Trabajo de biotecnologa

GRUPO VI
BIOTECNOLOGA.
1 Definicin de Biotecnologa.
2 Definicin de :
a Enzima de restriccin.
b Nucleasa.
c

DNAsa.

d Hibridacin
3 Mtodos utilizados en Biologa Molecular.
a Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
i Pasos de la PCR.
ii Tipos de PCR.
b Southern Blotting
c

Northern Blotting

d Western Blotting

Biotecnologa
La biotecnologa es un rea multidisciplinaria, que emplea la biologa, qumica y procesos, con gran
uso en agricultura, farmacia, ciencia de los alimentos, ciencias forestales y medicina. Probablemente
el primero que us este trmino fue el ingeniero hngaro Karl Ereky, en 1919.
Una definicin de biotecnologa aceptada internacionalmente es la siguiente:
La biotecnologa se refiere a toda aplicacin tecnolgica que utilice sistemas biolgicos y organismos
vivos o sus derivados para la creacin o modificacin de productos o procesos para usos especficos
(Convention on Biological Diversity, Article 2. Use of Terms, United Nations. 1992).
La biotecnologa genera innovacin constante, aplicable a sectores diversos como la industria textil,
qumica, farmacutica, alimentaria, de la energa, la agroindustria, etc. Tambin ofrece beneficios
ambientales en trminos de cuidado de la ecologa, ya al ser ms limpios los procesos industriales,
brindan soluciones al problema de la contaminacin. La incorporacin de la biotecnologa simplifica
los procesos, mejora la calidad de los productos, ahorra costos con menor impacto ambiental, y
permite el desarrollo de nuevas terapias y productos. Tcnicas in vitro de ADN, inyecciones de cido
nucleico en clulas, fusin de 2 o ms clulas de distintas familias de reproduccin, tcnicas no
tradicionales de reproduccin son slo algunos de los procedimientos de la diversidad biolgica y
seguridad de la biotecnologa
Las aplicaciones de la biotecnologa son numerosas y se suelen clasificar como:
* Biotecnologa roja: se aplica a la utilizacin de biotecnologa en procesos mdicos. Algunos
ejemplos son el diseo de organismos para producir antibiticos, el desarrollo de vacunas y nuevos
frmacos, los diagnsticos moleculares, las terapias regenerativas y el desarrollo de la ingeniera
gentica para curar enfermedades a travs de la terapia gnica.
* Biotecnologa blanca: conocida como biotecnologa industrial, es aquella aplicada a procesos
industriales. Un ejemplo de ello es el diseo de microorganismos para producir un producto qumico
o el uso de enzimas como catalizadores industriales, ya sea para producir productos qumicos
valiosos o destruir contaminantes qumicos peligrosos (por ejemplo utilizando oxidorreductasas).
Tambin se aplica a los usos de la biotecnologa en la industria textil, en la creacin de nuevos
materiales, como plsticos biodegradables y en la produccin de biocombustibles. Su principal
objetivo es la creacin de productos fcilmente degradables, que consuman menos energa y
generen menos deshechos durante su produccin. La biotecnologa blanca tiende a consumir menos
recursos que los procesos tradicionales utilizados para producir bienes industriales.
* Biotecnologa verde: es la biotecnologa aplicada a procesos agrcolas. Un ejemplo de ello es el
diseo de plantas transgnicas capaces de crecer en condiciones ambientales desfavorables o
plantas resistentes a plagas y enfermedades. Se espera que la biotecnologa verde produzca
soluciones ms amigables con el medio ambiente que los mtodos tradicionales de la agricultura
industrial. Un ejemplo de esto es la ingeniera gentica en plantas para expresar plaguicidas, con lo
que se elimina la necesidad de la aplicacin externa de los mismos, como es el caso del maz Bt. Si
los productos de la biotecnologa verde como ste son ms respetuosos con el medio ambiente o no,
es un tema de debate.

* Biotecnologa azul: tambin llamada biotecnologa marina, es un trmino utilizado para describir
las aplicaciones de la biotecnologa en ambientes marinos y acuticos. An en una fase temprana de
desarrollo sus aplicaciones son prometedoras para la acuicultura, cuidados sanitarios, cosmtica y
productos alimentarios.
* Biotecnologa gris: tambin llamada biotecnologa del medio ambiente, es aquella aplicada al
mantenimiento de la biodiversidad, preservacin de las especies y la eliminacin de contaminantes y
metales pesados de la naturaleza. Est muy ligada a la biorremediacin, utilizando plantas y
microorganismos para reducir contaminantes.
Biotecnologa naranja: es la biotecnologa educativa y se aplica a la difusin de la biotecnologa y la
formacin en esta rea. Proporciona informacin y formacin interdisciplinaria sobre temas de
biotecnologa (por ejemplo, el desarrollo de estrategias educativas para presentar temas
biotecnolgicos tales como el diseo de organismos para producir antibiticos) para toda la sociedad
incluyendo a las personas con necesidades especiales, como las personas con problemas auditivos
y/o visuales. Se pretende fomentar, identificar y atraer a personas con vocacin cientfica y altas
capacidades / superdotacin para la biotecnologa.

Definiciones:
Enzima de restriccin.
Las enzimas de restriccin son nucleasas que cortan ADN de doble cadena cuando reconocen un
patrn de secuencia especfico. Generan fragmentos de ADN conocidos como fragmentos de
restriccin. Las enzimas de restriccin son herramientas imprescindibles en biologa molecular,
ingeniera gentica y biotecnologa.
Se descubrieron en los aos 60 y su uso en biologa molecular empez en los 70 permitiendo el
desarrollo de las tecnologas de ADN recombinante. Las enzimas de restriccin tienen actividad
endonucleasa y cortan enlaces fosfodister en las dos cadenas del ADN. Reconocen ciertas
secuencias en el ADN. Las enzimas de restriccin de tipo I y III reconocen una secuencia especfica
pero cortan a una distancia variable del sitio de reconocimiento (sitio de restriccin). Las enzimas de
restriccin de tipo II reconocen una secuencia especfica conocida como secuencia diana y siempre
cortan entre los mismos nucletidos. De ah que generen siempre los mismos fragmentos de
restriccin. La secuencia diana es de tamao variable, la mayora de 4 y 6 nucletidos, y con
frecuencia es parcialmente palindrmica. Algunas enzimas de restriccin cortan generando extremos
llamados romos mientras que otras cortan generando extremos llamados cohesivos.
Uno de los campos en los que las enzimas de restriccin han tenido mayor implicacin ha sido el
diagnstico de enfermedades genticas relacionadas con cambios en la secuencia del ADN, ya sean
mutaciones puntuales, inserciones o deleciones de fragmentos. Si stas se producen en un sitio de
reconocimiento de la enzima de restriccin, al producirse eliminarn o agregarn nuevos sitios de
corte. Al aplicar esta enzima al gen de una persona sana y una enferma se deberan observar
distintas cantidades de fragmentos para cada caso en una electroforesis.

Las enzimas de restriccin son una herramienta bsica en Biologa molecular: en laboratorios de
PCR, creacin de sondas para hibridacin, laboratorios de secuenciacin de ADN, ingeniera
gentica, procesos de clonacin, manejo de genotecas y en muchas otras reas de genmica.

Nucleasa.
El ADN es el depositario y transmisor de la informacin gentica organizada en genes que codifican
productos gnicos (protenas o ARNs). Las nucleasas son enzimas que producen la rotura de los
enlaces fosfodiester de la cadena polinucleotdica de los cidos nucleicos.
Las nucleasas son enzimas hidrolasa del tipo esterasa que degradan cidos nucleicos [2]. Las
fosfodiesterasas o nucleasas son enzimas hidrolasas que catalizan la ruptura de los enlaces
fosfodister, como por ejemplo los que se establecen en los cidos nucleicos entre la pentosa de un
nucletido y el grupo fosfato de otro. Su accin regula la concentracin dentro de las clulas del AMP
cclico y del GMP cclico
Tipos
Ribonucleasas: especficas del ARN, por lo que tambin se llaman ARNasas o RNasas.
Desoxirribonucleasas: especficas del ADN, por lo que tambin se llaman ADNasas o DNasa.
Exonucleasas: escinden el ltimo nucletido del extremo 5' o 3' de un polinucletido. Pueden
degradar por completo un cido nucleico lineal.
Endonucleasas: cortan los enlaces fosfodister situados en el interior de los polinucletidos. Estos
enzimas no requieren un extremo libre, por lo que pueden cortar cidos nucleicos circulares. Algunas
endonucleasas, como la ADNasa I y la ADNasa II, son poco especficas por lo que se refiere a la
secuencia de nucletidos que hidrolizan.
Las nucleasas se pueden utilizar para la determinacin estructural de cidos nucleicos mediante el
diseo de nucleasas que puedan reconocer ciertas conformaciones de los cidos nucleicos
(cruciformes, por ejemplo), regiones de hebra sencilla o de hlices levgiras y para el estudio del
mecanismo de accin de las nucleasas naturales. Las nucleasas se pueden emplear en el
tratamiento de enfermedades producidas por virus, hongos, bacterias y algunos tipos de cncer. Si el
grupo cataltico est unido a un oligonucletido antisentido pueden producir la rotura del ARNm lo
cual impide la sntesis de la protena codificada por el gen respectivo

DNAsa.
enzima que cataliza la rotura de los enlaces fosfodister en el DNA. Si la enzima cataliza la rotura del
enlace fosfodister terminal se la denomina exodesoxirribonucleasa, mientras que si es un enlace
interno se la denomina endodesoxirribonucleasa.
Una desoxirribonucleasa (DNasa, para abreviar) es cualquier enzima que cataliza la rotura hidroltica
de los vnculos fosfodister en el ADN de red troncal, por tanto, son un tipo de nucleasa. Son
conocidas una amplia variedad de desoxirribonucleasas, que difieren en las especificidades de su
sustrato, mecanismos qumicos y funciones biolgicas

Funcin
Algunas DNasas cortan residuos slo en los extremos de las molculas de ADN (exodeoxiribonucleasa, un tipo de exonucleasa). Otros cortan en cualquier punto de la cadena (endodeoxiribonucleasas, un subconjunto de endonucleasas).
Algunas son bastante indiscriminadas sobre la secuencia de ADN que corta, mientras que otros,
incluyendo las enzimas de restriccin, son para secuencias muy especficas.
Algunos cortan slo ADN de hebra doble, otros son especficos para las molculas de cadena
simple, y otros ms activos hacia ambos

Hibridacin
Proceso de generacin de una molcula, clula u organismo combinado con material gentico
procedente de organismos diferentes. En las tcnicas tradicionales, los hbridos se producan
mediante el cruzamiento de variedades distintas de animales y plantas por alineacin o
apareamiento de bases de dos molculas de ADN de cadena sencilla que son homlogas o
complementarias. La tecnologa de fusin celular y la manipulacin transgnica son las nuevas
modalidades de hibridacin introducidas por la manipulacin gentica.

Mtodos utilizados en Biologa Molecular.

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
La Reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls (Polymerase
Chain Reaction), es una tcnica de biologa molecular descrita en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo
es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en
teora basta partir de una nica copia de ese fragmento.
Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN. Tras la amplificacin, resulta mucho ms
fcil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad,
identificar personas (test de paternidad) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado.
En 1984, Kary Mullis ide un mtodo ingenioso llamado reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
para amplificar Secuencias de ADN. Consideremos un dplex de ADN que consiste en una
secuencia diana rodeada por ADN no objetivo. Millones de Las secuencias diana se pueden obtener
fcilmente por PCR si se conocen las secuencias flanqueantes del objetivo. La PCR se lleva a cabo
Aadir los siguientes componentes a una solucin que contiene la secuencia diana: (1) un par de
cebadores que se hibridan con Las secuencias flanqueantes de la diana, (2) los cuatro
desoxirribonuclesido trifosfatos (dNTPs), y (3) un ADN termoestable Polimerasa.

Pasos de la PCR.
La PCR consta de tres pasos que se repiten durante varios ciclos (varan entre 25 a 40). Todas las
reacciones empiezan con la activacin de la polimerasa, por lo cual se somete a una temperatura de
94-95C durante 5-10 minutos.

Posteriormente los pasos que se repiten son

1. Desnaturalizacin (denaturation)
Se desnaturaliza el ADN, es decir se separan las dos hebras de las cuales est constituido. Este
paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95C) de la muestra la
forma ms habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la denaturacin depende, por
ejemplo, de la proporcin de G+C que tenga la hebra, como tambin del largo de la misma.
2. Alineamiento (annealing)
En esta etapa se hibridacin el cebador o partidor, unindose a secuencias complementarias en el
ADN molde. Para esto es necesario que la temperatura descienda (puede variar segn sea el caso
entre 45C y 65C). Estos cebadores actuarn como lmites de la regin de la molcula que va a ser
amplificada.
3. Extensin de la cadena
Por ltimo acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena
complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la sntesis de nuevo
ADN. Se aumenta la temperatura hasta 72 C, temperatura a la cual la ADN polimerasa presenta su
mximo de actividad, aumentando exponencialmente la cantidad de fragmentos de ADN amplificados
en la reaccin.
Una vez completados todos los ciclos, se finaliza con dos pasos, uno de extensin de la cadena a la
temperatura ptima de la ADN polimerasa, normalmente 72C, para finalizar enfriando la muestra a
4C para su conservacin.
PCR puede proporcionar valiosa informacin de diagnstico en medicina. Las bacterias y los virus se
pueden detectar fcilmente con el uso De cebadores especficos.

Tipos de PCR.
PCR anidada
Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificacin es utilizado como molde
para realizar una segunda amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la primera
secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer amplicn se pueden unir los cebadores y
se hace de nuevo una amplificacin dentro del amplicn inicial. Este tipo de PCR tiene la ventaja de
brindar alta sensibilidad y especificidad. La especificidad aumenta porque como es amplificacin de
un amplicn obtenido previamente, los cebadores slo van a hibridar en un sitio dentro de la
molcula y el resultado ser una nica banda. As, evitamos posibles hibridaciones inespecficas de
los cebadores. Ladesventaja de esta tcnica es que no nos permite cuantificar la muestra.
PCR in situ
La PCR in situ consiste en una reaccin de PCR en secciones histolgicas o clulas, donde los
productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin. Es realizada sobre
preparaciones fijas en un portaobjetos. En la tcnica de PCR in situ se realiza una primera
amplificacin de ADN blanco y luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondas

de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequesimas de genoma. Esta

tecnologa es de gran alcance en la capacidad de amplificar especficamente una poblacin de
secuencias de menor representacin.
PCR mltiple
PCR en la cual se amplifica simultneamente ms de una secuencia. Para ello, se combinan dos o
ms pares de cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los reactivos de la reaccin en
cantidades suficientes, para amplificar simultneamente varios segmentos de ADN. Ventajas:
informacin sobre varios locus en una sola reaccin, menor cantidad de molde para el anlisis,
menor cantidad de reactivos, rpida construccin de bases de datos. Desventajas: para llevarla a
cabo adecuadamente y sin errores, se requiere de una cuidadosa optimizacin del proceso.
RT-PCR
Dado que el ARN usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor, es necesario hacer una
transcripcin reversa (RT) antes de iniciar la amplificacin por PCR. La transcripcin reversa genera
una copia de la hebra de ARN, pero esta copia es ADN complementario (ADNc o DNAc en ingls) el
cual es estable al calor y puede resistir la metodologa PCR.
PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR)
Reaccin de PCR cuya principal caracterstica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN
presentes en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN
especficas a partir de su temperatura de fusin (tambin denominado valor Tm, del ingls melting
temperature).
Se puede dividir en las tcnicas basadas en fluorocromos no especficos y en las tcnicas basadas
en sondas especficas.
En las tcnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo, se
une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el
termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar slo una secuencia por reaccin
pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su realizacin. Es mucho ms econmica
que la que usa sondas especficas.
Las tcnicas basadas en sondas especficas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida
en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse); cuando la sonda est
intacta, presenta una transferencia energtica de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET
no se produce cuando la sonda est daada y los dos fluorocromos estn distantes, producto de la
actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrn de
fluorescencia y deducir el nivel de amplificacin del gen.

Tcnicas de transferencia (blotting)

Las tcnicas Southern blot y Northern blot se utilizan para separar y caracterizar ADN y ARN
respectivamente. La tcnica de Southern fue desarrollada por Edwin Southern para separar ADN y
por analoga la separacin de ARN se denomin Northern y la transferencia de protenas que se
denomin Western blot. El Southern Blot, que detecta la presencia de ciertas secuencias en el ADN,

se usa, por ejemplo, para estudiar mutaciones en el genoma. El Northern, en cambio, permite
detectar qu genes son transcriptos en determinadas condiciones. Hemos visto que dos clulas del
mismo organismo se distinguen por los genes que expresan y no por su ADN. El Southern Blot nos
permite evidenciar el mismo material gentico y el Northern Blot, la expresin de diferentes genes.
Estas tcnicas comienzan con una electroforesis en gel con el objetivo de separar las molculas por
su tamao, posteriormente la transferencia a una membrana para finalmente identificar un fragmento
especfico de ADN, una molcula de ARN particular o una protena de inters mediante la unin
especfica de otra molcula de cido nucleico (sonda) para ADN o ARN o anticuerpo para protenas.
La tcnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografa, y
permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de
protenas o de cidos nucleicos:
Si se trata de protenas, la tcnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con
radioactividad para identificar cul es la banda que presenta la protena que me interesa localizar
Si se trata de DNA, la tcnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (molculas de
DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qu bandas del gel
contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Si se trata de RNA, la tcnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (molculas de
RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qu bandas del gel
contienen secuencias complementarias a la de la sonda

Southern blot.
Es un mtodo de biologa molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en
una mezcla compleja de este cido nucleico. Para ello, emplea la tcnica de electroforesis en gel de
agarosa con el fin de separar los fragmentos de ADN de acuerdo a su longitud y, despus, una
transferencia a una membrana en la cual se efecta la hibridacin de la sonda. Su nombre procede
del apellido de su inventor, un bilogo ingls llamado Edwin Southern.
Los pasos para Southern blot:
1. Extraccin del ADN: Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano.
2. Digestin del ADN con una endonucleasa de restriccin. El ADN extrado de la muestra se trata
con una endonucleasa de restriccin,que es una enzima que corta el ADN bicatenarios en donde
tenga una secuencia caracterstica.
3. Electroforesis en gel de agarosa: Tras la digestin del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se
separan segn su tamao mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las
molculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las
molculas de ADN, su velocidad de migracin se ve reducida por la matriz del gel de agarosa
4. Preparacin de un ensayo de Southern ("Southern blot"): Tras la electroforesis, las molculas de
ADN separadas se desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando ste con
una disolucin alcalina. Tras la neutralizacin de sta, el DNA monocatenario resultante se transfiere

a la superficie de una membrana de nailon, realizando as una copia o "calco" (la traduccin ms
literal del ingls blot, conservando este sentido, es "secante"). Este proceso de desnaturalizacin y
transferencia se conoce como mtodo de Southern en recuerdo de quien lo invent, Edward
Southern.
5. Hibridacin con sonda radioactiva: Una sonda de locus nico es una molcula pequea de ADN o
ARN capaz de hibridar con el ADN de un fragmento de restriccin concreto en el ensayo de
Southern. La formacin de la molcula dicatenaria (dplex) depende del emparejamiento de bases
complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el"calco". Las sondas de
locus nico se marcan habitualmente con un istopo radiactivo para facilitar su deteccin, y se eligen
para que detecten un locus gentico polimrfico en un solo cromosoma humano.
6. Deteccin de los RFLPs mediante autorradiografa: Las posiciones de hibridacin de la sonda
radiactiva sobre la membrana del ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografa. En
esta tcnica, La membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una pelcula de rayos X
dentro de una caja que las asle de la luz. La pelcula registra las posiciones donde hay
desintegracin radiactiva. Tras su exposicin y el revelado fotogrfico, el registro resultante de la
hibridacin de Southern se conoce como autorradiografa.
7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales: En un anlisis legal de DNA se
suelen caracterizar polimorfismos de ADN en varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una
autorradiografa para la primera sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolucin a elevada
temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda radiactiva que se una
a un locus diferente. Se repiten as las etapas 5-7, detectando cada vez un locus diferente. El grupo
de autorradiografas de una misma transferencia de Southern se conoce como un "perfil de ADN"

Northern blot
Es similar a la tcnica anterior, pero permite detectar RNA en vez de DNA (Innis y Gelfand, 1990). En
sntesis la tcnica consiste en extraer el RNA de las clulas pertinentes y su posterior separacin por
tamao mediante electroforesis en gel. Las muestras de RNA son normalmente separadas en geles
de agarosa que contienen formaldehdo como agente desnaturalizante del RNA para obtener su
estructura secundaria. Los geles pueden ser teidos con bromuro de etidio y visualizados bajo luz
ultravioleta para observar el RNA. Los geles de poliacrilamida con urea tambin pueden utilizarse,
aunque esto suele limitarse a fragmentos de RNA o miRNA, ya que crean un tamao de poro mas
estrecho en su matriz, por lo que el RNA que suele utilizarse no podra desplazarse por el gel.
Las molculas de RNA son transferidas y unidas al filtro, al igual que en el Southern blot. Despus de
la hibridacin con una sonda marcada (y posterior a la deteccin segn el mtodo de marcaje
utilizado), las bandas en el gel indican la ubicacin de los tipos de RNA que sean complementarios a
la sonda. Teniendo marcadores de RNA de tamao adecuado, se puede conocer el tamao de los
RNA que se han identificado. As, la tcnica permite conocer el tamao preciso de un mRNA, luego
del empalme transcripcional. Adems, sirve para identificar diferentes tipos de mRNA codificados por
un mismo gen y para determinar la cantidad y el tejido especfico (o tipo de clulas) en que se
encuentra un mRNA especfico. As, ser posible determinar los niveles de actividad gnica, por
ejemplo durante el desarrollo, o bien en distintos tejidos (o tipos celulares) durante un perodo

definido dela vida, o despus de haber sido sometido a los organismos a diferentes estmulos
fisiolgicos.

Western blot.
El Western blot, o inmunoblot, es una tcnica analtica usada para detectar protenas especficas en
una muestra determinada (una mezcla compleja de protenas, como un extracto tisular). Se utiliza
para determinar la presencia y cantidad de antgenos y de anticuerpos especficos. En la actualidad
el Western blot es el estudio confirmatorio ms empleado para el diagnstico del SIDA. Se emplean
antgenos virales obtenidos por cultivo celular.
Mediante electroforesis se separan las diferentes protenas vricas por su diferente peso molecular.
Posteriormente se transfieren a papel de nitrocelulosa y secundariamente se incuban con el suero
problema. Los anticuerpos se detectan aadiendo una antiIgG humana marcada con una enzima
(peroxidasa) que produce una banda coloreada al aadir un sustrato. Esta tcnica identifica
anticuerpos especficos frente a las distintas protenas del VIH. Las protenas son separadas en
primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y posteriormente se transfieren
mediante la aplicacin de un campo elctrico y un tampn de transferencia para llevar las protenas
desde el gel hacia la membrana.
Para ello, se apilan en el orden descrito los siguientes elementos (del polo negativo o ctodo al
positivo o nodo): esponja, varios papeles de filtro empapados en buffer de transferencia, gel,
membrana, ms papeles de filtro empapados y otra esponja. Este montaje, llamado coloquialmente
sndwich, se dispone en el sistema de transferencia y se aplica una corriente elctrica, de magnitud
acorde a los materiales empleados, al tiempo disponible,... Las protenas del gel se desplazan hacia
el polo positivo y quedan atrapadas por la membrana. Tras la transferencia, se suele proceder a la
tincin del gel con Coomassie Brilliant Blue (un colorante de protenas) para comprobar que en
efecto una parte importante del material proteico ha pasado a la membrana.
La electrotransferencia es hoy en da la tcnica de transferencia ms usada gracias a la velocidad
del proceso y al elevado porcentaje de protena que se transfiere (especialmente en comparacin
con las otras tcnicas). Los resultados que nos informa el laboratorio son tres: un resultado positivo
es cuando aparecen mltiples bandas, un resultado negativo es cuando no aparece ninguna banda y
un resultado indeterminado es cuando slo aparece alguna o algunas bandas pero que no son
suficientes para ser considerado como positivo.