UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTOBAL

DE HUAMANGA
FACULTAD DE INGENIERA QUMICA Y METALURGIA
ESCUELA DE FORMACIN PROFESIONAL DE
INGENIERA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
DEPARTAMENTO ACADMICO DE INGENIERA QUMICA

PRCTICA 06

CINTICA ENZIMTICA DE LA -AMILASA SOBRE

MOLCULA DE ALMIDN
Curso

: INGENIERA DE BIOPROCESOS

Docente

: Ing. TIBURCIO REYNOSO ALBARRACN

Alumnas

: CHUCHN VILLANUEVA, Jack Adderly

GAMBOA GUZMAN, Ygor
PILLACA GARCA, Liz Mariela
PAUCARHUANCA YARIHUAMAN, Y. Katia
PALACIOS BALDEN, Ernestina

Grupo

: MARTES 10 am. - 1 pm.

AYACUCHO-PER
2014

INTRODUCCIN

La Cintica Enzimtica, se refiere a los procesos en los cuales

participan exclusivamente las enzimas con la finalidad de acelerar la
velocidad de reaccin.

sta accin enzimtica es denominada catalizadores

y
especficamente es un biocatalizador, las enzimas o fermentos son
sustancias proteicas con actividad cataltica producido por organismos
vivos.

Las sustancias sobre las cuales actan se llaman substratos y stas

enzimas pueden actuar tanto en substratos homogneos como
heterogneos.

La caracterstica fundamental de un proceso catalizado por enzimas, es

de disminuir la energa de activacin. Dentro de las reacciones
catalizadas por enzimas, tenemos a la Invertasa, Diastasa, Maltasa,
pepsina, tripsina, etc.

La Accin Enzimtica de las enzimas, se produce con la unin de stas

con una molcula de substrato, para luego formar el complejo enzimasubstrato y despus del proceso se forma inmediatamente el producto
quedando libre la enzima, para unirse con el nuevo substrato.

I.

II.

OBJETIVOS:
Determinar la accin enzimtica de -amilasa sobre molcula de
almidn.
Observar el desarrollo de hidrolisis del almidn utilizando solucin de
yodo.
Estudiar los parmetros de desarrollo.
FUNDAMENTO TERICO:

La -amilasa es una enzima que sobre la molcula de almidn para

hidrolizar y convertir en unidades de maltosa partiendo desde el extremo
reductor y determinndose en las ramificaciones y convertir tambin en
dextrinas el desarrollo de esta reaccin se puede detectar por su coloracin
a una solucin de yodo, tomando los colores azul, morado, rojo, pardo claro,
etc.
La -amilasa -1,4 glucan-maltohidrolasas es una exoenzima que ataca
los enlaces 1,4 glucosdicos en la parte externa de la cadena, -amilasa
separa unidades de maltosa a partir de los extremos no reductores de esta
por hidrlisis alterna de enlaces glucosdicos. Las -amilasas atacan la
amilosa solo desde un extremo a la vez, y, a causa d ello, son mucho
menos efectivas que las amilasas.
Debido a que esta enzima est imposibilitada para hidrolizar los puntos
ramificados -1,6 en la molcula de almidn, los productos finales de la
accin sobre el sustrato son maltosas y dextrinas, formndose pocas
cantidades de maltotriosa y glucosa.
Las -amilasas contienen un grupo sulfidrilo esencial para la actividad
enzimtica, que se lleva acabo de forma ptima en un rango de pH entre 4 y
5. La actividad de la enzima se analiza mediante mtodos colormetros que
miden la cantidad de azcares reductores, liberados a partir del almidn.
Estas enzimas estn presentes en gran nmero de bacterias gran positivas
formadas de esporas.
Multifect AA 23L es una -amilasa que exhibe excelente estabilidad a pH
5.5 o mayor y a una temperatura de 60 C. stas enzimas cumplen con las
actuales condiciones de calidad de la FAO/OMS y el Codex para alimentos
y productos qumicos y son GRAS (Generally Recognized As safe) en los
estados unidos
II.1.

LOS ALMIDONES son polisacridos vegetales. Fisiolgicamente son

sustancias de reserva, anlogas al glucgeno animal y no a los
constituyentes de estructura del tipo de celulosa o pectinas. Los
almidones se encuentran principalmente en los granos de los
tubrculos como la patata, mandioca, etc. La funcin nutricional del

los almidones es muy importante porque constituye, despus de la

hidrlisis digestiva en glucosa, la principal fuente de caloras en la
alimentacin humana.
Los grnulos de almidn se rompen por el calor y una parte del
contenido de almidn es soluble en agua caliente. El almidn soluble
es la amilosa y constituye del 10-20% de la mayora de los almidones
naturales. El resto, insolubles, es la amilopectina. La amilosa da en
soluciones de yodo una reaccin bien conocida: color rojo o azul
intenso; la amilopectina se vuelve roja en contacto con el yodo.
Estructuralmente, la amilosa es una cadena recta de unidades de DGlucosa, cada una enlazada a la siguiente: Por su lado, la
amilopectina est constituida tambin por unidades de D-Glucosa,
pero su estructura est compuesta de cadenas ramificadas de
unidades, y sus pesos moleculares en general son ms altos que los
de la amilosa.
La Hidrlisis Parcial de la amilopectina da mezclas llamadas
Dextrinas. Naturalmente la hidrlisis completa da D-Glucosa. Se usa
las Dextrinas como aditivos de alimentos, muclagos, pastas y en
acabados de papel y tejidos.
De igual manera, cuando los grnulos de almidn se exponen al
mismo tiempo al calor y a la humedad, hay una gelatinizacin, por
encima de 55-70C. Si se prolonga el tratamiento hidrotrmico,
puede surgir una ruptura de los granos, hidrlisis parcial y disolucin
ms o menos completas de las molculas constituyentes.
La Diastasa es una enzima de la familia de las amilasas que existen
en diferentes fuentes vegetales, animales y microbianas. sta
enzima cataliza las reacciones de hidrlisis del almidn, para
convertirlo en unidades de D-glucosa y dextrinas. sta fraccin se
puede determinar con el reactivo de Fehling, para determinar la
respectiva accin enzimtica.
El almidn como polisacrido puede ser hidrolizado por sustancias
que rompen los enlaces -1,4-glucosdico y -1,6-glucosdico, con
el objetivo de producir molculas ms pequeas como las dextrinas.
La determinacin del grado de hidrlisis, se debe a la cantidad de
azcares reductores que se han formado; especficamente glucosas
llamadas tambin dextrinas y se mide por las unidades de dextrosa
equivalente, determinada mediante el licor de Fehling.
II.2.

DETERMINACIN DE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIN

ENZIMTICA

Los principios de cintica enzimtica, puede usarse para escribir a

ecuacin de la velocidad para un modelo de enzima substrato y
enzima producto, que fue estudiado por Michailes Menten, es el
llamado sistema unireactivo sencillo con la aproximacin al equilibrio
rpido deducido por M. Menten. La reaccin ms sencilla catalizada
enzimticamente implica que un nico substrato da lugar a un nico
producto. El sistema se llama uni-uni en la nomenclatura de Cleland,
usando la siguiente reaccin:
E + S

ES

EP

P + E

El complejo ES y EP es demasiado rpido por lo tanto, la reaccin

queda expresada como:
E + S

ES

P + E

Realizando los clculos matemticos respectivos, la velocidad de una

reaccin enzimtica ser igual a:
V=

V max +(S )
Ks+(S )

Donde:
V
Vmax
(S)
Ks
II.3.

=
=
=
=

Velocidad enzimtica
Velocidad Mxima
Concentracin del Substrato
Constante de Michailes

FORMA INTEGRADA DE LA ECUACIN DE MICHAILES

Est dada por la siguiente relacin, determinada despus de una serie
de clculos de integraciones matemticas:
1
So V max SoSi
ln
=

T
Si
K m TK m

( )

La representacin grfica es la siguiente:

II.4.

FACTORES QUE INFLUYEN

REACCIONES ENZIMTICAS:

EN

LA

VELOCIDAD

DE

La velocidad de las reacciones enzimticas, estn influenciadas por

diversos factores, dentro de los principales se tiene:
- Concentracin del substrato
- Presencia de activadores o inhibidores
- pH ptimos para cada enzima
- Temperaturas.
III.

MATERIALES
- 1 matraz de 500 ml
- 4 matraces de 250 ml
- 4 vasos de 250 ml
- 1 bureta de 250 ml
- 1 pipeta de 10 ml
- 1 soporte universal y su pinza
- 1 plancha para calentar
-

IV.

Equipos
Bao mara
pH metro
1 termmetro

Reactivos
Almidn 100 gr
-amilasa en solucin
Licor de Feling A y B
Azul de metileno

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Prepare 200 ml de solucin de almidn al 5% en un matraz de 500

ml.
Figura N 1: Solucin de almidn al 5%.

Ajuste el pH de esta solucin con cido ctrico a 4.4 4.5 y lleve a 60

C en bao mara por un tiempo de una hora. Pero antes de colocar
en bao mara aada al matraz de 500 ml 20 ml de solucin de amilasa y deje que transcurra una hora. Pero cada 10 minutos saque
con una pipeta 10 ml de solucin y coloque en la bureta y complete
con 90 ml de agua.

Prepare en el vaso de 250 ml prepare licor de Fehling 5 ml de A y 5

ml de B y complete con 90 ml de agua, luego aade 2 a 3 gotas de
azul de metileno.
Figura N 2: Solucin de Fehling

Coloque en la plancha y cuando inicie a hervir titule en la solucin

que contiene en la bureta hasta que cambie de color a rojo ladrillo,
luego anote el volumen que ha gastado.
Figura N 3: Titulacin en la plancha a ebullicin.

En el transcurso que saca cada 10 minutos coloque unas cuantas

gotas en una luna de reloj y aada 1 gota de yodo. Anote el color que
ha tomado.
Figura N 4: Cambio de color de la solucin.

V.

RESULTADOS EXPERIMENTALES
N de
Experiencia
1
2
3
4
5
6

TIEMPO
(minutos)
10
20
30
40
50
60

VOLUMEN A. R.
(ml)
100
75
64
63
50
38

1 Ahora, ser necesario el clculo de Azcar Reductor equivalente a

Dextrosa en las diferentes muestras a diferentes tiempos. Para lo cual se
emplea el mtodo volumtrico de LANE y EYRON, utilizando un factor en
relacin al gasto en la siguiente expresin:
Factor x 100
AR mg/100 ml de solcucin=
Ttulo (ml)

FC=

volumen diluido
volumen de gasto

Azcar reductor =

Azcar reductor ( g)=

FC
x 100
Vol . de gasto

azcar reductor
x 100
Dilucin

Para la muestra 1 se tiene.

FC=

200 ml
=2.0000
100 ml
Azcar reductor =

Tiempo (min)

TABLA N 02
Gasto (ml)
Factor

10
20
30
40
50
60

VI.

2.0000
x 100=2.000
100

100
75
64
63
50
38

79.00
79.50
79.90
79.90
80.40
81.30

maltosa mg /
100 ml
79.00
106.00
124.84
126.83
160.80
213.95

CLCULOS
1. Con los datos obtenidos, volumen gastado, determine la
concentracin de la solucin de cada 10 minutos, que ha
sucedido, el tiempo determinado. Graficar y determine la
constante K y determine orden de reaccin.

n ( C 6 H 12 O6 ) Dextrina+ Maltosa
Y en la titulacin
siguiente:

por accin del reactivo de Fehling, se produce lo

2++2 e Cu0 ( s )
Cu

Determinacin de las constantes cinticas (Km y Vmax):

Los clculos sern realizados empleando la Ecuacin Integrada
de Michaeiles, que dice:
1
So V max SoSi
ln
=

T
Si
K m TK m

( )

En la tabla (03), se presentan los clculos respectivos para las

constantes Cinticas: Km y Vmax, en base a los datos de la tabla

(02) y desarrollados en la ltima expresin; teniendo en cuenta

que:
Si = S0 - %AR
Si = 100 - %AR
T (min)

So

Si

ln(So/Si)
T

(SoSi)
T

10
20
30
40
50
60

100
100
100
100
100
100

21.00
20.50
20.10
20.10
19.60
18.70

0.156065
0.079237
0.053482
0.040111
0.032593
0.027944

7.9000
3.9750
2.6633
1.9975
1.6080
1.3550

0.18
0.16
f(x) = 0.02x + 0
R = 1

0.14
0.12
0.1
(Ln(So/Si))/T 0.08
0.06
0.04
0.02
0
1

(So-Si)/T

Aplicando ecuacin integrada de Michailes, procedemos a elaborar

la grfica (01): (1/T) Ln(So-Si) Vs.(So-Si)/T, a partir de los datos
presentados en la tabla (03), de donde obtenemos las constantes
cinticas que equivalen a la pendiente (1/Km) y al punto de
prolongacin (Vmax/Km):
Km = 51.02
Vmax = 6.12 * 10-2

2. Reconocimiento con solucin de yodo.

Curso de hidrlisis
Almidn
Almidn soluble
Amilo dextrina
Eritrodextrina
Acrodextrina
Malto-glucosa

VII.

Reaccin con yodo

Azul
Azul
Prpura
Rojo
Incoloro
Pardo claro

CONCLUSIONES Y DISCUSIONES:

Se determin la accin enzimtica de -amilasa sobre la molcula

del almidn.
Se determin la constante K siendo 51.02, y una velocidad
mxima de 6.12 * 10-2
La enzima -amilasa cataliza las reacciones de hidrlisis del
almidn, para convertirlo en unidades de lactosa y dextrinas. sta
fraccin se puede determinar con el reactivo de Fehling, para
determinar la respectiva accin enzimtica.

El almidn como polisacrido puede ser hidrolizado por

sustancias que rompen los enlaces -1,4-glucosdico y -1,6glucosdico, con el objetivo de producir molculas ms pequeas
como las dextrinas. La determinacin del grado de hidrlisis, se
debe a la cantidad de azcares reductores que se han formado;
especficamente glucosas llamadas tambin dextrinas y se mide
por las unidades de dextrosa equivalente.

La coloracin de muestra + azul de metileno en los tubos de

ensayo se va clarificando a la medida que el tiempo va avanzando
es decir cada 10 minutos va cambiando de color lo cual es un
indicador de que hay una reaccin por efecto de la -amilasa.

VIII. BIBLIOGRAFIA:

D.PEARSON, Tecnologa de laboratorio para el anlisis

de alimentos. Pg. 78,79.

JONES, Mark
1969: Qumica, Editorial Interamericana S.A.
Mxico D.F. Pg. 286-287.