; Landim-Alvarenga, F.C.1;
Alvarenga, M.A.1; Squires, E.L.2
1

Department of Animal Reproduction and Veterinary Radiology University of So Paulo State,


Botucatu, SP, Brazil, 18618-000. 2 Animal Reproduction Biotechnology Laboratory - Colorado State
University, Fort Collins, CO, USA, 80523. krperes@ig.com.br
O FSH eqino purificado (eFSH - Bioniche Animal Health Inc., Canad) foi utilizado para induzir o
desenvolvimento de mltiplos folculos e a ovulao em guas em transio. Vinte e oito guas, de trs a
quinze anos, foram examinadas durante os meses de agosto a setembro de 2003 por ultra-sonografia durante
duas semanas antes do incio do experimento para comprovar as caractersticas transicionais (nenhum folculo
> 25 mm e nenhum corpo lteo presente). Aps este perodo, a partir do momento que as guas adquiriram
um folculo a 25mm, elas foram divididas alternadamente em dois grupos: 1) grupo controle no tratado;
2) grupo tratado com 12,5 mg de eFSH, duas vezes ao dia, at que metade dos folculos > 30 mm alcanassem
35 mm. Quando a maioria dos folculos das guas tratadas e quando o folculo das guas controle adquiriram
um tamanho pr-ovulatrio ( 35 mm), foi administrado 2500UI de hCG (Vetecor - Laboratrios CALIER
do Brasil Ltda, So Paulo), via endovenosa, para a induo da ovulao. Neste momento, as guas foram
inseminadas com smen fresco, em dias alternados, at a ovulao. O acompanhamento ultra-sonogrfico
continuou at a deteco da ovulao e a recuperao embrionria foi realizada sete a oito dias aps a
deteco da ovulao. Para as anlises estatsticas foi utilizado o teste t de Student. O tempo do incio do
tratamento at o primeiro folculo 35 mm e a ovulao foi mais curto (p<0,05) para as guas tratadas (4,1
e 6,6 dias) versus as guas controle (14,9 e 18,0 dias), respectivamente. Contudo, aps o tratamento luteoltico,
o tempo para a segunda ovulao foi maior para as guas tratadas (22,4 dias) do que para as guas controle
(10,9 dias). O perodo mdio de tratamento foi igual a 4,79 1,07 dias e 85,71% das guas tiveram mltiplas
ovulaes. O nmero de ovulaes e embries recuperados foi maior (p<0,05) para as guas tratadas (5,6
e 2,0) versus as guas controle (1,0 e 0,7). Concluindo, o eFSH foi eficiente para acelerar o incio da estao
reprodutiva, promover mltiplas ovulaes e aumentar a recuperao embrionria.
Agradecimentos: Bioniche Animal Health Inc., Canad; Laboratrios CALIER do Brasil, Ltda, So Paulo,
Brasil

212

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFEITO DO TRATAMENTO SUPEROVULATRIO ASSOCIADO AO DISPOSITIVO


INTRAVAGINAL DE PROGESTERONA E BENZOATO DE ESTRADIOL
NA CONCEPO DE RECEPTORAS BOVINAS
S Filho, O.G.1; Vasconcelos, J.L.M.1; Santos, R.M.1; Lara, C.S.2; Matos, S.P.M.2; Jacob, M.2
Departamento de Produo e Explorao Animal FMVZ/UNESP, Botucatu-SP, 18618-000. 2Cenatte
Embries, Caixa Postal 64, Pedro Leopoldo, MG, 33600-000. vasconcelos@fca.unesp.br

Este trabalho avaliou os resultados de 5.395 transferncias de embries, realizadas pela Cenatte Embries,
durante o ano de 2002. Os embries utilizados foram obtidos de dois tratamentos superovulatrios:
Tratamento-1) Observao de cio e incio da superovulao 8 a 12 dias aps; Tratamento-2) CIDR+Estrogin
(4mL) em dia aleatrio do ciclo estral e incio da superovulao no quinto dia. Os tratamentos superovulatrios
foram realizadas com Folltropin ou Pluset. As receptoras (Bos taurus x Bos indicus) receberam uma
aplicao de PGF2 (dia seis tarde) e foram observadas em estro. Nas que apresentaram estro foi realizada
a avaliao do CL por palpao retal (incluso, 1<2<3) e as transferncias realizadas pelo mtodo nocirrgico 5 a 9 dias aps o estro. Os dados foram analisados pelo GLM, sendo includas no modelo as
variveis tratamento superovulatrio, tipo de FSH, classificao do CL da receptora, sincronia doadorareceptora (-2, -1, 0, +1, +2), estdio de desenvolvimento embrionrio (Mo, Bi, Bl, Bx, Be - IETS) e
qualidade do embrio (grau 1, 2, 3 - IETS). A taxa de concepo foi influenciada pela sincronia doadorareceptora (-2: 52,23,1%; -1: 65,82,0%; 0: 69,51,7%; +1: 65,41,9%; +2: 54,94,2%; P<0,001),
estdio de desenvolvimento embrionrio (Mo: 64,62,0%; Bi: 65,71,9%; Bl: 63,71,8%; Bx: 57,82,0%;
Be: 56,05,1%; P<0,001) e qualidade do embrio (Grau 1: 66,51,7%; Grau 2: 59,61,8%; Grau 3:
58,62,9%; P<0,001). No foi detectado efeito do tamanho do CL na taxa de concepo das receptoras
(incluso: 62,02,9%; grau 1: 64,02,9%; grau 2: 60,02,9% e grau 3: 60,02,9%; P=0,53), indicando que
a sincronia um parmetro mais importante que o tamanho do CL na seleo das receptoras a serem
inovuladas. interessante observar que as receptoras que receberam embries obtidos de doadoras
submetidas ao tratamento 2 apresentaram melhor taxa de concepo (63,11,8% vs. 60,01,9%; P=0,02)
em relao s que receberam embries obtidos de doadoras submetidas ao tratamento 1. Possivelmente, a
sincronizao da onda folicular nas doadoras apesar de no alterar o nmero de embries viveis produzidos
(BO et al., Theriogenology, v.45, p.897-910, 1996), proporcionou o desenvolvimento de um grupo de
folculos mais uniforme quanto idade e o dimetro, o que pode ter beneficiado a qualidade intrnseca dos
ocitos e dos embries, que no pode ser avaliada visualmente. A sincronizao da onda folicular em doadoras
com utilizao de dispositivos intravaginais de progesterona associado a aplicao de benzoato de estradiol
pode aumentar o nmero de prenhezes/coleta atravs do aumento na concepo das receptoras, j que a
quantidade de embries recuperados no se altera com esses tratamentos.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

UTILIZAO DE DISPOSITIVO INTRAVAGINAL DE PROGESTERONA ASSOCIADO


AO BENZOATO DE ESTRADIOL EM PROGRAMAS DE
SUPEROVULAO NA ESPCIE BOVINA
Vasconcelos, J.L.M.1; S Filho, O.G.1; Santos, R.M.1; Belisario, H.L.R.2;
Alvin, M.T.T.2; Jaliba, W.P.2
1

Departamento de Produo e Explorao Animal FMVZ/UNESP, Botucatu-SP, 18618-000. 2Cenatte


Embries, Caixa Postal 64, Pedro Leopoldo, MG, 33600-000. vasconcelos@fca.unesp.br

A transferncia de embries ainda encontra algumas limitaes como alta variao dos resultados de
superovulao e a falta de programao das colheitas, fazendo com que o tcnico gaste muito tempo com um
nico animal, o que aumenta os custos por embrio. O presente trabalho avaliou os resultados de 1.167
coletas de embries, realizadas pela Cenatte Embries, durante o ano de 2002. As doadoras, das raas
Nelore, Gir e Guzer, foram divididas em: Tratamento-1) Observao de cio e incio da superovulao aps
8 a 12 dias (n=379); Tratamento-2) CIDR+Estrogin (4mL) em dia aleatrio do ciclo estral e incio da
superovulao no quinto dia (n=788). As superovulaes foram realizadas com 8 aplicaes de FSH em
doses decrescentes (Folltropin ou Pluset), duas vezes ao dia. A aplicao de PGF2 foi realizada no
stimo dia a tarde (sexta aplicao de FSH) e o dispositivo intravaginal de progesterona foi retirado no oitavo
dia pela manh (stima aplicao de FSH). Vacas detectadas em estro at s 12:00h do nono dia foram
inseminadas s 20:00 e 6:00h e as detectadas em estro entre 12:00 e 18:00h foram inseminadas as 6:00 e
18:00h. Vacas que no apresentaram estro at s 18:00h receberam 200g de GnRH (Conceptal) e foram
inseminadas s 6:00 e 18:00h. As colheitas foram realizadas 7 a 8 dias aps a IA. Os dados foram analisados
pelo GLM, sendo includas no modelo as variveis raa, tratamento, tipo de FSH, manifestao de estro e as
interaes. No foi detectado efeito de tratamento no nmero de estruturas viveis (5,590,52 vs. 5,470,25;
P=0,82) e no-viveis (4,060,53 vs. 4,190,26; P=0,82). As doadoras que no foram detectadas em
estro at 48h aps a PGF2 apresentaram menor nmero de estruturas viveis (3,690,17 vs. 6,090,17;
P<0,001) e no-viveis (2,840,38 vs. 4,940,17; P<0,001). Esses dados permitem concluir que o uso de
dispositivos intravaginais de progesterona associado ao estrgeno para sincronizar a onda folicular, em
protocolos de superovulao, apresentam resultados similares aos protocolos que utilizam cio-base, podendo
ser utilizados para programar as colheitas, otimizando o manejo, o que reduz os custos por embrio.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

RESULTADOS DE OVULAES MLTIPLAS SUCESSIVAS EM DOADORAS


NULPARAS, BOS INDICUS DA RAA GIR E BOS TAURUS DA RAA HOLANDESA
Lopes, B.C.1; Ferreira, M.B.D.4; Souza, J.C.3; Azevedo, N.A.4; Freitas, C.2; Sales, J.N.S.5.
1

DSc., MSc.,Mdica Veterinria av. Aimors 512 b. Carmo cep 35400716 - Sete Lagoas MG autnoma, e-mail:
biabrand@uai.com.br. 2Pesquisador da EMBRAPA Centro Nacional de Pesquisa em Gado de Leite, Faz Exp Santa
Mnica Valena RJ, e-mail: clio@cnpgl.embrapa.br. 3Professor adjunto Departamento de Zootecnia da UFLA ;e-mail:
jcamisao@ufla.br. 4Pesquisador da EPAMIG Centro Tecnolgico do Tringulo e Alto Paranaba Cxp 351 cep 38001970
Uberaba, MG, e-mail: brandao@epamiguberaba.com.br. 5MSc. Mdico Veterinrio, Aluno de Doutorado da UFLA.

O estudo foi realizado de janeiro a dezembro de 2003 na Fazenda Experimental Santa Rita, EPAMIG, Sete
Lagoas, MG. Avaliou-se a produo de embries F1 Gir x Holands advindos de nulparas de cada uma
destas subespcies, considerando-se os ndices de fertilidade dentro da raa da doadora, em trs
superovulaes consecutivas, intervaladas de aproximadamente 60 dias. Utilizou-se 38 novilhas com atividade
luteal cclica, sendo, 22 da raa Gir, com idade mdia de 33,634,46 meses e 16 da raa Holandesa, com
aproximadamente, 22,273,68 meses. As fmeas tiveram seus ciclos sincronizados com duas aplicaes de
500 g de Cloprostenol (Ciosin) intramuscular, intervaladas de 11 dias. O tratamento superovulatrio foi
iniciado entre o 8 e o 12 dia aps o cio base, induzido pelo Ciosin. As novilhas Gir receberam no total 100
UI de FSH (Pluset), diludas em 3 ml de soro fisiolgico e administradas por quatro dias consecutivos, em
doses intramusculares decrescentes, intervaladas de 12 horas. Administrou-se 500 g de Cloprostenol junto
com a 6 aplicao de FSH. Para as Holandesas repetiu-se o protocolo das Gir, porm a dose de FSH foi de
200 UI. As novilhas foram re-sincronizadas aps a 1 e 2 coleta, repetindo-se o protocolo inicial. Os
ovrios foram avaliados por ultra-sonografia no dia do cio, pela contagem de folculos 7 mm nos ovrios,
no dia da coleta, foram contados os folculos no ovulados e os corpos lteos. A coleta dos embries foi
realizada no 7 dia aps o incio do estro e as estruturas recuperadas foram avaliadas de acordo com as
normas da IETS. O mtodo estatstico utilizado foi a anlise de varincia e as mdias foram comparadas pelo
teste de T. O nmero mdio de corpos lteos palpveis no dia da coleta foi similar entre a 1, 2 e 3 coleta,
de : 7,865,7 (n=38); 8,085,2 (n=34) e 6,755,7 (n=16), bem como, o nmero de estruturas recuperadas,
de 6,964,25; 5,503,9 e 6,095,6, o numero de embries viveis, de: 4,093,12; 2,922,3 e 4,454,7 e
o numero de folculos no ovulados, de: 1,622,6; 1,192,0 e 0,802,2 respectivamente, para ambas as
raas. No houve diferena quanto ao nmero de folculos no dia do cio nos ovrios entre a 1 e a 2 coleta,
cujos valores foram de 17,5510,3 e 13,577,7, respectivamente, para ambas as raas. Nas novilhas
Holandesas, a resposta ovulao mltipla na terceira estimulao (7,113,9), foi menor que na segunda
(12,848,3; p<0,05). Na raa Gir, no registrou-se diferentes respostas quanto ao nmero de folculos
ovarianos no estro, de acordo com a ordem de superovulao (18,0511,1; 13,967,5 e 13,577,5 para a
1, 2 e 3, respectivamente, p>0,05), registrando-se que, das 25 novilhas utilizadas em duas coletas e das
sete superovuladas trs vezes, todas gestaram normalmente aps o experimento. Concluiu-se que a dose de
100 UI de FSH, repetidas em trs protocolos consecutivos, intervalados de 60 dias aps a coleta, estimulou
de maneira satisfatria os ovrios de novilhas Gir, sem prejuzo para a atividade reprodutiva das mesmas. Os
resultados sugerem que baixas doses de FSH podem ser eficientes para a superovulao de novilhas taurinas
e zebunas.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

CONTROLE HORMONAL DO CICLO ESTRAL EM VACAS ACCLICAS


Dias, A.J.B.1; Matos, L.F.1; Fontes, R.S1
1

Setor de Reproduo Animal, Laboratrio de Melhoramento Gentico Animal CCTA/ UENF,


Campos dos Goytacazes-RJ, Brasil. aburla@uenf.br

O retorno ao cio ps-parto um dos principais fatores que interferem na taxa de prenhez em rebanhos
bovinos de corte, que utilizam uma estao de monta definida. O objetivo deste trabalho foi avaliar a utilizao
do tratamento hormonal com progesterona, na induo da ovulao em vacas acclicas no final da estao de
monta. Foram utilizadas vacas mestias (europeu x Nelore, n=30), multparas, que ao exame por ultrasonografia apresentaram folculos maiores que 5 mm de dimetro e ausncia de corpo lteo em ambos os
ovrios. Todas as vacas eram lactantes, tinham mais de 90 dias ps-parto e encontravam-se no ltimo ms
da estao de monta. Registrou-se o escore corporal (EC, escala de 1 a 5) dos animais ao incio e ao final do
experimento. O grupo de animais submetidos ao tratamento hormonal foi composto por 24 vacas, que
receberam um dispositivo intravaginal de liberao controlada de progesterona (CIDR, 1,9 g). Este dispositivo
foi mantido por dez dias, sendo o dia de sua colocao, considerado o dia zero (D0) do tratamento. Benzoato
de estradiol (BE) foi aplicado por via intramuscular em D1 (2mg) e D11 (1mg). O grupo controle foi composto
por seis vacas, mantidas sob as mesmas condies do grupo tratado, nas quais no se realizou nenhum
tratamento hormonal. Nestes animais foi feita apenas a observao do cio durante todo o perodo do
experimento. A inseminao artificial foi realizada doze horas aps a observao do cio parado. Apenas uma
das vacas do grupo tratado (1/24) no foi observada em cio, as demais foram inseminadas no dia seguinte da
ltima aplicao do BE. At o dia do diagnstico de gestao, as seis vacas utilizadas no grupo controle
permaneceram anovulatrias, sem a observao de corpo lteo ao exame ultra-sonogrfico. O tratamento
hormonal com progesterona e BE resultou na prenhez de 14 vacas (58%). Observou-se que vacas com
maior EC (3,0-3,5) apresentaram melhores taxas de gestao (60-62%) do que as vacas com baixo EC
(2,5; 50%). Os resultados demonstram que o tratamento hormonal com progesterona e BE eficiente na
reduo do anestro ps-parto de vacas de corte, diminuindo o nmero de vacas vazias no final da estao de
monta. Tais protocolos podem contribuir, de maneira econmica, para aumentar a eficincia do manejo
reprodutivo da estao de monta.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

CONCENTRAO SRICA DE PROGESTERONA EM NOVILHAS CRUZADAS


NELORE/ANGUS TRATADAS COM DIFERENTES DISPOSITIVOS
INTRAVAGINAIS DE PROGESTERONA
Santos, R.M.; Vasconcelos, J.L.M.; Perez, G.C.; S Filho, O.G.; Maciel, A.B.B.
Departamento de Produo e Explorao Animal - FMVZUNESP, Botucatu, SP, 18.618-000, Brasil.
ricasantos@yahoo.com
Os dispositivos intravaginais de progesterona (P4) so usados para induzir ciclicidade e sincronizar estro/
ovulao, atravs da liberao de P4 na circulao. O objetivo foi determinar a concentrao srica de P4
durante tratamento por 25 dias com os diferentes dispositivos intravaginais CIDR 1,38g, CIDR 1,9g,
CRONIPRESS, DIB e PRID em novilhas cruzadas Nelore/Angus (n=64), previamente sincronizadas com o
protocolo Ovsynch modificado (GnRH, 50g - 6d - PGF2, 25mg - 48h GnRH, 50g). Sete dias aps a
segunda aplicao de GnRH, as novilhas sincronizadas (n=44) receberam uma aplicao de PGF2 e 24
horas depois foram divididas: G1 (n=9) CIDR 1,38g; G2 (n=9) CIDR 1,9g; G3 (n=9) CRONIPRESS; G4
(n=9) DIB e G5 (n=8) PRID. Somente as novilhas que regrediram o corpo lteo (determinado pelo decrscimo
na concentrao srica de P4 entre os dias 6, 7, 7,5 e 8 aps aplicao do segundo GnRH) foram mantidas
no experimento (G1: n=5, G2: n=7; G3: n=7; G4: n=8; G5: n=5). A concentrao srica de P4 foi determinada
por RIA. O pico da concentrao srica de P4 foi avaliado 0, 1, 4, 8 e 12 horas aps a insero dos
dispositivos, a concentrao srica durante os 25 dias de tratamento foi determinada a cada dois dias e o
decrscimo foi determinado 0, 1, 4 e 8 horas aps a remoo do dispositivo. Os dados foram analisados por
anlise de varincia. Duas novilhas do G2 (CIDR 1,9g) perderam o dispositivo (no dia 8 e no dia 25) e foram
excludas das anlises posteriores. Uma hora aps a insero dos dispositivos foi encontrado o pico da
concentrao srica de P4 nos grupos G1 (10,21,01ng/mL); G2 (6,80,86ng/mL); G3 (6,40,86ng/mL);
G4 (6,90,80ng/mL) e este foi influnciado pelo tratamento (P<0,05). O pico do G5 (6,30,63ng/mL) foi
observado com 8 horas. A concentrao de P4 foi mantida acima de 1ng/mL at o dia 13 no G4 (DIB); at
o dia 15 no G3 (CRONIPRESS); at o dia 22 no G5 (PRID) e at o dia 25 no G1 (CIDR 1,3g) e G2 (CIDR
1,9g). O decrscimo na concentrao srica de P4 aps a retirada do implante foi similar em todos os
grupos. No G1 (CIDR 1,38g) foi detectado o maior pico uma hora aps a insero do dispositivo. Este fato
pode ser importante em protocolos de sincronizao pois mudanas na concentrao de P4 afetam a
pulsatilidade de LH e o turnover do folculo dominante, e consequentemente, a emergncia da nova onda
de crescimento folicular. Estes resultados tambm mostram que os dispositivos intravaginais de progesterona
podem ser utilizados mais de uma vez, de acordo com o nmero de dias que cada dispositivo mantm a
concentrao de progesterona acima de 1ng/mL.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

TAXA DE PRENHEZ, APS INSEMINAO ARTIFICIAL COM TEMPO FIXO


(IATF), EM DOADORAS DA RAA NELORE SUBMETIDAS A
DIVERSAS COLHEITAS DE EMBRIO
Nogueira, M.F.G. *; Barros, C.M.
Departamento de Farmacologia, Instituto de Biocincias, UNESP, 18618-000 Botucatu So Paulo,
Brasil - marcelo@femanet.com.br, cmbarros@ibb.unesp.br
O tratamento hormonal de superestimulao ovariana aliado aos possveis traumas mecnicos e infecciosos
inerentes colheita de embries, constantemente so imputados como fatores de diminuio da fertilidade de
doadoras bovinas aps o trmino da sesso de colheitas. Este trabalho tem o objetivo de comparar a
performance reprodutiva de animais Nelore submetidos colheita embrionria e, posteriormente, tratados
com protocolo de IATF. Vacas da raa Nelore foram superestimuladas com o protocolo P36 (Barros, Porto
e Nogueira, Theriogenology, 59:524, 2003) e os embries foram colhidos aps 7 a 8 dias da administrao
do indutor da ovulao (pLH, 25 mg, im, Lutropin). As doadoras (n=39) foram superestimuladas e colhidas
entre 1 e 4 vezes (n=61 colheitas) antes de serem tratadas com o protocolo de IATF (entre 20 e 100 dias
aps a ltima colheita realizada). Antes da IATF em cada doadora, a condio ovariana foi monitorada at a
completa regresso dos CLs oriundos da superovulao, alm da ausncia de cistos ou patologias ovarianas,
do oviduto ou uterinas. Em dias aleatrios do ciclo estral (D0), os animais foram tratados com um dispositivo
intravaginal contendo progesterona e utilizado previamente (DIB, 1 g), concomitante administrao de
benzoato de estradiol (BE, 2 mg, im, Estrogin). No D8 os animais foram tratados com prostaglandina (150
g, im, Prolise) e o DIB foi removido. Vinte e quatro horas aps a remoo do DIB (D9) foi administrado 1
mg de BE (IM) e todos os animais foram inseminados (IATF) entre 30 e 34 h aps a administrao do BE
(D10). Os animais que no gestaram aps a primeira IATF receberam um segundo tratamento. As taxas de
prenhez, determinadas por palpao retal ao redor de 60 dias aps a IATF, no diferiram significativamente
(p>0,9) entre as doadoras submetidas previamente entre 2 e 4 colheitas (92,3%; 12/13) e aquelas colhidas
apenas uma vez (88,5%; 23/26). Em mdia, foi necessria 1,23 dose de smen para cada prenhez obtida.
Quando os animais foram analisados quanto ao nmero de prenhezes produzidas por colheita, as doadoras
que foram colhidas 2 a 4 vezes produziram, em mdia, 4,4 prenhezes em cada colheita (153/35), com uma
mdia de 2,7 colheitas realizadas em cada doadora. Nos animais colhidos uma vez, foram produzidas 2,1
prenhezes, em mdia, por colheita (53/26). Conclui-se que o aumento na freqncia de tratamentos
superovulatrios e de colheitas embrionrias, no alterou a taxa de prenhez aps IATF.
*Bolsista da FAPESP, no curso de ps-graduao da FMVZ-UNESP.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

TAXA DE CONCEPO INSEMINAO ARTIFICIAL E TRANSFERNCIA DE


EMBRIES EM VACAS HOLANDESAS DE ALTA PRODUO E REPETIDORAS DE
SERVIO
Rodrigues, C.A.1, Ayres, H.2, Reis, E.L.2, Nichi, M.2, Bo, G.A.3;Baruselli, P.S2
1

Clnica Veterinria SAMVET de So Carlos, So Carlos-SP, Brasil. 2Departamento de Reproduo


Animal, FMVZ USP, So Paulo SP, 05508-000, Brasil. 3Instituto de Reproduccin Animal Crdoba
(IRAC), Crdoba, Argentina. barusell@usp.br
O presente trabalho teve como objetivo avaliar a taxa de concepo inseminao artificial e transferncia
de embries em vacas Holandesas de alta produo repetidoras de cio ( 4 servios; repeat breeder). O
Experimento foi realizado na fazenda Agrindus S/A, em Descalvado SP. Foram utilizadas 2803 IAs e 2066
TEs em vacas Holandesas de alta produo (28,4 2,3 kg/dia) durante os anos de 2000, 2001, 2002 e
2003. Os animais foram submetidos observao de cio e subsequente IA (12h aps) ou TE (7 dias aps).
Os embries utilizados foram obtidos pela tcnica de MOET. Os dados foram comparados de acordo com
o mtodo (IA e TE) e com o ms do ano (janeiro a dezembro). Os dados foram analisados pelo teste de Quiquadrado, adotando-se 5% de nvel de significncia. No se verificou interao entre o ano e o mtodo (IA
e TE). A taxa de concepo em vacas repeat breeder foi superior (P<0,01) em animais inovulados (41,4%;
855/2066) que em animais inseminados (18,2%; 511/2803). As taxas de concepo para IA e TE de janeiro
a dezembro (anos agrupados) foram Jan: 12,4% (23/185)a vs 41,7% (70/168)b; Fev: 11,8% (27/228)a vs
45,7% (79/173)b; Mar: 12,3% (38/309)a vs. 41,4% (82/198)b; Abr: 10,5% (31/296)a vs. 43,2% (73/
169)b; Mai: 18,8% (54/287)a vs. 46,6% (103/221)b; Jun: 19,8% (64/323)a vs. 33,6% (49/146)b; Jul:
28,4% (97/342)a vs. 40,0% (64/160)b; Ago: 26,9% (47/175)a vs. 42,8% (71/166)b; Set: 25,5% (40/157)a
vs. 48,1% (74/154)b; Out: 27,5% (39/142) vs. 30,1% (50/166); Nov: 21,2% (24/113)a vs 37,1% (76/
205)b; Dez: 11,0% (27/246)a vs 44,4% (64/144)b, respectivamente (ab, P<0,05). Os resultados indicaram
que a TE apresenta maior taxa de concepo que a IA ao longo do ano em vacas Holandesas de alta
produo repetidoras de cio (repeat breeder).

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

AUMENTO DA TAXA DE PRENHEZ EM VACAS NELORE INSEMINADAS EM TEMPO


FIXO COM O USO DE eCG EM DIFERENTES PERODOS PS PARTO
Rodrigues, C.A.1; Ayres, H.2; Reis, E.L.2; Madureira, E.H.2; Baruselli, P.S.2
1

Clnica Veterinria SAMVET de So Carlos, So Carlos-SP, Brasil. 2Depart. de Reproduo Animal,


FMVZ-USP, So Paulo-SP, Brasil. barusell@usp.br

O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito do eCG no protocolo para inseminao artificial em tempo fixo
(IATF) a base de progestgeno em diferentes perodos ps-parto (PPP) de vacas Nelore lactantes. Foram
utilizadas 298 vacas Nelore lactantes (76,1 51,6 dias ps-parto) mantidas a pasto na regio de Araraquara
SP. Em dia aleatrio do ciclo estral (D0), todos os animais receberam 3 mg de Norgestomet e 5 mg
Valerato de Estradiol IM associados a um implante auricular contendo 3 mg de Norgestomet (Crestar,
Intervet). No D9, o implante foi removido e metade dos animais receberam 400 UI de eCG (Folligon,
Intervet). Todos os animais foram inseminados 54h aps a retirada do implante. Os animais foram divididos
em 4 PPPs e foi analisado o efeito do eCG em cada perodo. O P20-39 foi composto por animais com PPP
de 20 a 39 dias, que receberam (n=25) ou no (n=25) 400 UI de eCG no momento da retirada do implante.
O P40-49 foi composto por animais com PPP de 40 a 49 dias, com (n=21) ou sem (n=23) a administrao
de eCG. O P50-59 foi composto por animais com PPP de 50 a 59 dias, com (n=47) ou sem (n=39) a
administrao de eCG. O P>59 foi composto por animais com PPP maior que 59 dias, com (n=56) ou sem
(n=62) a administrao de eCG. O diagnstico de gestao foi realizado via ultra-sonografia 30 dias aps a
IATF. As taxas de prenhez foram analisadas pelo teste de Qui-quadrado. Verificou-se efeito positivo do eCG
dentro de cada perodo: P20-39 [40,0% (10/25) vs. 12,0% (3/25), P=0,01]; P40-49 [42,9% (9/21) vs.
21,7% (5/23), P=0,06]; P50-59 [59,6% (28/47) vs. 41,0% (16/39), P=0,04]; P>59 [66,1% (37/56) vs.
46,8% (29/62), P=0,01]. Os resultados indicaram que o tratamento com eCG no momento da retirada do
implante auricular de Norgestomet aumentou a taxa de concepo inseminao artificial em tempo fixo em
todos os perodos ps-parto, com exceo do P40-49 no qual se verificou uma tendncia (P=0,06). Os
dados mostram que possvel antecipar o primeiro servio ps-parto com a utilizao do eCG em programas
de sincronizao da ovulao para IATF.
Agradecimento: Intervet

220

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFEITO DO eCG E DO GnRH NA TAXA DE PRENHEZ DE VACAS NELORE


LACTANTES INSEMINADAS EM TEMPO FIXO

Silva, R.C.P.1; Rodrigues, C.A.2; Marques, M.O.1; Ayres, H.3; Reis, E.L.3;
Nichi, M.3; Madureira, E.H.3; Baruselli, P.S.3
1

GERAEMBRYO, Cornlio Procpio-PR, Brasil. 2Clnica Veterinria SAMVET de So Carlos, So


Carlos-SP, Brasil. 3Departamento de Reproduo Animal, FMVZ-USP, So Paulo-SP, Brasil.
barusell@usp.br

Com o objetivo de aumentar as taxas de prenhez na inseminao artificial em tempo fixo (IATF), o presente
trabalho analisou o efeito da administrao de eCG e de GnRH no tratamento com implante auricular de
progestgeno em vacas Nelore lactantes. Foram utilizadas 599 vacas Nelore lactantes (76,1 51,6 dias
ps-parto) mantidas a pasto na regio de Brasilndia-MS (Agropecuria HORA) e de Araraquara-SP
(Agropecuria NSA). Os animais foram divididos homogeneamente em quatro grupos experimentais (fatorial
2x2). Em dia aleatrio do ciclo estral (D0), os animais receberam 3 mg de Norgestomet e 5 mg de Valerato
de Estradiol IM associados a um implante auricular contendo 3mg de Norgestomet (Crestar, Intervet). No
D9, o implante foi removido e todos os animais foram inseminados 54h aps. O grupo G-CON (n=152) no
foi submetido a nenhum tratamento adicional. O G-GnRH (n=147) foi tratado com 100 g de GnRH IM
(Fertagyl, Intervet) no momento da IATF. O G-eCG (n=151) foi tratado com 400 UI de eCG IM (Folligon,
Intervet) no momento da retirada do implante. O G-eCG+GnRH (n=149) foi tratado com 400 UI de eCG
no momento da retirada do implante e com 100 g de GnRH no momento da IATF. O diagnstico de
gestao foi realizado por ultra-sonografia 30 dias aps a IATF. As taxas de prenhez foram analisadas pelo
teste de Qui-quadrado. No foi verificada interao entre os tratamentos. As taxas de prenhez para os
grupos G-CON, G-GnRH, G-eCG e G-eCG+GnRH foram de 27,6% (42/152)c, 40,1% (59/147)b, 47,7%
(72/151)ab e 55,7% (83/149)a, respectivamente (P<0,05). Analisando-se os efeitos principais, verificou-se
aumento na taxa de prenhez (P<0,05) pelo tratamento com eCG [51,8% (155/300)a vs. 33,8 (101/299)b] e
com GnRH [48,0 (142/296)a vs. 37,6% (114/303)b]. Os resultados indicaram que tanto o tratamento com
eCG no momento da retirada do implante auricular de Norgestomet quanto o tratamento com GnRH no
momento da IATF aumentam a taxa de prenhez de vacas Nelore lactantes inseminadas em tempo fixo.
Agradecimento: Intervet

221

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFEITO DO CIPIONATO E DO BENZOATO DE ESTRADIOL NA TAXA DE


PRENHEZ DE VACAS NELORE INSEMINADAS EM TEMPO FIXO
Marques, M.O.1; Ayres, H.1; Reis, E.L.1; Mapletoft, R.J.2; Baruselli, P.S.1
1

Departamento de Reproduo Animal, FMVZ USP, So Paulo SP, CEP 05508-000, Brasil.
Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan, Saskatoon, SK, Canada S7N
5B4. barusell@usp.br

O presente experimento teve como objetivo comparar as taxas de prenhez com a administrao de Benzoato
de estradiol (BE) ou de Cipionato de estradiol (CE) na induo da ovulao em dois momentos distintos do
protocolo de inseminao artificial em tempo fixo (IATF) com progesterona (P4). Foram utilizadas 214
vacas Nelore lactantes (60-90 dias ps-parto), mantidas a pasto em Brasilndia-MS. Os animais foram
divididos aleatoriamente em 4 grupos experimentais (fatorial 2x2) de acordo com o perodo ps-parto e com
o escore de condio corporal (1-5). Em dia aleatrio do ciclo estral (Dia 0), os animais foram tratados com
2 mg de BE IM (Estrogin, Farmavet) e com dispositivo intravaginal contendo 1,9 g de P4 (CIDR, Pfizer).
No Dia 8, os dispositivos foram removidos e administrou-se 25 mg de Dinoprost IM (Lutalyse, Pfizer)
juntamente a 400 UI de eCG IM (Novormon, Syntex). A partir desse momento os grupos experimentais
foram divididos quanto ao indutor de ovulao administrado e ao momento da administrao. Grupo CE0
(n=57): 0,5mg de CE (ECP, Pfizer) no Dia 8 (retirada do dispositivo); Grupo CE24 (n=52): 0,5mg de CE
no Dia 9 (24h aps a retirada do dispositivo); Grupo BE0 (n=51): 1mg de BE no Dia 8; e Grupo BE24
(n=54): 1mg de BE no Dia 9. A IATF foi realizada 54h aps a remoo dos dispositivos intravaginais de P4
em todos os grupos. O diagnstico de gestao foi realizado por ultra-sonografia 30 dias aps a IATF. As
taxas de prenhez foram comparadas pelo teste de Qui-quadrado. No foi verificada interao entre os
grupos experimentais. As taxas de prenhez para os grupos CE0, CE24, BE0 e BE24 foram 45,6% (26/57),
42,3% (22/52), 41,2% (21/51) e 42,6% (23/54), respectivamente (P>0,05). Analisando-se os efeitos
principais, encontrou-se taxas de prenhez semelhantes (P>0,05) para o CE e para o BE [44,0% (48/109) vs.
41,9% (44/105)] administrados no Dia 8 ou no Dia 9 [43,5% (47/108) vs. 42,5% (45/106)]. Os resultados
mostraram que o Cipionato e o Benzoato de estradiol administrados no momento da retirada do dispositivo
de progesterona ou 24h depois apresentam taxas de prenhez semelhantes em vacas Nelore lactantes
inseminadas em tempo fixo.
Agradecimento: Pfizer

222

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFEITO DO eCG E DO DESMAME TEMPORRIO NA TAXA DE PRENHEZ DE VACAS


NELORE LACTANTES INSEMINADAS EM TEMPO FIXO

Penteado, L.1; Ayres, H.2; Reis, E.L.2; Madureira, E.H.2; Baruselli, P.S.2

ETAPA, Londrina - PR, Brasil. 2Departamento de Reproduo Animal, FMVZ -USP, So Paulo - SP,
Brasil. barusell@usp.br

Com o objetivo de aumentar as taxas de prenhez na inseminao artificial em tempo fixo (IATF), o presente
trabalho analisou o efeito do desmame temporrio e da administrao de eCG no tratamento com implante
auricular de progestgeno em vacas de Nelore lactantes. Foram utilizadas 457 vacas Nelore lactantes (40100d ps-parto) mantidas a pasto na regio de Camapu-MS (Agropecuria Caf no Bule). As vacas foram
divididas homogeneamente em 4 grupos experimentais (fatorial 2x2) de acordo o escore de condio corporal.
Em dia aleatrio do ciclo estral (D0), os animais receberam 3 mg de Norgestomet e 5 mg de Valerato de
Estradiol IM associados a um implante auricular contendo 3 mg de Norgestomet (Crestar, Intervet). No
D9, o implante foi removido e todos os animais foram inseminados 54h aps. O grupo G-CON (n=118) no
foi submetido a nenhum tratamento adicional. O G-eCG (n=112) foi tratado com 400 UI de eCG IM (Folligon,
Intervet) no momento da retirada do implante (D9). No G-DES (n=114) foi realizado o desmame temporrio
por 54h (retirada do implante IATF). O G-eCG+DES (n= 113) foi tratado com 400 UI de eCG e submetido
ao desmame temporrio por 54h. O diagnstico de gestao foi realizado por palpao retal 45 dias aps a
IATF. As taxas de prenhez foram analisadas pelo teste de Qui-quadrado. No foi observada interao entre
administrao de eCG e desmame temporrio. As taxas de prenhez para os grupos G-CON, G-eCG, GDES e G-eCG+DES foram de 37,3% (44/118)a, 52,7% (59/112)bc, 47,4% (54/114)ab e 58,4 (66/113)c,
respectivamente (P<0,05). Analisando-se os efeitos principais, verificou-se aumento na taxa de prenhez
(P<0,05) pelo tratamento com eCG [55,6% (125/225)a vs. 42,2% (98/232)b] e pela realizao do desmame
temporrio [52,9% (120/227)a vs. 44,8% (103/230)b]. Os resultados indicaram que tanto o tratamento com
eCG no momento da retirada do implante auricular de Norgestomet quanto o desmame temporrio entre a
retirada do implante e a IA aumentam a taxa de prenhez de vacas Nelore lactantes submetidas IATF.
Agradecimentos: Intervet e Agropecuria Caf no Bule

223

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFEITO DO TRATAMENTO COM TRIU-B POR 7, 8 OU 9 DIAS EM PROGRAMAS DE


INSEMINAO EM TEMPO FIXO EM VACAS E NOVILHAS CRUZA ZEBU
Balla, E.123; Cledou, G.4; Nosetti, L.5; Maraa Pea, D.2; B, G.A.13
1

Universidad Catlica de Crdoba, Argentina. 2Universidad Nacional de Crdoba, Argentina. 3Instituto de


Reproduccin Animal Crdoba (IRAC), Jernimo Luis de Cabrera 106, X5000GVD, Crdoba, 4Lab.
Biognesis, 5Actividad Privada, Salliquelo, Argentina. e-mail: gabrielbo@iracbiogen.com.ar

Foram realizados 3 experimentos para avaliar o efeito do tratamento com dispositivos Triu-B (no Brasil,
Cronipres, Biognesis) por 7, 8 ou 9 dias sobre as porcentagens de prenhez em novilhas e vacas secas
Inseminadas em Tempo Fixo (IATF). No experimento 1 foram utilizadas 447 novilhas cruza zebu de 20 a 26
meses de idade e com condio corporal (CC) de 2,5 a 3,5 (escala 1 a 5). As novilhas receberam no Dia 0
um Triu-B novo ou um Triu-B de 3 uso (suplementados com 3 anis de 100mg de P4 cada uma) e 2 mg de
Benzoato de Estradiol (EB; Bioestradiol, Biognesis) por via intramuscular (IM). Ao mesmo tempo, as
novilhas foram subdivididas em trs grupos para retirar o Triu-B no Dia 7, 8 ou 9. Todas novilhas receberam
150 g de D (+) Cloprostenol (Enzaprost-DC, Biognesis) IM no momento em que foi retirado o Triu-B, 1
mg de EB 24h mais tarde e foram IATF 28 a 32h depois. No Experimento 2 utilizaram 394 vacas secas cruza
zebu e com uma CC de 2,0 a 3,0 que foram tratadas por 7, 8 ou 9 dias como no Experimento 1. Os Triu-B
utilizados foram novos, de 2 uso ou de 3 uso. No experimento 3 utilizaram 129 vacas secas Aberdeen
Angus com uma CC de 2 a 2,5 que foram tratadas s com Triu-B novo por 7, 8, ou 9 dias. Os diagnsticos
de prenhez foram realizados por ultra-sonografia aos 30 dias (Experimento 1 e 3) e 60 dias (Experimento 2)
da IATF. Compararam as taxas de prenhez por Regresso Logstica. No Experimento 1 no houve diferena
nas taxas de prenhez entre os dias do tratamento (Triu-B 7 dias: 54,7%; 8 dias: 44,1% e 9 dias: 54,1%;
P=0,98). Tambm no houve diferena entre os Triu-B novos (48,6%) e de 3 uso (53,2%; P=0,33). No
Experimento 2 tambm no observaram diferena entre os dias de tratamento (Triu-B 7 dias: 50,4%, 8 dias:
48,9% ou 9 dias: 43,2%; P=0,28), nem entre Triu-B novos (47,7%), de 2 uso (48,9%) e de 3 uso (47,2%;
P=0,91). Finalmente, no houve diferena nas porcentagens de prenhez obtidos no experimento 3 (Triu-B 7
dias: 46,5%, 8 dias: 48,8% ou 9 dias: 53,5%; P=0,80). Os resultados demonstram que se pode utilizar
programas de IATF de 7, 8 ou 9 dias com resultados similares de prenhez possibilitando a IATF de um
grande nmero de animais em trs dias de trabalho de IA. Tambm no observaram diferena entre os TriuB novos ou reutilizados at trs vezes.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFEITO DA UTILIZACO DE DISPOSITIVOS CIDR-B NOVOS OU DE


TERCEIRO USO SOBRE AS PORCENTAGENS DE PRENHEZ EM
VACAS CRUZA ZEBU INSEMINADAS EM TEMPO FIXO (IATF).
B, G.A.12 ; Balla, E.123; Venturini, M.2; Tribulo, R.13
1

Universidad Catlica de Crdoba, Argentina. 2Universidad Nacional de Crdoba, Argentina. 3Instituto de


Reproduccin Animal Crdoba (IRAC), Jernimo Luis de Cabrera 106, X5000GVD, Crdoba,
Argentina e-mail: gabrielbo@iracbiogen.com.ar

Foi feito um experimento para avaliar as taxas de prenhez em vacas sincronizadas com dispositivos CIDR
(1,9 g de progesterona; CIDR-B, Pfizer Salud Animal) novos ou CIDR previamente utilizados duas vezes
por 8 dias (CIDR de 3 uso), nos campos da Argentina. O experimento 1 utilizaram 96 vacas secas cruza
zebu com uma condio corporal (CC) de 2,5 a 3 (escala 1 a 5). No Dia 0, as vacas receberam um
dispositivo CIDR novo ou um CIDR de 3 uso e 2 mg de benzoato de estradiol (EB, Estradiol 10, Lab. Ro
de Janeiro) por via intramuscular (IM). No Dia 8 retiraram os CIDR e aplicaram uma dose de 500 g de
cloprostenol (Estroplan, Syntex) IM e 24h mais tarde (Dia 9) foi aplicado 1 mg de EB IM. Os animais foram
Inseminados em Tempo Fixo (IATF) entre as 52 e 56h aps a retirada do CIDR. No estabelecimento 2
utilizaram vacas cruza zebu secas (n=23) e com cria ao p (n=70), com uma CC de 2 a 2,5. As vacas foram
tratadas da mesma maneira que no estabelecimento 1. Os diagnstico de prenhez foram realizados por
palpao retal aos 60 dias da IATF no estabelecimento1 ou por ultra-sonografia transretal (100 Falco Vet.
Pie Medical, com transdutor 8 MHz) aos 30 dias da IATF no etabelecimento 2. Foram comparadas as taxas
de prenhez por Regresso Logstica. Tanto para o estabelecimento 1 como 2, no foram encontradas diferenas
significativas nas taxas de prenhez entre as vacas tratadas com CIDR novos (estabelecimento 1: 21/49;
42,9% e estabelecimento 2: 18/32; 56,3%) e as tratadas com CIDR de 3 uso (estabelecimento 1: 22/47;
46,8% e estabelecimento 2: 33/61; 54,1% P>0,7). No estabelecimento 2 tambm no houve diferenas
entre as vacas secas e com cria (P>0,6). Os resultados demonstram que se pode utilizar dispositivos CIDR
em vacas cruza zebu at 3 vezes, sem que afetem significativamente as taxas de prenhez. Estes resultados so
importantes do ponto de vista prtico, j que se pode diminuir significativamente o custo dos programas de
sincronizao e IATF.

225

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFEITO DO TRATAMENTO COM eCG E GnRH EM VACAS NELORE


INSEMINADAS EM TEMPO FIXO
Duarte, R.A.1; Reis, E.L.2; S Filho, M.F.2; B, G.A.2; Baruselli, P.S.2; Kozicki, L.E.1
1

UFPR, Curitiba/PR, Brasil. 2Depart. Reprod. Animal, FMVZ/USP, So Paulo/SP, Brasil. 3Inst.
de Reprod. Animal Crdoba, Crdoba, Argentina. radaduarte@ig.com.br

Este experimento teve como objetivo comparar o efeito da administrao de eCG no momento da retirada
do dispositivo intravaginal de progesterona (DP4) e da administrao de GnRH para formao de CL acessrio
(induo da ovulao do folculo dominante da primeira onda de desenvolvimento folicular) em vacas Bos
indicus (Nelore) submetidas inseminao artificial em tempo fixo (IATF). Foram utilizadas 174 vacas
Nelore lactantes, mantidas a pasto em Francisco Beltro-PR. Os animais foram divididos em 4 grupos
(fatorial 2x2) de acordo com a condio corporal e ciclicidade (ultassonografia). No Dia 0, todos os animais
receberam um DP4 (Cronipres, Biogenesis) e 2 mg de BE IM (Estrogin, Farmavet). No Dia 8, o DP4 foi
removido e administrou-se 0,15 mg de d-cloprostenol (Croniben, Biogenesis). No dia 9, aplicou-se 1 mg
de BE IM (24 horas aps a retirada do DP4). A IATF foi realizada 54h aps a remoo do DP4. Foi
realizado um exame ultrassonogrfico 12 dias aps a IATF para deteco dos CL acessrios. O grupo GCON (n=50) no recebeu nenhum tratamento adicional. O grupo G-GnRH (n=39) recebeu 0,2 mg de
Gonadorelina IM (GnRH, Fertagyl, Intervet) cinco dias aps a IATF. O grupo G-eCG (n=46) recebeu 400
UI de eCG (Folligon, Intervet) no momento da retirada do DP4. O grupo G-eCG+GnRH (n=42) foi
tratado com eCG e GnRH. O diagnstico de gestao foi realizado por ultrassonografia 30 dias aps a IATF.
Analisou-se as taxas de prenhez (TXP) e o nmero de CL (NCL) pelo programa estatstico SAS for Windows.
No foi verificada interao entre os tratamentos. As mdias para os grupos G-CON, G-GnRH, G-eCG e
G-eCG+GnRH foram, respectivamente: TXP: 66,0% (33/50) vs. 53,8% (21/39) vs. 53,5% (23/43) vs.
60,0% (29/42; P>0,05); NCL: 0,860,05a vs. 1,740,10b vs. 0,980,04a vs. 1,900,08b (P<0,05). Os
efeitos principais no demostraram efeito sobre a TXP do tratamento com eCG [eCG: 61,2% (52/85) vs.
no eCG: 60,7% (54/89); P>0,05] e com GnRH [GnRH: 61,7% (50/81) vs. no GnRH: 60,2% (56/93);
P>0,05]. Observou-se efeito da aplicao de GnRH no NCL [GnRH: 1,820,06a vs. no GnRH: 0,910,03b,
P<0,05]. Este efeito no foi observado no tratamento com eCG [eCG: 1,430,07 vs. no eCG: 1,260,07,
P>0,05]. No presente experimento a administrao de eCG no momento da retirada do DP4 e de GnRH
cinco dias aps a IATF no aumentaram a taxa de prenhez. No entanto, a administrao de GnRH cinco dias
aps a IATF foi eficiente para induzir a formao de CL acessrio em vacas Nelore lactantes.
Agradecimento: Biogenesis

226

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

SINCRONIZAO DA OVULAO DE NOVILHAS COM PROGESTERONA E


PROGESTGENO PARA INOVULAO EM TEMPO FIXO
Rodrigues, C.A.1; Mancilha, R.F.1; Reis, E.L.2; Mello, J.E.2; Ayres, H.2;
Madureira, E.H.2; Baruselli, P.S.2
1

Clnica Veterinria SAMVET de So Carlos, So Carlos-SP, Brasil. 2Depart. de Reproduo Animal,


FMVZ USP, So Paulo SP, Brasil. barusell@usp.br

Estudos anteriores mostraram satisfatria eficincia do tratamento com progesterona (P4) e eCG na
sincronizao da ovulao para inovulao em tempo fixo (ITF) em receptoras de embrio bovino. O presente
trabalho comparou a eficcia do tratamento com P4 ou progestgeno, associado ao Benzoato (BE) ou ao
Valerato de Estradiol (VE) no protocolo de superovulao de receptoras para ITF. Foram utilizadas 226
novilhas B. taurus x B. indicus mantidas a pasto na regio de So Carlos- SP. No D0, o Grupo 1 (G1;
n=99), recebeu um implante auricular contendo 3mg de Norgestomet (NOR) juntamente com 5mg de VE e
3mg de NOR IM (Crestar, Intervet). No D6 administrou-se 500UI de eCG (Folligon, Intervet) e no D9 os
implantes foram removidos. No D0, o Grupo 2 (G2; n=111) recebeu um implante auricular de NOR juntamente
com 2mg de BE e 50mg de P4 IM (Index). No D5, administrou-se 500UI de eCG e 150 mg d-cloprostenol
(Preloban, Intervet). A remoo do implante ocorreu no D8 e no D9 aplicou-se 1mg de BE IM. O Grupo
3 (G3, n=116) recebeu o mesmo tratamento do G2, no entanto o implante auricular foi substitudo por um
dispositivo intravaginal de P4 (CIDR; Pfizer). O dia do estro foi considerado o D11 para o G1, e o D10
para o G2 e o G3. A avaliao ultrassonogrfica ovariana foi realizada no momento da inovulao (9 dias
aps a retirada da fonte de P4 ou progestgeno). Nas receptoras consideradas aptas (CL 13 mm de
dimetro) foi inovulado um embrio produzido in vitro. O diagnstico de gestao foi realizado por
ultrassonografia 23 dias aps a TE. Foram analisadas as taxas de aproveitamento (APRO), de concepo
(CONC), de prenhez (PREN) e de superovulao (SOV), o nmero de CL por receptora (NCL) e o
dimetro do CL nico (DCL) em cada grupo. Os resultados foram analisados pelo SAS for Windows. As
variveis no paramtricas (binomiais) foram avaliadas pelo teste de Wilcoxon (unicaudal) e as paramtricas
pelo teste LSD de mdias. As mdias para os Grupos 1, 2 e 3 foram, respectivamente, APRO [72,7% (72/
99)a, 84,7% (94/111)b e 88,8% (103/116)b; P < 0,05], CONC [38,9% (28/72), 46,8% (44/94), 39,8%
(41/103); P>0,05], PREN [28,3% (28/99)a, 39,6% (44/111)b e 35,3% (41/116)ab; P<0,05], SOV [36,1%
(36/72), 41,4% (39/94) e 47,6% (49/103); P>0,05], NCL (1,70,1; 1,80,1 e 2,00,2; P>0,05), DCL
(18,20,4a, 20,20,6b e 19,50,5ab; P<0,05). Conclui-se que a substituio do VE por BE aumenta a
eficincia do tratamento para ITF. O tratamento com progestgeno e BE apresentou a mesma eficincia que
o tratamento com P4 e BE.
Agradecimento: Intervet

227

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFEITO DO TRATAMENTO COM eCG NA TAXA DE CONCEPO DE VACAS


NELORE COM DIFERENTES ESCORES DE CONDIO CORPORAL
INSEMINADAS EM TEMPO FIXO (ANLISE RETROSPECTIVA)
Baruselli, P.S.1; Madureira, E.H.1; Marques, M.O.2; Rodrigues, C.A.3; Nasser, L.F.1;
Silva, R.C.P.2; Reis, E.L.1; S Filho, M.F.1
1

Depart. de Reproduo Animal, FMVZ-USP, So Paulo-SP, Brasil. 2Geraembryo, Cornelio ProcpioPR, 3Clnica Veterinria SAMVET de So Carlos, So Carlos-SP, Brasil. barusell@usp.br

O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito do tratamento com eCG na retirada do dispositivo de progesterona
na taxa de concepo em vacas Nelore lactantes com diferentes escores de condio corporal (ECC)
inseminadas em tempo fixo. Estudos anteriores foram indicativos de que o tratamento com eCG aumenta a
taxa de concepo apenas em animais em anestro (Baruselli et al., Theriogenology, v. 59, p. 214, 2003). No
presente estudo, foram utilizadas 1984 vacas Nelore lactantes (anlise de 5 experimentos) mantidas a pasto
nos estados de So Paulo e Mato Grosso do Sul. No incio do tratamento os animais foram classificados
quanto ao ECC (escala de 1 a 5; 1 magra e 5 gorda). No dia da retirada do dispositivo de progesterona
metade dos animais receberam 400 UI de eCG. Todos os animais foram inseminados 54h aps a retirada do
dispositivo. O diagnstico de gestao foi realizado por ultra-sonografia em mdia 30 dias aps a IATF. No
se verificou interao entre tratamento (com ou sem eCG), lotes experimentais e ECC. Houve interao do
tratamento com a condio corporal. As taxas de prenhez foram analisadas pelo teste de Qui-quadrado.
Verificou-se diferenas estatisticamente significativas na taxa de concepo conforme o tratamento com eCG
somente nos animais com baixo escore de condio corporal [ECC 2,0, sem eCG=22,7% (5/22)a e com
eCG=47,6% (20/42)b, P=0,02; ECC 2,5, sem eCG=42,8% (83/194)a e com eCG=56,9% (124/218)b,
P=0,01; ECC 3,0, sem eCG=53,9% (253/469)a e com eCG=58,4% (261/447)b, P=0,08; ECC 3,5, sem
eCG=52,1% (136/261) e com eCG=51,7% (123/238), P=0,46; ECC > 4,0, sem eCG=69,6% (32/46) e
com eCG=63,8% (30/47), P=0,28]. Os resultados so sugestivos de que o tratamento com eCG no momento
da retirada do dispositivo de progesterona aumenta a taxa de concepo inseminao artificial em tempo
fixo somente em animais que apresentam baixo escore de condio corporal ( 3,0). O efeito positivo do
tratamento com eCG na taxa de concepo de animais com baixo ECC pode ser justificado pela alta freqncia
de anestro encontrada nessa categoria. Conclui-se que a resposta ao tratamento com eCG depende da
condio corporal no incio do tratamento de sincronizao da ovulao para IATF.

228

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

ADEQUAO DA DOSE DE hCG (VETECOR) PARA INDUO DA OVULAO


DE VACAS EM PROTOCOLOS DE INSEMINAO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO
Marques, M.O.1; Campos Filho, E.P.2, Mantovani, A. P.1; Reis, E.L.1;
Nichi, M.1; Baruselli, P.S.1
1

Departamento de Reproduo Animal, FMVZ USP, So Paulo SP, Brasil. 2Brangus Brasil, Fazenda
Sobrado, So Manuel SP, Brasil. barusell@usp.br

O objetivo deste trabalho foi adequar a dose de hCG, para induo da ovulao, em vacas Bos taurus x Bos
indicus lactantes inseminadas em tempo fixo (IATF), com ou sem a administrao de eCG no momento da
retirada do dispositivo intravaginal de progesterona. Foram utilizadas 521 vacas Bos indicus x Bos taurus
lactantes (75,8 20,5 dias ps-parto), mantidas a pasto em So Manoel - SP. Os animais foram divididos
aleatoriamente em 6 grupos experimentais (fatorial 3x2). Em dia aleatrio do ciclo estral (D0), os animais do
Grupo 1 (G1) receberam 2mg de benzoato de estradiol (BE) IM (Estrogin, Farmavet) e um dispositivo
intravaginal contendo 1,9g de P4 (CIDR, Pfizer). No D8, os dispositivos foram removidos e administrou-se
25mg de Dinoprost IM (Lutalyse, Pfizer) e 400UI de eCG IM (Novormon, Syntex). No D10 (54h aps
a retirada do dispositivo) os animais foram inseminados e tratados com 500UI de hCG IM (Vetecor Calier).
Os animais do Grupo 2 (G2) e do Grupo 3 (G3) receberam o mesmo tratamento que os animais do G1, no
entanto foram tratados com 1000 e 1500UI de hCG no momento da IATF, respectivamente. Os grupos G4,
G5 e G6 foram tratados com o mesmo protocolo dos grupos G1, G2 e G3 respectivamente, no entanto no
foram tratados com 400UI de eCG no momento da retirada do dispositivo. O diagnstico de gestao foi
realizado por palpao retal 45 dias aps a IATF. As taxas de prenhez foram comparadas pelo teste de Quiquadrado. No foi verificada interao entre os grupos experimentais. As taxas de prenhez para os grupos
G1, G2, G3, G4, G5 e G6 foram de 31,0% (27/87), 21,1% (16/76), 34,1% (30/88), 26,7% (24/90),
34,4% (33/96) e 28,6% (24/84), respectivamente (P>0,05). Analisando-se os efeitos principais, no foi
observado efeito do tratamento com eCG [com eCG: 29,1% (73/251) vs. sem eCG: 30,0% (81/270);
P>0,05] e das doses de hCG [500: 28,8% (51/177) vs. 1000: 28,5% (49/172) vs. 1500: 31,4% (54/172);
P>0,05]. Apesar das baixas taxas de prenhez verificadas em todos os grupos, os resultados mostraram que
a reduo da dose de hCG de 1500UI para 500UI no comprometeu a taxa de prenhez em protocolos de
IATF com dispositivo intravaginal de progesterona em vacas Bos indicus x Bos taurus lactantes. No foi
verificado efeito do tratamento com eCG no momento da retirada do dispositivo intravaginal de progesterona
em animais tratados com hCG para induo da ovulao.
Agradecimento: Laboratrios Calier do Brasil

229

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

USO DA INSEMINAO ARTIFICIAL COMO ROTINA EM PROGRAMAS DE


REPRODUO DE CADELAS DA RAA BULLDOG
Jacomini, J. O.1; Moreira, C.F.2; Cunha, G.N.2; Diniz, E.G.1
1

Prof. da Faculdade de Medicina Veterinria da Universidade Federal de Uberlndia-MG, Brasil. E-mail:


jojacomini@ufu.br. 2Aluno do curso de Mestrado em Medicina Veterinria da FAMEV-UFU

A procura por biotcnicas aplicadas reproduo de ces tem aumentado consideravelmente nos ltimos
anos. Especificamente para a raa Bulldog, a justificativa para o uso da inseminao artificial (IA) est no
relato de proprietrios que tiveram baixas taxas de prenhez e pequeno nmero de filhotes com monta natural,
devido s dificuldades durante o acasalamento. Durante o ano de 2003, foram inseminadas artificialmente
com smen fresco, 16 cadelas da raa Bulldog e idade entre 10 e 33 meses, que apresentaram um a trs
estros antes da IA. Para a realizao das IA, foi feito o acompanhamento por citologia vaginal quando
iniciado o pr-estro. As inseminaes eram realizadas aps o aparecimento de 100% de clulas superficiais
com a maioria delas anucleadas. Utilizou-se o smen de trs reprodutores com exame androlgico e
espermiograma normais, coletado por manipulao do pnis em tubo cnico acoplado a um funil plstico. A
temperatura do tubo foi mantida apenas pela proteo com a mo. Utilizou-se uma bainha de transferncia
de embries bovinos cortada ao meio como pipeta de IA, conectada a uma seringa plstica por meio de uma
mangueira de silicone. A pipeta foi introduzida na vagina, primeiramente, em ngulo de 45 ventralmente e em
seguida, na direo horizontal at encontrar um pouco de resistncia quando, ento, o smen foi depositado
num volume mdio de trs mL. A regio plvica da fmea foi erguida por cinco a 10 minutos e durante este
tempo massageou-se a vulva. Foram realizadas duas ou trs IA em dias consecutivos ou alternados. Ficaram
gestantes doze (75%) cadelas. A mdia de filhotes foi 6,20 por parto, com variao de dois a 10. A durao
mdia da gestao foi de 62,50 (58 a 67) dias em relao primeira IA e de 59,42 (57 a 63) dias em relao
ao ltimo procedimento. Setenta e cinco porcento dos partos necessitaram de cesariana. O uso da IA com
smen fresco em cadelas da raa Bulldog mostrou ser eficiente com boa taxa de gestao e nmero mdio de
filhotes aceitvel.

230

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

PADRONIZAO DA TCNICA DE IMUNOISTOQUMICA PARA DETECO


DE RECEPTORES DE ESTRGENO E PROGESTERONA NO ENDOMTRIO
DE VACAS NELORE (Bos taurus indicus)
Martin, I.1; Ferreira, J.C.P.1; Laufer Amorim, R.2; Torres Neto, R.2; Vettorato, L.F.1
1

Departamento de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria FMVZ/Unesp, Botucatu-SP, 18618000, Brasil. ian@fmvz.unesp.br. 2 Departamento de Clnica Veterinria rea de Patologia Veterinria
FMVZ/Unesp, Botucatu-SP, 18618-000, Brasil.
O presente estudo teve como objetivo validar a tcnica de imunoistoqumica para deteco de receptores de
estrgeno e progesterona no endomtrio de vacas Nelore. Foram utilizadas 16 fmeas P.O., primparas e
multparas, com escore corporal inicial entre 2,5 e 3,5. Estas foram mantidas em regime de estabulao
parcial recebendo feno, farelo de milho, sal mineral proteinado e gua ad libitum. A colheita de amostras
endometriais foi realizada com uma pina do tipo Yomann sempre no corno contralateral ao corpo lteo. As
amostras foram fixadas em formalina tamponada a 10% durante 24h, e, posteriormente, mantidas em lcool
70 at o momento da incluso em parafina. Aps a incluso, cortes de 3m forma obtidos e colocados em
lminas com extremidade fosca, previamente tratadas com Poly-L-lysina (Poly-L-lisine Sigma Chemical
Co.- P8920 USA). Inicialmente realizou-se o processo de desparafinizao e hidratao para posteriormente
proceder-se a tcnica de imunoistoqumica. Para a deteco de receptores de estrgeno realizou-se a
recuperao antignica em soluo de citrato 10 mM em pH 6,0 incubada em microondas durante 15 minutos;
e para os receptores de progesterona utilizou-se soluo de EDTA 10 mM em pH 8,0 e incubao em
banho-maria a 96oC durante 40 minutos. Aps o resfriamento da soluo em temperatura ambiente, as
lminas foram lavadas com gua destilada. A etapa seguinte foi o bloqueio da peroxidase endgena em
soluo de gua oxigenada 3%. Posteriormente as lminas foram novamente lavadas em gua destilada e em
soluo tampo pH 7,4 Tris (Trizma Base Sigma Chemical Co. USA) e, subseqentemente, procedeuse a incubao com BSA 5% durante 1h em temperatura ambiente. Realizou-se, ento, a incubao com o
anticorpo primrio, na diluio de 1:50, tanto para os receptores de estrgeno (Estrogen Receptor Ab-17,
rabbit polyclonal antibody - Labvision), como para os receptores de progesterona (Progesterone Receptor
Ab-8 clone hPRa 2+hPRa 3, mouse monoclonal antibody - Labvision), em cmara mida durante 18h
temperatura de 4oC. Procedeu-se, ento, nova lavagem em soluo tampo pH 7,4 Tris durante 10 minutos,
e incubao com o anticorpo secundrio e complexo ABC (DakoCytomation - USA). Realizou-se nova
lavagem com soluo tampo pH 7,4 Tris e revelao com o cromgeno DAB (3,3-diaminobenzidina Liquid DAB Cromogen DakoCytomation USA) durante 2 minutos ao abrigo da luz. Novamente as
lminas foram lavadas em soluo tampo pH 7,4 Tris e gua destilada. A contracolorao foi realizada
com metil-green durante 3 minutos e, posterior lavagem com lcool isoproplico. Por fim realizou-se a
desidratao dos cortes e montagem das lminas. Como controle negativo utilizou-se lminas sem o anticorpo
primrio, incubadas com BSA pelo mesmo perodo e temperatura das demais. As clulas portadoras de
receptores hormonais de estrgeno ou progesterona, aps o tratamento, passaram a apresentar seus ncleos
corados em marrom, demonstrando a eficincia da tcnica em bovinos. Apoio financeiro: FAPESP e
Fundunesp.
231

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFEITO DA CONCENTRAO PLASMTICA DE PROGESTERONA NA DINAMICA


FOLICULAR DE NOVILHAS BOS INDICUS X BOS TAURUS
Mantovani, A.P.1; S Filho, M.F.1; Reis, E.L.1; Nichi, M.1; Bo, G.A.2; Baruselli, P.S.1
1

Departamento de Reproduo Animal, FMVZ-USP, So Paulo, Brasil. 2Instituto de Reproduccin


Animal Crdoba, Crdoba, Argentina. barusell@usp.br

O objetivo deste experimento foi avaliar o crescimento folicular e a taxa de ovulao sob diferentes
concentraes plasmticas de progesterona (CPP) em novilhas Bos indicus x Bos taurus tratadas para
inseminao artificial em tempo fixo (IATF). Quarenta novilhas cclicas (deteco de CL por palpao
retal) foram sincronizadas com duas administraes de 25,0 mg de dinoprost IM (PGF2, Lutalyse,
Pfizer) com 12 dias (D -24 e D -12) de intervalo. No D0, o grupo G1 (n=10) foi tratado com 2 mg de
benzoato de estradiol (BE) IM (Estrogin, Farmavet) e com um dispositivo intravaginal contendo 1,9g de
progesterona (CIDR, Pfizer). No D8 administrou-se PGF2. O G2 (n=10) recebeu o mesmo tratamento
do G1, no entanto a PGF2 foi administrada no D5. O G3 (n=9) e o G4 (n=11) receberam o mesmo
tratamento do G2, no entanto os dispositivos inseridos foram previamente utilizados por 8 e 14 dias,
respectivamente. No D8, retirou-se os dispositivos e no D9 foi administrado 1 mg de BE em todos os
animais. Os exames ultrassonogrficos foram realizados a cada 24h do D5 ao D9 e a cada 12h no D11 e
no D12 para avaliao da dinmica folicular do D5 ovulao. Foram analisadas a CPP mdia durante o
tratamento (colheita de sangue D6, D7 e D8), a correlao da taxa de crescimento diria do FD do D6 ao
D9 (CF) com as CPP, o dimetro do folculo dominante no D8 (FD8) e no D10 (FD10) e a taxa de
ovulao (TOV). Os resultados foram analisados pelo SAS. A taxa de ovulao foi analisada por contrastes
ortogonais. Verificou-se diferena (P<0,05) nas CPP mdias durante o tratamento (G1: 3,30,5a; G2:
2,00,2b; G3:1,90,2b e G4:1,50,1b ng/ml). O CF foi negativamente correlacionado com a CPP (r = 0.41, P<0,05). Os resultados para o G1, G2, G3 e G4 foram, respectivamente - FD8: 0,760,04a vs.
0,860,03ab vs. 0,850,06ab vs. 0,900,02b mm (P<0,05); FD10: 0,870,07b vs. 1,000,06a vs.
1,040,07a vs. 1,060,03a mm (P<0,05); TOV: 60,0% (6/10)c vs. 80,0% (8/10)d vs. 77,8% (7/9)d vs.
90,9% (10/11)d, P=0,06. Os resultados indicaram que maiores CPP promovem a reduo do dimetro
mximo do folculo dominante e tendem a diminuir a taxa de ovulao em novilhas Bos indicus x Bos
taurus tratadas com dispositivo intravaginal de progesterona para IATF. Estratgias para a diminuio
das CPP durante o tratamento com dipositivo intravaginal de progesterona para IATF podem ser usadas
para aumentar a taxa de prenhez em novilhas Bos indicus x Bos taurus.

232

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

ACOMPANHAMENTO ULTRA-SONOGRFICO DA DINMICA UTERINA EM


VACAS NELORE (Bos taurus indicus) DURANTE O CICLO ESTRAL
Martin, I.1; Ferreira, J.C.P.1; Vettorato, L.F.1; Gioso, M.M.1; Tavares, R.Z.1;
Mota, A.V.1; Greatti, T.A.P.1; Oba, E.1
1

Departamento de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria FMVZ/Unesp, Botucatu-SP,


18618-000, Brasil. ian@fmvz.unesp.br

O presente estudo teve como objetivo caracterizar a dinmica uterina ao longo do ciclo estral em vacas
zebunas da raa Nelore. Foram utilizadas 16 fmeas P.O. provenientes do rebanho da Fazenda So Manuel
Unesp/Botucatu, primparas e multparas, com escore corporal inicial entre 2,5 e 3,5. Estas foram mantidas
em regime de estabulao parcial recebendo feno, farelo de milho, sal mineral proteinado e gua ad libitum.
Para o controle uterino utilizou-se a ultra-sonografia transretal (Aloka SSD 500 - Aloka Co. Ltda, Tokyo/
Japo com probe retal de 5,0 MHz). Os animais foram sincronizados com uma dose de GnRH (25g
Lecirelina IM Gestran Plus Tecnopec Ltda, SP, Brasil) e aps 7 dias uma aplicao de prostaglandina
(0,150mg d-Cloprostenol IM Prolise Tecnopec Ltda, SP, Brasil). A partir do momento da administrao
de prostaglandina os animais foram avaliados diariamente at o momento da ovulao (dia zero/D0). Os
exames ultra-sonogrficos continuaram a ser realizados a cada 24 horas at a deteco de uma nova ovulao.
Foram avaliadas a presena de coluna lquida em fundo vaginal e nos cornos uterinos, a textura uterina e a
mensurao, em centmetros, do dimetro dos cornos uterinos nos aspectos dorsal, cranial e ventral. Para a
avaliao da quantidade de fluido em fundo vaginal e nos cornos uterinos utilizou-se uma escala variando de
0 a 3 onde um escore 0 indicava ausncia de fluido, um escore 3 o acmulo mximo visualizado e os escores
1 e 2 valores intermedirios. Quanto a textura ultra-sonogrfica, esta foi classificada como caracterstica de
diestro (1 cinza homognea, sem evidncia de edema intersticial), estro (3 imagem heterognea e edema
proeminente) ou em estgio intermedirio (2 edema e heterogeneidade moderadamente discernveis). Os
resultados encontrados foram, quanto ao acmulo de lquido no fundo vaginal, uma queda acentuada a partir
do dia 3 ciclo estral e um aumento pronunciado a partir do dia 17, embora pequenas quantidades de fluido
estivessem sempre presentes durante todo o ciclo avaliado. Quanto ao acmulo de lquido nos cornos uterinos
houve um decrscimo intenso entre os dias 3 e 4 do ciclo estral e uma elevao acentuada apenas a partir do
dia 17; novamente pequenas quantidades de fluido foram sempre evidenciadas nos demais momentos. A
textura ultra-sonogrfica uterina apresentou uma diminuio do edema e heterogeneidade a partir do dia 2,
embora s tenha se tornado homognea ao redor do dia 6, esta voltou a ser mais heterognea por volta dos
dias 15 e 16, mas alcanou heterogeneidade e edema mximos prximo ao dia 19 do ciclo estral. Em relao
s mensuraes dos cornos uterinos estas evidenciaram, no aspecto dorsal, cranial e ventral, uma marcada
diminuio ao redor do dia 3 do ciclo estral e uma evidente elevao prximo ao dia 17. Estas ainda se
mostraram semelhantes e constantes entre os dias 5 e 15 do ciclo estral. Os achados demonstram claramente
que o tero se modifica continuadamente durante o ciclo estral, caracterizando uma fase de domnio
progesternico (luteal) e outra de domnio estrognico (estral).
Apoio financeiro: FAPESP e Fundunesp
233

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

CARACTERSTICAS ULTRA-SONOGRFICAS DO CORPO LTEO E DO DIMETRO


FOLICULAR PR-OVULATRIO DE VACAS NELORE
Martin, I..1; Vettorato, L. F.1; Tavares, R.Z.1; Greatti,T.A.P.1; Gioso, M.M.1; Mota, A.V.1;
Oba, E.1; Ferreira, J.C.P.1
1

Departamento de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria - FMVZ-Unesp. Distrito de Rubio


Junior S/N, CEP: 18.6188-000 - Botucatu - SP - Brasil - jcferreira@fmvz.unesp.br

Apesar de ser a raa de bovino mais empregada para fins comerciais no Brasil, o Nelore, tm sido objeto de
um nmero relativamente pequeno de estudos envolvendo a sua biologia reprodutiva, principalmente os
relacionados anatomia funcional do sistema reprodutor feminino durante o ciclo estral. Buscando preencher
esta lacuna, o presente trabalho dedicou-se a avaliao ultra-sonogrfica do desenvolvimento luteal e do
dimetro folicular de 16 vacas Nelore previamente submetidas ao seguinte protocolo de sincronizao: GnRH
(25 g lecirelina, IM - Gestran Plus - Tecnopec) e sete dias mais tarde PGF2? (0,15 mg de D+Cloprostenol,
IM - Preloban - Intevet). Atravs da ultra-sonografia transretal foi acompanhada a dinmica folicular pssincronizao e do ciclo estral subseqente, o que possibilitou o registro do dimetro do folculo ovulatrio
em ambos os perodos. Observou-se que os primeiros sinais ultra-sonogrficos de lutelise (diminuio da
ecogenicidade e do dimetro do corpo lteo) apareceram em mdia 2,4 0,6 dias aps aplicao da
PGF2 e que os animais ovularam em mdia 3,9 1,6 dias aps essa aplicao, ocorrendo uma disperso
das ovulaes de 5 dias. O dimetro mdio dos folculos ovulatrios ps-sincronizao foi de 13,1 1,0
mm, semelhante ao dimetro mdio mensurado no ciclo estral subseqente sincronizao, que foi de 12,8
1,2 mm. Tais medidas confirmam que este protocolo, apresentado por Barros et al. (Theriogenology, v.
53, p. 1121-1134, 2000) no interfere diretamente no dimetro do folculo ovulatrio. Contudo, os dimetros
foliculares encontrados foram superiores aos observados por Figueredo et al. (Theriogenology, v.47, p.14891505, 1996), que estudando vacas Nelore, encontraram como medidas mximas 11,3 0,3 e 10,4 0,3
mm, respectivamente, nos ciclos de duas ondas e trs ondas. A visualizao ultra-sonogrfica do corpo lteo
aps a ovulao foi possvel em mdia 4,6 1,6 dias e o mximo dimetro do mesmo, mensurado antes de
seu desaparecimento ultra-sonogrfico foi em mdia de 18,9 3,8 mm, valores tambm superiores aos
obtidos por Neves et al. (Rev. Bras. de Reprod Anim.,v.27, n.2, p.233-234, 2003), estudando ovrios de
animais da raa Nelore abatidos, e de Figueredo et al. (Theriogenology, v.47, p.1489-1505, 1996) que
estudou animais desta mesma raa ao ultra-som, observando medidas de aproximadamente 15,9 mm. Neste
estudo no foi observado correlao estatstica positiva significativa entre o dimetro do folculo ovulatrio e
o dimetro do corpo lteo em seu tamanho mximo (r = 0,3; P = 0,1). Os resultados obtidos demonstram
que o corpo lteo e o folculo pr-ovulatrio, na raa nelore, podem alcanar dimetros superiores aos
registrados pela literatura.
Suporte Financeiro: Fapesp e Fundunesp

234

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

DINMICA FOLICULAR DE VACAS NELORE LACTANTES EM ANESTRO


TRATADAS COM PROGESTGENO, eCG E GnRH
S Filho, M.F.1; Reis, E.L1; Viel Jr, J.O.1; Nichi, M.1; Madureira, E.H.1; Baruselli, P.S.1
1

Depart. de Reprod. Animal, FMVZ-USP, So Paulo-SP, Brasil. barusell@usp.br

Com o objetivo de avaliar os efeitos do uso do eCG e do GnRH em programas de inseminao artificial em
tempo fixo analisou-se a dinmica folicular de vacas em anestro tratadas com progestgeno, eCG e GnRH.
Foram utilizadas 50 vacas Nelore lactantes (133,5 16,6 dias ps-parto) em anestro (ausncia de CL por
ultrassonografia nos dias 14 e 7) mantidas a pasto no Campus Administrativo da USP em PirassunungaSP. Os animais foram divididos em 4 grupos experimentais (fatorial 2x2) de acordo com a condio corporal
e com o nmero de partos. No D0, todas as fmeas receberam um implante auricular de Norgestomet
(Crestar, Intervet), juntamente com a aplicao de 3 mg de Norgestomet e 5 mg Valerato de Estradiol IM.
No D9, o implante foi removido e os grupos diferiram quanto ao tratamento a partir desse momento. O grupo
G-CON (n=12) no foi submetido a nenhum tratamento adicional. O G-eCG (n=13) foi tratado com 400 UI
de eCG IM (Folligon, Intervet) no D9. O G-GnRH (n= 12) foi tratado com 100 g de GnRH IM (Fertagyl,
Intervet) 54 horas aps a retirada do implante. O G-eCG+GnRH (n= 13) foi tratado com eCG na retirada
do implante e com GnRH 54h aps. Os exames ultrassonogrficos foram realizados a cada 12 horas do D9
ovulao. Foram avaliados o dimetro mximo do folculo ovulatrio (DFO), taxa (TOV) e momento de
ovulao (MOV). Os resultados foram analisados pelo programa estatstico SAS. No foi verificada interao
entre os tratamentos. Analisando-se os efeitos principais, no foi observado efeito do eCG e do GnRH sobre
o DFO (eCG:1,300,06 vs. no eCG: 1,280,08 mm; GnRH: 1,290,07 vs. no GnRH: 1,300,06 mm,
P>0,05). As fmeas tratadas com GnRH apresentaram tendncia de menor disperso no MOV (GnRH:
72,01,1x vs. no GnRH: 71,12.0 hy; Teste de Bartlet, P=0.06). Este efeito no foi observado nas tratadas
com eCG (eCG: 70,92,0 vs. no eCG: 72,01,3 h; Teste de Bartlett, P>0,05). Os animais tratados com
eCG apresentaram aumento na TOV [eCG 71,0 (19/26)a vs. no eCG 50% (12/24)b; P<0,05). Este
incremento no foi visto nas fmeas que receberam GnRH [GnRH: 68,0% (17/25) vs. no GnRH: 56,0%
(14/25), P>0,05]. Os resultados indicam que o tratamento com eCG no momento da retirada do implante
auricular de Norgestomet aumenta a taxa de ovulao e o tratamento com GnRH sincroniza as ovulaes em
vacas Bos indicus em anestro tratadas com norgestomet, valerato de estradiol e eCG para inseminao
artificial em tempo fixo.
Agradecimentos: Intervet

235

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFEITOS DO CIPIONATO E DO BENZOATO DE ESTRADIOL NA DINAMICA


FOLICULAR E LUTENICA DE VACAS NELORE

Reis, E.L.1; Gimenes, L.U.1; Marques, M.O.1; Carvalho, J.B.P.1;


Mapletoft, R.J.2; Baruselli, P.S.1
1

Departamento de Reproduo Animal, FMVZ USP, So Paulo SP, CEP 05508-000, Brasil.
Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan, Saskatoon, SK, Canada S7N
5B4. vetreis@usp.br

O presente experimento teve como objetivo verificar o efeito da administrao de Benzoato de estradiol
(BE) ou de Cipionato de estradiol (CE) como indutores de ovulao em dois momentos distintos no protocolo
de inseminao artificial em tempo fixo (IATF) a base de progesterona (P4). Foram utilizadas 47 vacas
Nelore lactantes (85,5 23,2 dias ps-parto) mantidas a pasto em Pindamonhangaba-SP. Os animais foram
divididos em 4 grupos experimentais (fatorial 2x2) de acordo com o perodo ps-parto e com a ciclicidade
ovariana avaliada por ultra-sonografia no dia de incio do tratamento (A - presena de CL; B - fol(s) 8mm;
C fol(s) < 8mm). Em dia aleatrio do ciclo estral (D0), os animais foram tratados com 2 mg de BE IM
(Estrogin, Farmavet) e com dispositivo intravaginal de progesterona (CIDR, Pfizer). No D8, os dispositivos
foram removidos e administrou-se 25 mg de Dinoprost IM (Lutalyse, Pfizer) e 400 UI de eCG IM
(Novormon, Syntex). O grupo CE0 (n=12) recebeu 0,5 mg de CE (ECP, Pfizer) no D8 (retirada do
dispositivo). O grupo CE24 (n=12) recebeu 0,5 mg de CE no D9 (24h aps a retirada do dispositivo). O
grupo BE0 (n=12) recebeu 1 mg de BE no D8. O grupo BE24 (n=11) recebeu 1 mg de BE no D9. A partir
do D8 procedeu-se a ultra-sonografia ovariana a cada 12h para determinar o momento da ovulao. No
D20, em todas as fmeas foi realizada colheita de sangue para dosagem da concentrao plasmtica de P4
e ultra-sonografia ovariana para determinao da rea do CL. Foram analisadas a taxa (TOV) e o momento
de ovulao (MOV), o dimetro mximo do folculo ovulatrio (DFO) e a rea do CL (ACL) em cada
grupo. Os resultados foram analisados pelo SAS for Windows. As mdias para os grupos CE0, CE24, BE0
e BE24 foram, respectivamente: TOV: 100,0 (12/12) vs. 91,7 (11/12) vs. 100,0 (12/12) vs. 100,0 % (11/
11, P>0,05); MOV: 80,0 4,8a,x vs. 85,1 4,4a,x vs. 68,0 1,7b,y vs. 75,3 1,7ab,y h (P<0,05; Teste de
Bartlett); DFO: 1,37 0,05a vs. 1,27 0,04ab vs. 1,23 0,03b vs. 1,39 0,05a mm (P<0,05); ACL: 3,23
0,24 vs. 2,77 0,23 vs. 2,90 0,27 vs. 3,04 0,27 cm2 (P>0,05). Os resultados indicam que o CE e o
BE proporcionam elevadas taxas de ovulao, independentemente do momento de aplicao no protocolo
de IATF. No entanto, o CE no sincroniza a ovulao em animais tratados com P4 para IATF.
Agradecimento: Pfizer

236

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

DINMICA FOLICULAR OVARIANA DA CABRA AVALIADA COM ULTRA-SOM


POR VIAS TRANSRETAL E TRANSVAGINAL
Tenrio Filho, F.1; Santos, M.H.B.1; Moraes, E.P.B.X.1; Rocha, J.M.1; Oliveira, L.R.S.2;
Oliveira, M.A.L.3; Lima, P.F.3
1

Programa de Ps-Graduao em Cincia Veterinria/UFRPE. 2Curso de Graduao em Medicina


Veterinria/UFRPE. 3Departamento de Medicina Veterinria/UFRPE malo@ufrpe.br

Este trabalho teve o objetivo de comparar a eficincia do transdutor linear utilizado por via transretal com a
do micro-convexo endocavitrio por via transvaginal para monitorar a dinmica folicular ovariana de seis
cabras da raa Anglo-Nubiana com idade entre 40 e 45 meses e peso de 35 a 40 Kg. Anteriormente ao
perodo experimental, as cabras foram observadas quanto a ciclicidade durante trs ciclos consecutivos.
Constatada a ovulao, as cabras continuaram sendo examinadas uma vez por dia com ambos os transdutores,
ressaltando-se que em dias alternados, iniciava-se o exame com um tipo de transdutor. Os resultados
demonstraram que as cabras apresentam um padro dominante de quatro ondas foliculares. No primeiro
ciclo, a emergncia ocorreu nos dias 1,0 0,0, 5,17 1,83, 10,63 3,49, 14,5 0,58 e no segundo
durante os dias 1,17 0,41, 5,33 0,82, 11,17 2,32, 16,5 1,73, no se registrando diferena (P > 0,05)
entre os ciclos. No primeiro ciclo, o intervalo entre as ondas foliculares foi de 4,17 1,83, 5,67 1,86, 5,33
1,21, 5,75 1,26 e no segundo foram de 4,17 0,75, 5,83 1,83, 7,17 1,72, 6,75 1,26, no se
registrando diferena (P > 0,05) entre os ciclos. Em ambos os ciclos estrais, o dimetro do folculo ovulatrio
das cabras que evidenciaram trs ondas foi de 5,4 0,8 mm e de 5,3 0,4 mm naquelas que exibiram quatro
ondas. No foi constatada diferena (P > 0,05) entre o tamanho dos folculos ovulatrios. Os resultados
permitem concluir que o padro de crescimento folicular na cabra no varia de acordo com o ciclo estral,
bem como comentar que o transdutor micro-convexo endocavitrio provoca menor estresse ao animal,
favorece uma rpida visualizao dos ovrios e produz imagens de qualidade superior ao transdutor linear.

237

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

SINCRONIZAO DE ESTRO EM CABRAS TOGGENBURG DURANTE A


ESTAO DE ACASALAMENTO*
Fonseca, J.F.1; Bruschi, J.H.2; Santos, A.F.A.3; Maffili, V.V.3; Moraes, E.A.3;
Pontes, R.A.3; Prosperi, C.P.3
1

Embrapa Caprinos, Estrada Sobral/Groaras, Km 4, CP D10, Cep 62.011-000, Sobral-CE, Brasil,


jeferson@cnpc.embrapa.br. 2Embrapa Gado de Leite, Rodovia MG 133, Km 42, 36.155-000, Cel
Pacheco-MG, Brasil. 3Departamento de Zootecnia, Universidade Federal de Viosa, Av. P.H. Rolfs, s/n,
Brasil, 36.571-000.
O objetivo deste estudo foi testar a eficincia de dois protocolos de sincronizao de estro em cabras
Toggenbur durante a esta co de acasalamento. Foram utilizadas 30 cabras divididas aleatoriamente entre
dois tratamentos (T1 e T2) que receberam dispositivo intravaginal (CIDR) removido seis dias depois. Os
animais receberam uma dose de 22,5 g cloprostenol subvulvar no dia da insero (T1, n=15) ou 24 horas
antes da remoo do dispositivo (T2, n=15). Aps a detecto de estro, os animais foram acasalados com
machos frteis (T1=6 e T2=7) ou artificialmente inseminados (T1=8 e T2=7). A percentagem de animais em
estro foi a mesma para T1 e T2 (93,3%). O intervalo da retirada do dispositivo ao incio do estro no diferiu
(P>0,05) entre T1 (40,312,0h) e T2 (41,19,3h). A durao do estro no foi afetada (P>0,05) por T1
(43,613,4h) ou T2 (37,913,2h). A durao do estro no diferiu (P>0,05) entre acasalamento natural
(36,510,4h) e inseminao artificialor (44,314,9h) e no houve interao (P>0,05) entre tratamentos e
tipo de acasalamento. A taxa de gestao no diferiu (P>0,05) entre T1 (64,3%) e T2 (64,3%) ou acasalamento
natural (64,3%) e inseminao artificial (64,3%). Durante a estao de acasalamento natural, o estro pose
ser eficientemente sincronizado em cabras Toggenburg lactantes pela implantao de dispositivo intravaginal
e administrao de cloprostenol, independente do momento da aplicao de cloprostenol e uma boa fertilidade
pode ser alcanada tanto pelo acasalamento natural quanto pela inseminao artificial.
*Apoio financeiro: CNPq, FAPEMIG and Pfizer Sade Animal.

238

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

g) ADMIINSTRADO NO PONTO
BAIXA DOSE DE DL-CLOPROSTENOL (50
DE ACUPUNTURA BAI-HUI EM BFALAS
Teixeira, A.B.; DellAqua Jr., J.A.; Joaquim, J.G.F.; Siqueira-Pyles, E.S.C.; Zahn, F.S.;
Carvalho, F.A.; Azevedo, H.C.; Leo, K.M.; Nogueira, M.F.G.; Oba, E.
Depto de Reproduo Animal, FMVZ, UNESP, Botucatu, SP, Brasil;
A prostaglandina F2 (PGF) normalmente induz lutelise em vacas e bfalas quando administrada por via
intramuscular (IM). A utilizao de menores doses de PGF ( ou ) por via subcutnea ou submucosa
intravulvar comparadas dose normalmente utilizada por via IM foi descrita para induzir a lutelise e
conseqentemente o estro nesses animais. O ponto de acupuntura BAI-HUI (BH; localizado no espao
lombo-sacro, entre o processo espinhoso da 5 vrtebra lombar e 1 vrtebra sacral) foi descrito como uma
via alternativa para o uso de PGF em guas e vacas, contudo no foram encontrados trabalhos, na literatura
consultada, sobre a utilizao dessa via para administrao de PGF em bfalas. O objetivo desse trabalho foi
avaliar o efeito luteolco induzido por um dcimo da dose de dl-cloprostenol (normalmente utilizada por via
IM para induzir lutelise) administrado no ponto de acupuntura BAI-HUI ou por via intramuscular. Para
tanto, vinte bfalas mestias Murrah foram selecionadas por meio de ultra-sonografia trans-retal e sincronizadas
utilizando o protocolo: GnRH (acetato de buserelina1, 8 g, IM, d0), PGF (dl-cloprostenol2, 500 g, IM,
d7) e GnRH (d9). Doze dias aps a segunda aplicao de GnRH, os animais foram divididos em 3 grupos
que receberam: G1 (n=5) - 2mL de gua destilada no BH, G2 (n=6) - 50 g de dl-cloprostenol diludos em
2mL de gua destilada por via IM e G3 (n=7) - 50g de dl-cloprostenol diludos em 2mL de gua destilada
no BH. Amostras de sangue foram colhidas para posterior determinao da concentrao plasmtica de
progesterona pelo mtodo de radioimunoensaio. Aps a anlise, dois animais foram descartados por
apresentarem concentraes plasmticas menores que 1 ng/mL em suas amostras durante todo o perodo
experimental. Os dezoito animais restantes sofreram lutelise 48 h aps a administrao de 500 g de dlcloprostenol do protocolo de sincronizao, demonstrando o efeito luteoltico da PGF nesses animais. A
lutelise induzida foi utilizada como controle positivo nos grupos, sendo que a concentrao plasmtica de
progesterona antes e 48 h aps a administrao de PGF foi de 4,200,53 e 0,150,04 ng/mL (EPM),
respectivamente. Aps a sincronizao nenhum dos animais que receberam gua destilada (G1) sofreram
lutelise, contudo alguns animais no G2 (2/6, 33%) e G3 (3/7, 42%) sofreram lutelise (p>0,05, Teste Exato
de Fisher). A concentrao plasmtica de progesterona dos animais que sofreram lutelise antes e 48 h aps
a administrao de 50 g de dl-cloprostenol foi de 3,530,33 e 0,120,11 (G2, IM) e 3,340,58 e 0,110,01
ng/mL (G3, BH), respectivamente. Esses resultados sugerem que a eficcia da baixa dose de dl-cloprostenol
na induo da lutelise em bfalas no foi dependente da via de administrao uma vez que alguns animais
sofreram lutelise em ambos os grupos G2 (IM) e G3 (BH), por outro lado o efeito luteoltico induzido pela
da baixa dose de dl-cloprostenol foi mais dependente da sensibilidade individual dos animais que sofreram
lutelise.
Financiado pela FAPESP, Brasil.
1.
2.

Conceptal - Intervet, So Paulo - Brasil


Ciosin - Schering-Plough Coopers, So Paulo Brasil
239

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

EFEITOS DA SUPLEMENTAO ORAL COM TAURINA NO DESEMPENHO


REPRODUTIVO DE GATAS DOMSTICAS
Moreira, C.F.1; Jacomini, J.O.1; Antnio, F.I.1
1

Faculdade de Medicina Veterinria da Universidade Federal de Uberlndia - UFU. Avenida Par


1720, Bairro Jardim Umuarama, Uberlndia MG, cep 30408-283. jojacomini@ufu.br.

A importncia da taurina, um aminocido essencial para os gatos, vem recebendo grande ateno nos ltimos
anos, principalmente no que se refere aos efeitos da sua insuficincia diettica. Com a descoberta de que a
miocardiopatia dilatada, uma patologia causada pela carncia de taurina, poderia ser totalmente revertida
com a suplementao desse aminocido, houve um grande reforo das dietas comerciais para gatos com o
mesmo. No entanto, poucos estudos foram realizados para se analisar os efeitos, em longo prazo, da
suplementao de taurina nos diversos sistemas corpreos, principalmente no desempenho reprodutivo. O
objetivo deste trabalho foi determinar os efeitos da adio de taurina no desempenho reprodutivo de gatas
domsticas. Gatas adultas clinicamente saudveis foram divididas em dois grupos de 8 animais, onde ambos
receberam a mesma dieta comercial seca e um dos grupos recebeu diariamente a suplementao oral de
192mg de taurina, durante quatro meses. Aps esse perodo, todas as gatas copularam com gatos frteis e
foram ovariohisterectomizadas no oitavo dia ps-cpula, quando foram realizadas a coleta dos embries e a
preparao histolgica dos ovrios para observao em microscopia de luz, quantificando-se os folculos
ovarianos. As diferenas entre os nmeros de corpos lteos, folculos primordiais, primrios, secundrios e
tercirios por rea (mm2) de tecido cortical ovariano e o nmero de embries foram comparadas pelo teste
t de Student. Os valores mdios e o desvio padro para essas variveis no grupo controle foram de 2,191,22;
10,565,86; 1,682,26; 0,600,44; 0,731,19; 1,830,98, respectivamente. No grupo que recebeu a
taurina, esses valores foram 2,131,13; 10,468,87; 1,470,90; 0,380,17; 0,550,39; 3,671,63,
respectivamente. O nmero de embries foi estatisticamente maior no grupo que recebeu a taurina, no entanto,
nenhuma outra varivel estudada foi estatisticamente significativa. A suplementao da dieta comercial para
gatos com taurina, em longo prazo, no afetou o ganho de peso, apetite, comportamento e ciclo estral das
gatas. O desempenho reprodutivo foi melhor nas fmeas suplementadas com taurina, que apresentaram
maior nmero de embries e com a mesma qualidade do outro grupo. Esses resultados indicam que o uso da
suplementao oral de taurina pode representar uma alternativa para melhorar o desempenho reprodutivo de
felinos selvagens em risco de extino mantidos em cativeiros.

240

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

AVALIAO DO DIAGNSTICO PRECOCE DA GESTAO EM CABRAS


MESTIAS ATRAVS DE ULTRA-SONOGRAFIA TRANS-RETAL
Cavalcante, P.V.T.H.; Solano, R.F. ; Zaynette, F.T.; Moaraes Jr., F.J.; Solano, G.O.
Laboratorio de Biotecnologia da Reproduo Animal; Universidade Estadual do Maranho (UEMA),
Cidade Universitria Paulo VI, So Lus-MA, CEP. 65700-000, Brasil. paulovictor.medvet@ig.com.br
Atualmente vem-se necessitando de um diagnstico de gestao em estgios prvios devido as grandes
incertezas ocasionadas com a m deteco de das gestaes. A ultra-sonografia foi o mtodo de eleio a
ser trabalhado, pois detecta a prenhez em seus primrdios e em nveis de segurana confiveis. O objetivo do
presente trabalho foi predizer o momento timo para realizar o diagnstico de gestao em fmeas caprinas
mestias atravs do exame ultra-sonogrfico (ALOKA, 580) via trans-retal; com transdutor de 7 MHz
acoplado a um adaptador de policlorito de vinilo (PVC) para facilitar a manipulao, aps a inseminao
artificial (IA) ou monta controlada (MC). Foram avaliadas 125 cabras, examinadas entre os dias 25; 30 e 35
aps a IA ou MC. Os resultados obtidos foram aplicados no teste do Qui X. a presena de gestao foi de
28,9 % (11 / 38) com diagnstico de prenhez positivo aos 25 dias, 73,1 % (30 / 41) aos 30 dias e 78,2 %
(36 / 46) aos 35 dias. Entretanto os percentuais de falsos negativos foram de 52,5 %; 19,5 % e 21,7 % aos
25; 30 e 35 dias respectivamente. O diagnstico de gestao aos 25 dias foi significativamente menor (P <
0,5) quando comparado com o diagnstico aos 30 e 35 dias. Das 125 cabras avaliadas 76 % (12 / 95)
chegaram ao parto. Conclui-se que o diagnstico de gestao em fmea caprina atravs de ultra-sonografia
trans-retal pode-se determinar com segurana a partir de 30 dias aps a concepo, por isso a tcnica
exeqvel tanto em fazendas como em centrais de IA.

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

TAXA DE PRENHEZ, EM VACAS NELORE, APS REMOO TEMPORRIA DE


BEZERROS (RTB) E UTILIZAO DE PROTOCOLOS HORMONAIS COM eCG.
Souza, A.F.; Pinheiro, V.G.; Ereno, R.L.; Barros, C.M.
Departamento de Farmacologia, Instituto de Biocincias, UNESP, Botucatu - SP
Tanto a RTB quanto a aplicao de eCG so potencialmente teis para melhorar a taxa de prenhez de
animais submetidos a tratamentos hormonais para IA com tempo fixo (IATF). Neste trabalho foram realizados
dois experimentos para comparar a eficincia da aplicao do eCG e/ou da RTB em protocolos para IATF,
com ou sem progesterona exgena. No experimento 1, vacas Nelore lactantes (40 a 70d ps-parto, n=148)
foram divididas em 2 Grupos. Em estgio aleatrio do ciclo estral (D0), os animais do Grupo GPE/eCG
foram tratados com GnRH (50 g de licerelina, via IM, Gestran Plus) e sete dias mais tarde (D7) receberam
uma aplicao de PGF2 (150 g de d-cloprostenol, via IM, Prolise) e outra de eCG (300 UI, via IM,
Novormon). No D8, administrou-se benzoato de estradiol (BE, 1mg, Estrogin) e 30-36h mais tarde os
animais foram inseminados (IATF). No Grupo DIB/eCG as vacas receberam, um dispositivo intravaginal
contendo progesterona (1,0 g, DIB, D0) e BE (2,5 mg, IM). Oito dias mais tarde (D8) administrou-se
gonadotrofina corinica equina (eGC, 300 UI, via IM, Novormon) e dl-cloprostenol (150 g), e o DIB foi
removido. Vinte e quatro horas aps a remoo do DIB as vacas foram tratadas com BE (1,0 mg, IM) e 3036 h depois os animais foram inseminados (IATF). Em todos os experimentos, inclusive nos descritos abaixo,
foi realizado exame ultra-sonogrfico dos ovrios, dez dias antes e no dia do incio dos tratamentos hormonais
ou RTB, com a finalidade de determinar a presena de CL. As vacas do Grupo DIB/eCG apresentaram taxa
de prenhez (57,7%, 45/78) mais elevada do que as do grupo GPE/eCG (37,1%, 26/70, p<0,01). Alm
disso, apenas no Grupo GPE/eCG, a taxa de prenhez foi superior nos animais com CL (50%, 16/32) quando
comparados aos sem CL (26,3%, 10/38, p<0,03). No Experimento 2, testou-se o possvel efeito benfico
da remoo temporria de bezerros (RTB) no protocolo GPE/eCG, em vacas Nelore lactantes (40 a 70d
ps-parto, n=140). Os animais do Grupo GPE/eCG (controle) foram tratados de acordo com o descrito no
experimento 1, enquanto que no Grupo RTB/GPE/eCG os bezerros foram removidos das vacas durante 48
h antes do incio dos tratamentos. As vacas lactantes, nas quais realizou-se RTB, apresentaram aumento
significativo na taxa de prenhez, quando comparadas s do grupo sem RTB (51,2%, 34/66 vs 28,4%, 21/74,
respectivamente, p<0,01), tanto em animais com CL (54,8%, 17/31 vs 33,3%, 11/33) quanto sem CL
(48,5%, 17/35 vs 24,3%, 10/41). Concluindo, os resultados indicam que a simples adio de eCG, ao
protocolo GPE, no foi suficiente para produzir resultados semelhantes aos obtidos com o tratamento DIB/
eCG (Experimento 1). Entretanto, a RTB antes do protocolo GPE/eCG, promoveu aumento significativo na
taxa de prenhez de animais ciclando ou em anestro (sem CL, Experimento 2).

242

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

DIAGNSTICO ULTRA-SONOGRFICO DE GESTAO EM OVELHAS


UTILIZANDO AS VIAS TRANSRETAL E TRANSVAGINAL
Santos, M.H.B.1; Moraes, E.P.B.X.1; Guido, S.I.1; Lima-Verde, I.B.1; Rocha, J.M.1;
Bezerra, F.Q.G.2; Iunes-Souza, T.C.2; Oliveira, M.A.L.3; Lima, P.F.3
1

Programa de Ps-Graduao em Cincia Veterinria/UFRPE. 2Curso de Graduao em Medicina


Veterinria/UFRPE. 3Departamento de Medicina Veterinria/UFRPE (maloufrpe@uol.com.br)

O presente estudo teve a finalidade de comparar a viabilidade dos transdutores micro-convexo (5,0 e 7,5
MHz) por via transvaginal e linear (6,0 e 8,0 MHz) por via transretal no diagnstico gestacional de 246
ovelhas da raa Santa Ins. O tempo dispensado para a realizao de cada exame foi de 3,152,46 minutos
com o transdutor linear e de 3,222,95 minutos com o transdutor micro-convexo. Ambos os transdutores
mostraram-se eficientes para diagnosticar a gestao entre o 28 e o 41 dia, ressaltando-se que a imagem
do transdutor micro-convexo foi de melhor resoluo. A partir do 70 dia de prenhez, a utilizao do transdutor
micro-convexo por via transvaginal foi menos eficaz devido ao tero estar projetando-se em direo a cavidade
abdominal e no permitir que as ondas ultra-snicas atingissem o alvo desejado. Aps o 90 dia de prenhez,
o transdutor linear mostrou-se ineficiente devido profundidade em que se encontrava o feto. No que concerne
ao bem estar animal, ficou evidente que o transdutor micro-convexo proporcionou menor desconforto s
fmeas, alm de no ter provocado nenhum processo infeccioso no trato reprodutivo. Foi constatado que
nas fmeas obesas, o exame por via transretal torna-se mais difcil, sendo indicado, nestas ocasies, o exame
pela via transvaginal em funo da localizao do transdutor. Das 246 ovelhas examinadas, 126 (51,22%)
encontravam-se entre o 28 e 41 dia de prenhez, 69 (28,04%) com prenhez variando do 60 ao 75 dia, 27
(10,98%) no 90 dia de gestao, 18 (7,32%) no se encontravam gestantes e em 6 (2,44%) animais no foi
possvel emitir o diagnstico de gestao devido obesidade. As observaes aqui registradas permitem
concluir que ambas as vias so eficientes para diagnosticar precocemente a prenhez de ovelhas da raa Santa
Ins.

243

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

ASSOCIAO DO DIAGNSTICO PRECOCE DE PRENHEZ A RESINCRONIZAO


DO ESTRO EM VACAS ZEBUNAS
Freitas, D.S.1; Portela, A.P.M.1; Almeida, A.K.1; Bittencourt, R.F.1; Gonzles, S.G.1;
Gusmo, A.L.1; Chalhoub, M.1; Ribeiro Filho, A. de L.1
1

Laboratrio de Embriologia Departamento de Patologia e Clnicas EMV / UFBA, Salvador BA,


Brasil. alisboa@ufba.br

Atualmente, a obteno de taxas de concepo aceitveis aps o uso de protocolos de sincronizao do


estro e da ovulao para inseminao artificial em tempo fixo uma realidade. Entretanto, nem todas as
vacas sincronizadas tornam-se prenhes. Desta forma, a dificuldade da deteco do estro e portanto a diminuio
da taxa de servio reaparecer na medida em que as vacas no prenhes tiverem que ser re-inseminadas. No
intuito de proporcionar uma segunda oportunidade quelas vacas que no conceberam aps a inseminao
em tempo fixo, Ribeiro Filho et al. (Rev. Bras. Reprod. Anim., v. 25, p. 326-327, 2001) resincronizaram
vacas zebunas e alcanaram taxa de prenhez acumulada de 67,86%. Esse protocolo durou 35 dias e para
obteno dessa taxa esses autores tiveram que detectar estro por trs dias. Sendo assim, o propsito deste
estudo foi desenvolver uma estratgia de resincronizao que no utilize observao do estro de retorno e
obtenha uma taxa de servio de 100% para aquelas vacas que ficaram vazias aps a primeira IA em tempo
fixo. Desta forma, 40 vacas da raa Tabapu, receberam Dia 0 um dispositivo intravaginal contendo 1,9g de
progesterona e 2mg de Benzoato de Estradiol (BE) IM. No Dia 8 os dispositivos foram retirados e os
animais tratados com 75mg de D+Cloprostenol via submucosa-intravulvar (SIV) juntamente com 200UI de
eCG IM. No Dia 9 foi aplicado 1mg de BE IM e no Dia 10, cerca de 52 a 56 horas aps a retirada dos
dispositivos, foi realizada a inseminao artificial em tempo fixo. Doze dias aps as inseminaes (Dia 22),
metade dos animais, tiveram os implantes de progesterona reinseridos e receberam 1mg de BE IM. No Dia
30, os dispositivos foram retirados e as vacas diagnosticadas como vazias por meio de ultrassonografia
transretal, receberam 75mg de D+Cloprostenol via SIV e 200UI de eCG IM, no Dia 31 esses mesmos
animais foram tratados com 1mg de BE IM e inseminados em tempo fixo no Dia 32. O diagnstico de
gestao das vacas que no foram resincronizadas e dos animais que foram submetidos a uma segunda IA foi
realizado no Dia 62, 52 e 30 dias aps as respectivas inseminaes. Para se comparar a taxa de prenhez
entre os grupos experimentais, utilizou-se um estudo de disperso de freqncias, e para tanto se empregou
o teste de Qui-quadrado (2). As taxas de prenhes dos animais no resincronizados e dos submetidos
resincronizao foram de respectivamente, 50 e 75% e no houve diferena estatstica entre as mesmas.
Apesar deste resultado, a resincronizao elevou a taxa de prenhez em 50% e conseguiu em um perodo de
32 dias sem necessidade de deteco de estro dar duas oportunidades de inseminao para todas as vacas.

244

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

AVALIAO DA VIABILIDADE TCNICA DE PARTOS GEMELARES EM


BOVINOS DE CORTE NO PLANALTO CENTRAL
Lucas, L.A.1,2; Pimentel, C.M.1; Pivato, I.3; Rumpf, R.2
1

Universidade de BrasliaUnB/ Faculdade de Agronomia e Medicina VeterinriaFAV, 70910-900,


Braslia-DF, Brasil; 2 EMBRAPA Recursos Genticos e Biotecnologia, Parque Estao Biolgica, 70770900, Braslia-DF, Brasil.; 3Companhia Integrada de Desenvolvimento Agropecurio de Santa Catarina/
CIDASC. leolucas@hotmail.com
Os ndices zootcnicos da pecuria de corte nacional que ainda so baixos, podem ser melhorados pela
incorporao de novas tecnologias nos sistemas atuais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade
tcnica de produzir bezerros oriundos de partos gemelares, em sistema de criao extensiva. Foram utilizadas
117 vacas meio sangue Simental x Nelore, sendo que no tratamento 1 (T1-controle), 60 vacas foram
inseminadas (I.A.) com smen de touro da raa Guzer, enquanto que no tratamento 2 (T2) 57 vacas foram
inseminadas, e 6 a 9 dias aps a I.A. foram inovuladas no corno contralateral. Foram utilizados embries
criopreservados em etilenoglicol de doadoras meio sangue Simental x Nelore inseminadas com smen do
mesmo touro usado na I.A. de T1 e T2. Ao exame ultra-sonogrfico de gestao 35 a 45 dias aps I.A.
obteve-se 86,7% (n=52) de prenhez em T1 e 77,19% (n=44) em T2, sendo que 56,8% (n=25) das gestaes
eram gemelares bilaterais. O perodo mdio das gestaes gemelares foi de 289 dias e de 294 dias para as
gestaes simples do T1 e T2. Todos os partos foram normais. A taxa de natalidade em T1 foi de 81,7%. J
em T2 foi de 87,7%, porm a taxa de gemelaridade foi de apenas 48% sobre as 25 gestaes gemelares
diagnosticadas inicialmente por ultra-sonografia. A percentagem de aborto observada em T1 foi de 5,00%
(n=3) e em T2 foi de 12,28% (n=7), p > 0,05. O peso mdio ao nascimento foi em T1 33,38 kg e em T2 foi
de 36,40 kg e 24,27kg para partos simples e gemelares respectivamente (p< 0,0001). Aos noventa dias o
peso mdio dos bezerros do T1 foi de 111,21kg, no T2 parto simples foi de 124,64kg e o peso mdio dos
gmeos foi de 93,31kg, (p< 0,0001). Embora exista viabilidade tcnica para a produo de gmeos em
bovinos de corte, questes bsicas relativas as perdas fetais/abortos e de manejo das vacas gestantes, bem
como a relao custo/benefcio, devem ser melhor estudadas para emprego desta tecnologia no setor produtivo.
Agradecimentos: Fazenda Sanga Puit, Fazenda Santa Amlia, Integral Nutrio Animal.

245

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

NDICE DE AUTORES
A
Adania, C.H. ......................................................... 178
Aguiar Filho, C.R. ................................................. 123
Aguilar, A.P. .......................................................... 144
Alberti, K. ............................................................. 176
Alfieri, A.A. .......................................................... 134
Almeida, A.K. ....................... 167; 180; 203; 207; 244
Almeida, K.C. ....................................................... 205
Alvarenga, M.A. 89; 101; 170; 173; 209;210; 211; 212
Alvarez, R.H. ........................................................ 107
Alves, J.R. ............................................................ 123
Alves, S.G.G. ........................................ 167; 180; 203
Alvin, M.T.T. ......................................................... 214
Amaral, J.B. .......................................................... 194
Amarante, M. ....................................................... 109
Ambrsio, C.E. ..................................................... 151
Amorim, L.L. .......................................................... 99
Ancioto, K.L. ................................................. 114; 118
Andrade Moura, J.C. .............................................. 90
Andrade, E.R. ............................................... 134; 186
Andrade, J.C.O. .................................................... 185
Andrade, P.B. ....................................................... 138
Antnio, F.I. ......................................................... 240;
Antoniolli, C.B. ...................................................... 143
Arashiro, E.K.N. ................................... 160; 187; 193
Arajo, E.B. .......................................................... 174
Araujo, M.C.C. ....................................................... 87
Arajo, S.S. ........................................................... 123
Arruda, I.J. ............................................................ 205
Assis Neto, A.C. ........................................... 151; 153
Assumpo, M.E.O.A. ................. 131; 141; 148; 157
Athayde, C.S. ............................................... 125; 126
vila, F.F. .............................................................. 140
Ayres, H. ................161; 219; 220; 221; 222; 223; 227
Azevedo, H.C. ...................................................... 239
Azevedo, N.A. ...................................................... 215
B
Bacelar, F.H. ................................................. 201; 202
Balla, E. ........................................................ 224; 225
Barioni, L.G. ......................................................... 100
Barreiros, T.R.R. .................................................. 195
Barreta, M. ........................................................... 164
Barreto Filho, J.B. ................................................... 87
Barretto, L.S.S. ...................................... 108; 110; 111
Barros, C.M. ... 23; 115; 139; 169; 191; 196; 206; 208;
218; 242
Bartolomeu, C.C. .................................................. 122
Baruselli, P.S. ..... 1; 88; 161; 198; 219; 220; 221; 222;
223; 226; 227; 228; 229; 232; 235; 236
Batalha, L.M. ................................................ 181; 182
Beleti, M.E. ........................................................... 179
246

Belisario, H.L.R. .................................................. 214


Beltrame, R.T. ............................................. 100; 199
Bernardi, M.L. ..................................................... 119
Bersano, J.G. ....................................................... 125
Bertolla, R.P. ........................................................ 111
Bezerra, F.Q.G. ................................................... 243
Biase, F.H. ................................................... 103; 104
Biondi, F.C. .......................................................... 109
Biscarde, C.E.A. .................................................. 180
Bittencourt, R.F. ................... 167; 180; 203; 207; 244
Bittencourt, V.L. .................................................. 155
Blaschi, W. ........................................................... 186
B, G.A. ................... 1; 161; 219; 224; 225; 226; 232
Bordignon, J. ........................................................ 166
Borsato, E.A. ....................................................... 195
Boselli, C.C. ......................................................... 134
Braga, F.C. ................................................... 151; 152
Brando, D.O. ............................................. 124; 127
Brum, D.S. ................................................... 119; 172
Bruschi, J.H. ........................................................ 238
Buitkamp, J. ......................................................... 133
Buratini Jr., J. ....................................... 138; 139; 196
C
Caetano, A.R. ...................................................... 103
Caetano, H.V.A. .................................. 141; 147; 148
Calegari, R.S. ......................................................... 92
Callesen, H. ......................................................... 124
Camargo, L.S.A. .................................... 87; 128, 183
Cao, M. ................................................................ 138
Capezzuto, A. ...................................................... 129
Carambula, S.F. ................................................... 113
Carelli, J.B. .......................................................... 137
Carmo M.T. ......................................... 176; 209; 210
Carter, A.M. ........................................................ 151
Carter, J.A. .................................................. 201; 202
Carvalho, A.F. .............................................. 151; 152
Carvalho, C.S.P. ................................................... 174
Carvalho, F.A. ...................................................... 239
Carvalho, J.B.P. ................................................... 236
Carvalho, J.F. ............................................... 125; 126
Carvalho, L.M. ..................................................... 208
Carvalho, N.A.T. ................................................... 88
Castilho, A.C.S. ................................................... 138
Castro, F.O. ......................................................... 144
Castro, R.P.R. ...................................................... 200
Cavalca, L.G. ....................................................... 199
Cavalcante, P.V.T.H. ........................................... 241
Cavalcanti Neto, C.C. ............................ 93; 121; 122
Cavalieri, F.B. ...................................................... 188
Celestino, J.J.H. ................................... 135; 136; 163
Chalhoub, M. .................. 90; 167; 180; 203; 207; 244

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

Chirinea, V.H. ...................................................... 178


Chow, L.A. .......................................................... 156
Cledou, G. ............................................................ 224
Cordeiro Jr., F. ..................................................... 101
Cordeiro M.S. ...................................................... 109
Cortez, C. ............................................................. 132
Cortezzi, S.S. ......................................... 103; 104; 117
Costa e Silva, E.V. ............................................... 177
Costa E.P. ............................................................ 155
Costa Neto, W.P. ................................................... 88
Costa, A.C. .......................................................... 200
Costa, I.B. ............................................................ 139
Costa, L.F.S. ......................................................... 112
Costa, P.F. ............................................................ 146
Costa, S.H.F. ...........................................91; 135; 163
Coutinho da Silva, M.A. ......................................... 55
Coutinho, A.R.S. .................................................. 157
Cruz, F.B. ............................................................. 164
Cucco, D. ............................................................. 164
Cunha, G.N. ......................................................... 230
Cunha, I.C.N. ...................................................... 174
Cutaia, L. ................................................................. 1
D
DAngelo, M. ................................................ 125; 126
Dagli, M.L.Z. ....................................................... 157
Dantzer V. ............................................................ 154
De Armas, R,T. ................................................... 144
DellAqua Jr., J.A. ........................................176; 239
dePaula, F.A.L. .................................................... 177
Deschamps, J.C. .................................................. 166
Detmann, E. ......................................................... 174
Detoni, A.L. ......................................................... 199
Dias, A.J.B. ..................................................165; 216
Diniz, E.G. ...............................................99; 179; 230
Dode, M.A.N. ....................................... 102; 127; 184
Duarte, R.A. ........................................................ 226
E
Eberhardt, B.G. ..................................... 115; 179; 208
Emanuelli, I.P. .............................................. 103; 117;
Ereno Jr., J.C. ................................................ 95; 186
Ereno, R.L. .................................................... 23; 242
Esper, C.R. ........................................................... 168
F
Fagundes, B. ........................................................ 174
Farias Jnior, N.A. ............................................... 192
Feitosa, W.B. ....................................................... 148
Feltrin, C. ............................................................. 143
Fernandes C.A.C. . 155; 158; 159; 187; 189; 190; 197
Fernandes, C.B. .................... 101; 162; 175; 211; 212
Ferreira, A.B.C. ................................................... 180
Ferreira, A.M. ................................. 87; 128; 183; 187
Ferreira, C.R. ....................................................... 146

Ferreira, C.S. ....................................................... 177


Ferreira, F.V.A. .................................................... 136
Ferreira, J.C.P. ...................................... 231; 233; 234
Ferreira, M.B.D. .................................................. 215
Ferreira, M.M.G. .......................................... 191; 206
Fialho, S.S. ............................................................ 119
Figueiredo, A.C.S. ........................ 158; 159; 189; 190
Figueiredo, J.R. ............................... 91; 135; 136; 163
Fonseca, J.F. ......................................... 187; 193; 238
Fontes, R.S. .................................. 132; 133; 199; 216
Forell, F. ............................................................... 143
Franco, M.M. ....................................................... 140
Freitas, C. ............................................. 160; 193; 215
Freitas, C.P. ........................................................... 92
Freitas, D.S. .......................... 167; 180; 203; 207; 244
Freitas, V.J.F. ....................................................... 205
G
Gabaldi, S.H. .................................................145; 168
Galuppo, A.G. ................................................ 51; 125
Garcia, J.F. ........................................................... 149
Garcia, J.M. .......................... 114; 145; 146; 151; 153
Garcia, P.H. ......................................................... 171
Gerger, R.P.C. ............................................... 116; 130
Gimenes, L.U. ...................................................... 236
Giometti, I.C. ........................................................ 139
Gioso, M.M. .................... 89; 155; 158; 159; 233; 234
Goldschmidt, B. .................................................... 137
Gomes, G.M. ........................................................ 170
Gonalves, J.S.A. ................................................ 131
Gonalves, P.B.D. ................................................. 112
Gonzles, S.G. ...................................................... 244
Gordiano, H. ........................................................... 90
Greatti, T.A.P. ...................................................... 233
Greatti,T. .............................................................. 234
Grisolia, A.B. ....................................................... 149
Guido, S.I. .....................................................185; 243
Guimares J.D. .................................................... 155
Gusmo, A.L. ................................................ 90; 244
H
Hamlett, W.C. ...................................................... 152
I
Iguma, L.T. ...................................................140; 151
Iunes-Souza, T.C. .........................................122; 243
J
Jacob, J.C.F. ........................................................ 170
Jacob, M. ............................................................. 213
Jacomini, J.O. .........................................99; 230; 240
Jaliba, W.P. ........................................................... 214
Joaquim, J.G.F. ..................................................... 239

247

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

K
Karpinzaiki, C.R.L. ............................................... 115
Kfoury, Jr., J.R. ..................................... 150; 151; 152
Kohayagawa, A. .................................................. 152
Kozicki, L.E. ........................................................ 226
L
Landim-Alvarenga, F.C. 94; 101; 162; 175; 210; 211;
212
Lara, C.S. ............................................................ 213
Laufer Amorim, R. .......................................181; 231
Leal, C.L.V. ......................................................... 142
Leal, L.S. ............................................................. 197
Leo, K.M. ........................................... 170; 173; 239
Leiser, R. .............................................................. 151
Leivas, F.G. ................................................... 119; 172
Lima P.F. .............................................................. 121
Lima, F.S. ............................................................. 171
Lima, I.M.T. ......................................................... 205
Lima, P.F. ........................................ 93; 123; 237; 243
Lima-Verde, I.B. .....................................93; 122; 243
Lo Turco, E.G. ...................................................... 111
Lopes, B.C. .......................................................... 215
Lopes, C.R. .......................................................... 149
Lopes, M.D. ......................................................... 178
Lopes-Jnior, E.S. ................................................ 205
Loureiro, B. ...................................................121; 122
Lucas, L.A. .......................................................... 245
Lucci, C.M. ............................................................ 91
Lucia Jr., T. .......................................................... 166
Lucio, C.F. ........................................................... 131
Ludwig Jr., H.E. ................................................... 195
M
Macedo Jr., M.M. ................................................ 166
Macedo, L.P. ........................................................ 170
Machado M.S. ..................................................... 209
Machado, E.A. ..................................................... 192
Machado, M.A. ................................................... 183
Maciel, A.B.B. ..................................................... 217
Madureira, E.H. ............ 220; 221; 223; 227; 228; 235
Maffili, V.V. ......................................................... 238
Maia, E.L.M.M. ................................................... 205
Mancilha, R.F. ...................................................... 227
Mantovani, A.P. ............................................229; 232
Mapletoft, R.J. ..............................................222; 236
Maraa Pea, D. ................................................. 224
Marques, D.M. .................................................... 137
Marques, M.G. ...................................... 116; 117; 130
Marques, M.O. 88; 120; 195; 221; 222; 228; 229; 236
Martelli, L. ........................................................... 104
Martin, I. ............................................... 231; 233; 234
Martinez, A.C. ..................................................... 107
Martins Jnior, A. .................................................. 92
248

Martins, C.F. ........................................................ 102


Martins, F.S. .......................................... 135; 136; 163
Martins, L. ........................................................... 148
Martins, L.P. .......................................................... 90
Martins, M.I.M. ................................................... 178
Martins, R.P. ........................................................ 165
Matos, L.F. ............................................ 132; 133; 216
Matos, M.H.T. ...................................... 135; 136; 163
Matos, S.P.M. ...................................................... 213
Medina, M. ............................................................. 65
Meirelles, F.V. 103; 104; 107; 113; 117; 129; 142; 150
Mello, J.E. ............................................................ 227
Mello, M.B. .......................................................... 151
Melo, A.N. ........................................................... 123
Melo, D.S. ............................................. 191; 206; 208
Melo, E.O. ........................................................... 140
Melo, G.M. ....................................................125; 126
Melo, L.F. ............................................................ 184
Mendes, C.M. ...................................................... 157
Mendona, A.L.Z. ............................................... 176
Meneses, M.A. .................................................... 167
Mo, S.C. ............................................................. 146
Merighe, G.K.F. ............ 103; 104; 113; 117; 129; 142
Mesquita, L.G. ...................................... 103; 113; 117
Mezzalira, A. .................................................. 81; 164
Mezzalira, J.C. ..................................................... 164
Miglino, M.A. .......................... 75; 151; 152; 153; 154
Milazzotto, M.P. .................................... 141; 147; 148
Mingoti, G.Z. .................. 104; 108; 110; 111; 114; 118
Miranda, M.S. ...................................................... 109
Monteiro, A.B.S. .................................................. 200
Monteiro, F.M. ..............................................191; 208
Moraes Jr., F.J. .................................................... 241
Moraes, E.P.B.X. .......................................... 237; 243
Moraes, E.A. ....................................................... 238
Moreira, C.F. .................................................230; 240
Moreno, D. ............................................................... 1
Mota, A.V. .................................................. 233; 234;
Moura, R.T.N. ..............................................123; 122
Mozzaquatro, F.D. ................................................ 119
Mundim, T.C.D. ................................................... 140
N
Nascimento, A.B. ......................................... 116; 130
Nasser, L.F. ............................................ 88; 198; 228
Neves Neto, J.R. ................................................. 175
Niccio, A.C. ....................................................... 147
Nichi, M. ....... 131; 161; 198; 219; 221; 229; 232; 235
Nogueira, L.A.G. ................................................. 160
Nogueira, M.F.G. .......... 169; 196; 206; 208; 218; 239
Nonato Jr., I. .................................................. 95; 186
Nosetti, L. ............................................................ 224
Nunes, C.M. ........................................................ 149
Nunes, D.B. ......................................................... 177
Nunes, J.F. ............................................................. 91

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

O
Oba, E. .. 176; 181; 182; 189; 190; 194; 197; 233; 239
Ohashi, O.M. ................................................. 91; 109
Oliveira M.F. ........................................................ 154
Oliveira, E.R. ........................................ 158; 159; 190
Oliveira, G.D.M. .................................................. 200
Oliveira, J.A. .................................................134; 168
Oliveira, J.F.C. ...................................................... 112
Oliveira, J.V. ........................................................ 170
Oliveira, L.J. .................................................151; 152
Oliveira, L.R.S. .................................................... 237
Oliveira, M.A.L. ..................... 93; 121; 123; 237; 243
Oliveira, R.S. ........................................................ 183
Oliveira, V.P. ......................................... 116; 130; 131
Olivier, N. ............................................................. 172

P
Palho, M.P. .......................................... 160; 187; 193
Palma, G.A. ......................................................... 172
Papa, F.O. ............................................. 170; 175; 176
Papa, P.C. .....................................................151; 152
Paschoal, D.M. ...................................................... 92
Paula T.A. ............................................................ 155
Paula, N.R.O. ...................................................... 205
Pedrazzi, C.A.F. ..................................................... 94
Penteado, L. ......................................................... 223
Perecin, F. ......................................108; 111; 117; 146
Pereira, D.C. ................................. 102; 127; 140; 188
Pereira, F.T.V. ............................................... 151; 152
Peres, K.R. ........................................... 101; 211; 212
Peres, R.F.G. ......................................................... 99
Perez, G.C. .......................................................... 217
Pessa M.A. .......................................................... 89
Pimentel, C.M. ............................................... 96; 245
Pina, V.M.R. ................................... 93; 121; 122; 123
Pinheiro, V.G. ....................................................... 242
Pinho, T.G. ........................................................... 200
Pinto, M.G.L. ....................................................... 139
Pires, R.M.L. ................................................ 107; 194
Pivato, I. ......................................................... 188 245
Polisseni, J. ........................................................... 183
Ponchirolli, C.B. ................................................... 101
Pontes, J.H.F. ................................................ 95; 186
Pontes, R.A. ........................................................ 238
Porciuncula, P.M. .................................................. 112
Portela, A.P.M. ..................... 167; 180; 203; 207; 244
Portela, F.J.A. ............................................... 201; 202
Potiens, J.R. ......................................................... 191
Price, C.A. ....................................................138; 139
Prosperi, C.P. ....................................................... 238
Puelker, R.Z. ........................................................ 150
Puoli-Filho, J.N.P. ................................................ 173

Q
Queiroz, F.J.R. ..................................................... 200
Quintela, A. ............................................................ 90
Quirino, C.R. ......................................... 133; 165; 199
R
Rambo, G. ............................................................ 166
Ramos, A. ............................................................ 183
Reichenbach, H.-D. ................................93; 121; 133
Reis, E.L. ... 1; 88; 161; 198; 219; 220; 221; 222; 223;
226; 227; 228; 229; 232; 235; 236
Resende, J. ............................................................. 90
Rheingantz, M.G.T. .............................................. 166
Ribeiro Filho, A. de L. .... 90; 167; 180; 203; 207; 244
Ribeiro Jr., M. ...................................................... 195
Rigo, A.G. ............................................................ 120
Ripamonte, P. ................................................103; 104
Rocha Filho A.N. ................................................... 89
Rocha, J.M. ................................................... 237 243
Rodrigues, A.P.R. .......................................... 91; 163
Rodrigues, C.A. ............ 161; 219; 220; 221; 227; 228
Rodrigues, J.L. ............................................... 83; 143
Rojas, N. .............................................................. 126
Roncoleta, M. ....................................................... 118
Rondina, D. .................................................... 91; 205
Rosa e Silva, A.A.M. .......................................... 128
Roser, J.F. ............................................................ 209
Rubin, K.C.P. ................................................120; 134
Rubin, M.I.B. ........................................................ 119
Rufino, F.A. ........................................................... 95
Rumpf, R. 96; 102; 124; 127; 140; 151; 184; 188; 245
S
S Filho, M.F. ................................ 226; 228; 232; 235
S Filho, O.G. ............................... 197; 213; 214; 217
S, W.F. .......................................... 87; 128; 160; 183
Sales, J.N.S. ..................................................204; 215
Sanches, B.V. ........................................................ 95
Santana, R.C.M. .................................................. 207
Santos, A.F.A. ..................................................... 238
Santos, L.M. ........................................................ 199
Santos, M.H.B. ....................... 93; 121; 122; 237; 243
Santos, P.A.C. ............................................... 201; 202
Santos, R.M. ................................. 164; 213; 214; 217
Santos, R.R. .................................... 91; 135; 136; 163
Santos, S.E.C. ...................................................... 149
Santos, T.C. ..................................................151; 154
Saraiva, N.Z. ........................................................ 146
Sartorelli, E.S. ...................................................... 208
Sartori, R. ....................................................... 35; 188
Satrapa, R. ........................................................... 179
Satrapa, R.A. ................................................ 115; 179
Saueressig, M.G. .................................................. 100
Schroeder, R.V. .................................................... 120
249

Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

Seneda, M.M. ................. 95; 120; 130; 134; 186; 195


Serapio, R.V. ........................................................ 87
Serret, C.G. .......................................................... 166
Silva, A.A.B. ........................................................ 207
Silva, A.P. ............................................................ 192
Silva, C.A.M. ........................................................ 119
Silva, G.A. ............................................. 135; 136; 163
Silva, J.C. ............................................................... 90
Silva, J.F.S. ........................................................... 174
Silva, J.R.V. ................................................ 135; 163;
Silva, M.V.G.B. ...................................................... 87
Silva, R.C.P. .................................. 120; 195; 221; 228
Silveira, L.L. .......................................................... 96
Simes, R. ............................................................ 147
Sinhorini, I.L. ........................................................ 157
Siqueira, F. ........................................................... 149
Siqueira, L.G.B. ................................................... 155
Siqueira-Pyles, E.S.C. ............ 94; 101; 162; 210; 211;
212;239
Solano, G.O. .................................................. 156; 241
Solano, R.F. ........................................... 144; 156; 241
Soria, G. ................................................................ 111
Sousa, B.P.A. ....................................................... 185
Sousa, J.S. ............................................................ 109
Souza, A.F. ........................................................... 242
Souza, A.L. .......................................................... 205
Souza, D.B. .......................................................... 176
Souza, F.F. de ................................................178; 182
Souza, G.V. .......................................................... 174
Souza, J.A.T. .................................................201; 202
Souza, J.C. ....................................................204; 215
Souza, R.J. ....................................................126; 125
Souza, R.V. .................................................... 96; 184
Squires, E.L. ......................................... 209; 211; 212
Stefanello, J.R. ...................................................... 112
Suzuki, M.F. ......................................................... 126
T
Tavares, D.C. ............................................... 108; 110
Tavares, R.Z. ................................................233; 234
Tebet, J.M. ........................................................... 178
Tedesco, A.C. ...................................................... 168
Teixeira, A.B. ...............................................139; 239
Teixeira, D.I.A. .................................................... 205
Tenrio Filho, F. ................................................... 237
Tetzner, T.A.D. ...................................................... 99
Toniolli, R. ............................................................ 130
Torres Neto, R. .................................................... 231
Traldi, A.S. ........................................................... 129
Tribulo, R. ............................................................ 225
Trinca, L.A. ......................................................... 208
U
Uvo, S. ........................................................... 95; 186

250

V
Vajta, G. ............................................................... 124
Vale Filho, V.R. ...................................................... 87
Vannucchi, C.I. .................................................... 131
Vantini, R. ..................................................... 114; 118
Vasconcelos, J.L.M. ..................... 171; 213; 214; 217
Veloso, R.V. ......................................................... 100
Venturini, M. ........................................................ 225
Verechia, F.T. ................................................150; 153
Verneck, W.C. ..................................................... 199
Vettorato, L.F. ....................................... 231; 233; 234
Viana, J.H.M. ....................... 128; 160; 187; 190; 193
Vianna, F.P. .......................................................... 176
Vieira, A.D. ................................................... 83; 143
Viel Jr, J.O. .......................................................... 235
Villarroel, A.B.S. .................................................. 205
Vireque, A.A. ...................................................... 128
Visintin, J.A. . 116; 130; 131; 141; 147; 148; 151; 157;
W
Watanabe, Y.F. ............................................... 84; 142
Wentz, K.C. ......................................................... 164
Weppert, M. ............................................ 93; 121; 133
Wolf, A. ........................................................145; 168
Y
Yamada, C. .......................................................... 147
Yamazaki, W. ....................................................... 151
Z
Zahn, F.S. ............................................................. 239
Zanon, J.E.O. ......................................................... 92
Zaynette, F.T. ....................................................... 241
Zerio, N.M.C. ...............................................125; 126
Zccari, C.E.S.N. ................................................ 177