Introduccin a la Citometra de Flujo

Leticia Corts
INTRODUCCIN:

La citometra de flujo se inici en la dcada de los 60 como un importante

avance en el proceso de contar y medir el tamao de partculas o clulas en
poblaciones no homogneas.
Se define como citmetro de flujo al aparato que es capaz de medir
componentes y propiedades de clulas y organelas celulares (partculas
biolgicas) que fluyen en una suspensin celular. Los sorters tienen las mismas
prestaciones y posibilidades que los citmetros de flujo pero con la capacidad
adicional de separar partculas selectivamente de la suspensin lquida.

APLICACIONES:

La CMF se puede emplear para estudiar caractersticas estructurales y

funcionales de clulas o partculas en suspensin. Las aplicaciones
fundamentales de esta tcnica se dan en biologa y medicina y son la
identificacin de antgenos celulares mediante tcnicas de inmunofluorescencia
y el estudio del contenido de ADN y fases del ciclo celular.
La CMF se ha utilizado en biomedicina con diferentes objetivos:
o
o
o
o

En hematologa: contaje celular, frmula leucocitaria, contaje

reticulocitario, anlisis de mdula sea.
En farmacologa: estudios de cintica celular.
En inmunologa: subpoblaciones T, tipaje tisular, estimulacin linfocitaria.
En oncologa: diagnstico/pronstico, monitorizar tratamiento.

o
o

En microbiologa: diagnstico bacteriano y vrico, sensibilidad a

antibiticos.
En gentica: cariotipo, diagnstico de portador, diagnstico prenatal.

HISTORIA DE LA CITOMETRIA DE FLUJO:

El primer contador celular automtico fue desarrollado por Moldavan (1934) y

consista en un tubo capilar por el que se hacan pasar clulas teidas, el capilar
estaba montado sobre un microscopio ptico con un objetivo sobre el cual haba
un detector fotoelctrico que registraba el paso de clulas como un cambio en
la luz que reciba. Tuvo muchos problemas con el grosor del capilar y
obstruccin del mismo, dificultad en el mantenimiento de presiones, etc..
Unos aos ms tarde Kielland (1941) patenta un modelo que parece ser igual al
de Moldavan.
Un importante avance para el desarrollo de la citometra de flujo se consigui
en 1953 al inventar Crosland y Taylor una cmara de flujo basada en la
inyeccin de la muestra en el seno de un fluido de arrastre a travs de un
capilar que se estrecha y centra el flujo de la misma. Con este sistema se
evitaban dos grandes problemas:
o
o

el capilar tiene mayor dimetro con lo que su obstruccin es mucho ms

difcil
permite mejor el enfoque de la muestra con la fuente de luz. Es la base
de las cmaras que se usan en la actualidad.

W. Coulter haba descrito poco antes (1949) el principio que lleva su nombre.
Desarroll un contador celular basado en el cambio que produce una partcula al
pasar por un agujero en el que hay una diferencia de potencial conocida. En
1966 tambin us cambios en ondas de radiofrecuencia.
En 1953 Parker y Horst describen el primer contador diferencial hematolgico
usando clulas teidas en rojo (hemates) y azul (leucocitos), luz visible y
detectores para luz roja o azul.
Katmentsky (1965) introdujo dos avances capitales en la citometra:
o
o

el uso de la espectrofotometra (luz absorbida) para cuantificar ADN

la medida multiparamtrica de luz dispersada.

Fue el primero en emplear histogramas biparamtricos. Algo ms tarde

desarroll un sorter neumtico. Con el tiempo se va introduciendo el empleo de
sustancias fluorescentes que permiten una mejor seal/ruido que los colorantes
de absorcin.
En 1967-69 Van Dilla describe el primer citmetro de flujo con configuracin
ortogonal usando la cmara descrita por Crosland-Taylor. Demostraron la
relacin existente entre ploida e intensidad de fluorescencia en la cuantificacin

de ADN, y producen histogramas donde se pueden visualizar las fases del ciclo
celular (G0G1, fase S, G2M).

Fulwyler describe el proceso de sorter electrosttico en 1965 basndose en la

tecnologa de las impresoras por chorro de tinta. Es el sistema
mayoritariamente empleado en la actualidad.
Durante los aos 60 y 70 se producen avances en la tecnologa y su aplicacin a
la citometra de flujo pero hasta final de los aos 70 y principio de los 80
existan pocas aplicaciones de la citometra de flujo de inters biolgico. Los
esfuerzos se dirigan principalmente en mejorar las prestaciones de los
instrumentos que se estaban desarrollando.
Desde entonces se han producido avances en las aplicaciones de la citometra
de flujo en la investigacin mdico-biolgica. Los ms importantes se describen
a continuacin:
o

o
o
o
o

Reinherz (1975) emplea la tecnologa de los anticuerpos monoclonales

de Kholer y Milstein para identificar subpoblaciones celulares en funcin
de antgenos de superficie.
Loken (1977) mide simultneamente dos antgenos celulares con un solo
lser, emplea la compensacin electrnica de la seal entre isotiocianato
de fluorescena (FITC) y la tetralmetilrodamina.
Oi (1982) introduce las ficobiliprotenas como flourocromos (ficoeritrina).
Darynkiewicz y Traganos (1976-79) estudian con naranja de acridina el
ADN y ARN.
Andreeff usa dicha tcnica para clasificar las leucemias.
Grynkiewicz (1985) introduce el Indo 1 para medir concentracin
intracelular de calcio.

o
o

Entre 1979-80 varios autores describen tcnicas citomtricas para medir

condiciones fisiolgicas: Visser (pH intracelular), Valet (carga de
superficie), y Thorell (estado red-ox).
Hedley (1983) pone a punto un tcnica para el estudio por citometra de
flujo del ADN de ncleos de muestras parafinadas.
Gratzner (1975) describe la tcnica de la bromodeoxiuridina (BrdU) y los
anticuerpos contra ella, que permite ampliar el estudio de las fases del
ciclo celular.
Gray (1975) realiza el cariotipo por citometra de flujo. Este
procedimiento fue posteriormente mejorado por Carrano.

Muchos otros autores han contribuido con sus experimentos a desarrollar tcnicas
aplicables a la citometra de flujo que ahora estn dando sus frutos y se emplean tanto
en el laboratorio de rutina, como en la investigacin bsica
FLUOROCROMOS PARA CITOMETRA DE FLUJO:

Los fluorocromos ofrecen un mtodo sensible para obtener informacin acerca

de la estructura, funcin y vitalidad de las clulas.
Hay dos modo de uso: (1) unin covalente del fluorocromo a molculas que se
unen especficamente a componentes celulares, y (2) fluorocromos que varan
sus caractersticas en funcin del microambiente que les rodea.

Las propiedades ideales de un fluorocromo son: (1) alto coeficiente de extincin

a la longitud de onda de excitacin (probabilidad de absorber la luz), (2) alto
rendimiento cuntico (emisin de luz), (3) elevada fotoestabilidad, (4) corto
estado de exitacin. Si el fluorocromo va a estar unido a algo, ste ser
insensible a cambios de pH, polaridad y microambiente. Recordar que a
longitudes de onda inferiores a 500 nm se produce una alta autofluorescencia
celular debido a las flavinas.
1.- Tcnicas inmunoflourescentes: marcadores fluorescentes de unin
covalente: Son fluorocromos que reaccionan y se usan para marcar protenas,

lpidos, o bien otras molculas biolgicas. Deben ser suficientemente selectivos

y reactivos.
Se emplean cromforos con grupos isotiocianato, clorotrirzinil, y steres de
succinimida, por su capacidad de unin. El fluorocromo ms empleado es la
FLUORESCEINA. Otros que se han descrito y empleado son: rodamina, Texas
red, cianinas (lseres diodos), etc., pero el ms famoso es la FICOERITRINA
(ficobiliprotena) por su gran absorcin, rendimiento y fotoestabilidad; adems
se puede excitar a 488 nm pero emite ms all del espectro de la fluorescena
permitiendo el doble anlisis con un solo lser. Avances recientes son el uso de
sondas de ADN unidas a fluorescena, y los anticuerpos anti-bromodeoxiuridina
para el estudio del ciclo celular.
Actualmente se ha generalizado el estudio multiparamtrico de antgenos
celulares con el empleo simultneo de 3 y 4 anticuerpos conjugados cada uno
con fluorocromos con diferente longitud de emisin (FITC; R-PE, PerCP, AFC,
tndems de fluorocromos, etc).
2.- Fluorocromos que se unen no covalentemente a estructuras
celulares: Son fluorocromos que debido a su especial composicin molecular se
unen a determinados componentes celulares.
2.1.- Marcadores del contenido en ADN y ARN: Segn el tipo son ms o menos
especficos para el ADN, ARN, o determinadas bases. Se emplean el Hoechst
33342 (Unin a A-T, vital), DAPI (A-T), DIPI (A-T), cromomicina A3 (Unin a GC), olivomicina (G-C), mitramicina (G-C). El naranja de acridina se une al ADN y
ARN pero tiene la particularidad de emitir en diferente longitud segn al tipo de
cido nucleico al que est unido. De uso comn es el ioduro de propidio (unin
intercalante) que se excita con un lser de 488 nm.
2.2.- Marcadores del potencial de membrana: son las cianinas y la rodamina
123. Tambin marcar mitocndrias debido a la alta diferencia de potencial entre
su membrana.
2.3.- Marcadores de membrana y lpidos, marcadores que diferencian
compartimentos con distinto pH: poco usados en citometra de flujo.
3.- Marcadores fluorescentes que son sensibles al microambiente que
les rodea: Ciertos fluorocromos pueden ser empleados para estimar las
propiedades del ambientes en el que se encuentran, puesto que varan su
espectro de absorcin o emisin en funcin de las caractersticas del
microambiente que les rodea.
Se emplean para la determinacin de diversos estados funcionales celulares: pH
(6-carboxi-fluorescena, 2,3-diciano-1,4-dihidroxidenceno, hidroxipireno
trisulfato), calcio (quin II, fura-2, indo-1), potencial red-ox (diclorofluorescena,
NADH, NADHP), actividad enzimtica (substratos que por accin del enzima
varan su fluorescencia o espectro), polaridad (anilino-naftalina-sulfato o ANS),
y viscosidad/fluidez.
La disponibilidad de fluorocromos especficos y con altas prestaciones es
esencial para el desarrollo de aplicaciones por citometra de flujo.
TCNICAS INMUNOFLUORESCENTES, INMUNOFENOTIPAJE:

Durante el proceso de diferenciacin y maduracin celular se expresan genes

que son necesarios para el correcto desarrollo y funcin celular. Algunos de los

productos especficos del gen se expresan en la superficie celular, mientras que

otros son intracelulares. Ello permite caracterizar subpoblaciones celulares.
La respuesta inmune se desencadena cuando en un animal una sustancia
extraa (antgeno) entra en el organismo. Una parte de los linfocitos B se
estimulan y secretan unas protenas llamadas inmunoglobulinas (anticuerpos)
que neutralizan las sustancias extraas. Un linfocitos B slo sintetiza un solo
tipo de inmunoglobulina. Las pruebas inmunolgicas se han visto ayudadas por
el desarrollo de la tecnologa de los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos
tienen dos terminaciones: una responsable de la especificidad (Fab), y otra
regin constante (Fc). Tienen una exquisita especificidad y pueden distinguir
entre pequeas diferencias de estructuras tridimensionales.
El fluorocromo que se conjuga al anticuerpo acta como un simple marcador
con el que se pueden marcar distintos anticuerpos (facilita la standardizacin
del sistema ptico del citmetro).

La unin del anticuerpo a la clula no la mata, lo cual permite establecer sorters

para posterior caracterizacin funcional o bioqumica en funcin de marcadores
celulares de superficie.
Factores limitantes que deben ser tenidos en consideracin es que la frecuencia
relativa de las clulas condiciona la estrategia de marcaje para su bsqueda;
otra es la elevada diferencia de expresin en la superficie celular de los
antgenos (incluso en poblaciones clonadas). La estrategia tambin depende de
lo precisos que deban ser los resultados.

INCREMENTO DE LA SEAL/RUIDO:
Para conseguir lecturas precisas hay que procurar aumentar la razn entre la
seal especfica y el ruido de fondo que enmascara los resultados. Se describen
a continuacin diversos procedimientos para mejorar la lectura de los mtodos
inmunofluorescentes.
1.- Aumento de la seal fluorescente:
1.1.- Antisueros: es la mezcla de inmunoglobulinas que quedan en la sangre
despus de dejarla coagular; es por lo tanto una mezcla de anticuerpos
heterlogos. Son necesarios antgenos puros para inmunizar y el suero necesita
de repetidas purificaciones para que sea suficientemente especfico. Tienen la
ventaja frente a los anticuerpos monoclonales que son heterogneos y pueden
reconocer diferentes partes de la molcula del antgeno, y el resultado final es
que producen una seal fuerte de fluorescencia.
1.2.- Anticuerpos monoclonales: puestos a punto mediante la tecnologa de
los hibridomas en los que clulas inmunocompetentes contra antgenos
conocidos se fusionan con clulas mielomatosas. Los clonas resultantes
producen cantidades de anticuerpo monoclonal que puede ser purificada y
obtenido indefinidamente. La ventaja es que no se necesita de antgenos puros
para inmunizar puesto que se seleccionan clulas determinadas y el anticuerpo
es muy especfico ( se elige el mejor, ms especfico, ms fcil de conjugar con

el fluorocromo, etc.).
1.3.- Tincin inmunofluorescente: se pueden usar tcnicas directas (poco
background pero fluorescencia dbil) o indirectas (aumenta el background pero
aumenta la fluorescencia por amplificacin de la unin). Para reducir el marcaje
inespecfico por receptores Fc se pueden emplear fragmentos F(ab)2 o la
tcnica de la streptavidina-biotina.
1.4.- Seleccin del fluorocromo: el espectro de absorcin del fluorocromo
debe ser cercano al espectro de emisin de la fuente de luz; el coeficiente de
extincin (probabilidad de absorber la luz) debe ser alto (PE >> FITC), recordar
que puede ser modificado al unir el fluorocromo al anticuerpo; el rendimiento
cuntico (probabilidad de emitir fotones al absorber luz) debe ser alto (PE >
FITC), y el espectro de emisin debe ser diferente al de emisin para separar la
seal, y diferente del segundo fluorocromo si se desea hacer doble marcaje. Es
importante el tamao del conjugado, sobretodo con la ficoeritrina, puesto que
puede hacer insoluble al complejo PE-AcMo, y tambin es importante el nmero
de molculas unidas al anticuerpo, porque si aumenta, aumenta la
fluorescencia, hasta que por proximidad se produce artefactuacin de la emisin
o del espectro.
Varios fluorocromos se han usado mayoritariamente en citometra:
o
o
o

Fluorescena (FITC): se excita bien a 488 nm, su rendimiento cuntico es

de 0,5.
Tetrametilrodamina y derivados: est siendo reemplazado por la
ficoeritrina ya que no se excita bien con lseres inicos.
Ficoeritrina (PE): hay dos tipos: B y R. Mejor la R que la B porque se
excita mejor a 488 nm. Ideal para el doble marcaje con fluorescena. Es
de difcil conjugacin con los anticuerpos.
Otros: PerCP, Cy5, y otros, como: Texas red con un pico de absorcin a
596 nm, y aloficocianina que absorbe a 650 y emite a 660: para triple y
cuadruple marcaje con varios lseres.

o
2.- Disminucin del background y ruido:
El factor limitante de las tcnicas de inmunofluorescencia no suele radicar en el
equipo sin en la muestra: marcaje inespecfico y autofluorescencia:
2.1.- Background (marcaje inespecfico): se puede reducir utilizando slo la
parte F(ab)2 de los anticuerpos, evitar clulas muertas que captan al
anticuerpo de modo inespecfico (o discriminar con ioduro de propidio);
procesamiento de controles negativos y seleccin de seal inespecfica,
correccin informtica de solapamiento espectral en doble marcaje. Hay que
tener en cuenta el proceso de transferencia de energa cuando se marca con
dos fluorocromos (muy cercanos en el espacio).
2.2.- Autofluorescencia: la cantidad de autofluorescencia depende del tipo
celular y de sus estado de activacin , y se atribuye a las flavinas y otros
coenzimas. Depende tambin de la longitud de onda del lser (disminuye al
aumentar la longitud de onda). Tambin hay que eliminar el ruido producido por
el aparato con filtros pticos eficientes y compensacin de color.
3.- Otras tcnicas para aumentar la seal/ruido:

Aumentar la frecuencia relativa de las clulas deseadas en una poblacin

heterognea mejora su discriminacin del restante de clulas: ello se puede
conseguir purificando las clulas antes de su procesamiento por citometra (lisis
de los hemates centrifugacin, etc.) o bien con anlisis multiparamtrico
(emplear dispersin frontal y lateral de luz para diferenciar a los linfocitos, la
resistencia elctrica para discriminar en funcin de tamao, ioduro de propidio
para eliminar las clulas muertas, etc..).
4.- Almacenamiento de las muestras:
La partculas o clulas deben ser analizadas inmediatamente despus del
marcaje inmunofenotpico o deben ser fijadas. Las clulas vivas se deben
guardar en medios de cultivo y con un 0,1 % de NaH3 en hielo (4 grados) para
evitar cambios en las condiciones biolgicas. Si se puede (no se precisa
viabilidad celular) las clulas se pueden fijar en un 1 % de paraformaldehido en
PBS y guardar a 4 grados en oscuro, con lo que no disminuye la fluorescencia ni
cambian las caractersticas de dispersin de la luz y se puede demorar la lectura
varios das.
PRESTACIONES DE LOS CITMETROS DE FLUJO:

Se evalan en funcin de varios parmetros:

1.- Sensibilidad: cantidad mnima de molculas de un fluorocromo determinado
que pueden ser medidas con cierta precisin (resolucin), para la luz
dispersada, es el tamao menor o ndice de refraccin que puede ser medido
con cierta precisin. Depende de muchos factores, incluso del fluorocromo. Se
puede decir que la sensibilidad aumenta si se disminuye la velocidad de flujo
(paso) manteniendo constante el dimetro del flujo interno (muestra).
2.- Resolucin (expresado como coeficiente de variacin): es la
reproductibilidad de la seal producida por idnticas clulas o partculas.
3.- Velocidad de medida: es la velocidad media mxima a la que las clulas
pueden ser medidas sin exceder una frecuencia determinada de coincidencias
(dos clulas detectadas como una sola). En los citmetros lser oscila alrededor
de 5.000 clulas/segundo.

CICLO CELULAR Y ANEUPLOIDA. ASPECTOS TERICOS DEL ANLISIS

DEL ADN:

Los cidos nuclicos son polmeros formado por un esqueleto de fosfato unido a
un azcar (ribosa/desoxirribosa) y esta ltima con una base (ADN: AT y GC;
ARN: AU y CG). Los nucletidos unidos por enlaces 5'-3' forman el cido
nuclico que puede ser de hebra sencilla o apareados en doble hebra
complementraria.

Para una buena lectura interviene: el fluorocromo, equipo, muestra, etc..

Recordar que los citmetros ofrecen informacin relativa y que necesitamos
controles de ploida.

FLUOROCROMOS EN EL ANLISIS DEL ADN:

La seal fluorescente es proporcional a la unin del fluorocromo al cido
nucleico (estequiomtrico).
Se clasifican en funcin de su mecanismo de unin en: intercalantes (bromuro
de etidio, ioduro de propidio, naranja de acridina); unin preferente a AT (DAPI,
DIPI, Hoechst); unin preferente a CG (mitramicina, olivomicina, cromomicina
A3).
1.- Grupos generales de fluorocromos: hay cuatro grupos bsicos que
tienen algunas diferencias, sobretodo en el espectro de absorcin (factor
limitante la fuente de iluminacin del citmetro).
1.1.- Phenantidium: del tipo del bromuro de etidio y ioduro de propidio.
Especificidad por el ADN y ARN de doble cadena (tratamiento con ARNasa si
slo se desea medir ADN). Excitacin en el azul/verde-rojo. Precisan de clulas
muertas y fijadas, disminuye la intensidad de la seal y la especificidad la unin
secundaria a los grupos fosfato, proteasas, ADN estructura Z,
bromodeoxiuridina. No se afecta por el pH y la composicin de bases.
1.2.- Bismenimidazoles y afines: tipo Hoechst, DAPI y DIPI. Tienen elevada
especificidad por el ADN y se unen a las bases AT. Excitacin en el ultravioletaazul. Tien clulas vivas. Disminuye su intensidad con el pH cido (que
aumenta la unin secundaria), concentracin en exceso, bromodeoxiuridina, y
la unin secundaria. El DAPI y DIPI se usan para hacer las bandas
cromosmicas.
1.3.- Cromomicina y similares: como la cromomicina A3, mitramicina,
olivomicina. Se unen a las bases CG del ADN. Excitacin en el espectro
ultravioleta-azul/verde. Requieren del in magnesio (Mg) para la unin, pueden
teir clulas vivas. No afecta el pH.
1.4.- Otros: quinacrina (intercalante), naranja de acridina (unin al ADN y ARN
bicatenario, emisin diferente).

2.- Factores que influyen en la unin del fluorocromo al cido nucleico:

hay diversos factores que influyen en la unin.
2.1.- Muestra a analizar: depende del ADN, de la composicin de bases (AT,
CG), de la presencia de bases modificadas (bromodeoxiuridina) o metilacin,
estructura del ADN. Tambin depende de la unin entre las protenas
cromosmicas (histnas) y ADN, una unin fuerte entre ellos (formol) dificulta
la incorporacin del fluorocromo, se puede hacer incubacin con proteasas. Hay
que tener en cuenta la membrana citoplasmtica (el ioduro de propidio no la
atraviesa), y componentes intracelulares.

2.2.- Qumica, cintica y equilibrio de la unin: depende la concentracin

de sales del medio (favorece la disociacin histona-ADN), fuerza inica (inhibe
unin secundaria), la cromomicina necesita Mg, el pH (el pH cido favorece la
unin secundaria del Hoescht). Se debe tener cuidado con la concentracin, las
condiciones y el tiempo de incubacin.

ESTUDIO DE ANEUPLOIDA Y CICLO CELULAR:

En el ciclo celular se distinguen varias fases: la fase de reposo (G0), fase de
sntesis proteica (G1a), sntesis de ARN (G1b), sntesis de material gentico o
ADN (fase S), de nuevo sntesis de protenas (G2), y por ltimo divisin celular
(M). Segn el tipo y funcin de la clula, sta tiene ms o menos actividad
proliferativa, y el ciclo puede variar segn diversas condiciones: frmacos,
radiaciones, etc. Una poblacin proliferante asincrnica no debera tener ms
fase M que S.

1.- Tcnicas para medir la sntesis de ADN, estudio del ciclo celular:
Se supone que la intensidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de
fluorocromo, que es proporcional a la cantidad de ADN de la clula.
Hay cierta variacin entre el resultado terico y el obtenido, por ello se define el
coeficiente de variacin (CV) que nos da una idea de la semejanza de los
resultados obtenidos a la realidad. A partir del histograma, para calcular la fase
S, se pueden emplear varios mtodos informticos: rectangular, lineal,
polinomial, Gauss. El resultado vara segn el mtodo. Se puede hacer doble
marcaje con ioduro de propidio y la tcnica de la bromodeoxiuridinaantibromodeoxiuridina para conocer la sntesis real.

2.- Deteccin de aneuploida de ADN:

El trmino aneuploida de ADN significa presencia de una poblacin con un
contenido en ADN diferente a un control de clulas semejantes y en igual fase
del ciclo celular.
Se define como ndice de ADN (ID) al cociente entre la moda del pico G0G1
de la poblacin problema y la moda del pico G0G1 del control (en %).
A partir de ah se define: ADN diploide si ID igual 1, ADN aneuploide si ID
diferente de 1, (hiperploide si ID superior a 1, hipoploide si ID inferior a 1,
poliploide si ID es igual a 1.5, 2, 2.5, etc., haploide si ID es igual a 0.5).
Un problema importante es la discriminacin de dobletes que interfieren y
aumentan la fase de mitosis. La solucin se debe buscar en la tcnica, criterios
de standardizacin y soluciones citomtricas de anlisis de la seal.
2.1.- Algunos criterios para considerar aneuploida de ADN: (1) presencia
de dos poblaciones en la muestra, (2) coeficiente de variacin de la poblacin
aneuploide mayor que la euploide, (3) presencia de clulas en la regin de G2M
de la poblacin problema dudosamente aneuploide, (4) proporcionalidad entre
las fases, (5) comprobar los picos con distintas tcnicas.
2.2.- Linealidad del citmetro: la zona de mxima linealidad es la intermedia.
Para medir la cantidad de ADN se usa la rea en lugar de la altura de la seal.
Con una buena tcnica y el citmetro en condiciones se deben conseguir
coeficientes de variacin que permitan separar clulas con ndices de ADN de
0,95 a 1,05; en su defecto al menos de 0,9 a 1,1.
ESTNDARES Y CONTROLES:

1.- Estndares (Patrones de normalidad):

Un standard es un material estable que tiene unos valores determinados de
fluorescencia o dispersin de luz. Se usan para alinear o calibrar las
prestaciones del citmetro de flujo. Hay comerciales o se los puede preparar
uno mismo.

1.1.- Alineamiento y prestaciones: el uso de standards de alineamiento

proporciona un buen mtodo para detectar cambios y problemas en la
configuracin ptica y seal de un da a otro.
El citmetro de flujo se considera alineado cuando se consigue una elevada
fluorescencia o seal con un bajo CV. Se debe comprobar para todas las seales
y llegar a un compromiso entre ellas porque a veces cuando una aumenta la
otra disminuye.
1.2.- Calibracin (ajuste de escalas): los citmetros de flujo ofrecen una
informacin relativa, no absoluta. Para cuantificar hay que correlacionar los
canales con resultados de muestras conocidas.
El mtodo ms sencillo consiste en ajustar el voltaje del fotodetector (produce
cambios exponenciales o no-lineales de la seal) y/o ganancias (crecimiento
lineal) para conseguir un pico de una intensidad determinada de un standard
estable cada da. Es el equivalente a reseleccionar el citmetro a una escala de
intensidad relativa constante. Tambin es til hacer una calibracin cruzada de
escalas logartmicas y lineales.
1.3.- Compensacin de color: en las aplicaciones citomtricas con dos o ms
fluorescencias nuestro objetivo es marcar las clulas con fluorocromos distintos
que reflejen las diversas propiedades celulares diferentes y detectar la seal
proporcional a la primera fluorescencia (FL1) en un detector y la de la segunda
(FL2), etc, sin desviaciones producidas por interferencias de la seal. Los
fluorocromos tienen espectros de emisin que en ocasiones se superponen y los
filtros no son perfectos, por ello los citmetros poseen un sistema informtico
de compensacin o sustraccin de seal.

Es difcil predecir tericamente el grado de compensacin y hay que ajustarlo

individualmente. Generalmente se debe extraer FL1 (fluorescena) de FL2
(ficoeritrina), y tambin FL3 (ioduro de propidio) a FL2 y FL1 (fluorescena).
1.4.- El tiempo como standard: en los citmetros que lo permiten, se pueden
hacer grficas del nmero de clulas procesadas, del canal de fluorescencia,
etc.. a lo largo del tiempo. Se puede usar para ver la estabilidad de las
mediciones del citmetro con el tiempo y detectar la presencia de algn
problema.
1.5.- Standardizacin del procedimiento de sorting: la validez de nuestras
conclusiones depende de la pureza del resultado ya que el tiempo slo depende
de la eficiencia del sorting. Se producen ms gotas vacas que con clulas y
generalmente se sortean tres gotas por evento activado. Para calcular el retardo
se hacen pruebas hasta conseguir la mejor recuperacin (mnimo del 95 %). Si

se desea mirar tambin la pureza se usan bolas de dos colores y se establece

una ventana de sorter sobre unas de ellas. Cuando el nmero de clulas a
sortear debe ser preciso se pueden mezclar bolas con la muestra y calcular el
porcentaje de recuperacin de ellas, sabiendo ste (que se cuenta durante la
separacin) se asume que es el mismo que para las clulas, y se calcula el
nmero total de eventos a procesar para conseguir el nmero total de clulas
deseadas.
La monitorizacin en tiempo real de la velocidad de adquisicin puede
proporcionar informacin continuada de que no hay problemas en el correcto
funcionamiento del citmetro.
1.5.- Control de calidad: Hay que asegurarse que el citmetro funciona bien
cada da para poder comparar los resultados.
Hay dos mtodos: (1) no variar las condiciones de lectura y apuntar el canal
medio del pico standard y hacer curvas de da a da, y (2) fijar la posicin
constante del pico del standard variando las condiciones de lectura
(fotodetectores) y hacer curvas. Las dos son vlidas pero es ms sencilla la
primera por que la segunda tiene una variacin no-lineal. Se pueden hacer
ambas.

2.- Controles:
Los controles son un material que produce unos resultados esperados
(conocidos). Se usan para monitorizar las prestaciones o reproductibilidad de
los reactivos y la calidad de los mtodos de preparacin celular. Son
importantes en los anlisis de ADN e inmunofluorescencia. Generalmente se
usan controles de ploida y controles de inmunofluorescencia positivos y
negativos.
2.1.- Controles para cuantificacin de ADN y anlisis de las fases del
ciclo celular: como control de ploida se debe usar un control interno,
procesado en el mismo tubo que la muestra, para descartar o asegurar
aneuploida y calcular en ndice de ADN (tambin se puede procesar por
separado y mezclar), y otro tubo para calcular las fases del ciclo celular.
Las mejores clulas de referencia son clulas diploides del mismo individuo e
igual tejido, sin de igual tejido, y sin de diferente individuo y tejido, y por
ltimo de otra especie animal.
Para realizar una buena lectura de ADN se debe tener al citmetro de flujo en
perfectas condiciones y ser cuidadoso en el proceso de preparacin de la
muestra y tincin. Se deben usar controles. El anlisis e interpretacin se hace
mediante el software adecuado.
2.2.- Inmunofluorescencia: el objetivo de los anlisis de inmunofluorescencia
es usar reactivos especficos para identificar subpoblaciones celulares. Se
necesitan controles negativos para descartar unin inespecfica del fluorocromo
y seleccionar el umbral de autofluorescencia.
Son causas de tincin inespecfica los fragmentos Fc de la inmunoglobulinas, las
clulas muertas, debrs, etc... Si tenemos problemas con el control negativo se
debe procurar procesar con cuidado las muestras preservando su viabilidad,
utilizar fragmentos F(ab)2 o centrifugar el anticuerpo monoclonal para evitar
agregados, eliminar las clulas muertas con doble marcaje con ioduro de
propidio y diacetato de fluorecena. Si a pesar de todo seguimos obteniendo una
distribucin unimodal con considerable superposicin entre el control negativo y
el control positivo, podemos asumir (con ciertas reservas) que la tincin es
especfica pero de baja intensidad (no es seguro).

Los controles positivos son tambin esenciales para comprobar que la tcnica
funciona. Si no se emplean los resultados negativos de una muestra que se
espera positiva no se sabe si son por alteracin antignica o fallo de marcaje.