Investigacin: Aislamiento, purificacin y mtodos de secuenciacin de protenas.

Alumno: Edwin Ivn Ramrez Garduo Gpo: 43

Antecedentes:
Secuenciacin proteica: Secuenciacin de protenas es una tcnica para determinar
la secuencia de aminocidos de una protena, as como la conformacin que adopta la
protena y el grado en que se forma un complejo con cualquier molcula no peptdicas.
Actividad especfica: Expresa la magnitud de la actividad de una sustancia especifica
por unidad de peso de una mezcla que contiene la sustancia.
Electroforesis: Se denomina electroforesis a la tcnica mediante la cual se separan
las biomolculas en disolucin cuando se ven sometidas a un campo elctrico.
Discusin:
El aislamiento y la purificacin son prerrequisitos necesarios para el estudio de una
protena, ya sea para caracterizar su estructura o su funcin biolgica.
Se requieren generalmente varias etapas diferentes, cada una proyectada

para

eliminar una mayor porcin de material que no se desea de la fraccin de la etapa

previa hasta que, finalmente la protena deseada se obtiene en forma pura no
contaminada.
El aumento de la actividad especfica durante el aislamiento de una protena representa
un enriquecimiento continuo total en una fraccin particular con respecto a la protena
que se est aislando. Cuando se logra la pureza, mayor fraccionamiento dara una
actividad especfica incambiable, a menos que la protena haya perdido algo de
actividad debido a la desnaturalizacin en el manejo o en el almacenamiento.

Los dos principales mtodos directos de secuenciacin de protenas son la

espectrometra de masas y la reaccin de degradacin de Edman. Tambin es posible
generar una secuenciacin de aminocidos de la secuencia de ADN o ARNm que
codifica la protena, si es que se conoce.
Los mtodos clsicos de separacin

de protenas aprovechan las propiedades

variantes que presentan cada protena en singular, entre las que se incluyen tamao ,
carga y propiedades de unin.

Existen actualmente mtodos modernos

que

simplifican el proceso de purificacin de protenas como son el clonaje de ADN y la

secuenciacin de genomas.
Para el aislamiento de las protenas y su purificacin es necesaria una fuente de
donde obtenerlas, las cuales por lo general son clulas tisulares o microbianas. El
primer paso en cualquier purificacin de protenas es la rotura de las clulas fuente,
para la liberacin de protenas en una solucin denominada extracto crudo. Existen
diversos mtodos para la purificacin del extracto obtenido. Generalmente el extracto
se somete a tratamientos que separan las protenas en diferentes fracciones en base a
alguna propiedad como el tamao o la carga, dicho proceso se llama fraccionamiento.
Este proceso consiste en la utilizacin de diferencias en la solubilidad de las protenas,
que es una compleja funcin del pH, temperatura, concentracin de sal, entre otros
factores. Dicha solubilidad disminuye generalmente a concentraciones elevadas de sal,
un efecto que es llamado: "Salting out". La adicin de ciertas sales apropiadas puede
precipitar selectivamente algunas protenas, permaneciendo las restantes en
disolucin. Un compuesto utilizado para este fin es el Sulfato Amnico ((NH 4)2SO4), las
protenas precipitadas son separadas de las que siguen en solucin mediante
centrifugacin a baja velocidad.
La disolucin que contiene la protena de inters debe pasar por un proceso
denominado dilisis. Este consiste en separar las protenas de los disolventes
aprovechando el mayor tamao de las protenas. El extracto parcialmente purificado se
coloca en un saco o tubo de membrana semipermeable, que al suspenderse este en un
volumen mucho mayor de disolucin tamponada de fuerza inica apropiada, donde la

membrana permite el intercambio de sal y tampn, pero no de protenas. De esta

manera la dilisis retiene las protenas grandes dentro del tubo de membrana, mientras
que permite que la concentracin de los dems solutos

en la preparacin de la

protena cambie hasta llegar al equilibrio con la solucin del exterior de la membrana.
Cabe destacar que uno de los mtodos ms potentes para el fraccionamiento de
protenas utiliza la cromatografa en columna, debido a que se aprovecha de las
diferencias de carga, tamao, afinidad de unin y otras propiedades presentes en las
protenas.
Para este mtodo, la disolucin que contiene las protenas se introduce en la cabeza
de la columna y posteriormente se procede a la filtracin a travs de la matriz slida, en
formar una mvil. Es importante denotar que se requiere de materiales con las
propiedades qumicas adecuadas para el suceso en dicho proceso.
Otro de los mtodos importantes que existen es la cromatografa de intercambio inico
que esta aprovecha las diferencias en el signo y la magnitud de las cargas elctricas
netas que presentan las protenas a un pH determinante. La columna principal de la
cromatografa cuenta con intercambiadores catinicos y anicnico, la afinidad de cada
protena por los grupos cargados de la columna se ve afectada por el pH, dado que
este determina el estado de ionizacin de la molcula, por ello la separacin puede ser
ms exitosa optimizndola cambiando el pH gradualmente.
Existe otro mtodo conocido para la separacin de las protenas llamado cromatografa
de exclusin molecular o tambin conocida como de filtracin por gel, donde esta
separa las protenas en base a su tamao. En este mtodo, las protenas de mayor
tamao emergen de la columna

antes que las pequeas, dado esto como

consecuencia que las protenas de mayor tamao no pueden entrar por las cavidades
movindolas por diferentes caminos.
Otra tcnica importante para la separacin de protenas se basa en el desplazamiento
de las protenas cargadas en un campo elctrico, denominado electroforesis. Cabe
destacar que este tipo de procedimientos no son utilizados por lo general para purificar
protenas en grandes cantidades, dado que usualmente existen otros mtodos ms

sencillos y que adems los mtodos electroforticos afectan la estructura y con ello la
funcin de las protenas. La tcnica de electroforesis tiene un gran uso analticamente
hablando pues pueden visualizarse las protenas adems de separarse, lo que permite
contabilizar rpidamente el nmero de protenas en una mezcla o el grado de pureza
de distintas preparaciones proteicas.
Con el objetivo de purificar una protena es esencial disponer de un mtodo para
cuantificar la presencia de dicha protena en el proceso.
Conclusiones:
Es posible denotar que la purificacin de protenas es vital para la caracterizacin de la
funcin, estructura e interacciones de la protena de inters. Las protenas se separan y
purifican en base a diferencias en sus propiedades. Por medio de distintas aplicaciones
de mtodos las protenas se pueden precipitar selectivamente mediante la adicin de
ciertas sales. De los mtodos ms amplios para la purificacin y separacin de las
protenas es la cromatografa, de la cual existe una amplia gama que hace uso de las
diferencias de tamao, afinidad de unin, carga y otras propiedades como ventaja.
Entre estos mtodos se destaca la cromatografa de intercambio inico, exclusin
molecular, de afinidad y la cromatografa liquida de alta resolucin.
Todos los procedimientos de purificacin requieren un mtodo para destacar o
cuantificar la protena de inters cuando se encuentra esta, entre otras protenas. La
purificacin puede distinguirse mediante el ensayo de la actividad especfica. Es
posible decir que una preparacin pura de una protena es esencial para poder
determinar sus propiedades y su actividad de cada una. El descubrimiento de las
estructuras y funciones de las protenas en los seres vivos es una herramienta
importante para la comprensin de los procesos celulares, y para que permita que los
frmacos que se dirijan a vas metablicas especficas.
Bibliografa
Lehninger. Principios de Bioqumica, 4 ed. D.L. Nelson y M. M. Cox. Ediciones Omega, S.A.
2006
Bohinski, R. Bioqumica. 2a ed. Addison-Wesley Iberoamericana. 1987