MTODOS DE SIEMBRA

El mtodo de siembra a emplear depender de los objetivos que se pretendan alcanzar con el
cultivo, ya que en ocasiones se requiere que el desarrollo del microorganismo se produzca de
forma masiva, mientras que en otras resulta indispensables que las colonias queden aisladas o
que las manifestaciones del metabolismo tengan lugar con tensiones reducidas o privadas de
oxgeno, los mtodos de siembra ms empleados son los siguientes:
1.

Siembra por estras.

2.

Siembra por puncin.

3.

Siembra volumtrica.

4.

Siembra masiva.

Siempre que se utilicen instrumentos de siembra de platino o nicrn, deben ser calentados en la
llama del mechero hasta el rojo vivo, antes y despus de realizar la siembra, con el objetivo de
destruir a los microorganismos contaminantes de la superficie del instrumento.
Con independencia del tipo de medio y el mtodo de siembra a emplear sta debe realizarse en
las proximidades de la llama del mechero y a que el calor emanado reduce el nmero de
microorganismos presentes en sus inmediaciones, lo cual es utilizado como un recurso a favor
del proceder asptico.
Siembra por estras
Este mtodo de siembra se realiza sobre la superficie de los medios de cultivo slidos
distribuidos en placas de "Petry" o en tubos de ensayo solidificados en forma de cua.(Slam)
Instrumentos de siembra a emplear.
Para la siembra por estra se utiliza el asa de platino o el hisopo. En algunas ocasiones, como
explicaremos ms adelante, se utilizan ambos instrumentos en la misma siembra.
Procedimientos
Cuando se utilice exclusivamente el asa de platino o nicrn.
1.

Coger el asa por el cabo, en forma similar, a cuando tomamos el lpiz para escribir.

2.

Introduzca el asa de alambre de platino o nicrn directamente en la zona de color azul

de la llama del mechero, hasta que se ponga al rojo vivo. Seguidamente, proceda a
introducir lentamente el resto del alambre para lograr el mismo efecto.

3.

Retire el instrumento de la llama y espere de 4 a 5 segundos con el objetivo de que el

asa se enfre.

4.

Con el asa estril y fra tome el volumen o fragmento de la muestra que ser sembrado y
trasldelo de inmediato para el medio del cultivo seleccionado.

5.

Si la siembra se fuera a producir en un medio solidificado en forma de cua en tubo de

ensayo, proceda del siguiente modo:

a.

Con la mano opuesta a la que sujeta el asa, tome el tubo por l porcin inferior.

b.

Con el dedo meique de la mano que sostiene el asa, retire del tubo el tapn de algodn
o la tapa de rosca y retngala(no colocar el tapn o la tapa sobre la mesa de trabajo)

c.

Flamee de inmediato la boca del tubo de ensayo, pasndola una o dos veces por la llama
del mechero, con el objetivo de eliminar por incineracin, los microorganismos

contaminantes que se encuentran en esa zona, por la parte externa del tubo. Esta accin
calrica, provoca adems una conveccin del movimiento del oxgeno presente en el
interior del tubo hacia afuera, debido a la desigualdad de calor, lo cual favorece que
decrezca el riesgo de contaminacin.
d.

Introduzca el asa con el volumen o fraccin de la muestra en el tubo, hasta el fondo de

la cua. A partir de este momento, la siembra puede realizarse de diferentes maneras,
en dependencia del tipo de microorganismo que pretendemos que se desarrolle en ese
medio de cultivo:

Fig. 119: Siembra microbiolgica en medios de cultivos distribuidos en tubos de ensayo: 1) y 2)

Retirar el tapn del tubo; 3) Flamear la boca del tubo; 4) Introducir el instrumento de siembra
con la muestra y realizar la siembra; 5) Retirar el instrumento y flamear nuevamente la boca del
tubo; 6) Taponar el tubo.

Deslizando el asa, desde el fondo hacia arriba, por toda la superficie de la cua, trazando
una lnea longitudinal.

Deslizando el asa por la superficie de la cua desde el fondo hacia arriba, imprimindole
un movimiento de zigzag.

Motiando toda la superficie de la cua con hisopo.

Efectuando cualquiera de las tres variantes explicadas pero adicionalmente roturando el

medio con el asa, haciendo un pequeo corte longitudinal.

Al concluir la siembra se flamea la boca y se taponea nuevamente el tubo procediendo a

esterilizar el asa en las llama del mechero.

Fig. 120: Siembra en medios slidos en cuas (tubos de ensayo): a) Trazando una lnea
perpendicular desde el fondo hacia arriba; b) Deslizando el instrumento con el inculo de abajo
hacia arriba en forma de zigzag; c) Roturando el medio

Si la siembra se fuera a realizar en la superficie de un medio solidificado en placa de Petry,

proceda de la siguiente manera:
a.

Con la mano opuesta a la que sujeta el asa de platino, tome la placa de Petry, de manera
que la tapa quede hacia arriba. Con ayuda del dedo pulgar abra parcialmente la placa.

Fig. 121: Apertura manual de la placa de Petra con medio de cultivo.

b.

Introduzca el asa con la muestra y proceda a deslizarla suavemente en forma de zigzag,

desde la pared, hasta cubrir aproximadamente un tercio de toda la superficie.

c.

Cierre la placa y grela varios cm, en contra de las manecillas del reloj, procediendo a
abrirla nuevamente por igual procedimiento.

d.

Introduzca nuevamente el asa y haga un segmento similar al anterior, de manera que las
bacterias sembradas en el primer segmento sean removidas para el segundo.

e.

Repita esta operacin una o dos veces ms.

Fig. 122 : Mtodo de siembra por estrias en medios de cultivo slidos distribuidos En placas de
Petra
f.

Finalmente cierre la placa y colquela sobre la mesa de trabajo boca abajo.

g.

Esterilice el asa de platino a la llama del mechero, en la forma explicada antes de dejarla
en el puesto de trabajo.

Cuando la muestra es tomada con hisopo.

1.

Si la siembra se va a producir en una cua de agar, se procede en forma similar que la

siembra con asa en este tipo de medio de cultivo.

2.

Si la siembra se fuera a producir en medios slidos en placas, el primer segmento se

hace con el mismo hisopo con que se tom la muestra y los restantes se realizan con asa
estril, para lograr una diseminacin por agotamiento, que posibilite el desarrollo aislado
en los ltimos segmentos del microorganismo en estudio. Otra variante es la
diseminacin cruzada, en este caso, en lugar de hacer un primer segmento en zig zig
con el hisopo, se procede a trazar en el centro de la plaza una letra "Z" y a continuacin
con el asa esteril se procede a deslizarse con un movimiento ondulatorio sobre la "Z".

Fig. 123: Siembra por diseminacin cruzada: a) Trazar con el hisopo que contiene el inculo una
"Z"en la superficie del medio; b) Completar la siembra con un asa de platino estril, imprimiendo
movimientos ondulatorios sobre la "Z"
Siembra por puncin
Como es obvio, el instrumento de siembra a emplear ser la aguja de platino y el medio de
cultivo slido, generalmente, en tubo de ensayo. Las manipulaciones y la observancia de las
precauciones de asepsia, son similares que cuando se utiliza el asa. La particularidad que tiene
este mtodo, es que la aguja (con el inoculo) debe atravesar perpendicularmente el medio de
cultivo.

Fig. 124: Siembra por puncin

Siembra volumtrica
Este mtodo de siembra consiste en sembrar una muestra liquida cuyo volumen no puede ser
predeterminado, en medio de cultivo slidos o lquidos. Por ejemplo: En las muestras de
exudado vaginal tomadas con pipetas de Pasteur, no puede determinarse el volumen, ya que
este tipo de pipeta carece de escala de graduacin, sin embargo, la orina empleadas en el
urocultivo o la sangre para el hemocultivo se puede determinar con pipeta o jeringuilla
respectivamente el volumen que ser sembrado.
Siembra masiva
Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede utilizar la esptula de Driglaski. En este
caso la gota de muestra liquida se esparce con la esptula por toda la superficie del medio de
cultivo slido imprimindo un movimiento en espiral. La siembra masiva tambin se puede
realizar con un hisopo grueso embebido de un cultivo liquido, procediendo a su deslizamiento
sobre toda la superficie de una placa de agar.

Fig. 125: Siembra masiva con esptula de Drigalski

(Morales, 2012)

Siembra
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra (inculo) en un
medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y
multiplicacin. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura
adecuada para el crecimiento.
Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:

Que se efecten aspticamente

Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estn esterilizados
Que se realicen solo los manipuleos indispensables
Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un
mechero o bien Flujo laminar.

Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los requerimientos

del microorganismo a estudiar.
Medios slidos:
Siembra por inmersin: se coloca el inculo en una placa o caja de Petri y
sobre el mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido. Este
mtodo se utiliza para microorganismos aerobios.
Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por inmersin.
Una vez solidificado el medio se vierte una cantidad extra de medio
necesaria para cubrir la capa anterior (generalmente 10 ml. aprox.). Este
mtodo se utiliza para microorganismos anaerobios facultativos y
microaeroflicos.
Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo
fundido, se deja solidificar y se coloca sobre la superficie el inculo. Con
ayuda de una esptula de Drigalsky se extiende el inculo hasta su absorcin
total por el medio de cultivo. Este tipo de siembra se recomienda para
microorganismos aerobios estrictos.
Siembra en estra: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo
fundido y se deja solidificar.

Existen distintas tcnicas para la siembra en estras, el objeto es obtener

colonias aisladas

Tcnica A
Consiste en cargar el ansa con la muestra y
hacer estras paralelas en la cuarta parte de
la superficie de la placa, se quema el ansa,
se enfra, se gira la placa a 90 y se vuelve a
estriar tocando 3 o 4 veces el rea sembrada
inicialmente y cubriendo otro cuarto de la
placa. Por ltimo, sin quemar el ansa, se
estra el resto de la superficie sin sembrar.

Tcnica B
Con el ansa cargada se hacen 3 o 4 estras; se
quema el ansa, se hacen 3 o 4 estras
perpendiculares a las anteriores, se quema el
ansa y se repite el procedimiento hasta agotar
la superficie de la placa.

 Siembra en agar en tubo inclinado o bisel: en este caso se colocan 5 ml de

medio de cultivo fundido y estril, se inclina el tubo y se deja enfriar.

El inculo se siembra, con ayuda de ansa, de la siguiente manera:

En profundidad con
ansa de punta: se pica
con el ansa el cultivo a
sembrar y se introduce
mediante punsin en el
medio contenido en la
parte inferior del tubo.

En superficie con ansa de

aro: se pica con el ansa el
cultivo a sembrar y se
esparce el mismo sobre la
superficie en bisel en
forma de zigzag.

(Santambrosio, 2009)

OBTENCION DE CULTIVOS PUROS: SIEMBRA Y AISLAMIENTO

SIEMBRA O CULTIVO: es la operacin que consiste en depositar aspticamente

microorganismos en un medio de cultivo
Principios Generales
1. Practicar la siembra en medios de cultivos previamente esterilizados y adecuados para la
bacteria que se desea aislar 2. Emplear instrumentos estriles 3. No contaminar ni destruir los
microorganismos 4. Depositar los microorganismos aspticamente en los medios de cultivo 5.
Esterilizar los instrumentos empleados, inmediatamente despus de cada operacin
Los instrumentos empleados corrientemente en la siembra son:
1. Asa de Siembra: se utiliza alambre de platino, o alambre de una aleacin niquel-cromo
(nicrom) que tiene propiedades semejantes a la primera, con la ventaja de ser de menor costo.
Este alambre tiene un dimetro de 0,3 a1 mm y esta sujeto a un mango o porta asa metlico o
de vidrio. El alambre puede ser totalmente recto (asa en punta o aguja), recto con un anillo de
aproximadamente 3 mm de dimetro en la extremidad (asa) o aplastado en el extremo
(esptula). Puesto a la llama del mechero alcanza rpidamente el rojo blanco ( 1.300C ) y
tambin rpidamente se enfra.

2. Pipeta Pasteur: es un tubo de vidrio con una extremidad afilada u cerrada. La otra
extremidad que se encuentra abierta est protegida por una mota de algodn card o
hidrfobo.

La tcnica general de siembra depender de:

a) Estado fsico del material a sembrar ( slido o lquido ) b) Estado fsico del medio de cultivo
( agar o caldo ) c) Ambiente en el cual crece el microorganismo ( aerobiosis, microaerofilia o
anaerobiosis )

SIEMBRA EN ANAEROBIOSIS
Los medios de cultivo para las bacterias anaerobias poseen en general las mismas sustancias
nutritivas que para las bacterias aerobias, pero es necesario privarlos del O2 libre o en
disolucin mediante distintos mtodos:

1.- Mtodos Fsicos:

a) Expulsin del aire por ebullicin: antes de efectuar la siembra, los medios lquidos y slidos
se llevan a ebullicin en bao Mara con el fin de eliminar el aire. Este proceso se denomina
regeneracin de los medios. Esto evita el reoxigenamiento de los medios lquidos.

b) Reemplazo del aire por gases inertes: este mtodo consiste en la eliminacin del aire,
mediante bomba de vaco, del recipiente que contiene los medios sembrados y su reemplazo
por Hidrgeno, Nitrgeno, CO2, etc.
2. Mtodos Qumicos:
a) Sustancias reductoras txicas para las bacterias, por cuyo motivo no se adicionan a los
medios de cultivo, sino que en un lugar adecuado del recipiente que contiene los tubos
sembrados. Se utiliza principalmente Acido Piroglico o Hidrxido de potasio
b) Sustancias reductoras no txicas que se agregan directamente a los medios de cultivo , por
ejemplo Glucosa al 1-2%, Tioglicolato de sodio 0. 1 0.2%, Cistina al 0.05% entre otros.

3. Mtodos Biolgicos:
a) Tejidos animales que se adicionan a los medios de cultivo, como por ejemplo: carne picada,
cerebro, hgado, etc.

AISLAMIENTO Y TRANSPLANTE (TRASPASO)

Cuando se realiza una siembra en medios slidos es deseable obtener las bacterias en forma
asiladas. Sin embargo, generalmente las muestras tienen una flora mixta, que se manifiesta
por el desarrollo de distintas especies bacterianas: algunas son saprfitas (flora normal) o
contaminantes del proceso de muestreo y otras son las que tienen un rol patgeno.
Para realizar diagnsticos microbiolgicos el organismo debe ser primero aislado y mantenido
puro en condiciones de laboratorio.
Si en la placa de agar ha crecido ms de un tipo de bacterias, se debe realizar el aislamiento
de 1 colonia a otro medio de cultivo semejante o a medios selectivos.
Si fuese necesario las colonias se sometern a uno o ms re-aislamientos, hasta obtener
cultivos puros; es decir, presenten la misma morfologa y microscpicamente correspondan a
un solo tipo de bacteria.
Slo en este momento se puede proceder a la identificacin de la especie bacteriana
mediante el traspaso de 1 sola colonia a una batera de medios diferenciales.
El aislamiento de los microorganismos se puede conseguir por los siguientes procedimientos:

1. Mtodos Mecnicos
1.1. Aislamiento por diseminacin o agotamiento: consiste en efectuar estras sobre la
superficie del agar, utilizando un asa de cultivo, sin pasar 2 veces por el mismo lugar.

Tcnicas de aislamiento por estriacin:

Uno de los mtodos utilizados es el siguiente (Figura 10): - El inoculo se extiende sobre una
pequea superficie del agar - Se flamea el asa y se trazan 3 lneas oblicuas a partir del
deposito original ( sin pasar el asa 2 veces por el mismo sitio ) - Flamear el asa, girar la placa
levemente en sentido de las manecillas del reloj y volver a trazar 3 lneas de la misma forma
anterior - Flamear el asa, girar la placa levemente en sentido de las manecillas del reloj y
volver a trazar 3 lneas de la misma forma anterior - Flamear el asa, girar la placa levemente
en sentido de las manecillas del reloj y volver a trazar 3 lneas de la misma forma anterior Flamear el asa y trazar una estriacin en forma de zig-zag sobre la superficie del agar que ha
quedado libre.

(Torrez, 2015)