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BR/EQ
VOLUME 36, NMERO 2, 2011
Resumo:
______________________________________________________________________________
Um biossensor amperomtrico foi desenvolvido para deteco de perxido de hidrognio em
amostras de leite. O biossensor foi construdo a partir da imobilizao de enzima peroxidase
sobre eletrodo impresso de carbono. Parmetros de otimizao visando um melhor desempenho
do biossensor foram avaliados. O biossensor apresentou linearidade no intervalo de 5,0 a 40,0
mol L-1 de H2O2 em tampo fosfato. Em amostras de leite sem diluio, os limites de deteco e
quantificao foram de 0,42 mol L-1 e 1,39 mol L-1, respectivamente. O biossensor mostrou-se
uma alternativa sensvel e de baixo custo na deteco de H2O2 em amostras adulteradas de leite.
1. Introduo
2.1. Reagentes
Cloreto de potssio foi adquirido da Reagen e o cloreto de sdio da Dinmica. O
hexacianoferrato(III) de potssio, o glutaraldedo 25% (m/v), a hidroquinona e o perxido de
hidrognio 30% (m/v) foram obtidos da Vetec. A enzima peroxidase de horseradish Sigma
Type VI foi adquirida da Sigma Aldrich. O nitrognio utilizado para a remoo do oxignio do
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eletrlito suporte foi conseguido da White Martins com grau de pureza de 99,9%. A tinta
condutora de carbono utilizada na construo do eletrodo impresso foi adquirida da Eletrodag.
A folha de acetato que serviu como suporte do eletrodo impresso era da marca Apollo. Todos
os outros reagentes qumicos utilizados foram de grau analtico. As solues tampo fosfato que
foram utilizadas como eletrlito suporte foram obtidas pela mistura das solues de Na2HPO4 0,1
mol L-1 e de NaH2PO4 0,1 mol L-1. Todas as solues foram preparadas com gua deionizada.
2.2. Preparao dos eletrodos impressos
A impresso dos eletrodos foi feita com a deposio da tinta condutora de carbono
Eletrodag sobre a superfcie de folha de acetato pelo mtodo casting no intuito de simular a
tcnica industrial de screen-printing. Nesse mtodo, a tinta forada a passar atravs de uma
tela ou molde vazado para ser depositada sobre um substrato plano. O desenho, definido pelas
partes abertas da tela, reproduzido no substrato.
Os eletrodos foram feitos com rea geomtrica de 0,78 cm2 e largura da trilha igual a
2,0 mm. Aps o processo de impresso, foram levados estufa a 80C por uma hora para a
secagem da tinta. Em seguida, aplicou-se a eles uma camada parcial de adesivo de PVC que
definiu a rea para ser a superfcie do eletrodo e a rea a ser usada como contato eltrico.
Os eletrodos impressos (EI) foram submetidos a uma srie de 10 ciclos em
voltametria cclica com potenciais de inverso de -600 mV e +600 mV a velocidade de varredura
igual a 100 mV s-1 em tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,0. De acordo com BODOKI et al (2008)
[15], esse procedimento contribui tambm para uma diminuio da hidrofobicidade da
superfcie.
2.4. Instrumentao
Uma clula eletroqumica de 10 mL com eletrodo auxiliar de platina, eletrodo de
referncia de Ag/AgCl e eletrodos impressos foi utilizada para as medidas voltamtricas e
amperomtricas em PotenciostatoGalvanostato Autolab PGSTAT302N. As solues foram
purgadas com nitrognio por 10 minutos antes de cada ensaio.
(2008) [16]. O pH da soluo tampo utilizada nos ensaios iniciais foi 6,0, valor ideal para a
HRP segundo recomendaes do distribuidor da enzima (Sigma Aldrich).
A Figura 1 indica as curvas voltamtricas obtidas para o EI, EI-GA e EI-GA-HRP,
em tampo fosfato 0,1 mol L-1 contendo hidroquinona 25 mol L-1 e H2O2 80 mol L-1 com
velocidade de varredura igual a 50 mV s-1. Podemos observar que EI e EI-GA possuem curvas
com perfis semelhantes, com picos de reduo e oxidao para a hidroquinona em torno de -100
e 500 mV, respectivamente. Uma curva bastante caracterstica para o biossensor EI-GA-HRP
tambm pode ser vista. O pico em torno de -250 mV estaria relacionado reduo eletroqumica
da hidroquinona que foi oxidada no processo de regenerao da HRP [9, 17-18].
1,5
1,0
0,5
i / A
0,0
-0,5
-1,0
-1,5
-2,0
-2,5
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
E / V vs. Ag/AgCl
Figura 1 Curvas voltamtricas para EI (), EI-GA (----) e EI-GA-HRP () em tampo
fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,0 contendo hidroquinona 25 mol L-1 como mediador e 80 mol L-1 de
perxido de hidrognio. Velocidade de varredura: 50 mV s-1.
Ensaios de cronoamperometria foram realizados para avaliar a influncia do
potencial aplicado, efeito do pH, concentrao do mediador e concentrao enzimtica na
resposta do biossensor. A Figura 2a indica que a corrente de reduo aumentou medida que o
potencial variou de -100 a -250 mV, a partir de onde praticamente no se altera. Ento, o
potencial selecionado para os ensaios subseqentes foi -250 mV. Potenciais relativamente altos
devem ser evitados para diminuir a probabilidade de outras espcies qumicas indesejadas em
soluo sofrerem processo oxirredutivo, e assim, prejudicarem a leitura eletroqumica. O
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1,0
1,00
0,8
0,95
0,6
0,4
(b)
1,05
ipc / A
ipc / A
1,2
0,90
0,85
0,2
0,80
-350 -300 -250 -200 -150 -100
Eapl / mV (vs. Ag/AgCl)
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
pH
0,8
(d)
1,4
(c)
1,2
1,0
ipc / A
ipc / A
0,6
0,4
0,2
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
10 15 20 25 30 35 40
[Hidroquinona] / M
0,5
1,0
1,5
2,0
-1
[HRP] / mg mL
Figura 2 Ensaios cronoamperomtricos em tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5 na presena de
hidroquinona 25 mol L-1 e H2O2 100 mol L-1 para determinao do efeito do potencial (a),
influncia do pH (b), Influncia da concentrao do mediador hidroquinona (c), influncia da
concentrao da enzima HRP (d) na resposta do biossensor.
0.5
0.0
Respsota relativa / %
i / A
-0.5
-1.0
-1.5
-2.0
-2.5
-0.6
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
20
30
40
50
Nmero de ciclos
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
E / V (vs. Ag/AgCl)
Figura 3 - Estabilidade do biossensor avaliada em tampo pH 6,5 na presena hidroquinona 25
mol L-1 e H2O2100 mol L-1 usando voltametria cclica (50 ciclos) com potenciais de inverso
de -600 a 600 mV vs. Ag/AgCl. Velocidade de varredura: 50 mV s-1.
Figura 4 - Micrografia por MEV do EI (ampliao de 5000 x). (a) sem imobilizao e (b) com
imobilizao de GA e HRP.
1,2
1,0
i / A
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
(a)
LD / M com NC = 95%
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
Tampo
1:100
1:10
Amostras de leite
(b)
LQ / M com NC = 95%
2,2
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
Tampo
1:100
1:10
Amostras de leite
Figura 6 - Intervalo de confiana para os limites de deteco (a) e de quantificao (b) do
biossensor para o H2O2 em tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5, leite com diluio de 1:100, 1:10,
1:2 e sem diluio, calculado a partir de nvel de confiana igual a 95%.
sem diluio e caso alcance valores que saturem a linearidade da curva analtica, existindo a
inteno de quantificar o analito em questo, seja feita a diluio da amostra em tampo fosfato
na proporo de 1:10.
A equao de Michaelis-Menten usada para se calcular a atividade cataltica de
uma enzima, e pode ser algebricamente rearranjada para a Equao 1, chamada Lineweaver
Burk, que relaciona valores de corrente e concentrao de substrato,
(1)
onde Is corrente de estado estacionrio aps a adio de H2O2, Imx corrente mxima, obtida
aps a saturao da curva, Km a constante de Michaelis-Menten, c a concentrao de H2O2 na
soluo. Baseado na curva analtica obtida na resposta do biossensor em soluo tampo,
construiu-se um grfico considerando-se 1/Ipc em funo de 1/c, onde foi obtida uma reta com
inclinao positiva de coeficiente angular igual a Km/IMx com intercepto em 1/IMx (Figura 25).
A partir da Figura 25 e utilizando-se a Equao 10, obteve-se Km 48 M, considerado, quando
comparado na literatura, um valor de alta capacidade cataltica [21].
4. Concluses
5. Referncias
Abstract: An amperometric biosensor was developed for detection of hydrogen peroxide in milk
samples. The biosensor was constructed from the immobilization of peroxidase on printed
carbon electrode. Optimization parameters were evaluated in order to obtain better performance
of the biosensor. The biosensor showed linearity in the range 5.0 to 40.0 mol L-1H2O2 in
phosphate buffer. Milk samples without dilution reported the detection limit for H2O2 of 0.42
mol L-1 and quantification of 1.39 mol L-1.The biosensor could be a sensitive and inexpensive