Vous êtes sur la page 1sur 8

ARTICULOS TECNICOS

La determinacin de la biomasa es Determinacin de la biomasa


uno de los problemas que se presenta
en muchos procesos biolgicos.
Existen diversos mtodos, directos e
indirectos, que se han desarrollado
en procesos biolgicos
usando tcnicas fsicas y bioqumi-
cas. En este trabajo se describen algu- l. Mtodos directos e indirectos
nos de ellos, destacando sus ventaias
e inconvenientes.
Por: Carmen Arniz, Laura Isac y Julin Lebrato
Pqlqbrqs clqve: Grupo de Tratamiento de Aguas Residuales. Escuela Universitaia Politcnrca.
Universidad de Sevilla. C/. Virgen de Africa, 7. 410).1 Sevilla.
Determinacin de la biomasa, com-
ponentes celulares especficos, mto- I
Tel. / Fax: 954 55 28 48 954 28 27 11 . E-mail: lebrato@cica.es
dos bioqumicos, mtodos cinticos,
mtodos directos, mtodos indirec-
tos, mtodos de recuento, procesos
biolsicos

l. lntroduccin de los distintos mtodos de deter-


T a determinacin de la biomasa minacin de 1a biomasa.
Determining biomass in biologcal I .t una de las variables ms im-
I / portantes de un bioproceso. ya 2. Mrodos directos de
processes,
Direct and indirect methods. que su determinacin nos lleva a la determinocin de lo biomosq
Evaluation of biomass concentra- comprensin de la eficiencia del
tion is an important problem encoun- mismo. Se trata de una variable clave 2,1. Mtodos grovimtricos
tered in many microbial and othe para establecer las tasas de produc- La cantidad total de biomasa pre-
bioprocesses. Many direct and indi-
cin, de consumo de nutrientes y el sente en una muestra puede medirse
rect methods have been developed
clculo de los balances de masa de en lrminos de peso seco por uni-
using physical and biochemicai tech-
niques. In this work various methods cualqu ier proceso biolgico. dad de volumen, ya sea como sli-
are discussed taking into the conside- Los mtodos clsicos de deter- dos en suspensin totales (SST) o
ration their practical importance, use- minacin de biomasa son mtodos slidos en susoensin voltiles
fulness and constrains in application. directos que se basan en el nmero (SSV). Las clulis se separan del l-
de clulas o en el peso celular. Los quido bien por centrifugacin bien
Keywords: mtodos de enumeracin celular por filtracin.
Biochemical methods, biomass eva- son mtodos de observacin, basa- La principal desventaja de estas O
Iuation, bioprocesses, counting met- dos en propiedades fsicas o en la tcnicas es que su determinacin in-
hods, direct methods, indirect met- actividad biolgica. Actualmente cluye no sio microorganismos ac- c\
hods, kinetic methods, cellular speci-
hay un gran inters en mtodos al- tivos sino microorganismos muer- LLI
fic componenis' ua
ternativos de determinacin de Ia tos, material inerte, polmeros ex- cO
biomasa. Estos mtodos son indi- tracelulares y materia orgnica ad- l
F-
rectos y estiman algn componente sorbida. Adems, no puede aplicar- U
celular o alguna actividad metab- se cuando los sustratos a degradar
o
lica especfica. No requieren el son insolubles. rr)
examen visual de los organismos ni Los mtodos gravimtricos son c\
su incubacin. En la Figura 1 se simpies, pero consumen bastante
muestra un resumen esouemtico tiempo y son poco reproducibles. EFI
-,f -

'I'ECNOLOGIA DEL AGUA


-
i

ARTIEULOS TEChleo5

Mtodos de determinocin de lo biomosq

Mtodos directos
Mtodos grovimiricos
Mtodos espectrofofomtri cos
Miodos microscpicos de recuenio celulqr en cmoros
Microscopo de epifl uorescencio Noronio de ocridino, DAPI, queloto de europio, Mg-'A'NS
CTC, SFDA

FISH

Mtodos de siembro
Mtodos indirectos

Miodos fsico-qumicos indi rectos: COT, DQO


Componenfes celulores cidos nucleicos
Proteinos

Polisocridos
Lpidos

ATP

Mtodos bioqumicos Actividod esteroso


Actividod deshidrogenoso

Mtodos cinticos Adoptociones del Respirmeiro de Worburg


Tosq de respirocin

Toso de desoporicin de sustroto

Poienciol bioqumico de produccin de metono

Mtodos en continuo
Fig. 1. Esquemo de los disiintos mtodos de deferminocin de lo biomoso

de tal parmetro a partir de una sola por la profundtdad, obtenindose el


2,2, Mtodos
esPeclrof otomtricos medida de la turbidez. nmero de micrt-rorganismos Por
Se basan en la existencia de tlna Se trata de mtodos rPidos, Pero unidad de volumen (nrrnero de c-
r, generalmente).
relacin directa entre el nmero to- de baja sensibilidad y que presentan lulas.ml
problemas de calibracin (tiPo de El recuento de microorganismos
tal de microorganisn-los Presentes
cultivo, medio de cultivo) y de inter- en cmaras no es un mtodo muY
en una nlllestra y stl valor de turbi-
ferencias con partculas. exacto debido a las irregularidades
dez. Tras la determinacin de la tur-
bidez de la suspensin celular me- en la distribucin de la muestra.
O Adems. pueden confundirse las c-
O diante espectrofotometra, el resul- 2,3, Mtodos microscPicos
c\ de recuenlo celular en lulas con otras formas orgnicas e
taclo se expresa en unidades de ab-
cmoras inorgnicas existentes en el medio y
U sorbancia. Sin embargo, antes de
M
1a turbidez como mtodo de Existen diversos tiPos de cma- no permite distinguir clulas vivas
cO utilizar
l f as pafa el recttento de rnicroorga- de clulas muertas.
reclrento, hay que tealizar una recta
(, de calibrado qLre relacione medidas nismos tales como la cmara de
o directas (microscPicas, Por re- Neubauer. Thoma, Brker, Ttirk, 2.4. Mtodos microscPicos
rr) cuento en placa o Pcso seco) con las Fuchs-Rosenthrl, Mal assez, Petroff medianle epifluorescencid
O ttrser, etc. El recuenlo de microol'- La microscoPa de ePifluores-
C\ indirectas de 1a turbidez. Esta recta H
contiene datos sobre el ntmero de ganismos se realiza en la cuadrcula cencia comenz a emPlearse a Prin-
w cipios de los 70 Y hoY en da se con-
ffi central cle la cmara y se multiplica
ffi
clulas, permitiendo la estimacin

,f
IICNOI,OGIA I)IIL AGUA
ARTICULOS TECNTCOS

sidera como uno de los mejores m- mente inactivas, y las vivas, ya que
todos para la estimacin de la bio- el ADN conserva sus propiedades La epifluorescencia
masa. La epifluorescencia es debida incluso en clulas muertas.
a un agente fluorocromo, a la adi- El quelato de europio, al igual
cin de algn anticuerpo marcado que el naranja de acridina o el DA- es un mtodo
con fluorescencia (inmunofluores- PI, es un colorante especfico de
cencia) o a una autofluorescencia cidos nucleicos. Otros fluorocro-
natural debida a la existencia de al- mos como las sales de magnesio
gn componente celular autofluo- del cido 1 -anilino-8-naftalensul-
rescente. fnico (Mg-ANS) tien principal-
Cuando la epifluorescencia se mente componentes celulares co-
debe a un agente fluorocromo, el mo protenas, lpidos o membranas
procedimiento consiste en la tincin celulares. En cambio, el comporta-
de las bacterias con dicho agente y miento de estos agentes fluorocro-
posterior recuento mediante mi- mos es el comentado anteriormen-
croscopa ptica con iluminacin de te, sobrestiman el nmero de clu- cfica, y puede realizarse in situ.
epifluorescencia. Los sustratos las viables al no distinguir clulas Tambin puede llevarse a cabo me-
fluorescentes o fluorocromos que se vivas de muertas. diante hibridacin de sondas fluo-
han empleado para la observcin En el segundo grupo quedaran rescentes de ADN o ARN (Fluores'
directa de bacterias se clasifican en englobados fluorocromos como el cent in situ hybridization, FISH),
dos grupos. En el primero de ellos cloruro de 5-ciano-2,3-ditolil te- cadavezms utilizadas en Ecolosa
quedaran englobados aquellos trazolio (CTC, Rodrguez et al., Microbiana.
fluorocromos que tras ser adsorbi- 1992) el 5- (y 6-) diacetato de
dos actan especficamente sobre sulfofluorescena (SFDA, Tsuji et 2.5 Modos de siembro
cidos nucleicos u otros componen- al., 1995). Ambos fluorocromos, a El recuento de microorganis-
tes celulares. El segundo incluira a diferencia con los anteriores, dis- mos viables se fundamenta en la
todos aquellos que tras ser sustratos tinguen bacterias metablicamen- capacidad de dichas clulas via-
de una determinada actividad meta- te activas de las que no lo son ne- bles de desarrollar una colonia vi-
blica, son convertidos en molcu- diante la observacin microscpi- sible en un medio de cultivo apro-
las fluorescentes. ca del producto fluorescente resul- piado. En los recuentos.n piu.u
AI primer grupo pertenecen los tado de Ia actividad metablica pa- por vertido, un volumen de 0,1- I
principales fl uorocromos utilizados ra la que son especficos. En el ca- ml de la suspensin microbiolgi-
para la estimacin de la poblacin so del CTC 1a actividad metablica ca se mezcla con el medio de culti-
total de una muestra: el naranja de es la respiratoria y en el del SFDA vo fundido y parcialmente enfria-
acridina y el 4,6-diamidino-2-feni- es la actividad esterasa. La epi- do en una placa de Petri. En los re-
lindol (DAPI). Estos fluorocromos fluorescencia basada en fluorocro- cuentos en placa por siembra en
permiten distinguir clulas de part- mos como eI CTC y el SFDA pon- superficie, se extiende un volumen
culas e identificar bacterias no slo dr de manifiesto aquellos micro- de aproximadamente 0,1 ml de la
por su color, sino tambin por su organismos en los cuales estn suspensin sobre la superficie del
forma y tamao. presentes dichas actividades meta- medio de cultivo. Los resultados
El naranja de acridina colorea blicas, pero sin cuantificarlas. de los recuentos en placa se expre-
tanto el ADN como eI ARN de las Salvando este obstculo se en- san como unidades formadoras de
clulas emitiendo a una longitud de cuentran las medidas bioqumicas colonia (UFC) por unidad de volu-
onda aproximada de 470 nm. Los de determinacin indirecta de la men de la suspensin microbiol-
cidos nucleicos de hebra simple se biomasa, que s cuantifican activi- gica. Para que el recuento sea esta- a)
colorean de un color naranja-rojo dades metablicas. dsticamente srgnificativo, el nl- O
fluorescente, mientras que los de La epifluorescencia es un mto- mero de colonias deber estar c\
doble hebra adoptan un color verde do simple y rpido. No obstante, su comprendido entre 30 Y 300 colo- LIJ
M
fluorescente. EI fluorocromo DAPI reproducibilidad est cuestionada y nias. En el caso de muestras mttY cO
_l
es un colorante especfico del ADN necesita un equipamiento relativa- diluidas se puede emplear 1a filtra- F-
y su pico de excitacin se encuentra mente caro. cin de membrana, en la que tras la
prximo a la regin ultravioleta La fluorescencia mediante anti- filtracin de la muestra es el filtro
(365 nm). A pesar de las ventajas el que es colocado finalmente so- rr)
cuerpos marcados con agentes fluo- O
que supone el uso de estos fluoro- rescentes est basada en las propie- bre el agar (Atlas, 1992). C\
cromos, no permiten distinguir en- dades inmunolgicas de las clulas. Otro tipo de recttentos los consti-
tre las clulas muertas, metablica- Es una tcnica muy sensible y espe- tuyen aquellos que emPlean tln me-
ret

TECNOLOGIA DEL AGUA


Effi::::;:: -: ?-**::r :ea:

ARTIEULCIS TEeNTCOS

dio de cultivo lquido como es el ca- mar biomasa viva son los cidos nu- anlisis ms sensibles necesitan del
so de la estimacin del nmero ms cleicos, las protenas, Ios polisacri- uso de cromatografa lquida
probabie (NMP). dos,los lpidos y el ATP. (HPLC) o gaseosa (GC). Todas es-
El recuento de microorganismos tas tcnicas son laboriosas. muy
viables se fundamenta en el desarro- 3.1 .l . cidos nucleicos largas y necesitan de un equipa-
llo de una colonia visible a partir de El ADNI y el ARN son dos com- miento caro (Figura 2).
cada organismo viable. El principal ponentes de las bacterias cuya snte-
problema de este mtodo es que no sis es proporcional a Ia tasa de creci- 3.1.4. Lpidos
todas las bacterias presentes en una miento. Mientras que las concentra- Los lpidos son un componente
muestra pueden crecer en el medio y ciones de ARN varan considerable- fundamental de las membranas ce-
las condiciones de cultivo seleccio- mente con el estado fisiolgico ce- lulares. Su determinacin para la es-
nado. Suelen ser, por tanto, mtodos lular, la cantidad de ADN es relati- timacin de la biomasa de una po-
infraestimativos y estadsticamente vamente ms constante. blacin bacteriana ofrece muchas
cuestionables (I .azarova y Manem, La cantidad de ADN se determi- ventajas sobre otros mtodos. La
r99s). na mediante espectrofotometra, principal ventaja es su alto conteni-
tras su extraccin y purificacin. do especfico y que se encuentran en
3. Mfodos indirectos de Existen diversas tcnicas, si bien cantidades relativamente constan-
determinqcin de lo presentan la desventaja de que los tes. Otra ventaja muy importante es
biomqsq procedimientos de purificacin son que los lpidos no forman parte de
E,stos mtodos se basan funda- complejos, con diversas interferen- las reservas ceiulares y se degradan
mentalmente en la determinacin cias y bastante costosos. rpidamente durante la lisis bacte-
de algn componente celular espe- riana. Aproximadamente, entre un
cfico, en la cuantificacin de algu- 3.1 .2. Protenas 90-98Vo de los lpidos de las mem-
na actividad enzimtica (mtodos Existen varias tcnicas para el branas celulares est en forma de
bioqumicos) o en la medida de anlisis de protenas totales de una fosfolpidos (Lazarova y Manem,
consumo de sustrato o de la forma- muestra biolgica. Algunos estn 1 995).
cin de algn producto (mtodos muy extendidos y se caracterizan Las tcnicas de anlisis se basan,
cinticos). Tambin se incluyen en por su sensibilidad, rapidez y sim- fundamentalmente, en la extraccin
este apartado algunos mtodos fisi- plicidad. Es el caso de las tcnicas celular de los fosfolpidos con un di-
coqumicos. de Lowry et al. ( 195 1 ) y Bradford solvente orgnico, su posterior hi-
Los mtodos bioqumicos y cin- (1916). drlisis cida para liberar el fosfato
ticos determinan, ms que la viabili- La principal desventaja de la de- y, por ltimo, 1a determinacin co-
dad de las bacterias la actividad ya terminacin de protenas es que su lorimtrica de ste. Son tcnicas re-
que dependen ms del estado meta- cantidad en las clulas est sujeta a lativamente sencillas, reproducibles
blico de los microorganismos que fuertes variaciones debido, funda- y sensibles (de 0,1 a 1 nmol de fos-
de1 nmero de individuos. mentalmente, a cambios en las con- fato; Findlay et al., 1989).
diciones fisicoqumicas y al estado
3. l. Componenles celulares fisiolgico celular. 3.1.5. Trifosfato de
especficos adenosina o ATP
Cualquier componente celular 3.1 .3. Polisacrdos El ATP presenta las ventajas de
seleccionado para 1a estimacin de La mayora de ias clulas proca- ser un componente bioqumico cen-
la biomasa viva de una muestra de- riotas contienen cido murmico tral presente en todos los microor-
be responder a tres criterios filnda- (un peptidoglicano) como compo- ganismos y especfico de los micro-
mentales: nente de la pared celular. E,xisten organismos vivos, circunstancias
O o Estar presente nicamente en c- varias tcnicas para 1a determina- ambas que permiten relacionarlo
O lulas vivas. cin del cido murmico en mues- con la biomasa viva.
C\l
o Ser rpidarrente degradado lras que conlengan microorganis- Una de las tcnicas ms utiliza-
U cuando las clulas mueran. mos. Todas ellas se basan en la con- das para medir ATP se basa en la re-
M
CO Ser relativamente constante el.l versin del cido murmico a lac- accin luciferina-luciferasa, proce-
l
F- concentracin respecto a c1u.1- tato, segLrida del anlisis enzrmi- so responsable de la luz emitida por
bios en ei estado fisiolgico celu- co o qumico de la concentracin las lucirnagas y qlle ha sido am-
lal y entle distintas especies. de lactato. El cido murmico se pliamente estudiado. En este meca-
LO
Hasta el nromento, no exi\tc nrn- extrae de 1as clulas mediante una nismo de luminiscencia se sabe que
O
C\ gn componente celular que cunpla hidr1isis aicalina y se purifica intervienen luciferina (fenol hetero-
w estos tres requerimientos" Sin en- posteriormente mediante cromato- cclico, LH2), luciferasa (enzima,
E), ATP, cationes de n-iagnesio y
rug bargo, los nts adecuados para esti- grafa de intercambio inico. Otros

l'T.]CNOI,OGIA DEI, AGUA


1 h
':' i: {: u 1 ,.--} ; ?fieNr*s

-
:" ,i
#
Por cada molcula

i :3--i* I r .f
.- de luciferina oxtdada

se emtte un cuanto

q &i
Io conversin enzimtica la fluores-
cena. La fluorescena puede ser vi-
orgeno en un proceso de oxidorre- aumentar las de ADP y AMP (Uh- sualizada como un proclucto intra-
clLrccin que ocurre en doble etapa: linder y White, 1983). celular mediante el en-rpleo de la
rrricroscopa de epi lluorescencia o
lH
""j +\TP:tr ---_>
+ E-LH,-AMP + PPi (1) cuanti ficada mediante espectrofo-
E,-LH,-AMP+O, _- _____-_--> L + H,O + bioluminiscenciu (2) tometra tras ser extrada con disol-
ventes orgnicos.
Ya que por cada molcrla de lu- 3,2. Mtodos bioqumicos EI principio en el que se basa la
cil'erina oxidada se emite un cuanto Las medidas de alguna actividad tcnicr del FDA es en el car'rcter hi-
cle 1r-rz, la detenninacin del ATP en enzimtica pueden considerarse co- drofbico del diacetato de lluores-
biolgica puede hacer-
Llnx mLrestra mo una alternativa a los mtodos cena, lo que le permite penetrar a
se mediante extraccin por ebulli- tradicionales. Los ensayos enzim- travs de la brcapa lipdica que for-
cin en tampn Tris (hipocloruro de ticos son sirnples de realizar y sus ma la membrana celular. Una vez en
tr'i s-hi droximetil-aminoetano) del resultados se obtienen rpidamente. el interior celulal', es convertido me-
ATP, incubacin con lr,rciferina-lu- Adcmis. el equiparniento lrecesiu'io diante la actividad esterasa en fluo-
cif'crasa y posteriol medida de la luz no es ni costoso ni complejo. La ma- rescena, mo1cula de carcter hi-
pt'oducida en un fotmetro con re- yora de las medidas de actividad droflico que puede ser almacenada
gistro. enzimtica se realiza mediante 1a intracelulirmente dada 1a baja per-
I-a mayor desventaja de esta tc- convelsin de sustratos especficos neabilidad de la membrana a sta.
uica es 1a necesidad de procesar 1a a productos coloreados que son Ya que las clulas muertas se carac-
ttlue stra con rapidez, ya que el estado cuanti ficados fotomtricamente. terizan por presentar abundantes
fisiolgico de las clLrlas cambia r'r- La principal desventaja de los orificios en sus r.nembranas, el FDA
pidantente tras la toma de muestra. mtodos bioqumicos es la varia- slo tefiir clulls vivas.
La lelacin entre el ATP, el ADP cin de las actividades enzimticas El FDA se ha empleado princi-
Y el AMP y el contenido total de de- celulares con los cambios fisiolgi- palnentc en la determinacin de la
sox i n'ibonucletidos lefleja la carga cos y qlre, una vez que ios microor- actividad de hongos y bacterias en
ene r-utica de las clulas [(ATP + 0,5 ganisrnos rllueren, ]as enzimas libe- mllestras de suelos. Sin embargo, se
ADP)/(AMP + ADp + ATp)1. Esta radas pueden seguir actirras. Entre ha encontrado que no todas las espe- O
relacitin puede duplicalse en slo las distintas mediclts de actividad cies plesentes en el suelo son sensi- O
O
ttnos segundos. Aigur-ros autores sLl- C\
enzimtica cabe destacar li activi- bles a esta tcnica, ya sea porcllte el
gielcn que la carga energtica es un clrd esterasa y 1a actrvidad deshidlo- FDA no penetra adecuadamettte en U
M
t'alor ntucho nts preciso qLre el genasa. las clulas o porqLle no es bien rete- CO
conte nido absolr-rto de ATP ya que la l
nido. Tratanclo de ntinin-rizat estos t-
contposicin celular de desoxir.ribu- 3.2.1 Actividad esterasa problemas, en el campo de la ePi-
nttclctiticlos vara con el estado fi- El diacetato cle I'luorescent lluorescencia se han utilizado deli-
siolrir ieo cle los nlicloolglrnisrlo.: (FDA) es uu courpllesto que puede vados clel FDA como el diacetato clc r)
O
duriurte e l cr.ecimiento tlacteriano el ser hiclr'olizido por enzimas tales 6-calboxifluorescena (CFDA) y el C\
pool energtico clisrlinuye, al clis- coJro proteasas. lipasas y esterI- diacetato de -5- (y 6-) strlfofluores-
mlnLrir la conccntracin de ATp y sas, sienclo e1 producto cle dicha cena (SFDA). este ltitro Inencio- ffiffi
ffi
1'I.]CNOI-OGIA DEI- AGUA
ARTTCUTOS TECzuTCOS

nado antefiormente y que Por el mo-


mento se ha revelado como el ms
apropiado.

3,2.2. Activdad
deshidrogendscl (DHA)
En una muestra biolgica, la de-
terminacin de 1a actividad del sis-
tema de transporte electrnico pue-
de realizarse por medida de la acti-
vidad deshidrogenasa. Todos los
microorgani smos aerobios poseen
un sistema de transporte de electro-
nes activo, en el que el ms impor-
tante aceptor terminal de electrones
es el oxgeno. En la corriente princi-
pal de este transporte electrnico
Figuro 1.3 Visin ol microscopio piico {I OOOx) de uno muestro de fongo octivo trotodo segn el protocolo de lo
participan, entre otras, las deshidro- INT-deshidrogenoso.
genasas piridn-dependientes que
necesitan NAD o NADP como co-
enzima y las deshidrogenasas fla- la cuantificacin de la actividad res- metabolizanlama-
tes en la muestra
vn-dependientes que contienen fl a- piratoria de la muestra. teria orgnica con 1a consecuente
vn-adenn-dinucletido (FAD) El TTC presenta el inconvenien- disminucin del nivel de oxgeno,
flavn mononucletido (FMN) co- te de su elevada sensibilidad al ox- que es consumido, y el aumento de
mo grupo prosttico. Las deshidro- geno (Chung y Neethling, 1989). El la concentracin de CO' que es pro-
genasas son enzimas de oxido-re- INT no tiene esta limitacin y su uso ducido. El dixido de carbono es ad-
duccin que participan en el trans- est cada vez ms extendido. Sin sorbido en una solucin de potasa,
porte de electrones desde un sustra- embargo, su precisin y correlacin por lo que la disminucin de la pre-
to orgnico a un aceptor final de con la cantidad de biomasa viva no sin en este sistema cerrado es debi-
electrones mediante la transferencia est suficientemente demostrada da al volumen de oxgeno consumi-
de hidrgeno. La determinacin de (Singh etal.,1994). do por los microorganismos, lo cual
la actividad deshidrogenasa pttede puede ser medido mediante un sen-
hacerse midiendo la capacidad de 3,3. fftodos cnticos sor de presin y registrado. La re-
los microorganismos para reducir La base de estos mtodos es la presentacin en el tiempo del oxge-
un indicador o colorante redox. En- medida del consumo de sustrato o no disuelto (mg.l ') informa del
tre estos colorantes se encLtentran de la formacin de producto en en- consumo de oxgeno, siendo la pen-
sales de tetrazolio tales como el clo- sayos en discontinuo. El ejemplo diente de la recta de ajuste ptimo la
mro de 2,3,5-trifeniltetrazolio ms tpico en microorganismos ae- tasa de consumo de oxgeno (OUR)
(TTC) o el cloruro de 2-(p-iodofe- robios es la determinacin de la en mg O' l-r.h-1.
ni l) -3- trofenil )-5 -f'enil tetrazo-
(p -n i DBO, que indica la biodegradabili- Una adaptacin del respirmetro
lio (lNT). Ambas se caracterizan dad de un sustrato en disolucin a de Warburg para medir el biogs
por ser soh-rbles en agua en su forma travs del consumo de oxseno del producido en procesos anaerobios
oxidada y por formar depsitos ce- medio. puede encontrarse en James et al.
I ulares insolubles de TTC-fonnazn ( 1 ee0).

O e INT-formazn (Figura 3), respec- 3.3.1. Adaptaciones del


O tivamente, cuando son reducidas Respi rmetro d e Wo rb u r g 3.3.2. Tasd de respiracin
c\ por la actividad respiratoria. Estos Le tasa de cortsumo de oxgeno (Oxgen Upfake Rate, OUR)
l!
depsitos rojizos de formazn, al ser puede ser detelminada segn el El consumo de oxgeno de los
M
cO observados microscpicamente, plincipio en el que se basa el respi- rnicroorganisnros presentes en ttna
l permiten distir-rguir en mLlestras rmetro de Warburg, por el que a muestra biolgica debido a la respi-
acuosrs las bacterirrs qLte I'espilan temperatura y volumen constantes, racin endgena de nrantenimiento
de aquellas qLre no (deternrinacin la variacin en la cantidad de un gas celular y a la oxidacin del sustrato
v) directa de la bionasa). O bien, el puede medirse por la variacin de su orgnico presente en dicha muestra
O
C\l forrrazu.r es extrado con disolven- presin. En una planta piloto eqLrr- (en ausencia de nitrificacin), reci-
tes orgnicos y deterrriinado espec- pada para actrar como Lllt respir- be el nombre de respiracin. As

ffi trofotomtricamente, permitiendo

]'l.lcN0LO(;t^ t)lI_ AGU{


metro, los microorganismos presen- pue\. se denomina tasa de respira-
&*tTgf;-5t*s 'Ft:{r"*xcs5

La respiracin
endgena es
directamente
=t =.
. .:,,:: proporcional a la
.
concentracin de
.

microorganismos

cin (en mg O,.l t.-t) a la velocidad


Fig.4. Sistemo OXITOP lS WTW poro o deierminocin de DBO
con la que los microorganismos uti-
lizan el oxgeno en funcin a estos
dos conceptos.
La respiracin endgena, en la
prctica, se considera qLle es cons-
tante a temperatufa y concentracin
Instnimcnlo paru l;r rncclid;l de rnicroorganismos fijos. Por tan-
c1ctr crigeno to, ser directamente proporcional a
la concentracin de microorganis-
mos presentes en la suspensin bio-
lgica, estimados como SSV.
La respiracin debida a 1a meta-
bolizrcin del sustrato orgnico
presente en la muestra o respira-
lllcct:oclo cin exgena, ser proporcional a
orgc11(] la concentracin de sustrato org-
nico rpidamente biodegradable e
inch"rira, si lo hubiera, el consumo
de oxgelro ocasionado por nitrifi-
cacin.
La tasa de lespiracin total refe-
rida a la concentracin de microor-
ganisrnos, expresada como SSV, es
la tasa de respiracin especfica
(SOUR). Su principal caracterstica
es que define li actividad biolgica
en un momento dado de una bioma-
sa especflca. O
La medida cle la actividad biol- O
O
gica SOUR est relacionada con la c\
lclreirr "al imento/nt icroorganis-
M
rros" (F/M en terminologa anglo- .O
l
sajona), ya que conrprende la tasa c1e
(_)
respiracin exgena (propolcional a C
la DBO) y los SSV de un cultivo
biolgico. En la Figura 5 se r.nues- Lr)
O
esquetrla simplificaclo del dis-
trl Lrn C\
positivo empleado para 1a meclicla
F g.5 Disposi"'o de medido del consur6 6ls er gero. cle col.rsun'lo de oxgeno

'f lrc\Ol,oct1 l)ril. AG L .\

b---
Arargfrait*s TgNCQ5

3.3.3. Taso de desaparicin la determinacin on-line de la bio- phospholipid analysis in deter-


de svstrato masa de un proceso biolgico. Las mining microbial biomass in se-
Es el mtodo ms convencional tcnicas ms importantes se basar.t diments. Appl. Envir. Microbrol.,
para determinar la actividad de una en propiedades elctricas, microca- 55,2888-2893.
poblacin de microorganismos. La lorimtricas o espectrofotomtricas James, A., Chernicharo, C.A.L. y
disminucin de la concentracin de de los cuitivos biolgicos. Sin em- Campos, C.M.M (1990). The de'
sustl'ato en el tiempo puede hacerse a bargo, a pesar del desarrollo tecno- velopment of a new methodology
travs de mtodos indirectos, como lgico, no existe un sensor ideal pa- for the assesment of specific met-
la DQO o el COT, o mediante tcni- ra la monitorizacin en continuo de hanogenic activity. Wat. Res.,24,
cas especficas, fundamentalmente la biomasa (Singh et al., 1994). 8 I 3-825.
cromatogrficas (GC o HPLC). La Lazarova, V. y Manem, J. (1995).
bsqueda de nuevos mtodos ha 11e- Biofilm characterization and ac-
vado al empleo de tcnicas basadas 5. Agrodecimientos tivity analysis in water and was-
en el empleo de electrodos selecti- Los autores desean expresar su tewater treatment. Wat. Res., 29,
vos, en los que el clculo de la activi- agradecimiento a la Direccin Ge- aa11 a1A<
dad de 1a muestra biolgica se realiza neral de Investigacin Cientfica y Lowry, O.H., Rosebrough N.J.,
en base al tiempo requerido para que Tcnica, Ministerio de Educacin y Farr, A.L. y Randall R.J. (1951).
ocurra el 507o de la desaparicin del Cultura, por la financiacin de parte Protein measurement with folin-
sustrato suministrado y para el que el de este trabajo mediante dos becas phenol reagent. J. Biol. Chem.,
electrodo es especfico. del Programa de Formacin de Per- 193,265-215.
sonal Investigador, Refs.: IN92- Rodrguez, G.G., Phipps, D.,Ishi-
3.3.4. Potenciol bioqumco D28480461 y IN92-D28598661 guro, K. y Ridgway, H.F. (1992).
de produccin de rnetc'no concedidas a M.C. Arniiz y L. lsac, Use of fluorescent redox probe
(BMP) respectivamente. for direct visualization of acti-
Esta tcnica consiste en medir vely respiring bacteria. Appl. En-
con una jeringa o Lrn ft'asco de Ma- . Bibliogrofio vir. Microbiol., 58, 1 801 -1 808.
riotte relleno de agua Ia produccin Atlas, R.M. (1992). Microbial Eco- Singh, A., Kuhad, R.C., Sahai, V. y
total de biogs (CHo y CO,) produ- logy: Principes, Methods and Ghosh, P. (1994). Evaluation of
cida por un reactor anaerobio dis- Applications. M.A. Levin, R.J. biomass. Adv. Biochem. E,ng.
continuo. Seidler y M. Rogal (Eds.). Mac- Biotechnol., 5 1, 41 -1 0.
Graw-Hill, 29-43. Tsuji, T., Kawasaki, Y., Takeshima,
3.5. MIodos fiscoqumicos Bradford M. (1976). A rapid and S., Sekiya, T. y Tanaka, S.
indirecias sensitive method for the quanti- (19951. A new fluorescence stai-
La medida del COT o de la DQO tation on microgram quantities of ning assay for visualizing living
son mtodos muy nsados para la es- protein utilizing the principle of microorganisms in soil. Appl.
timacin indirecta de 1a biomasa protein-dye binding. Analyt. Envir. Microbiol., 61, 3415'
suspendida o f ijada. Son tnuy sensi- Biochem., 12, 148-254. 3421.
bles y precisos, pero presentan las Chung Y.C. y Neethling, J.B. Uhlinder D. y White, D.C. (1983).
misrnus importantes limitaciones ( 1989). Microbial activity mea- Relatronship between physiolo-
que los SST y SSV. surementes for anaerobic sludge gical status and formation of ex-
digestion. J. Wat. Pollut. Control tracell ular polysaccharide glyco-
4. Mtodos en contnuo Fed.,61 ,343-349. calyx in Pseudomonas atlantica.
Durante los aos 90 se han desa- Findlay, R. H., King, M. G. y Wa- Appl. Environ. Microbiol., 45,
lrolludo mtodos cuantitutivos nrra tling, J. (1989). Efficacy of 64-70.

O
O
c\

CO
mL.* tpss pRsmssrff F{nusrRHffi$
::)
27 .0OO eiemplares d istri bu idos gratutamente
o '
eritre el sector industiial
v)
O
C\

ffi
EPI Control OJD ' Distribucin nominqtivo
Solicite informacin y un eiemplar de muestra
Elsevier lnformacin Profesional, S.A.
Entenca,2B Entlo. - 08015 Barcelona -f el.:292 4638

1'I]Ci\OI,OGIA DI]I, AGUA