An Assessment of the Kinetics of Butanol Production by

Clostridium
acetobutylicum
F.
Se presentan los resultados de una actividad de investigacin con el objetivo de
investigar la viabilidad de la produccin de acetona-butanoiletanol (ABE) por
Clostridium acetobutylicum DSM 792. Se ha evaluado la cintica del proceso de
produccin de ABE por C. acetobutylicum libre en reactores discontinuos. Un
CSTR equipado con una unidad de microfiltracin ha sido configurado y operado
para evaluar la cintica en la fase solvente. Se adoptaron soluciones de
concentracin de lactosa entre 10 y 100 g / l, como medio, con el objetivo de
emular el suero de queso. El proceso de conversin se caracteriz en trminos de
clulas, cidos, disolventes, pH y compuestos orgnicos totales en funcin del
tiempo. Los ensayos realizados en condiciones de lote muestran que: i) el
crecimiento de las clulas es constante para la concentracin de lactosa (CL)
inferior a 100 g / l; Ii) el butanol especfico
La velocidad de produccin - estimada al inicio de la fase solvasa - en funcin de
CL puede estar representada por una cintica similar a Monod; Iii) la conversin de
lactosa - medida al final de la fase de la disolvente - disminuye con CL; Iv) la
selectividad de butanol con respecto a los disolventes totales aumenta con CL y se
estabiliza a aproximadamente 72% de W para CL superior a 30 g / L. Las pruebas
preliminares realizadas en condiciones continuas muestran que el proceso se
aprovecha del estado estacionario en condiciones solventes . En particular, la tasa
de conversin de butanol es mayor en el CSTR que en el STR, a pesar de la
menor concentracin final de lactosa experimentada en el CSTR.

INTRODUCCIN
Las fermentaciones con acetona-butanol-etanol (ABE) han aumentado a un
renovado inters como forma de actualizar la biomasa en valiosos combustibles
lquidos (Cascone, 2008). Los recientes desarrollos de las tcnicas moleculares
aplicadas a los microrganismos solventes en combinacin con los avances en la
tecnologa de fermentacin y procesamiento posterior han contribuido a mejorar la
factibilidad y competitividad de los procesos de fermentacin ABE. Los desafos
planteados en los ltimos aos en relacin con la produccin de ABE pueden
resumirse en: i) el uso de recursos renovables y desperdiciados como sustratos; Ii)
seleccin de cepas caracterizadas por una alta productividad de ABE; Iii)
desarrollo de nuevos sistemas de fermentacin; Iv) el desarrollo de nuevas
estrategias para la recuperacin de solventes.
La seleccin de sustratos no convencionales es favorecida por la capacidad de las
cepas de clostridia de metabolizar una amplia gama de carbohidratos - pentosas y

hexosas - como glucosa, lactosa, etc ..., tpicamente presentes en corrientes de

aguas residuales de, por ejemplo, la industria alimentaria. En particular, los
estudios disponibles en la literatura ponen de relieve el potencial de la produccin
de ABE mediante fermentacin de lactosa (Welsh y Veliky, 1984) o de suero de
queso (Maddox, 1980, Welsh y Veliky, 1986).
Aunque clostridia se ha demostrado exitosa para producir ABE, la informacin
Disponible en la literatura para apoyar la expansin industrial an no existe
(Villadsen, 2007; Cascone, 2008). La informacin que falta se refiere a la cintica
de la conversin del substrato, el crecimiento celular y la produccin de butanol
(Jones y Woods, 1986, Shinto et al., 2007) o los sistemas de reactores. En una
revisin sobre el estado del arte de la "biotecnologa blanca", Villadsen (2007) ha
mencionado especficamente el proceso ABE como un ejemplo de cmo y hasta
qu punto un enfoque ms fundamental hace que el desarrollo del proceso sea
ms eficaz y exitoso
Los resultados disponibles en la literatura abierta sobre fermentacin ABE por
cepas de clostridia se refieren principalmente a la va metablica durante la
fermentacin de sustratos convencionales. Las etapas principales del proceso de
fermentacin son: i) la fase de acidognesis, caracterizada por el crecimiento de
las clulas junto con la produccin de cidos; Ii) fase de disolio-genesis,
caracterizada por detencin del crecimiento, produccin de disolventes y
conversin de cidos en disolventes. La Figura 1 presenta una va simplificada
para la conversin de lactosa por Clostridium acetobutylicum (Bailey y Ollis, 1986;
Jones y Woods, 1986). Entre los parmetros clave, un papel relevante desempea
las condiciones operativas que promueven el cambio entre la fase de
acidognesis, asociada al crecimiento de las clulas, y la fase de la sntesis de
disolventes, asociada con la produccin de ABE. Se ha identificado un valor
umbral de la concentracin de cidos no disociados - acetilo y butrico - y del pH
como desencadenante de la fase de disolvente y de crecimiento. Otro aspecto
relevante de los procesos de produccin de ABE est relacionado con la mxima
concentracin de butanol que se puede alcanzar. De hecho, la actividad de
clostridio se inhibe a concentraciones de butanol aproximadas a aproximadamente
20 g / l.
Tpicamente, el proceso de fermentacin de ABE ha sido estudiado por medio de
sistemas de reactores pertenecientes a las tipologas de lote y de lote alimentado.
En la literatura slo se han publicado algunos intentos de fermentacin continua
por medio de cepas de clostridia confinadas en el reactor por inmovilizacin
(Qureshi et al., 2000, Huang et al., 2004, Ezeji et al., 2007 ) O el reciclaje de
clulas (Meyer y Papoutsakis, 1989, Tashiro et al., 2005). Algunos intentos se
informan tambin en la literatura acerca de los procesos de conversin en dos
etapas: la primera etapa dedicada a producir cidos, los segundos solventes
(Ramey, 1998, Mutschlechner et al., 2000, Zhang et al., 2008).

El presente estudio presenta los resultados de un programa de investigacin con

el objetivo de investigar la viabilidad de la produccin de ABE por Clostridium
acetobutylicum DSM 792 en un reactor de biopelcula continua que adopta suero
de queso como materia prima. La contribucin especfica se refiere a: i) la
caracterizacin de la cintica del proceso de produccin de ABE por C.
acetobutylicum libre bajo condiciones de lote; Ii) el establecimiento de un reactor
continuo para la caracterizacin de la cintica del proceso de conversin en
condiciones solventes. Se adoptaron soluciones de lactosa como medio con el fin
de emular el suero de queso. El proceso de conversin se caracteriz en trminos
de pH y concentracin de clulas, cidos, disolventes y compuestos orgnicos
totales. Los resultados se calcularon para evaluar la cintica del crecimiento de las
clulas y de la produccin de ABE. Tambin se evaluaron los rendimientos de la
fuente de carbono en clulas, cidos y disolventes.
MATERIALES Y MTODOS
Microorganismos y medios de cultivo
Clostridium acetobutylicum DSM 792 fue suministrado por DSMZ. Los cultivos en
stock se activaron de acuerdo con el procedimiento DSMZ.
El medio de cultivo adoptado consisti en Extracto de Levadura (YE) a 5 g / L DLactosa a una concentracin entre 2 y 100 g / L. El medio se esteriliz en
autoclave.
Los cultivos reactivados se almacenaron a 4C en el medio de reserva hecho de
50 g / L de medio de cultivo de DLactosa suplementado con CaCO 3 (18 g / L).
Aparatos

Equipo para pruebas batch

Se realizaron precultivos en tubos de 15 mL Hungate. La bioconversin de Dlactosa por C. acetobutylicum se investig por lotes en botellas de tapa roscada
(250 ml) alojadas en una habitacin termostatizada a 35C.

Equipos para pruebas continuas

El aparato para la bioconversin continua de lactosa por clulas libres se

representa en la figura 2. Consiste en un CSTR equipado con una unidad de
microfiltracin y un calentador de proceso. Se consigui una agitacin uniforme
mediante un agitador magntico. La seccin superior del reactor estaba equipada
con puertos para muestreo de cultivo, inoculacin y corrientes de alimentacin /
purga. Las condiciones isotrmicas se mantuvieron en el reactor por medio de
calentamiento externo y un cambiador de llaves que encierra el CSTR. La
corriente lquida se aliment al reactor mediante una bomba peristltica y se retir
como corriente de permeado de la unidad de microfiltracin. Se midi
continuamente una corriente de nitrgeno con un rotmetro a un caudal constante

y se roci en el fondo del recipiente para mantener las condiciones anaerbicas. El

volumen total del biorreactor fue 600 ml de volumen, aproximadamente 5 ml como
Cartucho de microfiltracin y tubos de conexin. El corte del cartucho de
microfiltracin fue de 0,22 m.
El reactor fue operado continuamente con respecto al gas ya las fases lquidas.
Condiciones y procedimientos operativos
Todos los ensayos se realizaron a 35 C en condiciones anaerobias y no se
adopt ningn control del pH. Se prepararon precultivos inoculando 2 ml del cultivo
de reserva en 5 ml de medio sinttico suplementado con lactosa y se incubaron
durante dos das.
Ensayos de batch
Se inocularon los precultivos en los reactores que contenan medio sinttico
constituido por YE y lactosa a una concentracin prefijada (hasta 110 g / L).
Tpicamente, la concentracin celular inicial se fij a 4 mg DM / L. El cultivo se
muestre peridicamente para medir las concentraciones de clulas y metabolitos,
hasta que la concentracin de lactosa se aproxim a un estado estacionario. Cada
medicin se realiz por triplicado.
Concentracin de sustrato (CL), clulas (X) y metabolitos (Ci) registrados durante
las pruebas para calcular los siguientes datos.

L de conversin total de lactosa, es decir, la relacin entre la lactosa

convertida y la lactosa inicial (CL, 0 - CL) / CL, 0

Yi / L, coeficiente de rendimiento fraccional de la "lactosa-a-especie", es

decir, la relacin entre la masa incremental de "especie i" y la disminucin
de la masa del sustrato medida durante el mismo intervalo de tiempo.

la tasa de crecimiento especfico de clulas determinadas de acuerdo

con los procedimientos habituales para el anlisis cintico a partir de datos
de cultivo discontinuo bajo la suposicin de cintica de crecimiento de
primer orden con respecto a la concentracin de biomasa en la fase
exponencial. Con las hiptesis adicionales de pequea concentracin inicial
de clulas y de gran concentracin inicial de sustrato (CL, 0), se calcul
como la pendiente de la ln (X / X0) vs t parcela en la fase de crecimiento
exponencial.

RB La tasa especfica mxima de butanol se estim en el umbral de la fase

de disolio-genesis como la pendiente de la curva de concentracin de
butanol (CB) frente a la curva de tiempo, dividida para la concentracin de
clulas medida en el inicio de la disolvente

Ensayos continuos
Se ajust el volumen del reactor (Vr) a 450 ml. Se inocularon 50 ml de precultivo
en 400 ml de medio con concentracin de lactosa al valor preestablecido. La
fermentacin se llev a cabo en condiciones de batch hasta el inicio de la fase
solventoigenica. La corriente portadora de lactosa se aliment a la velocidad (Q _
{0}) ajustada de acuerdo con la velocidad de dilucin preestablecida (D = Q 0 / Vr).
Al final de la operacin, el cartucho de microfiltracin se lav para eliminar las
clulas atrapadas / inmovilizadas y la biomasa seca recuperada ponderada. El
cultivo fue muestreado peridicamente para Medir las concentraciones de clulas
y metabolitos. Cada medicin se realiz por triplicado. Los datos medidos en
condiciones de estado estacionario se calcularon para evaluar los valores de
coeficientes de rendimiento fraccional y grado de conversin, de manera similar a
lo que se inform para las pruebas por lotes.

METODOS ANALITICOS
El pH se midi fuera de lnea en muestras de 3 ml mediante un pHmetro (Hanna
Instruments). El anlisis de las muestras de cultivo se llev a cabo despus de la
centrifugacin a 11.000 rpm durante 10 min. La fase slida se caracteriz para
determinar la concentracin de biomasa. La fase lquida se caracteriz por
determinar concentraciones de lactosa y metabolitos y carbono orgnico total
(TOC). La densidad celular se determin midiendo la absorbancia a 600 nm
(espectrofotmetro UV-VIS de Cary-Varian mod 50). Los ensayos de calibracin
indicaron que la densidad ptica es proporcional a la masa seca de C.
acetobutylicum en las condiciones de funcionamiento ensayadas, en particular 1
OD600 corresponde a 0,4 gDM / L. El anlisis elemental de la biomasa seca se
obtuvo mediante un analizador C / H / N 2000 LECO. La concentracin de
lactosa se midi mediante un kit enzimtico (Biopharm). Se utiliz un aparato GC,
equipado con un FID, y equipado con una columna Q de la columna capilar (25 m
x 0,32 mm). Se adoptaron normas externas para evaluar los cidos y alcoholes y
sus concentraciones. El TOC se midi con un analizador Shimadzu TOC 5000A.
RSULTADOS
Ensayos en lotes La Figura 3 reporta los perfiles resueltos en tiempo de la
concentracin de clulas de C. acetobutylicum (X), de lactosa (CL) y de
metabolitos (cido actico, cido butrico, etanol, acetona y butanol) as como del

pH, medido durante Un cultivo discontinuo realizado a una concentracin inicial de

lactosa de 50 g / L (CL, 0). Es posible identificar dos fases: acidognesis y
solvognesis. El inicio de la produccin de disolventes marca el inicio de la fase de
solvognesis (tA22 h). Despus de un intervalo de tiempo de aproximadamente
8 horas, la fase de acidognesis se caracteriza por: i) el aumento constante de la
concentracin de clulas y cidos; Ii) un perfil de concentracin celular vs tiempo
que refleja el consumo de lactosa; Iii) la disminucin del pH; Iv) una relacin molar
entre cidos (butrico / actico) constante e igual a 1,5. La fase de la disolvente es
desencadenada por el establecimiento de pH = 4, de acuerdo con los resultados
anteriores (Jones y Woods, 1986). La fase de la solventogenesis se caracteriza
por: i) la disminucin gradual de la concentracin de lactosa que se aproxima a un
valor estacionario; Ii) la relacin molar de cido constante e igual a 1,5; Iii) la
disminucin gradual de la concentracin celular como consecuencia de la lisis
celular (Mutschlechner et al., 2000, Ezeji et al., 2007).
El cultivo se caracteriz adems en trminos de: i) velocidad de crecimiento
especfica de las clulas (); Ii) rendimiento fraccional de lactosa a biomasa
estimado con referencia a la fase de acidognesis (YX / L) ac; Iii) disolucin de
rendimiento de lactosa a butanol fraccional (YB / L) con referencia a la fase de
disolvente-genesis; Iv) rendimiento de lactosa / disolvente fraccional (YSol / L) ov y
rendimiento fraccional de lactosa a butanol (YB / L) ov con referencia a la
conversin global; V) conversin total de lactosa (L); Vi) la tasa mxima de
butanol especfica (* Br) (vase la figura 2). Con referencia a la operacin indicada
en la figura 3, se obtuvieron los siguientes valores: = 0,29 h-1; (YX / L) ac = 0,18;
(Y _ {S} / L) _ {ov} = 0,20; (Y _ {B} / L) _ {ov} = 0,17; L = 0,34; Br = 80 mgB /
gDMh.
Etapa de acidificacin (figura 4A). Las concentraciones de lactosa, actico y
butrico cidos que se miden al final de la fase de acidognesis. El proceso se
caracteriza por la velocidad de crecimiento especfico de las clulas, la relacin
molar de cido y la constante de CA (YX / L) con CL, 0, bajo las condiciones de
funcionamiento ensayadas. Excepto para el ensayo realizado en CL, 0 = 2 g / L, el
valor de pH en el umbral de la fase de solvognesis no cambia con CL, 0. Durante
la operacin realizada en CL, 0 = 2 g / L, el pH disminuye con el tiempo y se
estabiliza a 4,4 cuando la conversin se detiene como consecuencia del
agotamiento de la lactosa. Cabe destacar que: i) la cantidad de lactosa convertida
durante la fase de acidognesis corresponde a una disminucin de la
concentracin de lactosa (CL) de aproximadamente 4 g / l, siempre que la
concentracin inicial sea mayor que esta cifra; Ii) la combinacin de (YX / S) ac y
de la cantidad de lactosa convertida antes de tA da como resultado una
concentracin de clulas en el umbral de la fase de disolio-genesis casi constante
e igual a 0,7 gDM / L; Iii) el crecimiento celular se caracteriza por una cintica de
orden cero con respecto a la lactosa con una tasa de crecimiento especfica de
0,29 h -1 en las condiciones operativas ensayadas.

fase de solventognesis. La Figura 4B presenta datos de la concentracin de

butanol y del rendimiento fraccional de lactosa a butanol estimado al final de la
fase de disolvente-genesis. El anlisis de los resultados pone de relieve que: i) la
concentracin final de butanol aumenta con CL, 0 y se aproxima a un valor
constante en CL, 0 mayor que 80 g / L; Ii) el rendimiento de lactosa en butanol se
caracteriza por un mximo en CL, 0 = 50 g / L.
pruebas continuas
La Figura 6 informa los datos medidos durante una prueba llevada a cabo en el
CSTR equipado con la unidad de microfiltracin, con el fin de confinar las clulas
dentro del reactor. La concentracin de lactosa al comienzo del cultivo discontinuo
y en la alimentacin se fij en 50 g / l. El cultivo discontinuo se detuvo al inicio de
la fase de disolvente-genesis, es decir, cuando el pH se aproximaba a 4. La
velocidad de dilucin del reactor se fij en 0,01 h -1 hasta que se detect el
agotamiento de la lactosa, a continuacin a 0,04 h -1. Condiciones estables
establecidas desde t = 240 h y duraron cuatro veces el espacio-tiempo del reactor
(= 1 / D). El curso temporal de la concentracin de clulas, sustrato y metabolitos
medidos durante el ensayo se ajusta a la investigacin previa realizada con otros
clostridia sp. Y sustratos en condiciones operativas comparables (Meyer y
Papoutsakis, 1989, Tashiro et al., 2005). La estabilidad de la operacin de CSTR
se verific observando las concentraciones de sustrato, clulas y metabolitos. El
valor estimado de ov (0,97) fue muy satisfactorio.
La masa seca de clulas recuperada del cartucho de microfiltracin era
aproximadamente 2,5% de la cantidad total de biomasa presente en el reactor. Por
lo tanto, se omiti la posible contribucin de esta fraccin al desempeo del
reactor.
Los datos medidos en condiciones de estado estacionario se calcularon para
obtener los promedios de tiempo de las variables y las tasas de conversin /
produccin estimadas de acuerdo con las ecuaciones (5) y (6). La Tabla 1
presenta los resultados seleccionados referidos a la serie cuyos resultados se
muestran en la figura 6.
Los valores no nulos de rAA y rBA indicados en la tabla 1 indican que, de acuerdo
con hallazgos anteriores (Mutschlechner et al., 2000, Qureshi et al., 2000), incluso
en la Fase de solvognesis algunas clulas son todava capaces de producir
cidos y crecer (Jones y Woods, 1986). La tasa de crecimiento especfico neto de
las clulas puede evaluarse calculando la velocidad de produccin de ambos
cidos y la tasa de conversin de cido a disolvente. Los desarrollos futuros de la
presente configuracin se dirigirn a permitir el monitoreo continuo de estas
variables.
Al comparar los resultados obtenidos en el reactor de funcionamiento continuo con
los de experimentos por lotes, se puede observar que:

El grado de conversin de lactosa en funcionamiento continuo fue mayor

que el medido en condiciones de lote, para la misma concentracin inicial
de lactosa;
la tasa de produccin especfica de butanol en funcionamiento continuo
(cuadro 1) era entre dos y tres veces la tasa de produccin mxima medida
en condiciones de lotes (figura 5), para la misma concentracin de lactosa
( 5 g / L);
YB / L y la selectividad al disolvente fueron aproximadamente iguales para
el lote y la operacin continua.

El rendimiento mejorado del microorganismo medido bajo la prueba continua

CONCLUSIONES
Se ha estudiado la conversin de la lactosa en acetona butanol-etanol por
Clostridium acetobutylicum, centrndose en la evaluacin de la cintica de la
produccin de cidos y disolventes. La velocidad de crecimiento especfico de las
clulas en condiciones de acidognesis y la velocidad de produccin de butanol al
inicio de la fase de disolvente-genesis se han caracterizado en experimentos
discontinuos.
Tambin se han investigado las velocidades de conversin / produccin en la fase
de diso- lgeno-genesis usando un reactor continuo operado en estado
estacionario y equipado con una unidad de microfiltracin para el confinamiento de
microorganismos. El proceso de fermentacin continua podra ser operado con
xito durante 13 das.
La comparacin de los rendimientos de los procesos continuos versus
discontinuos confirma el gran potencial del proceso continuo, que se puede lograr
sin ningn perjuicio para la selectividad del disolvente y el rendimiento fraccional.
De hecho, el funcionamiento continuo result producir mayores tasas de
conversin de lactosa y de produccin de butanol en comparacin con los
obtenidos en el funcionamiento por lotes, para valores comparables de
concentracin de lactosa.