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TESIS DOCTORAL

Elaboracin de vinos dulces de Andaluca


a partir de uvas secadas artificialmente

Elaboracin de vinos dulces de Andaluca


a partir de uvas secadas artificialmente

M Jess
Ruiz M Jess Ruiz Bejarano
Bejarano
2016 Puerto Real, 2016
Departamento de Qumica Analtica

Facultad de Ciencias

TESIS DOCTORAL

Elaboracin de vinos dulces de Andaluca a partir de


uvas secadas artificialmente.

Mara Jess Ruiz Bejarano


Cdiz, 2016

Facultad de Ciencias Campus Ro San Pedro, s/n
Departamento de Qumica Analtica 11510 - Puerto Real (Cdiz)
Tel.: 956016364
Fax: 956016460

"Elaboracin de vinos dulces de Andaluca a partir de uvas secadas


artificialmente"
Memoria presentada por la licenciada Da. M Jess Ruiz Bejarano para optar al
Grado de Doctor Europeo por la Universidad de Cdiz

Fdo: D Mara Jess Ruiz Bejarano

D Remedios Castro Mejas, Profesora Titular de Universidad del Departamento de


Qumica Analtica de la Universidad de Cdiz, y D M. Carmen Rodrguez Dodero,
Profesora Contratada Doctor del Departamento de Qumica Analtica de la
Universidad de Cdiz, hacen constar:
Que el presente trabajo de investigacin ha sido realizado bajo su direccin conjunta
en los laboratorios del Departamento de Qumica Analtica y en el Centro Andaluz
de Investigaciones Vitivincolas-Campus de Excelencia Internacional
Agroalimentario (CeiA3) de la Universidad de Cdiz y en los laboratorios de la
Facultad de Farmacia de la Universidad de Lisboa (Portugal), y rene las condiciones
exigidas por la ley vigente.

Y para que conste y surtan los efectos oportunos, firmamos la presente en Puerto
Real a 25 de Noviembre de 2015.

Fdo: Remedios Castro Mejas Fdo: M. Carmen Rodrguez Dodero



Facultad de Ciencias Campus Ro San Pedro, s/n
Departamento de Qumica Analtica 11510 - Puerto Real (Cdiz)
Tel.: 956016364
Fax: 956016460

Dr. D. Dominico A. Guilln Snchez, Catedrtico de Qumica Analtica y Director


del Departamento de Qumica Analtica de la Universidad de Cdiz

HACE CONSTAR:

Que el presente trabajo de investigacin titulado "Elaboracin de vinos dulces de


Andaluca a partir de uvas secadas artificialmente", constituye la memoria que
presenta D. Mara Jess Ruiz Bejarano para optar al grado de Doctor Europeo,
habindose realizado la investigacin en Departamento de Qumica Analtica y en el
Centro Andaluz de Investigaciones Vitivincolas-Campus de Excelencia
Internacional Agroalimentario (CeiA3) de la Universidad de Cdiz y en los
laboratorios de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Lisboa (Portugal) bajo
la direccin de las profesoras Dra. D. Remedios Castro Mejas y Dra. D. M
Carmen Rodrguez Dodero.

Y para que conste y surtan los efectos oportunos, firmo la presente en Puerto Real,
a 25 de Noviembre de 2015.

Fdo. Dr. D. Dominico A. Guilln Snchez



Los trabajos de investigacin presentados en esta Tesis Doctoral han sido
realizados gracias a la financiacin recibida del Ministerio de Ciencia e
Innovacin a travs de la concesin de una beca de investigacin del programa
de Formacin de Profesorado Universitario, con referencia AP2007-02383.

Los estudios descritos en la presente Tesis se encuentran recogidos en las


siguientes publicaciones:

Ruiz Bejarano, M.J., Rodrguez Dodero, M.C., Barroso, C.G. (2010). Optimizing
the process of making sweet wines to minimize the content of Ochratoxin A. Journal of
Agricultural and Food Chemistry 58 (24): 1300613012.

Ruiz-Bejarano, M.J., Castro-Mejas R., Rodrguez-Dodero, M.C., Garca-


Barroso, C. (2013). Study of the Content in Volatile Compounds During the Aging of
Sweet Sherry Wines Obtained From Grapes Cv. Muscat and fermented under different
conditions. European Food Research and Technology 237(6): 905-922.

Ruiz-Bejarano, M. J., Castro-Mejas, R., Rodrguez-Dodero, M.C., Garca-


Barroso, C. (2015). Ethyl carbamate content during aging of sweet Sherry wines obtained
from grapes cv. Muscat and Pedro Ximenez produced under different conditions. Australian
Journal of Grape and Wine Research 21(3): 396-403.

Ruiz-Bejarano, M. J., Castro-Mejas, R., Rodrguez-Dodero, M.C., Garca-


Barroso, C. Volatile composition of Pedro Ximnez and Muscat sweet Sherry wines from
sun and chamber dried grapes: a feasible alternative to te traditional sun-drying. Journal of
Food Science and Technology, En revisin.

AGRADECIMIENTOS
Y lleg el momento muchos recuerdos de todos estos aos dan vueltas sobre mi cabeza,
Cmo agradecer a tantas personas? Cmo resumir en unas simples lneas todo lo que
quiero decir?
En primer lugar, quiero dar las gracias a mis directoras de Tesis, M. Carmen Rodrguez
Dodero y Remedios Castro Mejas, por su apoyo y ayuda inestimable, por sus consejos y
su infinita paciencia, en definitiva, por estar ah en todo momento.
A Carmelo Garca Barroso, por contar siempre conmigo y brindarme la oportunidad de
pertenecer a este GRUPO en el que he encontrado grandes amigos. Juntos hemos
compartido horas de trabajo y, por supuesto, de ocio; alegras e ilusiones y tambin,
momentos difciles.
Tambin quiero dar las gracias a los miembros del Dpto. de Qumica Analtica la ayuda e
inters mostrado en los avances de sta Tesis, especialmente en los ltimos meses.
A la Profa. Mara Rosario Bronze, por guiarme durante los meses de estancia en Lisboa,
as como a los profesores, investigadores y meninas del laboratorio por la buena
acogida recibida.
Por eso, os quiero agradecer a todos los que habis estado conmigo en el da a da, en el
laboratorio y las comidas, a los que segus por la Universidad y aquellos que
emprendieron otros caminos, por tener siempre un minuto (o ms de uno) para
resolver dudas, arreglar equipos, o simplemente para compartir un rato de conversacin
(eso sin contar las catas y vendimias!!) en definitiva por ser partcipe de una u otra
forma de sta Tesis.
A mis nias, por preguntar infinitas veces cmo iba todo aunque no entendieseis bien
que es lo que estaba haciendo, por los nimos, por estar ah.
Por ltimo, pero no menos importante, a mi familia, por ser mi apoyo y mi referente. S
que, a veces, no ha sido fcil sobrellevar dos tesis a la vez pero con vuestra ayuda
incondicional todo es posible. Por esto y otras mil razones ms, muchsimas gracias! (y
qu decir de los pequeines, Joaqun y Jess, que con esas sonrisillas es casi imposible no
cerrar cinco minutos el porttil).

A R.N.M., sta va por ti!



NDICE

Captulo I. Justificacin y Objetivos 7

I.I.Objetivos ................................................................................................. 9

I.I.1. Objetivo general ................................................................................9

I.I.2. Objetivos especficos..................................................................... 10

Captulo II. Introduccin 15

II.I. Los vinos andaluces ........................................................................... 15

II.I.1. Marco Regulador .......................................................................... 16

II.I.2.Vinos andaluces con Denominacin de Origen Protegida


(DOP) o Indicacin Geogrfica Protegida (IGP) .............................. 18

II.II. Vinos dulces naturales andaluces. Elaboracin y crianza ........... 28

II.II.1. Variedades de uva ....................................................................... 28

II.II.2. Proceso de pasificacin. Asoleo ............................................... 30

II.II.3. Vinificacin.................................................................................. 32

II.II.4. Crianza.......................................................................................... 33

II.III. Secados alternativos al asoleo ........................................................ 35


II.III.1. Pretratamientos con agentes qumicos................................... 35

II.III.2. Secado a la sombra .................................................................... 36

II.III.3. Secaderos solares ....................................................................... 36

II.III.4. Estufas y secaderos de aire caliente ........................................ 38

II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos


dulces naturales andaluces ......................................................................... 42

II.IV.1. Parmetros de control de la seguridad alimentaria ............... 42

II.IV.2. Parmetros relacionados con la calidad organolptica ........ 58

II.V. Quimiometra. Tratamiento estadstico de datos ......................... 86

II.V.1. Anlisis Univariante .................................................................... 86

II.V.2. Anlisis Multivariante ................................................................. 88

Captulo III. Materiales y Mtodos 99

III.I. Muestras.............................................................................................. 99

III.I.1. Vendimia 2008 .......................................................................... 103

III.I.2. Vendimia 2009 .......................................................................... 104

III.I.3. Vendimia 2010 .......................................................................... 105

III.II. Control de la seguridad alimentaria ............................................ 106

III.II.1. cido glucnico....................................................................... 106


III.II.2. Ocratoxina A ........................................................................... 108

III.II.3. cidos orgnicos ..................................................................... 113

III.II.4. Carbamato de etilo .................................................................. 116

III.III. Calidad organolptica .................................................................. 118

III.III.1. Composicin polifenlica y actividad antioxidante ......... 118

III.III.2. Compuestos voltiles ............................................................ 128

III.III.3. Anlisis sensorial.................................................................... 131

Captulo IV. Resultados y Discusin 139

IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria .............. 139

IV.I.1. cido glucnico ........................................................................ 139

IV.I.2. Ocratoxina A ............................................................................. 143

IV.I.3. cidos orgnicos....................................................................... 151

IV.I.4. Carbamato de etilo.................................................................... 168

IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos


dulces .......................................................................................................... 180

IV.II.1. Compuestos polifenlicos ..................................................... 180

IV.II.2. Compuestos voltiles .............................................................. 210

IV.II.3. Anlisis sensorial ..................................................................... 256


Captulo V. Conclusiones 275

Bibliografa 281

English summary 305

I. Justification and Objectives............................................................ 307

I.I. Objectives ......................................................................................... 308

II. Backgrounds: Andalusian sweet wines. Winemaking and


associated risk ............................................................................................ 311

II.I. Asoleo (Sunning) ........................................................................... 311

II.II. Vinification.................................................................................... 313

II.III. Aging ............................................................................................ 314

III. Experimental and results ............................................................ 316

III.I. Samples .......................................................................................... 316

III.II. Evaluation of food safety parameters ..................................... 318

III.III. Organoleptic quality ................................................................. 336

IV. Conclusions................................................................................... 372

References .................................................................................................. 375

Artculos derivados de la Tesis 383


Captulo I.

Justificacin y Objetivos.
Captulo I. Justificacin y Objetivos

CAPTULO I. JUSTIFICACIN Y
OBJETIVOS

Los vinos dulces naturales de Andaluca gozan de una fama considerable


estando basada su elaboracin tradicional en el asoleo de las uvas a fin de
elevar su contenido en azcar y en el sistema de envejecimiento por soleras y
criaderas. A su vez, forman parte de otros tipos de vinos, los generosos de
licor o vinos de cabeceo, combinados con los vinos generosos del tipo oloroso
y amontillado fundamentalmente. Igualmente son utilizados mediante mezclas
adecuadas en otros productos de calidad como el vinagre y el brandy y, cada
vez ms, se suelen utilizar en la prctica culinaria de las cocinas ms famosas.

Como se ha comentado, una de las etapas ms caractersticas de la elaboracin


de vinos dulces andaluces es el asoleo de las uvas, donde por efecto de la
temperatura y escasa humedad, se deshidratan y concentran principalmente en
azcares.

Pero la etapa del asoleo natural, que implica un cierto periodo de tiempo,
conlleva junto a importantes cambios en la composicin, importantes riesgos,
entre los que destaca la posible lluvia o el aumento de la humedad durante la
noche, que puede desencadenar una significativa prdida de calidad del
producto, ocasionando incluso infeccin fngica por especies como Botrytis
Cinerea, responsable de la podredumbre gris, o Penicillium y Aspergillus causantes
de la formacin de Ocratoxina A (OTA), metabolito txico, cuyo contenido
mximo en alimentos est regulado en la Unin Europea ((CE) No
1881/2006).

7
I.I.Objetivos

Por tanto, es importante la bsqueda de alternativas que permitan un mayor


control del proceso, as como de sus caractersticas higinico-sanitarias, sin que
incida negativamente en las propiedades organolpticas del producto final.

Existen alternativas a los secados tradicionales con vistas al mximo


aprovechamiento del sol, al tiempo que se evitan las posibles lluvias
(Doreyappa Gowda 2000; Pangavhane y Sawhney, 2002), incluyendo algunas
como el tratamiento qumico de la uva (Doymaz y Pala, 2002) ya sea solo o, en
otros casos, combinado con otros tratamientos (Di Matteo et al., 2000).
Aunque todos estos procesos buscan acelerar el proceso de pasificacin, en su
mayora se valen del sol como fuente de energa, con lo que los problemas
asociados a las variaciones climatolgicas derivadas de su empleo no son
solventados.

Como alternativa al asoleo natural o acelerado mediante el tratamiento de la


uva, nos encontramos con el empleo de cmaras climticas. En el seno del
grupo Investigacin Qumico Analtica del Vino y Productos
Agroalimentarios (PAI AGR122) se han llevado a cabo estudios de
pasificacin acelerada a pequea escala mediante una cmara climtica (Castro
et al., 2005) con control de temperatura, luz y humedad en comparativa con el
pasificado tradicional. Los primeros resultados obtenidos pusieron de relieve
que ambos procesos de pasificacin implicaban importantes cambios tanto en
el contenido polifenlico como en el contenido en compuestos voltiles de las
uvas consideradas. El empleo de una cmara climtica implic acortar el
tiempo de secado de unos 20 das para el secado natural a tan slo 6-7 das en
el caso del secado artificial, sin alterar sustancialmente los parmetros
esenciales salvo el contenido en compuestos voltiles, que ven reducida su
presencia en las uvas tratadas. Debemos tener en cuenta que las variedades de

8
Captulo I. Justificacin y Objetivos

uva que se emplean normalmente para los vinos dulces andaluces suelen ser
variedades muy aromticas que dan lugar a vinos con un aroma muy
caracterstico.

Se hace sumamente importante, por tanto, el llevar a cabo el secado artificial


mediante condiciones que aceleren el proceso, con el mximo acortamiento de
tiempo, sin mermar las cualidades organolpticas de las uvas de partida, con la
menor prdida de voltiles o la recuperacin de los mismos, y estudiar
asimismo el envejecimiento de los vinos logrados mediante uva secada
artificialmente.

I.I.OBJETIVOS

I.I.1. OBJETIVO GENERAL

El objetivo que se persigue en esta tesis es la obtencin de vinos dulces


andaluces a partir de uva secada en condiciones controladas, de composicin y
caractersticas organolpticas similares a la de aquellos obtenidos de uva
asoleada de manera tradicional. Para ello, se emplear una cmara climtica
con control de temperatura y humedad y de una capacidad que permita el
tratamiento de cantidades adecuadas de uva para una posterior vinificacin de
al menos unos 100 litros, cantidad sta que permita el estudio de la etapa de
envejecimiento, acortando el periodo de secado (o permitindolo cuando y
donde las condiciones climticas no sean las adecuadas) sin mermar las
caractersticas organolpticas de las uvas empleadas y minimizando las
prdidas de aromas durante el proceso.

9
I.I.Objetivos

En los primeros ensayos realizados a pequea escala, se han encontrado


numerosas ventajas en el secado artificial, como la disminucin de los
parmetros relacionados con problemas climticos (ocratoxina A, cido
glucnico). Sin embargo, existen pequeas disminuciones de compuestos
voltiles, lo que debe cuidarse al tratar grandes cantidades de uva para su
vinificacin posterior. Dado que otro de los factores esenciales de este tipo de
vino es el envejecimiento, se deber estudiar el comportamiento de los vinos
obtenidos de uvas secadas artificialmente durante dicha etapa.

I.I.2. OBJETIVOS ESPECFICOS

1. Obtencin de uvas secadas en cmara climtica a escala piloto para su


posterior vinificacin.

Dado que, como se cit anteriormente, el pasificado de la uva es una de las


etapas ms relevantes en la elaboracin de vinos dulces, se deber evaluar el
estado sanitario de los mostos de uvas secadas por el sistema artificial y
compararlos con aquellos obtenidos por el asoleo tradicional.

2. Optimizacin de las condiciones de vinificacin de uvas secadas


artificialmente.

En este apartado se persigue, por un lado, el incremento de la extraccin de


compuestos aromticos en el mosto evalundose la maceracin de las uvas, as
como la conservacin de los compuestos aromticos durante la fermentacin e
incremento de los aromas fermentativos mediante el estudio de
fermentaciones a bajas temperaturas (aprox. 10C) y adicin de nitrgeno.

3. Estudio del envejecimiento de vinos procedentes de uvas secadas


artificialmente.

10
Captulo I. Justificacin y Objetivos

Se busca con ello, comprobar la influencia que sobre el producto final tiene el
proceso de secado y pasificado de las uvas estudiado, cmo evolucionan los
vinos a medida que avanza el proceso de envejecimiento, y comparar, tanto
desde el punto de vista analtico como sensorial, los vinos obtenidos.

4. Control analtico de parmetros relacionados con la seguridad alimentaria.

Por la propia naturaleza de las muestras estudiadas es importante llevar a cabo


un seguimiento de aquellos parmetros directamente relacionados con la
calidad y seguridad alimentaria, como son ocratoxina A, cido glucnico y
cidos orgnicos, al ser claros indicadores de contaminaciones fngicas
durante el proceso de secado natural de la uva, as como furfurales, indicadores
de un aumento excesivo de la temperatura durante el secado de la uva y
carbamato de etilo, compuesto de especial relevancia en vinos fortificados.

5. Evaluacin qumico-analtica de parmetros de calidad en los vinos.

Se investigar el potencial aromtico como parmetro de calidad en vinos


elaborados a partir de uvas secadas artificialmente. Asimismo se evaluar el
contenido polifenlico de los vinos, al ser compuestos que influyen en gran
medida en su calidad organolptica.

6. Caracterizacin organolptica mediante anlisis sensorial de los mostos y


vinos elaborados.

La evaluacin sensorial de los diferentes vinos obtenidos permitir el aporte de


datos sobre las propiedades sensoriales de los vinos en estudio en los distintos
ensayos.

11
Captulo II.

Introduccin.
Captulo II. Introduccin

CAPTULO II. INTRODUCCIN

II.I. LOS VINOS ANDALUCES

Andaluca es una de las regiones vitivincolas con ms tradicin de Espaa. Su


importancia en el mercado actual se refleja en las 30.000 hectreas de viedo
destinadas a vinificacin, que dan origen a ms de un milln de hectolitros de
vino al ao, de los que alrededor del 75% estn protegidos por una de sus
menciones de calidad (CAPDER, 2015a).

Su clima, con influencias tanto atlnticas como mediterrneas y su orografa


permiten la elaboracin de un amplio rango de productos vitivincolas de gran
calidad, desde los tradicionales vinos generosos y de licor hasta la elaboracin
de vinos tintos, contando con siete Denominaciones de Origen y dos Vinos
de Calidad (Figura 1): Condado de Huelva, Vino de Naranja del Condado
de Huelva, Jerez-Xrs-Sherry, Mlaga, Manzanilla-Sanlcar de
Barrameda, Montilla-Moriles, Sierras de Mlaga, Vino de calidad de
Granada y Vino de calidad de Lebrija, adems de diecisis vinos con
Indicacin Geogrfica Protegida.

Figura 1. D.D.O.O. de Andaluca.

15
II.I. Los vinos andaluces

II.I.1. MARCO REGULADOR

Los vinos andaluces estn regulados por la Ley de proteccin del Origen y la
Calidad de los Vinos de Andaluca (BOJA n 246, 2007), en el cual se
establece, dentro del marco de la normativa de la Unin Europea y del
Estado, una clasificacin de los vinos en diferentes niveles de calidad y
proteccin de Origen con un grado de requisitos creciente, de modo que cada
nivel implica mayores exigencias que el inmediatamente inferior. Atendiendo a
dicha ordenacin, se establecen las siguientes categoras (Tabla 1):

Vinos de mesa Vinos de calidad producidos en


una regin determinada (VCPRD)

1 Vinos de mesa. 1 Vinos de calidad con indicacin


geogrfica.
2 Vinos de mesa con derecho a la
2 Vinos con denominacin de origen.
mencin vino de la tierra.

3 Vinos con denominacin de origen


calificada.

4 Vinos de pagos.

Tabla 1. Clasificacin de los vinos andaluces (BOJA n 246, 2007)

Son los operadores quienes podrn decidir el nivel de proteccin a que se


acogen sus vinos, siempre que cumplan con los requisitos establecidos para ese
nivel en la legislacin aplicable. Cada nivel de proteccin debe contar con una
regulacin general que recoger las obligaciones derivadas de las distintas
normativas aplicables. Asimismo, este reglamento autonmico establece que,
para el reconocimiento de la proteccin de un nombre geogrfico de un vino
de la tierra o de un vino de calidad producido en regin determinada

16
Captulo II. Introduccin

(VCPRD), ste deber contar con una normativa especfica reguladora, de


acuerdo con los requisitos establecidos en cada caso y que incluir un pliego de
condiciones donde se determinen las caractersticas definitorias de los
productos protegidos, desde las variedades de vid empleadas hasta el proceso
de envejecimiento y delimitacin geogrfica.

La Ley de proteccin del Origen y la Calidad de los Vinos de Andaluca


(BOJA n 246, 2007) queda regulada a nivel nacional por el Estatuto de la
Via, del Vino y de los Alcoholes (BOE n 165, 2003), que adapta la
normativa del Estado al marco comunitario y establece los niveles y figuras de
proteccin vinculadas a la regulacin de los vinos de calidad, as como por el
Reglamento Europeo ((CE) No 1493/1999) sobre la Organizacin Comn
del Mercado del Sector Vitivincola, donde se describen las prcticas y
tratamientos enolgicos, designacin, denominacin, presentacin y
proteccin de los vinos.

No obstante, actualmente el Reglamento ((CE) No 1493/1999) ha sido


modificado por el Reglamento ((CE) No 479/2008) y posteriormente por el
Reglamento ((CE) N 491/2009) que establecen la nueva organizacin comn
del mercado (OCM) vitivincola y agrcola respectivamente. Entre los
principales cambios, se elimina la categora VCPRD (vinos de calidad
producidos en regiones determinadas), incorporando las DOP (denominacin
de origen protegida) e IGP (indicacin geogrfica protegida).

Segn informacin del Ministerio de Agricultura, Alimentacin y Medio


Ambiente (MAGRAMA, 2015b), aunando la nueva normativa europea a la
actual legislacin autonmica y nacional, para indicar que un producto se
acoge a una DOP o IGP se emplean los trminos tradicionales de forma que
los vinos de calidad producidos en regiones determinadas quedan actualmente

17
II.I. Los vinos andaluces

recogidos bajo el distintivo de Denominacin de Origen Protegida, mientras


que los tradicionales vinos de mesa con derecho a mencin de vinos de la
Tierra, se engloban bajo la distincin de Indicacin Geogrfica Protegida
(Tabla 2).

IGP DOP
Vino de la Tierra Denominacin de Origen
Denominacin de Origen Calificada
Vino de Calidad con indicacin geogrfica
Vino de Pago
Vino de Pago Calificado
Tabla 2. Trminos tradicionales para IGP/DOP. (Fuente: MAGRAMA, 2015b)

II.I.2.VINOS ANDALUCES CON DENOMINACIN DE


ORIGEN PROTEGIDA (DOP) O INDICACIN GEOGRFICA
PROTEGIDA (IGP)

Andaluca cuenta con un amplio abanico de elaboraciones, estando un gran


nmero de ellas amparadas bajo una Denominacin de Origen Protegida
(DOP) o Indicacin Geogrfica Protegida (IGP) (Figura 2), distintivos que
reconocen la calidad de un producto, por sus caractersticas propias y
diferenciales, por la zona de produccin de las materias primas y de
elaboracin, y tambin por la influencia del factor humano que participa en las
mismas.

Adems de vinos blancos, rosados y tintos, en la zona de Andaluca se


elaboran vinos especiales, como los vinos de licor as como vinos de uvas
sobremaduras y de uvas pasificadas, que por sus peculiares caractersticas y sus
singulares mtodos de elaboracin requieren de una descripcin ms detallada.

18
Captulo II. Introduccin

Figura 2. Vinos de Andaluca con DOP/IGP.

II.I.2.1. CONCEPTOS PREVIOS ((CE) No 479/2008)

Mosto de uva: producto lquido obtenido de uva fresca de manera natural o


mediante procedimientos fsicos. Se admite un grado alcohlico adquirido que
no exceda del 1 % vol.

Mosto de uva parcialmente fermentado: producto procedente de la fermentacin de


mosto de uva, con un grado alcohlico adquirido superior al 1 % vol. e
inferior a las tres quintas partes de su grado alcohlico volumtrico total.

Mosto de uva parcialmente fermentado procedente de uva pasificada: producto


procedente de la fermentacin parcial de mosto de uva obtenido a partir de
uvas pasificadas, con un contenido total de azcar antes de la fermentacin de

19
II.I. Los vinos andaluces

272 g/l como mnimo y con un grado alcohlico natural y adquirido no


inferior al 8 % vol.

Mosto de uva concentrado: es el mosto de uva sin caramelizar obtenido por


deshidratacin parcial de mosto de uva, efectuada por cualquier mtodo
autorizado, excepto el fuego directo, de modo que el valor numrico indicado
por el refractmetro a la temperatura de 20C no sea inferior al 50,9 %. Se
admite un grado alcohlico adquirido que no exceda del 1 % vol.

Grado alcohlico volumtrico adquirido: Nmero de volmenes de alcohol puro, a la


temperatura de 20C, contenidos en 100 volmenes del producto considerado
a dicha temperatura.

Grado alcohlico volumtrico en potencia: Nmero de volmenes de alcohol puro, a


la temperatura de 20C, que pueden obtenerse por fermentacin total de los
azcares contenidos en 100 volmenes del producto considerado a dicha
temperatura.

Grado alcohlico volumtrico total: suma de los grados alcohlicos volumtricos


adquirido y en potencia.

Grado alcohlico volumtrico natural: Grado alcohlico volumtrico total del


producto considerado antes de cualquier aumento artificial del grado
alcohlico natural.

II.I.2.2. VINO DE LICOR

Segn la reglamentacin vigente ((CE) No 479/2008), el vino de licor se define


como el producto obtenido a partir de:

20
Captulo II. Introduccin

mosto de uva parcialmente fermentado, vino o una mezcla de


ambos productos, de variedades de vid permitidas y con un grado
alcohlico volumtrico natural inicial no inferior al 12 % vol,
(salvo excepciones).

al cual se adiciona, solo o mezclado, alcohol neutro de origen


vitcola, incluido el alcohol producido por destilacin de pasas,
con un grado alcohlico volumtrico adquirido no inferior al 96 %
vol. o destilado de vino o de pasas, con un grado alcohlico
volumtrico adquirido no inferior al 52 % vol. ni superior al 86 %
vol.

Adems, tendrn un grado alcohlico volumtrico adquirido no inferior al 15


% vol. ni superior al 22 % vol. con un grado alcohlico volumtrico total no
inferior al 17,5 % vol., con la excepcin de determinados vinos con
denominacin de origen protegida.

Por otra parte, podr contener uno o varios de los productos siguientes:
mosto de uva concentrado o mezcla de alcohol vnico con mostos de uva
parcialmente fermentada, mosto de uva o mezcla de este producto con vino.

II.I.2.2.1. Consideraciones especiales para los Vinos andaluces de licor


con D.O.P ((CE) N 606/2009)

Para determinados vinos de licor como los de las D.O. de Condado de


Huelva, Jerez-Xrs-Sherry (Figura 3), Manzanilla-Sanlcar de
Barrameda, Mlaga, Montilla-Moriles, se permite, la adicin de alcohol
de vino o alcohol de pasas, con un grado alcohlico volumtrico adquirido que
no sea inferior al 95 % vol. ni superior al 96 % vol. Adems, los generosos de

21
II.I. Los vinos andaluces

las D.D.O.O. Condado de Huelva, Jerez-Xrs-Sherry, Manzanilla-


Sanlcar de Barrameda, Montilla-Moriles y el vino seco de la D.O. de
Mlaga, podrn tener un grado alcohlico volumtrico total inferior al 17,5
% vol sin ser inferior al 15 % vol, ya que la legislacin nacional que les era
aplicable antes del 1 de enero de 1985 as lo contemplaba expresamente.

Tambin est permitido el uso de uno o varios de los productos siguientes:

mosto de uva parcialmente fermentado obtenido a partir de uvas


pasificadas para los vinos generosos de licor en las D.D.O.O. Jerez-
Xrs-Sherry y Montilla-Moriles y vinos dulces de Mlaga.

mosto de uva concentrado obtenido por aplicacin directa de calor que se


ajuste, exceptuando por esta operacin, a la definicin de mosto de uva
concentrado, para los vinos generosos de licor en las D.O. Jerez-
Xrs-Sherry, Montilla-Moriles, Condado de Huelva y vinos
dulces de Mlaga.

mosto de uva concentrado en el caso de los vinos dulces de las


D.D.O.O. Montilla-Moriles y Mlaga.

Los mostos y vinos para la elaboracin de los vinos de licor, as como el mosto
de uva concentrado y el mosto de uva parcialmente fermentado procedente de
uvas pasificadas, utilizados para la elaboracin de vinos de licor con
Denominacin de Origen protegida deben ser originarios de la regin cuyo
nombre lleve el vino de licor con denominacin de origen protegida de que se
trate.

No obstante, en el caso de los vinos de licor con denominacin de origen


protegida Mlaga y Jerez-Xrs-Sherry, el mosto de uva pasificada al que

22
Captulo II. Introduccin

se le ha aadido alcohol neutro de origen vitcola para impedir la fermentacin,


procedente de la variedad de vid Pedro Ximnez, puede ser originario de la
regin Montilla-Moriles.

Figura 3. Vinos de licor D.O. Jerez.

II.I.2.2.2. Clasificacin de los vinos de licor

Vinos generosos

Son vinos de licor secos, con denominacin de origen protegida, elaborados


total o parcialmente bajo velo y obtenido a partir de uva blanca procedente de
las variedades de vid Palomino de Jerez, Palomino fino, Pedro Ximnez,
Verdejo, Zalema y Garrido Fino, con dos aos de edad media de
envejecimiento en barrica de roble.

En este grupo se incluyen, el Fino, Amontillado, Palo Cortado y Oloroso de


las D.D.O.O. de Jerez-Xrs-Sherry y Montilla-Moriles, la Manzanilla de
Sanlcar y los vinos Condado Plido y Condado Viejo de la D.O. Condado
de Huelva.

Vinos generosos de licor

Es el vino de licor con denominacin de origen protegida elaborado a partir de


vino generoso, que ha sido objeto de una adicin, bien de mosto de uva
pasificada al que se le ha aadido alcohol neutro de origen vitcola para

23
II.I. Los vinos andaluces

impedir la fermentacin, bien de mosto de uva concentrado rectificado, bien


de vino dulce natural, y con una edad media de maduracin en toneles de roble
de dos aos.

Entre los vinos de Andaluca que se acogen a esta normativa, destacan (D.O.
"Jerez-Xrs-Sherry", 2015):

Pale Cream: se elabora a partir de un vino de crianza biolgica -fino o


manzanilla- al que se ha adicionado mosto concentrado, con objeto de
conservar el color amarillo pajizo a dorado plido y los aromas propios
de la crianza biolgica bajo velo de flor del vino de origen aportando
un sabor abocado.

Medium: vino generoso de licor elaborado a partir de una mezcla o


"cabeceo" de un vino generoso con un vino dulce natural o bien con
mosto concentrado rectificado. Los vinos base para el cabeceo suelen
ser bien amontillados o bien vinos que, aunque hayan sido
fundamentalmente envejecidos mediante crianza oxidativa, han tenido
igualmente un cierta crianza biolgica.

Cream: vino generoso de licor elaborado mediante la mezcla o


"cabeceo" de vinos generosos de crianza oxidativa (fundamentalmente
olorosos) con un importante aporte de vino dulce natural o bien de
mosto concentrado rectificado. La totalidad del proceso de crianza es
por tanto de carcter oxidativo.

Vinos dulces naturales

Las mencin especfica tradicional vino dulce natural, junto a otras de


similares caractersticas, , vino dolce naturale o

24
Captulo II. Introduccin

vinho doce natural quedan reservadas a los vinos con denominacin de


origen protegida, obtenidos a partir de vendimias procedentes en un 85 %
como mnimo de variedades de vid definidas previamente, procedentes de
mostos con una riqueza natural inicial en azcar de 212 g/l como mnimo y
obtenidos, con exclusin de cualquier otro aumento artificial del grado
alcohlico natural, mediante adicin de alcohol, de destilado o de aguardiente.

En este sentido, los vinos dulces naturales andaluces se producen siguiendo un


esquema de elaboracin comn, basado en una previa sobremaduracin o
asoleado de uvas, mayoritariamente Moscatel o Pedro Ximnez, seguida de
una fermentacin parcial y posterior encabezado. No obstante, y siempre
dentro de los mrgenes que establece la normativa vigente, existen ciertas
diferencias propias de cada regin como son el grado de sobremaduracin, el
uso y porcentaje mximo permitido de ciertas variedades o la riqueza en
azcares tanto de la uva de partida como del vino acabado, que van a definir el
producto final aportando la singularidad propia de la zona (BOJA n 249,
2011b; BOJA n 249, 2011a; BOJA n 249, 2011c; BOJA n 155, 2013).

Mistelas

La Organizacin Internacional del Vino (OIV) define las mistelas como


productos provenientes de uvas frescas o de mostos de uvas que no han
fermentado (se tolera 1 % vol. de alcohol adquirido) y convertidos en no
fermentables con la adicin de aguardiente de vino o de alcohol rectificado
alimentario o de alcohol de origen vitcola. El mosto de uvas utilizado debe
tener un grado alcohlico total natural de por lo menos igual a 12 % vol. El
grado alcohlico adquirido del producto acabado no debe ser inferior a 15 %
vol. y no superior a 22 % vol. (OIV, 2015).

25
II.I. Los vinos andaluces

La reglamentacin actual, incluye a las Mistelas de la D.O. Condado de


Huelva, en el grupo de vinos de licor con denominacin de origen protegida
cuya elaboracin se rige por normas particulares: vinos de licor con DOP en
cuya elaboracin se utiliza mosto de uva o la combinacin de este producto
con vino ((CE) N 606/2009).

II.I.2.3.VINOS SIN AUMENTO ARTIFICIAL DEL GRADO


ALCOHLICO.

II.I.2.3.1. Vinos dulces de uvas pasificadas y sobremaduradas.

Son vinos dulces elaborados sin ningn aumento artificial del grado alcohlico
natural, siendo el alcohol procedente en su totalidad de la fermentacin y los
azcares residuales tambin naturales. Destacan los vinos elaborados en la
D.O. Mlaga que pueden ser vinos de uva sobremadurada, entre los que se
encuentran los vinos naturalmente dulces, o vinos de uva pasificada.

Vino de uvas pasificadas.

Es el producto elaborado sin aumento artificial del grado alcohlico natural, a


partir de uvas secadas al sol o a la sombra para su deshidratacin parcial; con
un grado alcohlico total de al menos 16 % vol. y un grado alcohlico
adquirido de al menos 9 % vol. El grado alcohlico natural debe ser al menos
16 % vol. (o un contenido de azcar de 272 g/l).

Vino de uvas sobremaduradas.

Es el producto elaborado sin aumento artificial del grado alcohlico natural,


siendo ste superior al 15 % vol. Adems, el grado alcohlico total no ser
inferior al 15 % vol. ni el grado alcohlico adquirido inferior al 12 % vol.

26
Captulo II. Introduccin

Vinos naturalmente dulces

La elaboracin de este vino en la D.O. Mlaga (BOJA n 249, 2011a) se realiza


a partir de uva sobremadurada, exclusivamente de las variedades preferentes
Pedro Ximnez y/o Moscatel, y a partir de mostos con una riqueza natural
inicial superior a 300 g/l de azucares, sin ningn aumento artificial de su
graduacin y con el alcohol procedente en su totalidad de fermentacin. El
grado alcohlico volumtrico adquirido ser como mnimo de 13 %.

27
II.II. Vinos dulces naturales andaluces. Elaboracin y crianza

II.II. VINOS DULCES NATURALES ANDALUCES.


ELABORACIN Y CRIANZA

En trminos generales, el proceso de elaboracin de los vinos dulces naturales


en Andaluca es muy similar independientemente de cul sea la variedad de uva
mayoritariamente, Moscatel o Pedro Ximnez. Sin embargo, en determinadas
regiones, como Mlaga o Montilla-Moriles (BOJA n 249, 2011c; BOJA n
249, 2011a), los vinos realizados con Moscatel, pueden proceder de uva fresca
o sobremadurada no asoleada. Adems, la variedad Moscatel de Alejandra
posee un tamao de grano mayor, por lo que el efecto de asoleo puede
desarrollarse con menor intensidad de pasificacin (D.O. "Jerez-Xrs-
Sherry", 2015).

II.II.1. VARIEDADES DE UVA

II.II.1.1. MOSCATEL DE ALEJANDRA

Tambin llamada Moscatel de Mlaga o Moscatel de


grano gordo (Figura 4), es una de las variedades ms
antiguas que se conocen. Destaca por su riqueza y
potencial aromtico. Se emplea como uva de mesa,
de pasificacin y vinificacin. Su cultivo est muy
extendido por toda Espaa, especialmente en Cdiz,
Mlaga, Aragn, Catalua, Canarias, Navarra y
Figura 4 Moscatel de
Valencia. Alejandra.

28
Captulo II. Introduccin

II.II.1.2. MOSCATEL DE GRANO MENUDO

Se cultiva en todo el Mediterrneo y centro de Europa. Como su nombre


indica, difiere de la variedad Moscatel de Alejandra en el menor tamao de las
bayas lo que ofrece una mayor superficie de hollejos proporcionando a los
vinos una elevada cantidad de aromas. Es, posiblemente, la uva blanca de
mayor expresin aromtica con recuerdos a ptalos de rosa, azahar, geranio,
vainilla, almizclado y uvas pasas (Hidalgo-Togores, 2003b).

II.II.1.3. PEDRO XIMNEZ

Variedad de uva cultivada en gran parte de Andaluca


(Figura 5), destacando en las zonas de Montilla-
Moriles, Mlaga y Jerez. Tambin se cultiva en otras
zonas de Espaa como Canarias y Levante.
Morfolgicamente es una uva redonda, de piel fina y
sensible a los climas hmedos (Alejandre, 2007). Figura 5. Pedro Ximnez.

II.II.1.4. OTRAS VARIEDADES

Aunque las variedades de Moscatel y Pedro Ximnez son las preferentes para
la elaboracin de los vinos dulces naturales de Andaluca, tambin est
permitido el uso de otras variedades en las distintas zonas de produccin. La
variedad Palomino se incluye en la D.O. Jerez-Xrs-Sherry al igual que en la
D.O. Condado de Huelva donde est autorizado adems el uso de Zalema,
Listn y Garrido Fino. Lairen, Doradilla y Rome en la D.O. Mlaga o Layren,
Baladi, Verdejo, Torrontes, Chardonnay, Sauvignon Blanc y Macabeo en
Montilla-Moriles son otras de las variedades permitidas (BOJA n 249, 2011b;
BOJA n 249, 2011a; BOJA n 249, 2011c; BOJA n 155, 2013).

29
II.II. Vinos dulces naturales andaluces. Elaboracin y crianza

II.II.2. PROCESO DE PASIFICACIN. ASOLEO

Tras la vendimia, los racimos son transportados al almijar o pasera, terrenos


ligeramente inclinados para favorecer la insolacin y la escorrenta en caso de
lluvia. All, las uvas se distribuyen sobre discos de esparto, denominados
redores o sobre largas extensiones de material plstico, pudiendo ocupar hasta
quince hectreas de superficie. Peridicamente, los racimos se voltean a fin de
conseguir una homogeneidad en la pasificacin y son cubiertos por la noche
para evitar la humedad (Figura 6). En todo este proceso, desde el transporte
hasta su posterior manipulacin en las paseras, es de suma importancia el
manejo cuidadoso de los racimos para evitar la rotura de las bayas (Alejandre,
2007). Se trata, por tanto, de un proceso laborioso y de elevado riesgo, ya que
condiciones climticas adversas, como lluvias en dicho periodo, puede
ocasionar el deterioro de la uva y, en consecuencia, importantes prdidas
econmicas.

Figura 6. Sistema tradicional de asoleo. (Fuente: , D.O. "Jerez-Xrs-Sherry", (2015))

30
Captulo II. Introduccin

Sometidos a intensas horas de sol, se producir una prdida gradual de agua de


los racimos as como un importante aumento en la concentracin de azcares
y otros componentes. Por otra parte, contina la respiracin de las uvas, por
lo que se produce la combustin de cidos, principalmente mlico y de
pequeas cantidades de azcares (Hidalgo-Togores, 2003b).

Este proceso, conocido como asoleo, puede durar, dependiendo de las


condiciones exteriores, desde una semana hasta veinte das producindose una
merma en el peso de la uva de entre un 25% y un 60% (BOJA n 249, 2011c)
as como el oscurecimiento de las uvas hacia tonalidades marrones, fruto de un
conjunto de reacciones tanto enzimticas como no enzimticas (Serratosa et al.,
2008b). En primer lugar, intervienen enzimas oxidativas como la
polifenoloxidasa (PPO). La PPO cataliza la oxidacin de compuestos fenlicos
en presencia de oxgeno molecular, dando lugar a quinonas que
posteriormente evoluciona a pigmentos marrones (melaninas).

Por otra parte, como ocurre en otros tratamientos trmicos de alimentos, se


produce la reaccin de Maillard entre compuestos que poseen grupos
carbonilo y amino libres. En este caso, son principalmente monosacridos y
aminocidos los que reaccionan por condensacin, deshidratacin,
isomerizacin y ciclizacin formando compuestos que producen un cambio
sustancial de la uva, alterando su color, sabor y propiedades nutricionales.

La reaccin de Maillard, se ve condicionada por el pH, la temperatura, la


actividad del agua, y el tiempo. As, a pH cidos, la reaccin se inicia por
enolizacin de las pentosas y hexosas dando lugar a la formacin de furfural e
hidroximetilfurfural (HMF) respectivamente. stos, a su vez y por reacciones
sucesivas dan lugar a polmeros nitrogenados conocidos como melanoidinas
(Martins et al., 2000; Rivero-Prez et al., 2002). Aunque a estos compuestos se

31
II.II. Vinos dulces naturales andaluces. Elaboracin y crianza

les han atribuido propiedades mutagnicas y antioxidantes, existe una cierta


discusin sobre sus efectos beneficiosos o perjudiciales para la salud, siendo
objeto de numerosos estudios (Somoza, 2005).

II.II.3. VINIFICACIN

Cuando se ha alcanzado el nivel ptimo de sobremaduracin, los racimos son


transportados al lagar, donde se molturan, traspasan a prensas horizontales, y
posteriormente a prensas hidrulicas. Dada la elevada riqueza en azcares, el
proceso de obtencin del mosto, es complejo y de mayor dificultad que
cuando se realiza con uva fresca por lo que, para obtener un mayor
rendimiento, la pasta obtenida a la salida de la prensa horizontal se dispone en
capas finas separadas por los propios redores, cuyo entramado facilita el
drenaje del mosto, para el prensado vertical. Aun as, el rendimiento obtenido
es bajo (250-300 litros/ tonelada) y el mosto alcanza una densidad de 1,190 a
1,230, llegando fcilmente a los 28 B (Alejandre, 2007).

sta elevada concentracin de azcares dificulta la fermentacin, la cual se


inicia de forma muy lenta. Adems, con el objetivo de detener la actividad
fermentativa de los mostos, tan pronto comienza dicho proceso, se les aade
alcohol vnico hasta una graduacin mnima de 15 % vol. En las bodegas de la
D.O. Jerez-Xrs-Sherry, se suele realizar este proceso en dos etapas. A fin
de parar la actividad de las levaduras, se efecta un primer encabezado hasta
aproximadamente 10 grados alcohlicos. El vino as estabilizado se va
clarificando durante los meses de otoo e invierno, tras lo cual se desla y
fortifica complementariamente hasta los 15-17 de alcohol, de forma previa a
su envejecimiento (D.O. "Jerez-Xrs-Sherry", 2015).

32
Captulo II. Introduccin

En el caso particular de los vinos de la D.O. Mlaga, ste tipo de elaboracin, a


partir de uva largamente asoleada y una fermentacin muy breve, recibe el
nombre de Tierno. El trmino vino dulce natural se reserva para el
producto procedente de uva fresca con una riqueza natural inicial mnima de
azcares de 212 g/l fermentado hasta un grado alcohlico no inferior a 7 %
vol. y encabezado hasta situarlo en el rango correspondiente de grado
alcohlico. Por ltimo, el vino Maestro es un vino dulce natural obtenido a
partir de mostos de uva fresca que se encabeza con alcohol vnico hasta 8 %
vol. permitiendo una fermentacin posterior muy lenta e incompleta, que se
paraliza cuando la riqueza alcohlica es de 15-16 % vol., quedando ms de 100
g/l de azcares sin fermentar (BOJA n 249, 2011a).

II.II.4. CRIANZA

La crianza se realiza en barricas de roble previamente envinadas y con una


capacidad no superior a 1000 litros, llamadas tradicionalmente botas, donde el
vino se oxida y pierde agua generando su oscurecimiento, una progresiva
concentracin aromtica y una complejidad creciente, si bien procurando
siempre no perder la frescura y el carcter frutal tpico de la variedad.

El envejecimiento, con una duracin mnima de dos aos, puede ser esttico o
de aadas o mediante el sistema de criaderas y soleras. ste ltimo es un
sistema dinmico, mediante el cual el vino final es el resultado de una mezcla
compleja de vinos de distintas aadas.

El mtodo de operacin en un sistema de soleras y criaderas, cuyo esquema se


representa en la Figura 7, consiste en, peridicamente, extraer una cierta
cantidad del vino contenido en cada una de las botas que componen la solera,

33
II.II. Vinos dulces naturales andaluces. Elaboracin y crianza

proceso que se conoce como "saca. El vaco generado en las botas se


completa con el vino procedente de la escala que le sigue en crianza, la 1
criadera. Igualmente, la 1 criadera se completa con vino de la saca de la 2
criadera y as sucesivamente hasta llegar a la escala ms joven, que a su vez se
completa con el vino procedente del sistema de sobretablas o aadas. El
resultado es, por tanto, un vino con unas caractersticas ms homogneas que
los sometidos al sistema de aadas (BOJA n 249; BOJA n 155).

Figura 7. Esquema del sistema de criaderas y soleras (Fuente: D.O. "Jerez-Xrs-Sherry",


(2015)).

34
Captulo II. Introduccin

II.III. SECADOS ALTERNATIVOS AL ASOLEO

Durante el asoleo, la uva en las paseras se encuentra expuesta al ataque de


insectos y de aves as como a inclemencias meteorolgicas, como lluvias y
humedad, que pueden favorecer el desarrollo fngico de Botrytis Cinerea,
causante de la podredumbre gris y/o de especies ocratoxignicas, llegando a
ocasionar una merma en el rendimiento del proceso y de la calidad del
producto final con las consecuentes e importantes prdidas econmicas.

Por ello, en los ltimos aos, se estn desarrollando nuevas alternativas,


principalmente para el secado de frutas y la obtencin de pasas para consumo
directo (Pangavhane y Sawhney, 2002), que permitan un secado rpido,
homogneo, controlando las caractersticas higinico-sanitarias del producto,
sin que incidan negativamente en sus propiedades organolpticas.

II.III.1. PRETRATAMIENTOS CON AGENTES QUMICOS

La finalidad de esta operacin es reducir el tiempo de secado, aumentando su


velocidad. Son, mayormente, procesos de inmersin en soluciones alcalinas o
emulsiones con aceite que actan sobre la cutcula cerosa de la superficie de
las uvas, disminuyendo su resistencia y favoreciendo la difusin de la humedad
a travs de la baya (Jairaj et al., 2009).

Entre los diversos agentes qumicos utilizados, la mezcla de K2CO3 con aceite
de oliva o con oleato de etilo a temperatura ambiente son dos de los ms
frecuentes y cuyo uso est ms extendido (Doymaz y Pala, 2002; Serratosa et
al., 2008a).

35
II.III. Secados alternativos al asoleo

No obstante, aunque estos tratamientos aceleran el proceso de deshidratacin,


no solventan los inconvenientes causados por las condiciones externas
adversas asociados al secado al aire libre, por lo que suelen emplearse
combinados con otros sistemas, como los secaderos solares, o las cmaras de
secado (Serratosa et al., 2008a; Ramos et al., 2014).

II.III.2. SECADO A LA SOMBRA

Basado en los mismos principios que el secado al sol, se da en regiones donde


las condiciones ambientales no son favorables para el asoleo. Para un correcto
secado es necesaria una completa circulacin de aire, por lo que el secado a la
sombra debe realizarse bajo techo con lados abiertos (Enachescu Dauthy,
1995) o en contrucciones con grandes ventanas situadas en paredes opuestas,
realizndose el control del secado mediante la apertura o cierre de las mismas
(Hidalgo-Togores, 2003b). El secado a la sombra lleva ms de tiempo de lo
que normalmente se requiere para el secado a pleno sol.

II.III.3. SECADEROS SOLARES

En el secado solar, la energa solar se utiliza ya sea como nica fuente de calor
requerido o como sistema de apoyo (Ekechukwu y Norton, 1999). Se clasifican
en tres grupos: los secaderos directos, indirectos y mixtos (Jairaj et al., 2009).

- En los secaderos solares directos, las uvas estn expuestas


directamente a la radiacin solar o a una combinacin de radiacin
solar directa, as como radiacin reflejada. En la mayora de este tipo
de construcciones, la radiacin solar pasa a travs de una cubierta
transparente, generalmente de vidrio, e incide sobre las uvas. La

36
Captulo II. Introduccin

cubierta de vidrio reduce las prdidas por conveccin al ambiente y


aumenta la temperatura en el interior del secadero (Figura 8).

Figura 8. Cabina para secado


solar (Fuente: Jairaj et al., (2009))

- En los secaderos de tipo indirecto, las uvas no entran en contacto


directamente con la radiacin solar, pero el aire calentado por la
radiacin solar se hace fluir a travs de ellos. En este tipo de sistemas,
el colector solar y la cmara de secado, se sitan, por tanto, en zonas
independientes (Figura 9).

Figura 9. Secadero de tipo indirecto


con circulacin natural. (Fuente: Jairaj et
al., (2009)).

- Por ltimo, en el secadero tipo mixto, las uvas se encuentran expuestas


directamente a la radiacin solar a la vez que el aire caliente fluye a
travs de las mismas.

37
II.III. Secados alternativos al asoleo

Estos secaderos, a su vez, pueden subdividirse en dos grupos en funcin de si


el movimiento de aire se realiza de manera natural o forzando la circulacin del
aire caliente a travs de las uvas mediante ventiladores o extractores elctricos
o motorizados.

Los secaderos solares hbridos son un tipo especial de secaderos de


conveccin forzada o activos que complementan el calor generado por la
radiacin solar con otra fuente de energa, principalmente elctrica o de
combustibles fsiles, incorporando un aporte trmico auxiliar (Figura 10). Si el
aire est suficientemente caliente, el calentador de aire solar puede ser usado
directamente, en caso contrario, el deshidratador externo puede actuar
aumentando la temperatura del aire hasta los niveles necesarios (Ekechukwu y
Norton, 1999).

Figura 10. Secador


hbrido. (Fuente: Jairaj et
al., (2009)).

II.III.4. ESTUFAS Y SECADEROS DE AIRE CALIENTE

Las estufas de desecacin son los equipos ms simples de deshidratacin sin


apoyo solar o tambin llamados sistemas de secado artificial (Hidalgo-Togores,
2003b). Basan su funcionamiento en el empleo de calor radiante como fuente
de energa, lo que conlleva un bajo rendimiento calorfico ya que parte del

38
Captulo II. Introduccin

calor se pierde en la atmsfera. Adems, el proceso es lento y poco uniforme


producindose el movimiento de aire nicamente por los gradientes de
temperatura generados, por lo que, actualmente, han sido reemplazados en su
mayora por secaderos de aire caliente.

El secado por aire caliente es el mtodo ms empleado para la deshidratacin


de productos agroalimentarios, especialmente para granos, lminas de frutas y
verduras (Maupoey et al., 2001). La transferencia de calor en este tipo de
equipos se realiza por conveccin forzada por medio de ventiladores. La
corriente de aire cumple una doble finalidad; trasmite el calor a los alimentos
para su correcta deshidratacin y arrastra el vapor de agua generado. Las
fuentes de energa utilizadas para calentar el aire son muy variadas, como gas
natural, biomasa o electricidad.

Los sistemas de secado por aire caliente se componen de elementos comunes,


bsicamente, un alimentador, un calentador con ventilador para la circulacin
de aire y un colector con objeto de lograr una buena distribucin del aire
climtico en la cmara, sin que la temperatura de los racimos se eleve en
exceso as como un control de la humedad del aire de entrada y de salida.

En funcin de los requisitos de operacin, principalmente de la cantidad de


producto a tratar y el tiempo de secado, el diseo del equipo puede ser para
trabajar en discontinuo, como el secadero en bandejas (armarios o cmaras) o
en continuo o semicontinuo. En los primeros, tambin llamados de tipo
uniforme, la distancia de las uvas a la fuente de calor es fija, mientras que en
los continuos o progresivos, la vendimia se traslada lentamente dentro del
secadero, destacando en este grupo los secaderos de tipo tnel (Figura 11), que
pueden ser en contracorriente o con corriente de aire transversal al
movimiento de las vagonetas o bandejas donde se sitan las uvas.

39
II.III. Secados alternativos al asoleo

Figura 11. Secadero tipo tnel. (Fuente: Hidalgo-Togores, (2003a)).

Un ejemplo de equipos de funcionamiento discontinuo, es el empleo de


cmaras climticas para la obtencin de uvas pasas (Castro et al., 2005;
Serratosa et al., 2014). Estos dispositivos, posibilitan el ajuste de la temperatura
y humedad del secado, disminuyen el tiempo de pasificacin, permitiendo una
independencia de las condiciones meteorolgicas externas. Castro et al., (2005)
demostraron que el empleo de una cmara climtica permite realizar el
proceso de secado de forma controlada con una alta similitud en el contenido
polifenlico y de compuestos voltiles de estos mostos con los de aquellos
secados de forma tradicional.

Aunque el secado en cmara permite un mayor control del proceso que los
deshidratadores solares, proporcionando un producto con una ptima calidad
final, conlleva un elevado coste energtico asociado al propio proceso de
deshidratacin y a las prdidas de calor debido a la humedad del aire agotado y
al mal aislamiento trmico de los recintos de secado (Minea, 2013).

Las medidas actuales se centran en la reduccin y/o recuperacin del calor


perdido. En este sentido, las bombas de calor, son dispositivos capaces de
ahorrar un 50 % o ms de la energa primaria utilizada, realizando un
recalentamiento y deshumificacin del aire de salida de la cmara de secado,
que es recirculado posteriormente al sistema.

40
Captulo II. Introduccin

Por ltimo, como medidas de ahorro energtico, se estn desarrollando nuevas


tecnologas para el secado de productos (Vega-Mercado et al., 2001) como el
empleo de microondas que pueden emplearse de forma independiente o como
pretratamiento al secado por aire caliente (Clary et al., 2007). En la tcnica de
microondas a vaco, el calor generado se produce principalmente en el
producto debido a las radiaciones electromagnticas mientras que el vaco
reduce el punto de ebullicin del agua contenida en el alimento, por lo que las
prdidas de calor al ambiente son mucho menores, permitiendo trabajar a
temperaturas ms bajas y acortando el tiempo de secado. Aunque se han
obtenido buenos resultados a escala de laboratorio, los elevados costes de
equipamiento, hacen que el potencial de esta tcnica est enfocado a la
obtencin de nuevos productos o con caractersticas nicas que no pueden ser
reproducidas de forma efectiva con otras tecnologas (Sun, 2014).

41
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

II.IV. PARMETROS ANALTICOS DE INTERS EN


LA ELABORACIN DE VINOS DULCES
NATURALES ANDALUCES

II.IV.1. PARMETROS DE CONTROL DE LA SEGURIDAD


ALIMENTARIA

II.IV.1.1. CIDO GLUCNICO COMO INDICADOR DE


PODREDUMBRE GRIS (BOTRYTIS CINEREA)

En la podredumbre gris, la uva es infectada por Botrytis cinerea, uno de los


agentes patgenos con peores consecuencias para la calidad de los vinos,
afectando a la composicin, estabilidad y propiedades sensoriales.

La infeccin (Figura 12) se produce principalmente cuando la uva se encuentra


completamente madura, por penetracin del hongo en su interior. La
susceptibilidad al ataque depender, en gran medida de las condiciones
climticas, vindose favorecida por la humedad ambiente, con veranos
lluviosos y otoos hmedos (Suarez y Inigo, 2004), siendo, por tanto, de
especial relevancia durante el proceso de pasificacin.

Otros factores determinantes en el desarrollo del hongo en las uvas son el


grosor del hollejo y/o su resistencia, as como la compacidad del racimo, ya
que si las bayas rozan entre s, se favorece la destruccin de la capa de pruina
que acta como barrera protectora (Zoecklein et al., 2000; Hidalgo-Togores,
2003b).

42
Captulo II. Introduccin

Figura 12. Infeccin por botrytis


cinerea.

El resultado es la evaporacin del jugo y absorcin, por parte del mismo, de


gran cantidad de sustancias. Se produce un aumento del extracto seco,
consecuencia de la formacin de glicerina, sustancias mucilaginosas y cido
glucnico y glucurnico. Igualmente, causa una disminucin de la acidez total
y un aumento del pH, por salificacin de los aniones orgnicos. Adems,
Botrytis cinerea consume el nitrgeno amoniacal para su propio metabolismo,
que junto al elevado contenido de azcar en el mosto y la formacin de
compuestos antibiticos (botrycina), dificulta la fermentacin alcohlica.

Otros de los efectos nocivos del hongo, es la formacin de metanol por la


accin de enzimas pectolticas y esterasas, as como la disminucin del
sulfuroso libre por la generacin de altas concentraciones de compuestos que
se combinan con el dixido de azufre.

El cido glucnico (Figura 13), que se produce por la oxidacin enzimtica de


la glucosa, tiene especial inters ya que, al no ser degradado por levaduras y
bacterias, es el indicador habitual de podredumbre en prcticas enolgicas,
emplendose en vendimia como referencia del estado sanitario de la uva.
Mientras que la concentracin de cido glucnico en uva sana y sus respectivos
vinos es de aproximadamente 0,5 g/l, esta cantidad puede oscilar entre 1 y 5
g/l en vinos elaborados con uvas infectadas por Botrytis cinrea (Zoecklein et
al., 2000).

43
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

Figura 13. Estructura molecular cido glucnico.

Respecto a las propiedades organolpticas, las vendimias atacadas, son ms


ricas en polifenoloxidasas que las sanas, lo que junto a la accin de las enzimas
lacasas de origen fngico, provoca la oxidacin de gran parte de la fraccin
polifenlica principalmente de tipo no flavonoide como son los cidos cafeico
y p-cumrico, libres o esterificados con cido tartrico, que se transforman en
quinonas y polimerizan, virando el color de las uvas hacia tonos marrones.

Adems, transmite un sabor amargo al vino y ocasiona una prdida de


tipicidad, sustituyendo el carcter afrutado por olores desagradables a fenol y
a yodo, induciendo la degradacin de los monoterpenos primarios como
nerol, geraniol y linalol responsables de los aromas de ciertas variedades como
la Moscatel y la inestabilidad de los aromas de fermentacin, debido a la accin
de enzimas esterasas que hidrolizan los steres producidos durante dicha etapa.

Por otra parte, genera una mayor predisposicin a la infeccin por bacterias
causantes de enfermedades como el picado actico y facilita el desarrollo de
otros hongos de los gneros Penicillium y Aspergillus, que pueden dan lugar a
la formacin de Ocratoxina A (OTA), metabolito de elevada toxicidad. Sin
embargo, algunos estudios han demostrado que la infeccin por Botrytis Cinerea
es capaz de degradar la Ocratoxina A (Abrunhosa et al., 2002; Valero et al.,
2008b).

44
Captulo II. Introduccin

II.IV.1.2. OCRATOXINA A

Ocratoxina A (OTA) es un metabolito de elevada toxicidad, producido por


hongos de los gneros Penicillium y Aspergillus. Su estructura qumica (Figura
14) contiene un grupo 7-carboxi-5-cloro-8-hidroxi-3,4-dihidro-(3R)-
metilisocumarina enlazada mediante el grupo carboxi a L--fenilalanina.

Figura 14. Estructura molecular Ocratoxina A.

OTA es causante de nefropatas crnicas en diversas especies de mamferos y


aves. En el ser humano se ha relacionado con una nefropata endmica de la
regin de los Balcanes. Posee, adems, efectos teratognicos, hepatotxicos,
neurotxicos e inmunotxicos, estando clasificada por la Agencia
Internacional para la Investigacin del Cncer (IARC) como posible
carcingeno humano (clase 2B) (IARC, 1993).

En la Unin Europea est regulado el contenido de OTA en alimentos


susceptibles a la contaminacin. En el caso del vino, otras bebidas a base de
vino y/o mostos el lmite mximo establecido es 2.0 g/l ((CE) No
1881/2006).

La contaminacin fngica puede producirse desde el comienzo del envero


(Battilani et al., 2003), sin embargo, el desarrollo de OTA depende de varios
factores, principalmente aquellos relacionados con las condiciones climticas
de humedad y temperatura durante la maduracin del fruto (Bell et al., 2005;

45
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

Battilani et al., 2006). Mientras que en climas fros y templados la


contaminacin por OTA se debe a hongos de tipo Penicillium, en climas clidos
como el sur de Europa, es el gnero Aspergillus el predominante (Battilani et al.,
2006; Blesa et al., 2006). En este sentido, A. Carbonairus presenta una elevada
resistencia a la radiacin solar y a altas temperaturas con un mximo superior a
40 C, siendo la mayor fuente de OTA en uvas, vinos y otros productos
vitivincolas (Cabaes et al., 2002; Battilani et al., 2004). La sntesis de la
micotoxina se ve afectada, adems, por la actividad del agua (aw) de las uvas,
con un rango ptimo de 0,930 a 0,987 (Mitchell et al., 2004).

Otros factores que influyen en el desarrollo del hongo es el tiempo y


condiciones de almacenamiento de la uva tras la vendimia y el tiempo de
secado en la elaboracin de pasas (Bell et al., 2004; Valero et al., 2005), de ah
su inters en vinos elaborados a partir de uvas pasificadas, como es el caso de
los vinos dulces naturales andaluces. Durante el secado de la uva, aumenta la
incidencia de Aspergillus seccin Nigri (A. carbonarius y A. niger) frente a otro
tipo de hongos. Mientras que el agregado A. niger es el predominante, A
carbonarius presenta un mayor potencial ocratoxignico (Valero et al., 2005),
demostrndose la existencia de niveles superiores de Ocratoxina A en vinos
procedentes de uva pasificadas al sol respecto a otras elaboraciones (Marn et
al., 2007).

En la Tabla 3 se detallan a modo de resumen todas aquellos factores que


condicionan el contenido en OTA en vino, entre los que encontramos la
etapa de pasificacin como prctica enolgica que favorece una mayor
presencia de esta micotoxina.

46
Captulo II. Introduccin

FACTORES QUE INCREMENTAN EL CONTENIDO EN OTA


Latitud: Mayores niveles de OTA en regiones
de la zona Sur.
Condiciones Climticas
Ao de produccin: bajas temperaturas y
tormentas durante el verano.
Variedades de vid sensibles a mohos y
podredumbre.
Grado de maduracin.
Cultivo de la vid Dao fsicos o por microorganismos.
Control fitosanitario inadecuado.
Zonas mal ventiladas y/o con exceso de
humedad.
Condiciones de almacenamiento postcosecha.
Tcnicas enolgicas Maceracin.
Proceso de Pasificacin.

Tabla 3. Principales causas de contaminacin por OTA.

II.IV.1.2.1. Medidas para prevenir y reducir el contenido en OTA

Tal es la importancia que esta micotoxina tiene en la elaboracin de vinos


dulces, que en Andaluca, desde 2011, se establece el control de Ocratoxina A
durante el proceso de pasificacin como medida obligatoria para acogerse al
Distintivo de Garanta de Produccin Integrada de Andaluca. Reglamento
Especfico de Produccin Integrada de Andaluca para las industrias de
obtencin y elaboracin de vinos (BOJA n 197, 2011).

Por otra parte, en el ao 2007 se estableci un Cdigo de prcticas para la


prevencin y reduccin de la contaminacin por Ocratoxina A en el vino
(CAC/RCP 63-2007). En l se recogen las directrices y medidas a seguir, desde
el anlisis de los factores de riesgo y especies ocratoxgenas en cada regin
hasta las operaciones en vendimia y posteriormente en bodega a fin de evitar la
formacin del hongo o, en su defecto, la reduccin del contenido en OTA en
uvas, mostos y vinos.

47
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

Para prevenir la formacin de OTA, es necesario en primer lugar un correcto


control fitosanitario durante el cultivo de la vid, evitando la proliferacin de
otros microorganismos y daos fsicos en las bayas que faciliten la entrada de
hongos ocratoxgenos.

Especficamente, las recomendaciones para la produccin de uva pasa


destinada a la elaboracin de vinos dulces son:

Asegurar la higiene de los recipientes destinados a la cosecha y/o al


secado de las uvas.
Utilizar solamente las uvas no daadas por los insectos y no
contaminadas por mohos.
Seleccionar las uvas eliminando los granos daados o contaminados.
Colocar las uvas a secar o a pasificar en una capa y evitar la
superposicin de los racimos.
Favorecer el secado progresivo y uniforme de todas las partes del
racimo.
Tomar las medidas necesarias para evitar el desarrollo de los
drosfilos.
En cuanto a las condiciones particulares de secado al aire libre, se
recomienda efectuar el secado en condiciones bien ventiladas y cubrir
las uvas durante la noche para evitar la condensacin de la humedad.

Como medidas reductoras del contenido en OTA en el caso de vinos


contaminados, en dicha norma del Cdex Alimentarius (CAC/RCP 63-2007),
se recomienda el uso de carbn enolgico en dosis reducidas para minimizar
las posibles prdidas de compuestos polifenlicos y aromticos.

48
Captulo II. Introduccin

II.IV.1.3. CIDOS ORGNICOS

De gran relevancia en el estudio de las caractersticas de un mosto o de un


vino, la acidez influye en multitud de parmetros tales como la estabilidad del
color, el aroma, propiedades gustativas y el estado sanitario (Garcia-Romero et
al., 1993; Lpez-Tamames et al., 1996). El contenido cido contribuye
organolpticamente a la frescura de las uvas y mostos, as como a la calidad de
los vinos. El estudio individualizado de los distintos cidos presentes en un
vino es indicativo de posibles desarrollos microbiolgicos, en ocasiones, no
deseados. En trminos generales un mosto presenta valores de pH entre 3,1 y
3,6, y valores de acidez total que varan entre 3,5 y 7,5 g/l (expresado en cido
tartrico).

La fraccin cida de la uva est constituida mayoritariamente por los cidos


tartrico, mlico y ctrico. En ocasiones pueden encontrarse a bajas
concentraciones cidos actico y fumrico. Sin embargo, estos ltimos, al igual
que otros cidos como succnico, lctico o frmico, se originan principalmente
por el metabolismo microbiano de levaduras y bacterias. Son mayoritariamente
compuestos polihidroxicidos con uno o varios centros quirales. La
configuracin absoluta de los carbonos asimtricos del cido est directamente
relacionada con el azcar del cual deriva (Jackson, 2014).

La sntesis de los cidos orgnicos tiene lugar en las hojas y en los mismos
racimos a travs de diversas rutas metablicas. Sin embargo durante la
maduracin, especialmente en zonas clidas, se produce un descenso de su
concentracin (Lamikanra et al., 1995; Blouin). Dicha disminucin puede
explicarse por varios factores; en primer lugar, por efecto del fenmeno de
dilucin por el engrosamiento de la baya, ya que desde el envero a la vendimia
la uva dobla prcticamente su volumen.

49
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

Adems, se produce el catabolismo respiratorio de stos cidos. No obstante,


mientras el cido tartrico requiere de temperaturas superiores a 30 C, en el
cido mlico se realiza la respiracin a temperaturas inferiores a 30 C. Por
tanto, vendimias ms clidas o procedentes de zonas vitcolas con gran
nmero de horas de sol, darn lugar a mostos con valores ms alto de pH, y
menor concentracin de cidos, sobre todo de cido mlico.

Una tercera causa, es el transporte desde la raz de ciertos cationes,


generalmente potasio, que produce la salificacin y consecuente neutralizacin
de los cidos tartrico y mlico.

El cido L(+)tartrico es el constituyente mayoritario de la uva, sin embargo es


poco frecuente en otros frutos. Es el cido ms fuerte de los presentes en las
uvas (menor valor de pKa) y responsable mayoritario del valor de pH de las
mismas, as como de la naturaleza tampn de los mostos, al encontrarse en
parte salificado con cationes sodio y potasio. El contenido de cido tartrico
en la madurez puede oscilar entre los 3 y 9 g/l en funcin de la variedad y las
condiciones ambientales.

El cido L(-)mlico es uno de los primeros metabolitos que aparece con la


fotosntesis. El contenido de ste cido en uvas maduras vara en funcin de la
temperatura durante la maduracin; en zonas clidas oscila entre 1 y 2 g/l
mientras que en zonas ms fras puede estar entre 4 y 8 g/l aunque estas
concentraciones pueden llegar a desaparecer por la accin de bacterias lcticas,
que por descarboxilacin lo transforman en cido lctico, en un proceso
denominado fermentacin malolctica. Esta tiene lugar principalmente en
vinos tintos y algunos blancos producidos en climas fros. El mayor beneficio
que aporta esta transformacin es la evolucin a sabores ms redondos, con
notas lcteas.

50
Captulo II. Introduccin

Pero no es sta la nica va de formacin del cido lctico; es posible que


durante la fermentacin pueda sintetizarse por las levaduras una pequea
cantidad de cido lctico. Adems, el cido lctico puede ser un indicador de
alteracin, cuando su formacin est asociada a la degradacin por bacterias
lcticas de otros sustratos, principalmente azcares y determinados cidos
orgnicos, distintos del cido mlico.

En este sentido, los cidos ctrico, pirvico y glucnico pueden ser


metabolizados por dichos microorganismos, mientras que el succnico no se ve
afectado. El cido tartrico solo es degradado por un reducido nmero de
bacterias del gnero Lactobacillus, cuando ya se han transformado los otros
cidos. Las bacterias lcticas pueden diferenciarse por su carcter
homofermentativo, si generan nicamente cido lctico o heterofermentativo,
si producen adems otros compuestos como anhdrido carbnico, cido
actico y alcohol etlico. Este proceso se denomina picado lctico y se da en
vinos dulces o en vinos secos que por algn problema en la fermentacin
posean restos de azcares sin consumir.

La presencia de cido ctrico, principalmente en las races, se debe sobre todo a


reacciones caractersticas del ciclo de Krebs. En mostos de uva sana, su
contenido es del orden de 150 a 300 mg/l pudiendo llegar al gramo en uvas
atacadas por Botrytis cinerea.

El cido succnico aparece de forma significativa como derivacin del proceso


degradatorio de las hexosas por las levaduras, siendo uno de los productos ms
comunes del metabolismo de la fermentacin. Es resistente al ataque
microbiano bajo condiciones anaerbicas y particularmente estable en el vino.
Sin embargo, el sabor amargo/salado limita su uso en la acidificacin de vinos.

51
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

El cido actico es producido en pequeas cantidades por las levaduras


durante la fermentacin. Niveles normales en el vino (hasta 300 mg/l),
pueden ser deseables aadiendo complejidad al sabor y olor del vino. Es
igualmente importante en la produccin de algunos steres de acetato que
pueden dar al vino un carcter afrutado (Jackson, 2014). Niveles de cido
actico superiores a 500 mg/l, se asocian generalmente con la contaminacin
de la uva, mosto o vino con bacterias acticas o lcticas.

La podredumbre cida, a veces confundida con la infeccin por Botrytis cinerea,


tiene lugar cuando las bayas presentan fisuras por donde penetran bacterias y
levaduras del gnero Acetobacter, Sacharomyces y Kloeckera que son
propagadas principalmente por la mosca del vinagre (Drosophila
melanogaster) u otros insectos (MAPA, 1988).

Poco a poco, las bayas van adquiriendo un tono marrn y un fuerte olor a
vinagre por la formacin de cido actico (Rodrguez-Lpez, 1996). Adems,
se produce la salida del mosto por la fisura que inici la podredumbre,
contaminando las uvas vecinas.

Las temperaturas elevadas de ms de 30 C y el exceso de humedad en la


poca final de maduracin, frenan el desarrollo de la podredumbre gris y
favorecen el de la podredumbre cida.

Los daos que ocasiona son importantes. La uva destinada a vino produce
mostos con menor grado alcohlico, mayor acidez voltil total y desviacin de
aromas.

Para evitar la proliferacin de la podredumbre cida es necesario un correcto


manejo del viedo, evitando los daos en las bayas, el exceso de vigor y

52
Captulo II. Introduccin

apiamiento de racimos y los riegos durante el periodo de maduracin. As


mismo, se debe prestar especial atencin al control de las moscas del vinagre,
mediante insecticidas contra dpteros y el cuidado en la manipulacin de los
racimos (MAPA, 1988).

En el vino, la va de formacin de cido actico ms importante es la


oxidacin del etanol por bacterias del gnero Acetobacter proceso denominado
picado actico. Estas concentraciones de cido actico dan lugar a vinos
considerados de poca calidad con un sabor picante y fuerte que recibe el
nombre de avinagrado.

Queda pues patente que la determinacin del contenido individualizado en


cidos orgnicos en vinos en general y, en vinos dulces en particular, se hace
necesario para abordar el estudio de posibles cambios microbiolgicos y fsico-
qumicos.

53
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

II.IV.1.4. CARBAMATO DE ETILO

El carbamato de etilo (CE, uretano) (Figura 15) es un compuesto genotxico y


carcingeno formado principalmente como subproducto de fermentacin a
partir de la reaccin de varios precursores, especialmente urea y citrulina, con
etanol (Ough et al., 1988; Matsudo et al., 1993). Se han identificado otras
fuentes como el cianuro de hidrgeno en el caso de destilados de frutas de
hueso (Baumann y Zimmerli, 1987).

Figura 15. Estructura molecular carbamato de etilo.

Aunque CE est catalogado en el grupo de carcingenos 2A (probable


carcingeno para el ser humano) por la Agencia Internacional para la
Investigacin del Cncer (IARC, 2010) y ha sido una sustancia vigilada por la
Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y Alimentacin
(FAO) desde 2002, no existe actualmente un consenso sobre los niveles
mximos permitidos para el mismo en la Unin Europea (EFSA, 2007). Sin
embargo, s se han establecido lmites mximos de CE (Tabla 4) para
diferentes tipos de vinos en algunos pases como Canad, USA, Japn o Korea
(Liang et al., 2009; Rodrguez-Madrera y Surez-Valles, 2009).

Dada la potencial actividad carcinognica que el carbamato de etilo ha


demostrado en animales (Baumann y Zimmerli, 1987; Matsudo et al., 1993),
hay un gran inters en reducir los niveles de CE en productos alimenticios.

54
Captulo II. Introduccin

La formacin de CE est favorecida, de forma significativa, por las altas


temperaturas, as como por las elevadas concentraciones de etanol, urea y
citrulina (Canas et al., 1993; Stevens y Ough, 1993; Kodama et al., 1994). La
principal fuente de carbamato de etilo en vino es la reaccin qumica de etanol
con urea, aunque tambin pueden participar citrulina y carbamil fosfato (Ough
et al., 1988).

Lmite legal de carbamato de etilo (g/l)


Pas Brandy
Vino Destilado
Vino Sake de
Fortificado Espirituoso
frutas
Canad 30 100 150 200 400
USA 15 60 - - -
Repblica
30 100a 150 200 400b
Checa
Francia - - 150 - 1000
Alemania - - - - 800
a) Vinos de frutas y licorosos
b) Destilados de frutas y otros espirituosos de frutas o mezcla.

Tabla 4. Niveles mximos permitidos de carbamato de etilo en bebidas alcohlicas.

La urea se forma como consecuencia de la degradacin de arginina por la


levadura durante la fermentacin, siendo dependiente de la cepa de levadura
empleada y de las condiciones en las que se lleve a cabo el proceso (Ough et al.,
1990; Ough et al., 1991). Ough et al., (1991) analizaron el efecto del empleo de
diferentes temperaturas sobre la formacin de urea durante la fermentacin
alcohlica, concluyendo que las elevadas temperaturas implicaban una alta
concentracin del contenido en urea de los vinos obtenidos.

Respecto a la adicin de nutrientes, diversos estudios han demostrado que el


uso de fosfato de diamonio en los mostos, para estimular la fermentacin
alcohlica, tiene una influencia significativa en el contenido de CE de los vinos
obtenidos y que este efecto depende de la cepa de levadura y el momento (al

55
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

principio, en el medio o al final del proceso de fermentacin) en el que es


aadido al mosto (Henschke y Ough, 1991; Shinohara y Yanagida, 1999;
Adams y van Vuuren, 2010). En este sentido, Torricelli et al., (1995) hallaron,
en experimentos de fermentacin con una nica cepa de S. cerevisiae y adicin
de sulfato amnico y aminocidos, que la formacin de urea dependa de la
cantidad y calidad de la fuente de nitrgeno. Aminocidos como arginina,
citrulina y alanina favorecan la formacin de urea. Ough et al., (1991)
observaron que un nivel muy elevado de aminocidos disminua el consumo
de arginina durante la fermentacin alcohlica y minimizaba la excrecin de
urea.

En relacin con la cepa de levadura, Daudt et al., (1995) hallaron, en estudios


llevados a cabo con uva variedad Cabernet Sauvignon, que el contenido en
urea en vinos fermentados con Saccharomyces bayanus era menor que aquellos
fermentados con Saccharomyces montrachet. Balcerek y Szopa, (2006) tambin
obtuvieron, en estudios de fermentacin de pur de ciruelas con diferentes
cepas de levaduras de vino seleccionadas, un menor contenido en carbamato
de etilo cuando se empleaba S. bayanus.

Uthurry et al., (2006) no encontraron diferencias significativas en el contenido


de CE en vinos fermentados con Saccharomyces bayanus y S. cerevisiae a diferentes
temperaturas (25 C y 30 C) y a dos valores de pH (3,2 y 3,8). Sin embargo, en
el mismo estudio, se observ que el contenido de urea fue mayor para aquellos
vinos fermentados con S. cerevisiae a 30 C y pH 3,8, sugiriendo una mayor
capacidad de esta cepa para formar urea y, por tanto, una mayor capacidad
para la produccin de CE.

En el caso de los vinos fortificados, como es el caso de los vinos dulces


naturales andaluces, la fortificacin en s misma puede agravar el problema de

56
Captulo II. Introduccin

la excrecin de urea por la levadura. La urea se forma mayoritariamente


durante las etapas inicial e intermedia de la fermentacin, con el posterior
consumo por levaduras de generaciones siguientes, durante las ltimas fases. Si
el proceso de fermentacin se detiene antes de llegar a sta ltima fase, como
es el caso de los vinos fotificados, pueden obtenerse vinos con alto contenido
en urea (Daudt et al., 1992).

Las condiciones fisicoqumicas durante el envejecimiento y almacenamiento de


los vinos tambin influyen notablemente en la formacin de carbamato de
etilo (Kodama et al., 1994). Larcher et al., (2013) demostraron que la
temperatura de conservacin era crucial para la formacin de CE en diferentes
vinos blancos almacenados a 12 C y 40 C. Aquellos vinos con una
concentracin de urea mayor de 20 mg/l y que fueron sometidos a 40 C
presentaron un contenido en CE desde 15 hasta 30 g/l en menos de 5 das.
Koch-Wilk et al., (2006) obtuvieron resultados similares en vinos de frutas
almacenados en oscuridad a temperatura de bodega (6-10 C) o con luz de da
a temperatura ambiente (20-30 C). En dicho estudio, estas ltimas
condiciones (luz de da y 20-30 C) tuvieron una influencia significativa y
positiva en los niveles de CE.

Teniendo en cuenta todos estos factores, varias acciones preventivas, como el


control de las tcnicas de fertilizacin, ajuste del contenido en nutrientes de los
mostos, uso de levaduras adecuadas y aplicacin de cepas de bacterias lcticas
y ureasas cidas, se han recomendado por la U.S. Food and Drug
Administration para reducir los niveles de CE (Butzke y Bisson, 1997).

57
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

II.IV.2. PARMETROS RELACIONADOS CON LA CALIDAD


ORGANOLPTICA

II.IV.2.1. COMPUESTOS POLIFENLICOS

Los compuestos polifenlicos contribuyen, en gran medida, a la calidad de los


vinos, siendo responsables del origen y estabilidad del color, la astringencia o
el sabor. Adems, en los ltimos aos han gozado de un creciente inters ya
que, debido a su capacidad para actuar contra el dao oxidativo, poseen
propiedades antinflamatorias, antihipertensivas o cardioprotectoras entre otras
(Fernandez-Panchon et al., 2008; Gresele et al., 2011; Georgiev et al., 2014).

II.IV.2.1.1. Clasificacin

Qumicamente, los compuestos polifenlicos son estructuras bencnicas


cclicas con uno o ms grupos hidroxilos unidos directamente al anillo as
como sus derivados (steres, metil steres, glicsidos, etc.). Una primera
clasificacin de este tipo de molculas distingue entre compuestos
flavonoides, que presentan dos anillos fenlicos unidos por un ncleo de
pirano (C6-C3-C6) y los no flavonoides, de estructura ms simple (Jackson,
2014).

Flavonoides

Dentro de la primera categora, los flavonoides, destacan los flavonoles, los


flavan-3-oles y los antocianos, stos ltimos, en el caso del vino tinto. Tambin
pueden existir pequeas cantidades de dihidroflavonoles (flavanonoles). Los
flavonoides pueden encontrarse libres o ligados a otros flavonoides, azcares o
no flavonoides o una combinacin de ellos.

58
Captulo II. Introduccin

Antocianos

Son los responsables del color rojo azulado del hollejo de las uvas tintas y de la
pulpa de las variedades tintoreras. Mayoritariamente se encuentran como
glucsidos, lo que favorece su estabilidad qumica y su solubilidad en agua
denominndose antocianidinas. La glucosa puede estar, adems, esterificada
con diferentes cidos como actico, p-cumrico y cafico.

Los antocianos presentan un equilibrio entre formas qumicas diferentes que


condicionan su color. A los pH del vino y los mostos, podemos considerar que
existe un equilibrio entre las formas roja, azul e incolora. Conjuntamente,
existen dos factores que modifican este equilibrio; la copigmentacin y la
combinacin con los flavanoles.

Flavan-3-oles

Esta familia de compuestos lo constituye las diferentes formas isomricas de la


catequina y sus polmeros que forman los taninos catquicos o condensados.
A diferencia de otros grupos, los flavan-3-oles no se encuentran como
glicsidos, aunque s, esterificados con cido glico (Waterhouse, 2002).

Fundamentalmente, los monmeros se localizan en lo hollejos, las semillas y


el raspn del racimo (Tabla 5); siendo mayoritariamente (+)-catequina, (-)-
epicatequina y 3-galato de (-)-epicatequina. Los taninos condensados estn en
una mayor proporcin que los monmeros, son responsables de parte de la
componente amarilla del color, as como de la capacidad de mantener el color
con el tiempo.

59
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

Nombre R1 R2 R3
Catequina H OH H
Galocatequina H OH OH
Epicatequina OH H H
Epigalocatequina OH H OH
Tabla 5. Flavan-3-oles monmeros de la uva.

Flavonoles

Son pigmentos amarillos de los hollejos de las uvas blancas y tintas (Tabla 6).
Las formas glucosiladas son las ms abundantes, encontrndose igualmente
cantidades importantes de derivados glucurnidos (Flanzy, 2003). Los
flavonoles parecen actuar como pantalla solar natural, encontrndose en
mayores concentracines en la piel de uvas expuestas a la luz solar (Price et al.,
1995; Haselgrove et al., 2000).

Nombre R1 R2

Kaempferol H H
Quercitina OH H
Miricetina OH OH
Isoramnetina OCH3 H

Tabla 6. Flavonoles de la uva.

Mientras que kaempferol y quercitina se encuentran habitualmente en los vinos


blancos, la miricetina es propia de los vinos tintos.

60
Captulo II. Introduccin

Flavononoles

Han sido identificados en el hollejo de uvas blancas y en vinos en diferentes


concentraciones en funcin de la variedad (Singleton y Trousdale, 1983;
Trousdale y Singleton, 1983) (Tabla 7). Se cree que estos compuestos pueden
estn relacionados con un tipo de decoloracin oxidativa que ocurre algunas
veces en los vinos blancos.

Nombre R

Astilbina OH

Engeletina H

Tabla 7. Flavononoles de la uva.

No flavonoides

Pueden clasificarse en cidos fenlicos, grupo comprendido por los cidos


benzoicos (C6-C1) y cidos cinmicos (C6-C3), y otros derivados como los
estilbenos.

cidos fenlicos

Los cidos hidroxicinmicos e hidroxibenzoicos se encuentran en la pulpa de


la uva y son fcilmente extrados tras la molturacin y el prensado. De stos
dos subgrupos, son los cidos hidroxicinmicos en forma de steres con
azcares, alcoholes o cidos orgnicos, principalmente tartrico, los
compuestos mayoritarios en el mosto y en el vino blanco (Waterhouse, 2002).
Ejemplo de ello, son los cidos caftrico, coutrico y fertrico, steres del

61
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

cido tartrico con cafeico, p-cumrico y cido ferlico, respectivamente


(Jackson, 2014) (Tabla 8).

Nombre R R
cido p-cumrico H H
cido cafeico OH H
cido ferlico OCH3 H

cido sinpico OCH3 OCH3
Tabla 8. cidos hidroxicinmicos.

En comparacin con los cidos hidroxicinmicos, el conjunto de cidos


hidroxibenzoicos se encuentran en menor proporcin pudiendo aparecer en
forma libre, de aldehdos u otros derivados (Barroso et al., 1986; Moreno-
Arribas y Polo, 2008) (Tabla 9).

Nombre R R

. p-hidroxibenzoico H H
. protocatquico OH H
cido vainllico OCH3 H
cido glico OH OH
cido sirngico OCH3 OCH3
Tabla 9. cidos hidroxibenzoicos.

Estilbenos

En el hollejo de la uva se encuentran el resveratrol (trans-3,5,4-


trihidroxiestilbeno), su ismero cis y los respectivos glucsidos (piceidos).
Aunque la forma trans es la ms abundante, la radiacin lumnica provoca la
isomerizacin cis/trans (Waterhouse, 2002) (Tabla 10).

62
Captulo II. Introduccin

La sntesis de resveratrol en la uva se debe a un mecanismo de proteccin


frente al estrs causado por diferentes factores como infecciones fngicas
(principalmente Botrytis Cinerea), dao o exposicin a luz UV (Versari et al.,
2001).

cis-resveratrol trans- resveratrol

Tabla 10. Ismeros cis/trans- resveratrol.

II.IV.2.1.2. Influencia de la vinificacin y envejecimiento en madera

Al igual que ocurre con los compuestos voltiles, el perfil polifenlico del vino
vendr determinado por la materia prima de partida y por las posteriores
etapas de vinificacin y envejecimiento.

En primer lugar, la cantidad presente en la uva vara considerablemente de una


variedad a otra, dependiendo de las condiciones climticas y de la madurez de
la fruta (Ramos et al., 1999). Adems, tras el prensado de la uva, los polifenoles
son transferidos al mosto, en mayor o menor medida, en funcin de la presin
empleada (Barroso et al., 1986) as como de su distribucin en la uva.

El contenido polifenlico del vino aumenta durante las primeras etapas de la


fermentacin si el mosto est en contacto con el hollejo y las semillas. Largas
maceraciones extraen ms compuestos flavonoides, principalmente flavonoles
y en menor medida flavan-3-oles (Ivanova et al., 2012). Posteriormente, el

63
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

contenido polifenlico disminuye debido a su precipitacin junto a protenas y


restos celulares.

Adems, durante la vinificacin se produce un conjunto de reacciones, tanto


qumicas como biolgicas, que transforman el perfil polifenlico. Una de las
transformaciones ms caractersticas es la oxidacin, durante el prensado, de
los cidos caftrico y coutrico hacia quinonas que por reaccin con glutatin
da lugar a GRP (grape reaction product), compuesto no coloreado. Si no existe
glutatin en el medio, o se encuentra a bajas concentraciones, la reaccin
apenas tiene lugar y se produce el pardeamiento del mosto. Por otra parte, las
diversas prcticas enolgicas, pueden tambin cambiar la fraccin polifenlica,
como el tratamiento con enzimas pectolticas que favorece la hidrlisis del
cido caftrico en cido cafeico y tartrico.

El envejecimiento en madera conduce a un incremento del contenido


polifenlico (Garca Moreno y Barroso, 2002), debido principalmente a la
formacin de elevadas cantidades de derivados de cidos hidroxibenzoicos,
principalmente cido elgico (dilactona formada por la interaccin de dos
molculas de cido glico) as como por la extraccin de la madera de
derivados de tipo cinamaldehdos y benzaldehdos, fundamentalmente vainilla,
siringaldehdo, coniferaldehdo y sinapaldehdo (Jackson, 2014).

II.IV.2.1.3. Actividad antioxidante

Los compuestos polifenlicos estn ntimamente relacionados con los efectos


beneficiosos para la salud del consumo moderado de vino, debido
principalmente a su actividad como antioxidantes (Alonso et al., 2002;
Feliciano et al., 2008). Esta propiedad puede definirse como la capacidad de

64
Captulo II. Introduccin

reaccin que ciertos compuestos muestran con especies reactivas de oxgeno y


nitrgeno (ROS y RNS) causantes del dao oxidativo de las clulas.

El poder antioxidante de los compuestos polifenlicos se debe a su capacidad


de captar los radicales libres, donar tomos de hidrgeno o electrones o
quelatar cationes metlicos, siendo su estructura qumica, nmero y posiciones
de los grupos hidroxilos, as como la naturaleza de las sustituciones en el anillo
aromtico, los principales responsables de la relacin estructura-actividad
(Balasundram et al., 2006).

Entre los antioxidantes del vino y las uvas, algunos actan eliminando las
especies reactivas, como los cidos saliclico y benzoico, que eliminan los
radicales hidroxilos, altamente reactivos, formando compuestos hidroxi
(Zoecklein et al., 2000). Otros, por sus caractersticas estructurales, pueden,
adems, intervenir en reacciones de transferencia de electrones. Es el caso de
los cidos fenlicos, cuya actividad antioxidante se relaciona con el grupo
funcional carboxilo y el nmero y posiciones relativas de los grupos hidroxilo
en la estructura de anillo aromtico; mientras que el cido glico,
trihidroxilado, muestra una elevada actividad antioxidante, la sustitucin con
grupos metoxilo de los grupos hidroxilo de las posiciones 3 y 5, como en el
cido sirngico, reduce la actividad (Balasundram et al., 2006).

En trminos generales, los cidos hidroxicinmicos son antioxidantes ms


efectivos que los cidos hidroxibenzoicos debido al aumento de las
posibilidades de deslocalizacin electrnica del radical fenoxilo. Por este
mismo efecto de deslocalizacin electrnica, los steres de los cidos
hidroxicinmicos, como el cido caftrico o coutrico, presentan una mayor
actividad antioxidante que sus respectivos cidos de origen (De Beer et al.,
2002).

65
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

Por ltimo, la actividad antioxidante de los flavonoides depende en gran


medida de las diferentes sustituciones en los anillos fenlicos y el ncleo de
pirano, siendo la quercetina, uno de los captadores de radicales libres ms
efectivos en esta familia de compuestos (De Beer et al., 2002).

66
Captulo II. Introduccin

II.IV.2.2. COMPUESTOS VOLTILES

La fraccin voltil de un vino est definida por cientos de compuestos


qumicos diferentes. Alcoholes, aldehdos, steres, cidos, monoterpenos y
otros compuestos minoritarios constituyen frecuentemente la fraccin voltil
de este producto. Su presencia o ausencia en un vino en particular depende de
varios factores: ambientales (clima y suelo), madurez y variedad de uva,
condiciones de elaboracin y envejecimiento.

Mientras que algunos compuestos estn ya presentes en la uva, otros son


formados durante el proceso de fermentacin y envejecimiento (Schreier y
Jennings, 1979; Rapp y Mandery, 1986; Garcia-Jares et al., 1995). En algunos
casos, la variedad de uva empleada en la elaboracin de un vino en particular
determina completamente el aroma de dicho vino, persistiendo los
compuestos voltiles que estn presentes en las uvas a lo largo de todo el
proceso de vinificacin y envejecimiento. La medida en la que estos
compuestos perduren durante todo el proceso, depender de las condiciones
de vinificacin y envejecimiento (Rapp, 1998).

No obstante, el proceso de vinificacin en s mismo y particularmente la


fermentacin alcohlica, genera la mayor parte de los compuestos aromticos
presentes en el vino (Lee et al., 2004; Hernndez-Orte et al., 2005).

En muchos de los vinos, todos estos compuestos aromticos estn sujetos al


subsecuente proceso de envejecimiento en madera. Durante el envejecimiento
en madera, el vino adquiere complejidad aromtica como resultado de un
diverso e importante conjunto de reacciones (Ortega-Heras et al., 2004).
Adems, nuevos compuestos, voltiles y no voltiles, son extrados de la
madera, modificando el bouquet del vino. Como consecuencia de todos estos

67
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

procesos, los compuestos voltiles afrutados y fermentativos, disminuyen


durante el proceso de envejecimiento en madera (Escalona et al., 2002).

II.IV.2.2.1. Aromas de la uva

El potencial aromtico de la uva puede presentarse de dos formas distintas; en


primer lugar, en su forma libre, debido a las sustancias olorosas tpicas de la
variedad; el segundo grupo corresponde a los aromas en forma combinada,
que no presentan sus propiedades olfativas pero que en el transcurso de la
elaboracin pueden transformarse en los primeros y comunicar al vino sus
aromas caractersticos.

Terpenos

Son principalmente monoterpenos y sesquiterpenos, compuestos de diez y


quince tomos de carbonos respectivamente. Los primeros son generalmente
hidrocarburos simples, aldehdos, alcoholes, cidos y steres. Respecto a los
sesquiterpenos, algunos derivados como el farnesol o el nerolidol han sido
identificados en uvas, si bien, esta familia de compuestos no ha sido tan
ampliamente estudiada como los monoterpenos (Coelho et al., 2006; Dunlevy
et al., 2009).

Los alcoholes monoterpnicos o terpenoles, como linalol, geraniol y -


terpineol son el grupo de compuestos con mayor poder odorfero, siendo
responsables en gran medida del aroma caracterstico de las variedades
Moscatel, Gewrztraminer o Riesling (Lea et al., 2003). En este sentido, se ha
demostrado que existe una correlacin entre los atributos florales de estas
variedades y los altos niveles de linalol y -terpineol (Marais, 1983; Park et al.,

68
Captulo II. Introduccin

1991). Tambin pueden encontrarse en variedades menos aromticas, aunque


generalmente a concentraciones por debajo del umbral de percepcin.

Otros derivados terpnicos que influyen en el aroma, aunque en menor grado,


son principalmente aldehdos como geranial, neral o citroneral; los
hidrocarburos terpnicos como limoneno, p-cimeno, -terpineno o miriceno; y
xidos terpnicos (Ribreau-Gayon et al., 2003b).

Los terpenos se encuentran en la uva mayoritariamente en forma de


precursores inodoros, glicosilados, en una proporcin que puede oscilar en
funcin de la variedad entre 2/1 hasta 24/1 respecto al contenido en terpeno
libre.

Adems, bajo las condiciones de pH del mosto y del vino, algunos


monoterpenos son transformados dando lugar a otros metabolitos. Por
ejemplo, bajo condiciones cidas, se produce la degradacin del geraniol y
linalol, dando lugar a la formacin de xidos de linalol y -terpineol (Figura
16). Dicha reaccin aumenta con la temperatura, por lo que pueden producirse
durante el transporte y almacenamiento, dando lugar al carcter envejecido de
los vinos (Robinson et al., 2014).

69
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

Figura 16. Modificacin de los terpenoles en medio cido,


(Flanzy, 2003)

Norisoprenoides

Son compuestos de 9 a 13 tomos de carbonos derivados de la degradacin


oxidativa de los carotenoides. Dentro de sta familia destacan por sus
propiedades odorferas los derivados C13-norisoprenoides como la -
damascenona de olor complejo floral y de frutas exticas o el TDN (1,1,6-
trimetil-1,2-dihidronaftaleno) con olor a queroseno, que se forma
principalmente durante el envejecimiento en botella por lo que no suele estar
presente en la uva o el vino joven. La exposicin de las uvas al sol durante la
maduracin acelera la degradacin de los carotenoides, aumentando, por tanto,
la formacin de derivados glicosilados de C13-norisoprenoides (Ribreau-
Gayon et al., 2003a).

70
Captulo II. Introduccin

Metoxipirazinas

Procedentes del metabolismo de los aminocidos, son caractersticas de la


variedad Cabernet Sauvignon, aunque tambin se ha detectado en otras
variedades como Semilln o Merlot. Se dan principalmente en vendimias
inmaduras o en aquellas donde la maduracin se ha dado en condiciones fras.

Precursores aromticos

Aunque los tioles se forman durante la fermentacin alcohlica, son sus


precursores aromticos principalmente S-conjugados de cistena, los que se
encuentran en la uva. Estos, por la accin de enzimas -liasas son liberados
durante la fermentacin. Es el caso de los compuestos 4-metil-4-
mercaptopentan-2-ona y 3-mercapto-1-hexanol, responsables del aroma
caracterstico de los vinos de Sauvignon Blanc.

Otros compuestos de especial relevancia que pueden actuar de precursores


aromticos son los cidos grasos. En la uva, predominan las formas
insaturadas (mayoritariamente los cidos linoleico y linolnico) que por accin
de enzimas lipoxigenasas, dan lugar principalmente a aldehdos y alcoholes de
seis tomos de carbono, aportando carcter herbceo, especialmente, en uva
de maduracin insuficiente. Otra familia de compuestos que tiene su origen en
la degradacin de cidos grasos son las - y - lactonas que se forman a travs
de sus correspondientes cidos 4- o 5- hidroxicarboxlicos.

Por ltimo, algunos compuestos fenlicos, cmo los cidos fenlicos (cafico,
p-cumrico, ferlico) y sus steres, por accin de las levaduras o por estearasas,
pueden dan lugar a fenoles voltiles. Mientras que los vinilfenoles (4-vinilfenol
y 4-vinilguayacol) se forman en su mayora por la accin de S. cerevisiae, siendo

71
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

las concentraciones ms elevadas en blancos que en tintos, la formacin de


etilfenoles (4-etilfenol y 4-etilguayacol) se asocia a la contaminacin por
bacterias lcticas o por levaduras Brettanomyces/Dekkera, as como a otros
factores desconocidos (Flanzy, 2003).

II.IV.2.2.2. Etapa prefermentativa

Se trata de los compuestos formados desde el momento de la cosecha hasta el


inicio de la fermentacin por las operaciones de vendimia, durante el
transporte, estrujado, despalillado, prensado, calentamiento o maceracin.

En todas estas operaciones, puede existir una incorporacin de oxgeno y una


rotura a nivel celular liberando enzimas que transforman el aroma de los
mostos.

Maceracin pelicular

En la maceracin pelicular, la uva despalillada, estrujada y sulfitada es


macerada en condiciones controladas de tiempo y temperatura, con objeto de
extraer los compuestos aromticos y sus precursores de los hollejos logrando
as una mayor potencia aromtica (Flanzy, 2003).

Esta tcnica debe emplearse en vendimias sanas y con una ptima maduracin
ya que de lo contrario podran transferirse aromas herbceos en el caso de uva
inmadura o aromas terrosos y de hongo en uva con podredumbre (Ribreau-
Gayon et al., 2003a).

Proceso de Pasificacin. Asoleo

Durante el asoleo se produce, en trminos generales, un aumento en el


contenido de los compuestos voltiles presentes en la uva. Franco et al., (2004)

72
Captulo II. Introduccin

observaron, en estudios de mostos de uva pasificada Pedro Ximnez, que este


hecho puede ser explicado, en parte, por el efecto de concentracin debido a la
deshidratacin de los racimos, como ocurre para el butan-1-ol y los alcoholes
isoamlicos. Adems, se produce el metabolismo anaerbico de los azcares y
la formacin de etanol, dando lugar a un incremento significativo de ciertos
voltiles; isobutanol, alcohol benclico, 2-feniletanol, -butirolactona, -
hexalactona y 5-metilfurfural, los cuales se encuentran directamente
relacionados, con las notas afrutadas, dulces y tostadas de los mostos de uvas
asoleadas.

Por el contrario, otros compuestos, principalmente, alcoholes y aldehdos C6


((E)-hex-3-en-1-ol, (Z)-hex-3-en-1-ol, (E)-hex-2-en-1-ol, (E)-hex-2-enal),
responsables del carcter herbceo, no se detectaron en los mostos de uva
pasificada. Este hecho podra explicarse por la baja actividad lipoxigenasa en la
baya durante el secado debido a las altas temperaturas del proceso. Adems,
la elevada densidad y viscosidad del mosto obtenido, origina una baja actividad
de agua y una escasa difusin de oxgeno de la atmsfera, factores que
disminuyen la actividad de dicha enzima (Franco et al., 2004).

II.IV.2.2.3. Etapa fermentativa

Durante la fermentacin alcohlica se producen, como subproductos de los


metabolismos glucdico, nitrogenado, lipdico y azufrado, un gran nmero de
compuestos aromticos responsables de la nota vinosa caracterstica de todos
los vinos.

Los alcoholes superiores son un grupo de compuestos de gran relevancia


contribuyendo a la complejidad aromtica global, sin embargo a elevadas
concentraciones pueden considerarse como defectos del aroma. Se forman por

73
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

el metabolismo de los aminocidos y azcares (Tabla 11). Su produccin


depender de la cepa de levadura empleada, su perfil de utilizacin de los
aminocidos y su demanda de nitrgeno total as como de las condiciones en
las que se lleve a cabo la fermentacin.

Aminocido Alcohol superior


Leucina 3-metil-1-butanol
Isoleucina 2-metil-1-butanol
Valina 2-metil-1-propanol
Treonina Propanol
2-fenilalanina 2-feniletanol
Tirosina Tirosol
Tabla 11. Origen de los alcoholes superiores a partir de sus precursores aminocidos.

Otros compuestos que marcan el aroma fermentativo, son los cidos grasos
de cadena corta (C2-C10), sus steres etlicos y acetatos de alcoholes
superiores. La formacin de dichos compuestos est ligada a las condiciones
de fermentacin como temperatura o la presencia de oxgeno.

Por ltimo, ciertos productos voltiles como los compuestos carbonlicos


(aldehdos y cetonas), azufrados y nitrogenados, lactonas o fenoles voltiles
pueden estar presentes tambin en los vinos y, aunque algunos se encuentren
en concentraciones por debajo de su umbral de percepcin, todos contribuyen
en mayor o menor medida, a la complejidad del aroma final (Flanzy, 2003).

II.V.2.2.4. Envejecimiento en madera

En la crianza oxidativa en madera, tienen lugar un complejo conjunto de


procesos que contribuyen, en gran medida, a la mejora de las caractersticas
organolpticas del vino.

74
Captulo II. Introduccin

En primer lugar, se produce la transformacin fisicoqumica de ciertos


compuestos del vino, como los alcoholes, que por oxidacin dan lugar a
aldehdos. Asimismo, se produce la esterificacin entre cidos orgnicos y
alcoholes. Este tipo de reacciones son lentas, vindose favorecidas por la
temperatura y el pH, y reversibles, por lo que no se produce una esterificacin
total, sino un equilibrio entre los cidos libres y los cidos esterificados.
(Hidalgo-Togores, 2003a). En los vinos con adicin de alcohol y oxidados, se
favorece, adems, la reaccin de acetilacin entre los aldehdos y los alcoholes
o polioles como el glicerol, ya que presentan elevadas concentraciones de
ambos compuestos.

Por otra parte, se produce la cesin por parte de la madera de un gran nmero
de voltiles que vendrn determinados por el tipo de madera empleada,
frecuentemente roble, de su origen y de las condiciones de fabricacin y
utilizacin de las barricas (Garde-Cerdn et al., 2010). En el caso de los vinos
de Jerez, en los que se emplean botas de roble previamente envinadas, la
extraccin de dichas sustancias es menos pronunciada (Flanzy, 2003).

En funcin de su estructura qumica, estos compuestos voltiles, extrados de


la madera de roble, se pueden clasificar en:

Fenoles voltiles que aportan olores a humo y especias, como el eugenol


(clavo) o el 4-metil-guayacol (aroma a madera quemada).

Aldehdos fenlicos y fenilcetonas. Algunos tan caractersticos como la


vainillina que confiere los aromas vainillados.

Lactonas como la -metil--octalactona, tambin llamada oak lactona


(lactona de roble) o whisky lactona que se encuentra en la madera de roble

75
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

proporcionando aromas a nuez de coco. Presenta dos ismeros, cis- y trans-,


cuya relacin isomrica evoluciona con el tiempo a favor del primero, que es
diez veces ms aromtico que la forma trans.

Aldehdos furnicos: se forman por la degradacin trmica durante el tostado


de la madera. Son, principalmente, furfural, 5-metilfurfural e
hidroximetilfurfural, cuyos aromas recuerdan a las almendras amargas. La
concentracin de estos compuestos en los vinos suele ser muy inferior a su
umbral de percepcin olfativa, aunque existen excepciones como
determinados vinos dulces fortificados envejecidos en madera nueva (Cutzach
et al., 2000).

76
Captulo II. Introduccin

II.IV.2.3. ANLISIS SENSORIAL

Mientras la medida de las caractersticas fsicas, qumicas y microbiolgicas se


llevan a cabo mediante mtodos en la lnea ms clsica del mtodo cientfico,
podra pensarse que la evaluacin de las propiedades sensoriales es algo
subjetivo. Pero esto no corresponde con la realidad. El anlisis sensorial (en
adelante AS) es, si se disea y ejecuta correctamente, una disciplina cientfica,
pues definido un objetivo, la metodologa para conseguirlo se basa en el
planteamiento de una hiptesis y el diseo de las pruebas que generen datos
cuantitativos reproducibles, de cuya interpretacin es posible extraer
conclusiones. Adems, el AS utiliza conocimientos de fisiologa de los
sentidos, de qumica, tecnologa de los alimentos, estadstica y otras ramas de
la ciencia. Se define pues el AS como la disciplina cientfica empleada para
medir e interpretar las reacciones a aquellas caractersticas de alimentos u otras
sustancias, tal como se perciben a travs de los sentidos de la vista, el olfato, el
tacto, el gusto y el odo. Lo que hace especial pues al AS es que los
instrumentos de anlisis son personas entrenadas al efecto (UNE-ISO 6658,
2008; Durn et al., 2012).

De manera muy simplificada, el proceso durante el AS puede describirse


mediante las siguientes etapas:

1. La observacin analtica por medio de los sentidos: los centros receptores


asociados a cada sistema sensorial reciben el estmulo externo y lo
transforman en impulso elctrico, que transmiten a travs de las
neuronas...
2. hasta la corteza cerebral donde se integra y se produce la toma de
conciencia (percepcin).

77
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

3. La emisin de un juicio razonado, la comunicacin de lo percibido,


constituye la tercera etapa en un AS, pues sin dato generado y susceptible
de ser tratado, no habran resultados ni conclusiones ni informacin
buscada.

Como se ha comentado, la percepcin se realiza a travs de los sistemas


sensoriales. Se denomina as a la organizacin funcional mediante la cual un
organismo procesa informacin del ambiente externo e interno. Las
estructuras bsicas de un sistema sensorial las constituyen los rganos
receptores y el sistema nervioso central. Cada sistema opera como un
transductor, un dispositivo que cambia un tipo de energa en otro
manteniendo el mismo mensaje. Los receptores, clulas nerviosas
especializadas que poseen un potencial generador proporcional a la magnitud
del estmulo) se clasifican por el tipo de energa que detectan: qumica
(receptores del gusto y el olor/aroma), mecnica (receptores tctiles), lumnica
(receptores pticos).

Cuando se degusta un alimento, el sujeto recibe un conjunto de impresiones


sensoriales simultneas, y, a menos que realice un entrenamiento adecuado, no
podr llevar a cabo una evaluacin analtica, esto es, de cada atributo por
separado, y en su orden de percepcin natural, que es:

1. Aspecto: Incluye los atributos que se perciben a travs del sentido de la


vista. Algunos de ellos son: color, tamao, forma, textura de la superficie,
efervescencia, transparencia, etc.
2. Textura. Conjunto de propiedades geomtricas (tamao, forma y
distribucin de las partculas en el producto: granulosidad, etc.),
mecnicas (de reaccin del producto frente a un esfuerzo: cohesin,
fragilidad, viscosidad, elasticidad, dureza, adherencia, masticabilidad,

78
Captulo II. Introduccin

gomosidad) y de superficie (sensaciones producidas por el contenido de


agua o de grasa) de un producto, que son percibidas por los receptores
mecnicos, tctiles y, cuando corresponde, visuales e incluso auditivos.
3. Olor. Sensacin percibida por va nasal, al acercar el alimento a la nariz
(ortonasal), relacionada con la presencia de sustancias voltiles y solubles
parcialmente en agua y en lpidos, para que puedan llegar hasta los
receptores olfativos situados en la glndula pituitaria. Un olor se define
con su nota, una intensidad y eventualmente su permanencia. En AS se
distingue olor de aroma. El aroma ocurre tras introducir el alimento en la
boca, llegando las sustancias al centro de recepcin en la pituitaria por va
retro-nasal. En estas circunstancias la temperatura es mayor, no solo el
aire acta de medio transmisor (tambin la mucosa del paladar), y se
detectan sustancias liberadas durante la masticacin.
4. Gusto o sabor bsico. Son las sensaciones de salado, dulce, amargo, cido,
y umami, producidas en la boca por sustancias de cierta hidrosolubilidad
que llegan a los centros receptores, las papilas gustativas.
5. Flavour. Sensacin olfatogustativa compleja que causa un alimento en la
boca al ser percibidos simultneamente gusto, aroma y sensaciones
trigeminales (las que se perciben como agresivas astringencia, picante,
pseudotrmicas-).
6. Sonido. Los sonidos provocados al masticar o morder un alimento, al
abrir el envase, o al servirlo, completan la percepcin de su textura y
forman parte del placer de comer.

La realizacin del AS requiere, en primer lugar, el uso de un lenguaje comn.


La norma, UNE-EN ISO 5492, (2010) presenta una lista de trminos
habituales con sus definiciones. Los descriptores son las palabras que se utilizan

79
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

para definir las caractersticas organolpticas del alimento, si bien la


terminologa especfica se define y trabaja para cada estudio particular.

En AS es necesario tener en cuenta las siguientes consideraciones:

1. La respuesta humana a un estmulo no se puede aislar de otros estmulos


sensoriales provenientes del entorno. No obstante, se puede controlar la
influencia de estos factores y normalizar sus efectos.
2. La variacin de la respuesta sensorial es inherente a cualquier grupo de
personas participantes en las pruebas y es inevitable. No obstante, con
entrenamiento, un mismo grupo de personas con aptitudes puede dar
respuestas individuales muy concordantes.
3. La variacin de las conclusiones que se puedan sacar de los resultados
depende de la prueba utilizada y de la forma en que se haya realizado, as
como de la eleccin de las preguntas hechas.

Las tcnicas de evaluacin sensorial proporcionan los procedimientos


necesarios para objetivar el sistema, generar datos cuantitativos e
interpretarlos. Muchos factores afectan a la evaluacin sensorial de un
alimento, de manera que se hace necesaria una normalizacin de la totalidad de
los aspectos que intervienen en una sesin de evaluacin. Existe en este
sentido un largo trabajo por parte de las organizaciones dedicadas a la
normalizacin y certificacin, que dan como resultado las conocidas normas
ISO (internacionales) y UNE (nacionales).

Entre las variables externas que deben cuidarse para minimizar los efectos
indeseables que puedan restar objetividad a los juicios, se encuentran:

80
Captulo II. Introduccin

1. Las relacionadas con el lugar donde se realizar el entrenamiento de los


jueces y las sesiones de trabajo (UNE-EN ISO 8589, 2010).
2. Otras relacionadas con la muestra (UNE-ISO 6658, 2008): temperatura,
cantidad, vehculos, agente enjuagante, diluciones, nmero de muestras,
codificacin y orden de presentacin, utensilios (UNE 87-022-92, 1992;
UNE-ISO 16657, 2007).
3. Las relativas a la organizacin: horario, cuestionarios, programacin de
sesiones.

El juez (o evaluador) es la persona que realiza la prueba de anlisis sensorial.


En funcin del objetivo del estudio, se trabajar con el tipo de juez necesario.
Existen cuatro tipos de jueces:

Expertos: de productos de lujo, de calidad (vino, queso, t), con


intensa formacin autodidacta. No forman parte de un comit. Su
criterio aislado es muy valorado, aunque no se rige por los parmetros
que establece la disciplina del AS.
Juez entrenado o catador: miembros de un panel de entre 7 y 15 personas,
entrenados y que ejercen con periodicidad. Saben exactamente qu
han de medir y poseen larga experiencia en determinadas propiedades
sensoriales. Se emplean en anlisis complejos, tal como los
descriptivos.
Juez semientrenado o de laboratorio: Entrenados tambin, y miembros de
un equipo de entre 10 y 20 que trabaja de manera peridica. Se
emplean en pruebas discriminativas, aunque pueden trabajar en
estudios descriptivos sencillos.
Cconsumidor: No relacionados con la industria del alimento. Se usan en
pruebas afectivas (de preferencia o aceptacin). Lo habitual es

81
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

elegirlos de entre la poblacin potencialmente consumidora del


producto. N mnimo = 30.

La seleccin y el entrenamiento de los jueces se regulan en las normas UNE 87024-


1, (1995) y UNE-EN ISO 8586-2, (2009), para jueces con distinto grado de
destreza y entrenamiento.

A la hora de elegir un grupo de panelistas adecuados, conviene realizar una


preseleccin considerando unas condiciones bsicas, como son: inters,
disponibilidad, normalidad de percepcin fisiolgica (deteccin de
dicromatismos, determinacin de la sensibilidad gustativa (UNE 87003, 1995);
emparejamiento de olores y sabores bsicos para descartar ageusia y anosmia -
(UNE-ISO 13301, 2007).

En la etapa de seleccin se llevarn a cabo pruebas para la caracterizacin de su


agudeza sensorial, mediante test discriminativos de intensidades de estmulos,
ya sean triangulares (UNE-EN ISO 4120, 2008) o de ordenamiento (UNE-EN
ISO 8587, 2009), determinacin de sus umbrales de deteccin, identificacin y
diferenciacin (UNE 87003, 1995; UNE-ISO 13301, 2007), as como de su
capacidad para desarrollar e interpretar un vocabulario especfico (olfativo y de
textura), y sobre la consistencia o reproducibilidad de sus juicios. A la vez, se
familiarizar a los jueces con los mtodos y los materiales utilizados en AS.
Junto con los datos generales recopilados y los resultados de las pruebas, en la
seleccin primera de los jueces se tendrn muy en cuenta la aplicacin prevista,
y, ms que su comportamiento inicial, su potencial, as como la confirmacin
durante un breve periodo de tiempo de los requisitos superados.

82
Captulo II. Introduccin

Durante el entrenamiento, los jueces son ser calibrados para realizar medidas que
puedan ser reproducidas e interpretadas universalmente. Para ello, se tendrn
en cuenta las siguientes consideraciones generales:

Se les acostumbrar a evitar hbitos como el tabaco, caf, cosmticos,


etc., justo antes de las sesiones.
Respecto al protocolo, se les instar a proceder en toda ocasin de la
manera establecida.
Han de utilizarse las muestras, escalas, pruebas e instrumentos que se
usarn en las pruebas reales.
Ha de asegurarse que los candidatos comprenden las pruebas y los
cuestionarios.
Han de repetirse las pruebas para determinar la mejora en la
reproducibilidad de las respuestas.

Cuando se ha establecido la naturaleza del problema y fijado explcitamente el


objetivo, la eleccin de la prueba estar ligada a la naturaleza de las muestras y a
la disponibilidad de los jueces.

Pruebas afectivas. El juez/consumidor expresa su reaccin subjetiva ante el


producto. Un mnimo de 30 jueces no entrenados, consumidores habituales y
compradores potenciales del tipo de alimento en cuestin. El campo de
aplicacin principal de este tipo de pruebas son los estudios de mercado, de
producto en venta o en perspectivas de comercializarse.

Preferencia (UNE-EN ISO 5495, 2009): de comparacin entre dos


muestras para saber si la que est en estudio es preferida y por qu.
Ordenamiento de preferencia (UNE-EN ISO 8587, 2009), llamada
tambin ordenacin por rangos o ranking de preferencia: Cada juez

83
II.IV. Parmetros analticos de inters en la elaboracin de vinos dulces naturales andaluces

recibe tres o ms muestras y las ordena desde la que ms le gusta a la


que menos le gusta. No se obtiene informacin sobre la magnitud de
la diferencia.
Prueba de medicin del grado de satisfaccin: mediante escalas
hednicas (verbales o grficas) de intervalo con las que es posible
evaluar cunto gustan o disgustan N muestras.

Pruebas discriminativas o de diferencias. Se desea conocer si hay diferencia entre dos


o ms muestras, y en el caso de que se trate de un atributo en concreto, cul es
el sentido de esa diferencia. Requieren jueces semientrenados.

Comparacin por parejas (UNE-EN ISO 5495, 2009): Se presentan 2


muestras, y se le pide al juez que las compare en cuanto a alguna
caracterstica sensorial e indique si percibe diferencia entre ellas, y en
todo caso cul de ellas posee una mayor intensidad en esa
caracterstica.
Triangular (UNE-EN ISO 4120, 2008): Se le presentan al juez tres
muestras, de las cuales dos son iguales, y se le pide que identifique la
muestra que es diferente. El anlisis se realiza sobre la muestra como
conjunto o sobre una propiedad. Existe la posibilidad de ampliar el
esquema bsico de la prueba, interrogando a los jueces sobre la
naturaleza de la caracterstica que marca la diferencia, y/o sobre el
valor cuantitativo aproximado de esa diferencia.
De ordenamiento (UNE-EN ISO 8587, 2009): Se dan a los jueces tres
o ms muestras que difieren en alguna propiedad, y se les pide que las
pongan en orden creciente o decreciente de dicha propiedad.

84
Captulo II. Introduccin

Pruebas de calificacin mediante escalas o categoras (UNE-ISO 4121, 2006). Usadas


para evaluar la magnitud de las diferencias, categoras o clases que se atribuyen
a las muestras presentadas. Los jueces han de ser al menos semientrenados.
Calificacin con escalas no-estructuradas: El juez debe expresar su
apreciacin de la intensidad de un descriptor de un alimento marcando
sobre una lnea comprendida entre un extremo mximo y uno mnimo.
Calificacin con escalas de intervalo: la intensidad de un descriptor se
define en uno de los puntos (extremos o intermedios) que tiene
marcada la escala.
Calificacin con escalas estndar: Utiliza escalas de intervalo cuyos
puntos son definidos por alimentos que representan el grado de
intensidad del descriptor que est siendo medido.

Pruebas descriptivas. Pretenden caracterizar cualitativa y/o cuantitativamente uno


o ms atributos sensoriales. Proporcionan mucha informacin. El
entrenamiento de los jueces debe ser ms intenso y monitorizado, y la
interpretacin de los datos es laboriosa. Las ms habituales son la
determinacin de perfiles sensoriales olfatogustativos (UNE 87017, 1992) y de
textura (UNE 87025, 1996), que consisten en una descripcin minuciosa de las
caractersticas que conforman una propiedad sensorial, seguida de la
estimacin de la intensidad de cada una de ellas. En las escalas de intervalo
(UNE-ISO 4121), la intensidad de cada atributo se define en uno de los
puntos (extremos o intermedios) que tiene marcada la escala. El problema de
la subjetividad de los jueces se resuelve, en parte, con las escalas continuas,
pero tienen el inconveniente de que es difcil lograr dar una descripcin
adecuada de los puntos intermedios.

85
II.V. Quimiometra. Tratamiento estadstico de datos

II.V. QUIMIOMETRA. TRATAMIENTO


ESTADSTICO DE DATOS

La quimiometra puede definirse como el conjunto de procesos que permiten


la transformacin de los datos y seales analticas en informacin til mediante
el uso de las matemticas, la estadstica y la lgica formal (Durn et al., 2012).
Las tcnicas quimiomtricas pueden clasificarse en dos grupos, tcnicas
univariantes y multivariantes.

II.V.1. ANLISIS UNIVARIANTE

El anlisis univariante de los datos consiste en hacer una revisin del valor de
un slo indicador, por ejemplo, el tipo de envejecimiento al que se ha
sometido un vino. Suele usarse cuando interesa conocer en profundidad qu
significan, por separado, algunos indicadores y es utilizado con fines
descriptivos en las primeras etapas de los estudios realizados.

Entre las principales tcnicas de anlisis univariante, encontramos: las medidas


de tendencia central (media, mediana y moda), las medidas de dispersin
absolutas y relativas (desviacin tpica, varianza, coeficientes de variacin,
entre otros) y las medidas inferenciales (prueba z, prueba t).

II.V.1.1. ANLISIS DE LA VARIANZA (ANOVA)

El anlisis de la varianza permite contrastar la hiptesis nula de que las medias


de K poblaciones (K>2) son iguales, frente a la hiptesis alternativa de que
por lo menos una de las poblaciones difiere de las dems en cuanto a su valor
esperado. Este contraste es fundamental en el anlisis de resultados

86
Captulo II. Introduccin

experimentales, en los que interesa comparar los resultados de K


tratamientos o factores con respecto a la variable dependiente o de
inters. A la variable categrica, que define los grupos, la denominamos factor
o variable independiente, mientras que la variable cuantitativa en la que
deseamos comparar los grupos la denominamos variable dependiente.

Para poder aplicar un ANOVA a un conjunto de datos deben cumplirse una


serie de hiptesis:

Cada conjunto de datos debe ser independiente del resto.


Los resultados obtenidos para cada conjunto deben seguir una
distribucin normal.
Las varianzas de cada conjunto de datos no deben diferir de forma
significativa.

Asimismo, si en lugar de un factor se evalan dos o ms factores (ej: distintos


laboratorios y distintas metodologas de anlisis) estaremos ante el anlisis de la
varianza de forma multivariante (MANOVA). En este caso, adems de
identificar si los cambios en las variables independientes tienen efectos
significativos en las variables dependientes, la tcnica tambin intenta
identificar las interacciones entre las variables independientes y su grado de
asociacin con las dependientes.

Frecuentemente, tanto en el ANOVA como en el MANOVA, se trabaja con el


estadstico p (p-valor). En las pruebas de significacin y diseo de experimentos,
Fisher emplea el valor p para determinar la probabilidad que permite declarar
la significacin de una prueba. El trmino significacin se usa para indicar que
la probabilidad es suficientemente pequea como para rechazar la hiptesis
planteada, es decir, si el valor p es muy pequeo, usualmente menos de 0,01

87
II.V. Quimiometra. Tratamiento estadstico de datos

0,05, se declara que la probabilidad de rechazar la hiptesis nula sin


equivocarnos es muy alta, del orden del 99% 95% respectivamente y, por
tanto, que el efecto del factor ha sido demostrado.

II.V.2. ANLISIS MULTIVARIANTE

El anlisis multivariante (Grupo de Quimiometra y Cualimetra Universitat


Rovira i Virgili, 2002; Mongay, 2005) se refiere a todas las tcnicas estadsticas
que simultneamente analizan medidas mltiples recogidas sobre cada unidad
de anlisis, es decir, aborda todas las variables disponibles para un fenmeno
determinado. ste se divide en dos clases: los mtodos que asumen
dependencia y que usan como tcnicas principales los modelos de regresin
(simple, mltiple y logstica), el anlisis de segmentacin y el anlisis
discriminante; y los mtodos que no asumen dependencia, cuyas tcnicas
principales son los modelos factoriales, de clasificacin y el anlisis
exploratorio de datos.

La disponibilidad de informacin sobre ms de una propiedad de la muestra


ampla mucho las posibilidades de estudio. Nos puede interesar conocer: a) si
todo el conjunto de muestras es homogneo o no. b) En caso de que no lo sea,
si existe alguna muestra particular discrepante (outlier), o conjunto de muestras
que se diferencien del resto. c) Si encontramos muestras caractersticas, es
conveniente conocer cules de los parmetros analizados (llamados variables)
le aporta esa diferenciacin respecto del resto. d) tambin podra ayudar a
saber si la informacin contenida en alguna de las variables es suplementaria
del resto de variables y, por tanto, si realizamos demasiado trabajo analtico
con el consiguiente gasto innecesario en tiempo y reactivos.

88
Captulo II. Introduccin

Aunque las tcnicas multivariantes son una herramienta muy til en


investigacin, no siempre se aplican de manera correcta, ponindose en
entredicho en estos casos la validez de los resultados que aporta. En este
sentido, algunas tcnicas estadsticas multivariantes requieren un anlisis
exploratorio previo de los datos originales (Martnez, 1999; Riu y Boqu,
2003), que confirme que su estructura es adecuada para la aplicacin de esa
tcnica en concreto, garantizando de esta forma la validez y consistencia de
los resultados. Otras veces, simplemente se trata de evitar sesgos causados por
la presencia de datos anmalos, o a la reduccin en exceso del n de casos
debido a datos ausentes. O incluso puede que simplemente se recomiende una
transformacin de escala en las variables para mejorar su potencia.

II.V.2.1. REGRESIN LINEAL MLTIPLE

El anlisis de regresin lineal es una tcnica estadstica empleada para estudiar


la relacin entre P variables dependientes (variables respuesta) a partir de la
informacin proporcionada por Q variables independientes (variables
explicativas o regresoras) (Mongay, 2005).

Las variables independientes pueden ser de tipo cuantitativo o cualitativo,


siendo necesario en este caso convertirlas en cuantitativas mediante asignacin
de valores de acuerdo a un cdigo preestablecido (variables dummy) (Ferr,
2006).

En el modelo de regresin lineal se asumen las siguientes hiptesis de partida:

La funcin de regresin es lineal.


Los residuales son independientes entre s, es decir, las observaciones
de la variable respuesta Y son independientes entre s.

89
II.V. Quimiometra. Tratamiento estadstico de datos

Los residuales son homocedsticos y con una distribucin normal.


Se supone que las variables explicativas son linealmente
independientes.
El nmero de puntos N debe ser mayor que Q + 1.

En el modelo ms sencillo se postula que todo valor observado de una nica


variable dependiente se expresa como una funcin lineal de una (regresin
simple) o ms (regresin mltiple) variables independientes.

El coeficiente de correlacin lineal, que evala el nivel de asociacin lineal ente


la variable respuesta y las explicativas, oscila entre 1 (fuerte asociacin lineal
positiva o negativa) siendo 0 cuando no existe correlacin lineal. Su valor
depende del tamao de la muestra, de modo que un mismo valor del
coeficiente de correlacin para muestras de distinto tamao no corresponde a
un mismo grado de asociacin. Adems, el anlisis de regresin lleva
asociados una seria de procedimientos de diagnstico (anlisis de residuos,
puntos de influencia) que informan sobre la estabilidad e idoneidad del anlisis.

II.V.2.2. ANLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES

En el caso del anlisis de componentes principales (ACP PCA, Principal


Component Analysis) es una tcnica estadstica de reconocimiento de modelos
(pattern recognition en ingls) no supervisado, cuyo objetivo es analizar tablas
de datos en busca de relaciones entre objetos y variables (Boqu y Ferr,
2004). Se buscan nuevas variables, denominadas componentes principales,
combinacin de las variables medidas que demuestran correlacin entre ellas y
que explican la mxima variabilidad entre las muestras. El proceso de
compresin usa la correlacin entre las variables originales.

90
Captulo II. Introduccin

Para el primer nuevo eje, llamado Componente Principal 1 (CP1), el algoritmo


selecciona la direccin en la que las muestras presentan la mayor variabilidad.
La siguiente componente (CP2) ha de situarse en el plano perpendicular a la
CP1 (para respetar el carcter ortogonal del sistema original), y toma la
direccin de la mxima variabilidad de los datos. El n mximo de CPs, que
explican el 100% de la variacin, es igual al n de variables originales, y esto
ocurre siempre. Por tanto, el PCA es de inters como tcnica de
representacin cuando los 2-3 primeros CP ya definen el conjunto de los datos
de manera significativa (cuando representan un % elevado de la variabilidad
total), pues solo as se permite su visualizacin sin prdida de mucha
informacin.

Una informacin de gran utilidad que puede proporcionar el PCA es que, al


agrupar las variables originales ms correlacionadas entre s en un mismo CP, a
veces es fcil concluir que un determinado CP es una variable latente lo que
podra facilitar la interpretacin de las diferencias y similitudes encontradas
entre las muestras. Adems, es posible realizar rotaciones de los CP (ejes) sin
afectar a las varianzas explicadas por cada uno, lo que en ocasiones mejora su
interpretacin (varimax, quartimax, etc.).

Por tanto, las aplicaciones del PCA son diversas, pudiendo emplearse para la
representacin de datos multidimensionales, hallar variables latentes as como
encontrar relaciones entre las muestras en funcin de dichas variables.

PCA no es una tcnica de inferencia estadstica por lo que en relacin a los


requisitos que se les exige a los datos conviene tener en cuenta que:

Los datos no han de presentar necesariamente una distribucin


normal.

91
II.V. Quimiometra. Tratamiento estadstico de datos

Las variables no han de presentar varianzas similares (requisito de


homocedasticidad).
No presenta problemas al trabajar con variables redundantes que
aporten informacin similar.
Resulta conveniente analizar presencia de outliers, aunque la decisin
de eliminarlos depender que cul sea la posible causa.
Si las variables se mueven en rangos muy diferentes, hay que
estandarizarlas antes de realizar el PCA, pues de otro modo se corre el
riesgo de que aquellas que se muevan en valores muy superiores
puedan contribuir al modelo ms que otras, incluso si su variabilidad
relativa no es tan significativa.

Los principales resultados generados en un PCA se expresan en forma de tabla


de CPs extrados y sus correspondientes varianzas explicadas; tabla de
correlaciones de cada nueva CP con las variables originales (loadings) o
grficos de proyeccin de las muestras en el nuevo espacio, sobre los planos
definidos por las CP que explican las mayores variabilidades, realizado en base
a los valores que toma cada muestra en cada nuevo CP (scores).

II.V.2.3. ANLISIS LINEAL DISCRIMINANTE

Como el PCA, el Anlisis Lineal Discriminante (ALD o LDA, Linear


Discriminant Analysis) ayuda a identificar las caractersticas que diferencian
(discriminan) a dos o ms grupos de muestras, pero la diferencia es que el
LDA otorga ms peso a las variables discriminativas frente a las que contienen
informacin sobre la similitud de las muestras de un mismo grupo (Martnez,
1999; Rodriguez-Dodero, 2004). Adems permite crear una funcin capaz de
distinguir con gran precisin entre los miembros de uno u otro grupo,
aportando un criterio matemtico ms all de la proyeccin espacial (tpica del

92
Captulo II. Introduccin

PCA) para asignar grupos a las muestras (Figura 16). Para establecer las reglas
de asignacin de clase (o grupo), las funciones que actan como fronteras
entre grupos se construyen mediante combinacin lineal de las variables
independientes, de tal modo que el conjunto de pesos sea ptimo para una
mxima discriminacin entre los grupos.

En esta tcnica se conoce el valor de la variable dependiente para el conjunto


de muestras con las que se construye el modelo (reconocimiento supervisado
de modelos). Las variables independientes en LDA son de tipo cuantitativo,
mientras la variable dependiente es categrica, pudiendo contemplar 2 ms
grupos o clases.

El anlisis discriminante es en definitiva un proceso de maximizacin


matemtica, pues maximiza la variacin entre grupos, con respecto a la
variacin intragrupos. El estadstico de uso ms habitual es la lambda de
Wilks.

El modelo puede construirse usando todas las variables originales, o bien con
solo una seleccin de las mismas tras una serie de etapas secuenciales
(stepwise). Con esta estrategia, es posible construir una funcin usando
nicamente aquellas variables que realmente son tiles para la clasificacin, a la
par que se evala la contribucin individual de cada variable al modelo
discriminante (mayor para mayores F). La estrategia backward (hacia atrs)
toma inicialmente todas las variables y elimina de manera secuencial las que
menos discriminan, mientras la forward (hacia delante) las incluye paso a paso
desde un modelo con 0 variables, en orden decreciente de poder
discriminatorio. En este proceso, pueden eliminarse algunas variables en fases
posteriores, si la informacin que aportan es redundante con la de alguna
combinacin de las variables ya introducidas.

93
II.V. Quimiometra. Tratamiento estadstico de datos

Para facilitar la asignacin de una muestra desconocida a uno de los grupos, se


construyen adems N funciones de clasificacin (donde N es el n de clases o
grupos), que tras aplicarse a los valores de las variables de la muestra indican
su clasificacin en el grupo que alcance un mayor valor (funciones de Fischer).

Los principales resultados que genera el LDA se expresan en forma de tabla


resumen del proceso de estimacin del modelo, con las variables incluidas
junto al estadstico F que indica su poder discriminante; las funciones de
clasificacin, para la asignacin de grupo a una muestra desconocida que no ha
participado en la construccin del modelo y la matriz de clasificacin para la
evaluacin del ajuste global, que es una tabla de contingencia en la que se
presentan el nmero de casos clasificados correctamente en cada grupo (y sus
valores porcentuales).

El LDA es muy sensible a la razn n casos/n variables, que de manera


ptima se sita en 10-20. Como mnimo, el grupo menor deber tener al
menos 20 casos, y siempre ms que variables independientes.

El fin predictivo del LDA exige que la estructura original de los datos cumpla
unos requisitos:

Normalidad univariante y multivariante en el conjunto de las variables


predictoras, aunque es bastante robusto frente a ligeras desviaciones.
Homocedasticidad (igualdad de matrices de varianzas/covarianzas de
los diferentes grupos), si bien las desviaciones se minimizan con
tamaos de muestra elevados
Linealidad de las relaciones entre las variables predictoras y la
dependiente

94
Captulo II. Introduccin

Ausencia de multicolinealidad (redundancia) entre variables


independientes. En tal caso, debern aplicarse previamente tcnicas de
reduccin de variables (PCA, por ejemplo)
Ausencia de outliers.

II.V.2.4. ANLISIS DE CONGLOMERADOS

El anlisis de conglomerados (o clsters) es una tcnica descriptiva


multivariante que pretende agrupar un conjunto de muestras por afinidades
definidas en funcin de las variables estudiadas (variables observables),
examinado las relaciones o similitudes entre ellas, de forma que los elementos
de una misma agrupacin se asemejen entre s y discrepen de las restantes
(Mongay, 2005).

Los mtodos de anlisis de conglomerados se pueden clasificar en mtodos


jerrquicos y mtodos no jerrquicos. En los mtodos jerrquicos no se
especifica el nmero de conglomerados que se van a formar, y se verifican
funciones sucesivas (acumulativos) o divisiones (disgregativos) para definirlos,
presentando los resultados en forma de dendograma (diagrama de rbol). Sin
embargo, en los mtodos no jerrquicos o de particin se debe definir a priori
el nmero K de conglomerados en que se quiere subdividir el conjunto de
objetos, sin que se establezca estructura jerrquica alguna. A diferencia de los
mtodos jerrquicos, las tcnicas no jerrquicas pueden redistribuir un objeto
de un conglomerado a otro a lo largo del proceso.

En cualquier caso, para agrupar los elementos en estudio (casos o variables)


deber definirse el parmetro por el cual se proceder a la asociacin de los
elementos considerados similares, y el algoritmo en el que se basar el mtodo
que permita el enlace de los grupos afines que se vayan formando.

95
II.V. Quimiometra. Tratamiento estadstico de datos

La semejanza entre dos objetos A y B se establece por un coeficiente de


proximidad que indica la similaridad o disimilaridad entre los objetos. Con
datos cuantitativos usualmente se recurre a medidas de disimilaridad para
estudiar los casos y de similaridad para las variables.

Entre las medidas de asociacin en estudios de disimilaridad se encuentra la


distancia eucldea al cuadrado o distancia eucldea (suma de los cuadrados de
las diferencias entre los valores de los elementos o su raz cuadrada). Para
evaluar la similaridad, se emplea, entre otros mtodos, la correlacin se
Pearson (coeficiente de correlacin lineal entre dos variables).

Una vez seleccionada la medida de proximidad, el siguiente paso ser elegir el


algoritmo adecuado para la formacin de los conglomerados. Los mtodos de
enlace simple y completo calculan distancias entre elementos reales de los
conglomerados, mientras que las agrupaciones de centroides y de medianas
determinan distancias entre elementos virtuales definidos en los
conglomerados; entre ambos estn los promedios inter e intra-grupos que,
partiendo de medidas entre elementos reales, recalculan luego un valor
promedio para establecer las medidas de disimilaridad. Por ltimo, el mtodo
de Ward no computa distancias sino las varianzas de los elementos dentro de
los conglomerados.

96
Captulo III.

Materiales y Mtodos.
Captulo III. Materiales y Mtodos

CAPTULO III. MATERIALES Y MTODOS

III.I. MUESTRAS

Los vinos y mostos objeto de estudio fueron vinificados por el propio grupo
de Investigacin en el Centro Andaluz de Investigaciones Vitivincolas (CAIV)
a partir de dos variedades diferentes de uva, Moscatel y Pedro Ximnez
durante tres vendimias: 2008, 2009 y 2010. Las uvas Pedro Ximnez fueron
proporcionadas por una bodega de Jerez, mientras que la variedad Moscatel
proceda de una via situada en Chipiona (Figuras 17 y 18).

Figura 17. Variedad Moscatel. Via de Figura 18. Variedad


Chipiona. Pedro Ximnez

El pasificado de la uva se realiz por distintos procedimientos de secado:


asoleo tradicional y asoleo artificial en cmara climtica.

En el asoleo tradicional (Figura 19) los racimos se situaron sobre redores de


esparto al aire libre sin ningn tipo de proteccin frente a condiciones
ambientales (Tabla 12). ste tipo de secado tuvo lugar en dos ubicaciones

99
III.I. Muestras

diferentes, el propio centro de investigacin (CAIV) y,


en el caso de la variedad Pedro Ximnez de las
vendimias 2009 y 2010 se dispuso, adems, de uva ya
pasificada en la propia via.

Figura 19. Asoleo en


via

Precip.
Mes Temperatura (C) Humedad Relativa (%)
(mm)
Max Min Med Max Min Med
V. 2008 Ag. 0,0 38,0 12,3 24,6 85,6 7,8 52,9
Sept. 84,4 34,8 12,7 21,9 88,1 13,1 62,8
V. 2009 Ag. 0,0 37,5 14,2 26,2 84,6 11,7 49,0
Sept. 37,8 35,7 12,3 22,7 86,6 15,3 56,3
V. 2010 Ag. 0,0 41,1 16,8 27,7 96,6 12,7 55,8
Sept. 14,6 38,2 12,3 23,8 96,5 17,4 62,7

Tabla 12. Condiciones climticas en la zona de Jerez. Meses de septiembre y agosto de 2008, 2009
y 2010. Fuente: Estacin Agroclimtica de Jerez, (CAPDER, 2015b).

Para el secado artificial se emple una cmara climtica (Ibercex A.S.L., S.A.,
Espaa) a una temperatura de 40 C y humedad relativa de 10 %. Los racimos
fueron distribuidos uniformemente en bandejas formando una nica capa. En
todos los ensayos se parti de aproximadamente 2000 kg de uva fresca, salvo
en la variedad Pedro Ximnez de la vendimia 2008 donde el volumen de uva
fue menor, por lo que los ensayos se realizaron a pequea escala y el mosto
obtenido no fue posteriormente vinificado. La cmara climtica usada en este
caso fue una de reducidas dimensiones, modelo UV Xenon-Tester (CCI,
Espaa).

100
Captulo III. Materiales y Mtodos

Caractersticas de la cmara climtica IBERCEX (Figura 20):

Dimensiones interiores: Aprox. 3 m x 4 m x 2,10 m.


Homogeneidad de la Temperatura: 1 C en vaco (2 C a plena
carga).
Homogeneidad de la Humedad: 2 %HR en vaco (3 %HR a plena
carga).
Circulacin de aire de tiro forzado mediante motoventilador ubicado en
el fondo de la Cmara.
Sistema de calefaccin por resistencias
elctricas.
Sistema de Seguridad mediante
termostato independiente por
sobretemperatura con desconexin del
sistema de calefaccin.
Figura 20. Cmara climtica Ibercex

Caractersticas de la cmara climtica UV XENON-TESTER (CCI) (Figura


21):

Dimensiones interiores: Aprox. 50 cm x 40


cm x 40 cm.
Rangos de temperatura comprendidos entre 0
C y 150 C, y humedades relativas entre 10%
HR y saturacin.
Conveccin forzada en el interior de la
cmara para conseguir la mxima precisin.
Regulacin del flujo de conveccin
Figura 21. Cmara climtica
UV Xenon-tester (CCI).

101
III.I. Muestras

trmica de gravedad, mediante orificios de entrada y salida graduable


por compuerta.
Bandejas perforadas para un secado uniforme.

En todos los casos, la evolucin, en lnea general, del pasificado se control


peridicamente, midiendo el grado Baum y el promedio de prdida de peso
de los racimos situados en varias bandejas/redores de control distribuidas en
los diferentes sistemas de secado (Figura 22). Todos los ensayos se dieron por
finalizados cuando se alcanz una prdida de peso aproximada del 35 % y un
Baum mayor de 20 B.

Tras 8 das.

Figura 22. Pasificado en Cmara Climtica, Moscatel, 2008.

Una vez alcanzado el punto ptimo, las pasas fueron despalilladas, molturadas
y prensadas en una prensa vertical. Se realizaron tres ciclos, siendo la mxima
presin en cada uno de ellos de 300 bares. Por ltimo, el pH del mosto fue
ajustado a 3,5 con cido tartrico (Agrovin, Espaa), adicionando, asimismo,
metabisulfito potsico equivalente a una dosis de 120 mg/l de dixido de
azufre antes de proceder a su vinificacin.

Cuando la densidad de los vinos en fermentacin lleg a 1,060


aproximadamente y el contenido de azcar residual se situ alrededor de 100
g/l, se procedi a la parada de la fermentacin mediante adicin de alcohol
vnico hasta un grado alcohlico final de 17.

102
Captulo III. Materiales y Mtodos

Posteriormente, se abord la etapa de envejecimiento en madera (Figura 23),


cuyas condiciones concretas para cada vendimia y variedad se detallan ms
adelante.

Figura 23. Esquema de elaboracin.

III.I.1. VENDIMIA 2008

Los vinos de la vendimia 2008 se elaboraron a partir de uva Moscatel secada


en cmara climtica. El mosto obtenido fue sometido a cinco condiciones
diferentes de vinificacin (Tabla 13).

El ensayo 1 (E1), se realiz a temperatura ambiente (menos de 30 C)


empleando levadura Saccharomyces cerevisiae (40 g/hl, Lalvin D254, Lallemand,
Australia).

Las condiciones del ensayo 2 (E2) fueron las mismas que en el primero,
adicionando adems nutrientes de levadura (fosfato diamnico, 10 g/hl)
(Actimax Plus+, Agrovin, Espaa).

En el experimento 4 (E4), el mosto fue fermentado a baja temperatura (menos


de 10 C) empleando S. bayanus (40 g/hl, Uvaferm 43, Lallemand, Australia).

103
III.I. Muestras

En las experiencias 3 (E3) y 5 (E5), se estudi el empleo para la elaboracin de


los vinos dulces de maceracin prefermentativa en fro a 4 C usando 3 g/hl
de enzimas pectolticas (Enozym Arome, Agrovin, Espaa). Tras 24 horas, la
pasta de uva fue prensada usando una prensa vertical bajo las condiciones
mencionadas anteriormente (tres ciclos, con un mximo de presin de 300
bares en cada ciclo). Ambos ensayos fueron fermentados a temperatura
ambiente, empleando S. cerevisiae para el experimento 3 y S. bayanus para el exp.
5.

Los vinos dulces obtenidos en las cinco vinificaciones fueron envejecidos en


barricas de roble de tostado medio de 30 litros previamente envinadas as
como en depsitos de acero inoxidable de 10 litros durante, al menos, 12
meses. Adems, uno de ellos fue envejecido durante tres meses en contacto
con chips de madera de tostado medio (4 g/l, Roblemor T, Agrovin, Espaa).

Maceracin
Temperatura
Ensayo Levadura1 Nutrientes enzimas
fermentacin2
pectolticas

E1 S.c. T. A. No No
E2 S.c. T. A. S No
E3 S.c. T. A. No S
E4 S.b. T. B. No No
E5 S.b. T. A. No S
1 S.c.: S. cerevisiae; S.b.: S. bayanus
2T. A.: Temperatura Ambiente; T. B.: Temperatura baja

Tabla 13. Condiciones de vinificacin.

III.I.2. VENDIMIA 2009

Los vinos de 2009 se elaboraron a partir de uva Moscatel secada en cmara


climtica y uva de la variedad Pedro Ximnez pasificada tanto en cmara
climtica como en asoleo natural en la via (Tabla 14).

104
Captulo III. Materiales y Mtodos

Las condiciones de vinificacin seleccionadas fueron las mismas que para los
vinos de la experiencia 4 de la vendimia 2008 (S. bayanus a baja temperatura) ya
que los resultados obtenidos para los vinos de 2008 demostraron que estas
condiciones de vinificacin permitan obtener vinos con mejor perfil sensorial
y bajo contenido en Ocratoxina A y carbamato de etilo. Igualmente, el
envejecimiento se llev a cabo en botas de roble tostado medio de 30 litros
de capacidad durante, al menos, 12 meses.

III.I.3. VENDIMIA 2010

Se emplearon ambas variedades de uva, Moscatel y Pedro Ximnez, secadas


tanto en cmara climtica como por el sistema tradicional (Tabla 14). Las
fermentaciones se realizaron en las mismas condiciones que en la vendimia
2009, es decir, a baja temperatura con S. bayanus. El envejecimiento se efectu
en botas de iguales caractersticas que los vinos de la vendimia 2008 y 2009
durante un mnimo de 12 meses.

Variedad de Sistema de Vendimia


Uva secado 2009 2010
P.X C. V09.PX.C V10.PX.C
P.X. 1T. - V10.PX.1T
P.X. 2T. V09.PX.2T V10.PX.2T
M. C. V09.M.C. V10.M.C.
M. 1T. - V10.M.1T

Tabla 14. Vinos v. 2009 y 2010. (C.: cmara; 1T: asoleo tradicional en el CAIV; 2T: asoleo
tradicional en via).

105
III.II. Control de la seguridad alimentaria

III.II. CONTROL DE LA SEGURIDAD


ALIMENTARIA

III.II.1. CIDO GLUCNICO

III.II.1.1. REACTIVOS

Test enzimtico comercial (Boehringer Manheim, R-Biopharm, Alemania):


Solucin 1: Buffer de trietanolamina, pH aprox. 7,6; NADP, aprox.
60 mg; ATP, aprox. 150 mg; sulfato de magnesio diluidos en 27ml de
agua calidad Milli-Q.
Solucin 2: suspensin de 6-PGDH, aprox. 110 U.
Solucin 3: suspensin de gluconato kinasa, aprox. 13 U

III.II.1.2. METODOLOGA INSTRUMENTAL

El ensayo se realiz mediante test enzimtico comercial (Boehringer Manheim,


R-Biopharm, Alemania), en cubetas de 1cm de paso de luz, siguiendo las
indicaciones descritas a continuacin.

Aadir en las cubetas: Blanco Muestra


Solucin 1 0,500 ml 0,500 ml
Muestra - 0,050 ml
Agua Milli-Q 1,000 ml 0,950 ml
Solucin 2 0,010 ml 0,010 ml
Mezclar y leer la absorbancia (A1) a los 5 min. Comenzar la reaccin por adicin de:
Solucin 3 0,010 ml 0,010 ml
Mezclar y esperar a que se complete la reaccin (20 minutos). Medir la absorbancia (A2); si
la reaccin no ha concluido, continuar a intervalos de 2 min.
Tabla 15. Protocolo para la determinacin de cido glucnico. (Adaptacin de Boehringer
Manheim; R-Biopharm, Alemania).

106
Captulo III. Materiales y Mtodos

La absorbancia fue registrada a 340 nm en un espectrofotmetro, modelo


Helios Gamma (Unicam Instruments, UK) (Figura 24). Todas las muestras
se analizaron por duplicado, concluyendo la reaccin a los 20 minutos. El
nico tratamiento previo realizado, fue la filtracin de todos los mostos por
filtros de nylon de 0,45 m. (Millipore, USA).

Figura 24. Espectrofotmetro


"Helios Gamma & Delta"

III.II.1.3. TRATAMIENTO DE LOS DATOS

En primer lugar, se calcul la diferencia de absorbancia del blanco y cada una


de las muestras. A A2A1 muestra A2A1 blanco

Posteriormente, se determin la concentracin de cido glucnico de cada uno


de los ensayos realizados, segn la frmula:

(mg/l)

V=Volumen final (ml).


MW= Masa molecular del cido glucnico. (MW=196,1 mg/mmol)
=coeficiente de extincin de NADPH a 340 nm (= 6,3 l/(mmol x cm))
=paso de luz cm .
v=Volumen de muestra (ml).

107
III.II. Control de la seguridad alimentaria

III.II.2. OCRATOXINA A

III.II.2.1. REACTIVOS

cido clorhdrico, 37%. (Panreac, Espaa).


Amoniaco, 30%. (Panreac, Espaa).
Hidrogenocarbonato sdico. (Panreac, Espaa).
Polietilenglicol 8000. (Scharlab, Espaa).
Acetonitrilo (Grado Gradiente HPLC, Panreac, Espaa).
cido Actico. (Merck, Alemania).
Estndar de Ocratoxina A. (Sigma-Aldrich, Espaa).
cido tartrico. (Merck, Alemania), cido mlico (Sigma-Aldrich,
Espaa) y glucosa (Panreac, Espaa).
Metanol. (Grado gradiente HPLC, Scharlab, Espaa).

III.II.2.2. VERIFICACIN DE LA CONCENTRACIN DE OTA

A partir del estndar de Ocratoxina A, se prepar una disolucin de trabajo de


50 mg/l en metanol. Fue almacenada a -8C. La concentracin exacta de
dicha disolucin fue verificada regularmente y antes de cada curva de
calibracin siguiendo el procedimiento descrito en la norma, UNE-EN 14133,
(2004).

Para ello, 5 mililitros de la disolucin stock de OTA fue llevada hasta sequedad
bajo corriente de nitrgeno y redisueltos en el mismo volumen de la mezcla de
disolventes tolueno/cido actico glacial (99:1, v/v). A continuacin, se
registra el espectro de absorcin de la disolucin entre 300 y 370 nm en
cubetas de cuarzo de 1 cm de paso de luz. La concentracin, en miligramos
por litros, de OTA vendr dada por:

108
Captulo III. Materiales y Mtodos

A (mg/l)

Amax: Absorbancia determinada a la longitud de onda de mxima absorcin.


MW: masa molecular relativa de la OTA (MW = 403.8 g/mol).
:coeficiente de absorcin molar relativo de la OTA en tolueno/cido actico
glacial (99:1, v/v) ( = 5440 m2/mol).
: longitud de paso ptico de la cubeta de cuarzo ( = 1 cm).

III.II.2.3. METODOLOGA INSTRUMENTAL

Los mtodos elegidos para la determinacin de Ocratoxina A en mostos y


vinos fueron desarrollados dentro del grupo Investigacin Qumico Analtica
del Vino y Productos Agroalimentarios (PAI AGR122) (Hernndez et al.,
2006; Hernndez, 2009). Se fundamentan en una primera extraccin seguida
de separacin por cromatografa lquida (HPLC) y posterior deteccin de la
toxina por fluorescencia (Figura 25). La extraccin en mostos se realiz por
adicin de hidrogenocarbonato de sodio y polietilenglicol. Para los vinos, al ser
una matriz de mayor complejidad, se recurri a la extraccin en fase slida
(SPE) (Figura 26). Las condiciones cromatogrficas fijadas fueron las mismas
en ambos casos.

109
III.II. Control de la seguridad alimentaria

Figura 25. Equipo HPLC-FLD. Figura 26. Rapid Trace SPE Workstation

III.II.2.4. PREPARACIN DE LAS MUESTRAS

III.II.2.4.1. Mostos

Se tomaron 5 g de cada uno de los mostos a los que se les adicion 75 mg de


polietilenglicol 8000 y 250 mg de hidrogenocarbonato de sodio. La mezcla fue
sometida a agitacin durante 30 min y posteriormente centrifugada durante 5
min a 4000 rpm. El sobrenadante obtenido se pas por filtros de jeringa de
nylon de 0,45 m (Millipore, USA). Todos los anlisis se realizaron por
duplicado.

III.II.2.4.2. Vinos

En el caso de los vinos, se realiz una extraccin en fase slida (SPE)


siguiendo el mtodo propuesto por Hernndez et al., (2006).

Dicha extraccin fue llevada a cabo en varias etapas en un sistema Rapid


Trace, SPE Workstation (Zymark, Alemania) (Figura 26) empleando
Cartuchos Bond Elut C-18 de 500 mg/3 ml (Varian, USA). En primer lugar se
acondicion el cartucho con 5ml de MeOH y 5 ml de agua Milli-Q ambos a un

110
Captulo III. Materiales y Mtodos

flujo de 2 ml/min. Posteriormente se hizo pasar 10 ml de una dilucin 1:2 de


la muestra en agua Milli-Q a travs del cartucho a 0,5 ml/min. Se realiz
entonces un lavado del cartucho con 2 ml de agua Milli-Q y 2 ml de
metanol/agua (60:40, v/v), aplicando posteriormente un secado bajo corriente
de N2 durante 10 min. Por ltimo se recogi el extracto en 2 ml de metanol a
una velocidad de 0,5 ml/min.

III.II.2.5. HPLC- DETECTOR FLUORESCENCIA

El sistema HPLC empleado para el anlisis fue Waters Alliance 2695


(Waters, USA) (Figura 25), con una columna de fase inversa Gemini 5 m
C18 110A, de 250 mm 3,0 mm i.d. y 5 m de tamao de partcula
(Phenomenex, USA). La fase mvil alcalina estaba compuesta por
acetonitrilo/buffer de amoniaco-cloruro amnico (20 mM, pH 9,4) en una
proporcin 20:80 (v/v). Se emple flujo isocrtico a 30 C a una velocidad de
0,75 ml/min. El volumen de muestra fue de 25 l.

Para la medida de fluorescencia se emple un detector Waters 474 Scanning


Fluorescence Detector (Waters, USA). Las longitudes de onda de excitacin y
de emisin fueron 380 y 440 nanmetros, respectivamente.

El tiempo de adquisicin de datos para cada una de las muestras se fij en 15


min, el software empleado para el registro y procesamiento de los mismos fue
Empower Pro 2002 (Waters, USA).

Para la cuantificacin en mostos se elabor una recta de calibrado a partir de


ocho concentraciones diferentes de una disolucin estndar de OTA (entre 0,2
y 40,0 g/kg). Todas las diluciones se prepararon por duplicado, en matriz de
mosto sinttica (1 g/l de cido mlico, 6 g/l de cido tartrico y 200 g/l de

111
III.II. Control de la seguridad alimentaria

glucosa) y fueron tratadas de la misma manera que las muestras reales. Cada
una de ellas se analiz por duplicado. Por ltimo, se represent grficamente
las reas de pico de OTA obtenidas en los cromatogramas frente a sus
respectivas concentraciones.

Para las muestras de vinos, la recta de calibrado se realiz en metanol, a partir


de volmenes conocidos de una disolucin de trabajo de 50 g/l (entre 0,2 y
20,0 g/l). De todas las diluciones se prepararon dos rplicas que se analizaron
por duplicado.

112
Captulo III. Materiales y Mtodos

III.II.3. CIDOS ORGNICOS

III.II.3.1. REACTIVOS Y SUSTANCIAS PATRONES

Los reactivos y sustancias patrones empleados para ste anlisis se describen a


continuacin:

cido trifluoroactico, TFA. (Scharlab, Espaa)


cido etilendiamino tetractico, EDTA. (Scharlab, Espaa)
Bis-[2-hidroxietil]-imino-tris-[hidroximetil]-metano.(Merck, Alemania).
cidos ctrico, lctico y frmico (Fluka, Suiza); cidos mlico y
succnico (Sigma-Aldrich, Espaa); cidos actico y tartrico (Merck,
Alemania).

III.II.3.2. METODOLOGA INSTRUMENTAL

Para la determinacin de cidos orgnicos mediante cromatografa de


exclusin inica (IEC) con deteccin conductimtrica se sigui el mtodo
descrito por Guilln et al., (1998).

III.II.3.3. CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN INICA (IEC) CON


DETECCIN CONDUCTIMTRICA

El equipo estaba compuesto por dos bombas modelo 2150 y un horno modelo
2155 donde se situaba la columna, todos de LKB (Pharmacia, Suecia), un
detector de conductividad Conductomonitor modelo III de Milton Roy
(PMA, USA) y un inyector automtico modelo 717 de Waters (Milford, USA)
(Figura 27).

113
III.II. Control de la seguridad alimentaria

Figura 27. Equipo para la determinacin de cidos.

La separacin cromatogrfica se llev a cabo con una columna modelo Rezex


ROA-Organic Acid H+ 8%, 300 x 7,8 mm, (Phenomenex, Alemania). La
temperatura del horno se fij en 60C. La fase mvil empleada fue una
disolucin de 2,5 mM de cido trifluoroacetico (TFA) a un flujo de 0,4
ml/min. Para aumentar la sensibilidad de la deteccin, una disolucin
compuesta de 2,5 mM de TFA, 20 mM de buffer Bis-tris y 100 mM de EDTA
fue aadida a la salida de la columna, por medio de una segunda bomba, con
un caudal de 0,4 ml/min. El volumen de muestra inyectado fue de 40 l. El
tiempo de adquisicin de datos se estableci en 40 minutos. El software
empleado para el registro y procesamiento de los mismos fue Empower pro
2002 (Waters, USA).

Antes de cada anlisis los mostos y vinos fueron filtrados a travs de filtros de
jeringa de nylon de 0,45 m de dimetro de poro (Millipore, USA).

La cuantificacin se realiz mediante calibracin externa. Para la elaboracin


de las rectas de calibrado, se prepar una disolucin concentrada de los cidos
objeto de estudio. A partir de sta, se prepararon por dilucin otras de menor

114
Captulo III. Materiales y Mtodos

concentracin. El rango de concentraciones para cada uno de los cidos


estudiados, quedan recogidos en la Tabla 16. Antes de su anlisis, las diferentes
diluciones fueron filtradas a travs de filtros de jeringa de nylon de 0,45 m de
dimetro de poro (Millipore, USA). Se realizaron dos rplicas de cada una de
las diluciones. Para los cidos succnico, lctico, frmico y actico se
representaron las reas de pico frente a la concentracin de los patrones,
mientras que para los cidos ctrico, tartrico y mlico, se emple la altura de
pico. Todos los anlisis se realizaron por duplicado.

Analito Rango (mg/l)


cido Ctrico 45- 1500
cido Tartrico 180 - 6000
cido Mlico 120 - 4000
cido Succnico 45 1500
cido Lctico 45 1500
cido Frmico 15 500
cido Actico 90 - 3000

Tabla 16. Rango de concentraciones de los cidos empleados.

115
III.II. Control de la seguridad alimentaria

III.II.4. CARBAMATO DE ETILO

III.II.4.1. REACTIVOS

cido clorhdrico (37%). (Panreac, Espaa).


Etanol absoluto. (Panreac, Espaa).
Metanol (grado HPLC gradient, Fisher, UK).
1-Propanol (calidad analtica, Merck, Alemania).
Carbamato de etilo. (TCI Europe nv, Blgica).
9-xantidrol (calidad analtica y pureza mnima del 98%, Aldrich,
Espaa).

III.II.4.2. METODOLOGA INSTRUMENTAL

El mtodo elegido para la determinacin de carbamato de etilo en vinos fue el


descrito por Rodrguez-Madrera y Surez-Valles, (2009) para destilados de
sidra. Est basado en una derivatizacin inicial seguido de una separacin por
cromatografa lquida con deteccin por fluorescencia.

III.II.4.3. DERIVATIZACIN DE LAS MUESTRAS

Dado que el contenido alcohlico de las muestras influa en el anlisis, fue


necesario una etapa previa de optimizacin. Tras adaptar la metodologa a los
vinos dulces objeto de estudio en esta tesis, se prepar una disolucin de 0,02
M de 9-xantidrol en 1-propanol y otra de 1,5 M HCl en etanol. Las muestras
de vino fueron diluidas en etanol en una proporcin 83:17 (v/v, muestra:
etanol) y filtrados por 0,45 m con filtros de jeringa de nylon (Millipore, USA).
En un vial de cromatografa, se adicionaron 1 ml de muestra diluida, 0,2 ml de
xantidrol 0,02 M y 0,1 ml de HCl 1,5 M. La inyeccin en el equipo

116
Captulo III. Materiales y Mtodos

cromatogrfico se realiz transcurridos 30 minutos desde la agitacin del


medio de reaccin con objeto de asegurar la completa formacin del complejo
xantil-CE y la estabilidad de las medidas.

III.II.4.4. ANLISIS MEDIANTE HPLC-FLD

El Sistema HPLC empleado para el anlisis fue "Waters Alliance 2695"


(Waters, USA), con una columna de fase reversa 110A C18 Gemini
(Phenomenex, Alemania) de 250 mm largo x 3,0 mm d.i., con tamao de
partcula de 5 m junto a una precolumna Gemini C18 4 x 2,0 mm. La
temperatura en columna se fij en 35 C, empleando un sistema binario de
fases compuesto por: (A) agua Milli-Q (Millipore, USA) y (B) metanol a un
flujo de 0,4 ml/min. El gradiente de 37 minutos fue el siguiente: 0 min, 39%
A; 25 min, 39% A; 26 min, 0% A. Posteriormente, se proceda a un lavado de
columna con 100% B durante 10 minutos a un flujo de 0,8 ml/min y 2
minutos de equilibrado con 39% A para acondicionar el sistema antes del
siguiente anlisis. El volumen de inyeccin fue fijado en 60 l.

Para la deteccin de fluorescencia se emple un detector Waters 2475


Scanning Fluorescence Detector (Waters, USA). Las longitudes de onda de
emisin y excitacin fueron 233 y 600 nm, respectivamente. La adquisicin y
procesamiento de los datos se realiz mediante el software Empower Pro 2002
(Waters, USA). La cuantificacin se realiz mediante una recta de calibrado
con seis concentraciones diferentes de una disolucin estndar de carbamato
de etilo (de 10,0 a 350,0 g/l). Todas las disoluciones fueron preparadas por
duplicado, en una matriz hidroalcohlica al 17 % y fueron tratadas de igual
forma que las muestras reales.

117
III.III. Calidad organolptica

III.III. CALIDAD ORGANOLPTICA

III.III.1. COMPOSICIN POLIFENLICA Y ACTIVIDAD


ANTIOXIDANTE

III.III.1.1 CUANTIFICACIN DE POLIFENOLES Y FURFURALES


INDIVIDUALES MEDIANTE UPLC-PDA

III.III.1.1.1. Reactivos

Acetonitrilo (Grado HPLC gradiente, Panreac, Espaa).


cido Actico. (Merck, Alemania).
Patrones de compuestos polifenlicos. (Merck, Alemania) y (Sigma,
Alemania).

III.III.1.1.2. Metodologa instrumental

El anlisis de los compuestos polifenlicos se realiz siguiendo el mtodo


propuesto por Schwarz et al., (2009) mediante un equipo Waters Acquity
UPLCTM (Waters, USA) acoplado a un detector de matriz de fotodiodos
(PDA) (Figura 28).

III.III.1.1.3. Anlisis mediante UPLC-PDA

Para la separacin cromatogrfica se emple una columna Acquity UPLC


BEH C18 (100 x 2,1 mm D.I., con 1,7 m de tamao de partcula)
suministrada tambin por Waters, USA. La temperatura de la columna se fij
en 47 C. El volumen de inyeccin fue de 2,5 l.

118
Captulo III. Materiales y Mtodos

El sistema binario de disolventes fue el siguiente: Fase A (95% de agua Milli-


Q, 3% de acetonitrilo, 2% de cido actico); Fase B: (85% de acetonitrilo, 13%
de agua Milli-Q, 2% de cido actico) a un flujo de 0,7 ml/min.

El gradiente empleado de 6,5 min fue el siguiente: 0 min. 100% A, 3 min. 90%
A (curva 6), 4 min. 90% A, 6,5 min. 25% A (curva 6). Finalmente la columna
se lav con 100% de B durante 3 minutos y se equilibr con 100% de A
durante otros 3 minutos.

Previo a la inyeccin, todas las muestras fueron filtradas por filtros de nylon
de 0,22 m (Scharlab, Espaa). La identificacin de los compuestos fue
realizada por comparacin de sus espectros UV-Visible y tiempos de retencin
con los correspondientes a las disoluciones estndar de patrones.

Figura 28. Equipo UPLC-PDA

Para la cuantificacin se elaboraron diferentes rectas de calibrado para cada


uno de los compuestos de inters (Tabla 17). Mientras que para los cidos
fenlicos (cido glico, cido protocatquico), los compuestos furnicos (5-
hidroximetilfurfural, 2-furfuraldehdo, 5-metilfurfural) y tirosol, la longitud de
onda para su cuantificacin fue fijada en 280 nm, en el caso de los cidos
hidroxicinmicos (cido cafeico, cido p-cumrico) as como los aldehdos

119
III.III. Calidad organolptica

fenlicos, vainillina y siringaldehdo, se seleccion una longitud de onda de


320 nm. Galato de etilo, caftrico, cafeato de etilo, cido p-cutrico y cumarato
de etilo, fueron cuantificados empleando las rectas de calibrado de sus
correspondientes cidos benzoicos o hidroxicinmicos (cido glico, cido
cafeico o cido p-cumrico).

En el caso de los compuestos no identificados, las concentraciones relativas se


calcularon en base al cido glico, si su absorbancia mxima se encontraba a
una longitud de onda prxima a 280 nm, o al cido cafeico, si sta se situaba
cercana a 320 nm.

Concentracin
Compuestos polifenlicos (nm)
(ppm )
cido glico 280 0,20-20,0
5-Hidroximetilfurfural 280 0,12-120
cido Protocatquico 280 0,10-4,00
2-Furfuraldehdo 280 0,15-15,0
Tirosol 280 0,95-38,0
5-Metilfurfural 280 0,10-2,00
cido cafeico 320 0,12-1,00
Vainillina 320 0,20-20,0
cido p-cumrico 320 0,03-3,00
Siringaldehdo 320 0,20-20,0

Tabla 17. Rango de concentraciones de los compuestos polifenlicos y furfurales.

III.III.1.2. IDENTIFICACIN DE COMPUESTOS POLIFENLICOS


POR HPLC-DAD-MS/MS

Con objeto de ampliar el estudio del contenido polifenlico en vinos dulces


andaluces, y fruto de una estancia de investigacin realizada en la Facultad de
Farmacia, Universidad de Lisboa (Portugal) a cargo de la Profa. Dra. Mara
Rosrio Bronze, se llev tambin a cabo la identificacin de polifenoles por
HPLC-DAD-MS/MS. Los anlisis fueron realizados en el Laboratorio de

120
Captulo III. Materiales y Mtodos

Cromatografa Lquida y Espectrometra de masas de dicha Facultad


emplendose un equipo HPLC (Alliance Waters 2695)-DAD (Waters 996),
(Waters, USA) acoplado a un espectrmetro de masas de triple cuadrupolo
Micromass Quattro micro API Mass Spectrometer (Waters, USA) con
ionizacin por electrospray negativa (Figura 29). El sistema binario de
disolventes fue: Fase A (0,5% cido frmico); Fase B: (100% Acetonitrilo). El
gradiente de elucin se describe en la Tabla 18. Los vinos fueron filtrados a
travs de filtros de jeringa de 0,45 m de dimetro de poro.

Tiempo (minutos) %A (0,5% . Frmico) %B (100% ACN)


0,0 97,0 3,0
5,0 89,0 11,0
13,0 81,0 19,0
25,0 81,0 19,0
50,0 33,5 66,5
51,0 97,0 3,0
60,0 97,0 3,0
Tabla 18. Gradiente empleado para HPLC-DAD

Para la determinacin por MS las condiciones establecidas fueron:


Polaridad: ESI -
Capilar: 3.00 kV ; Cono: 20.00 V
Energa de colisin: 20 eV
Temperatura de la fuente: 120C
Temperatura de desolvatacin: 350C

El anlisis de las muestras se realiz en modo MRM (monitorizacin de


mltiples reacciones) que permite la monitorizacin de una serie de
transiciones MS/MS (fragmentaciones) con una elevada sensibilidad. La
identificacin de los compuestos polifenlicos se realiz por comparacin de
sus masas y patrones de fragmentacin junto a sus espectros de absorcin UV-
Visible y tiempos de retencin con los correspondientes a las disoluciones

121
III.III. Calidad organolptica

estndar de patrones. En el caso de no disponer de los compuestos de


referencia, dichos parmetros fueron comparados con los aportados en la
bibliografa (Monagas et al., 2005; Bravo et al., 2006).

Figura 29. Equipo HPLC-DAD-MS/MS

III.III.1.3. DETERMINACIN DEL CONTENIDO POLIFENLICO


GLOBAL

III.III.1.3.1. Determinacin de reas cromatogrficas totales mediante


HPLC-DAD-ED

El contenido polifenlico de algunas de las muestras consideradas en esta tesis


fue tambin analizado mediante HPLC-DAD (Thermo Finnigan-Surveyor,
USA) acoplado a un detector electroqumico con un electrodo de carbono
vitrificado (ED40, Dionex, USA) (Feliciano et al., 2008) con ocasin de la
estancia llevada a cabo en la Facultad de Farmacia de la Universidad de Lisboa
(Portugal), antes mencionada.

Para la separacin cromatogrfica se emple una columna LiChrospher C18 (5


m, 250 4 mm i.d., Merck, Alemania) a un flujo de 0,3 ml/min. La
temperatura de la columna se fij en 35C. El volumen de inyeccin fue de 20
l. Se emplearon las mismas condiciones cromatogrficas que en el anlisis por
HPLC-DAD-MS/MS, a excepcin del empleo de cido fosfrico 0,1% en

122
Captulo III. Materiales y Mtodos

lugar de cido frmico al 0,5% en el disolvente A. Las muestras se filtraron


por filtros de jeringa de 0,45 m. Todos los anlisis se realizaron por
duplicado.

III.III.1.3.2. ndice de Polifenoles Totales

El ndice de Polifenoles Totales (IPT) fue determinado mediante una


modificacin del mtodo de Folin-Ciocalteu (Singleton y Rossi, 1965)
previamente descrito por Serra et al., (2008). La posible influencia del elevado
contenido en azcares de las muestras fue evaluada en un rango
concentraciones entre 100-200 g/l de glucosa, fructosa y mezcla de ambas en
proporcin 1:1, no detectndose interferencia en ninguno de los casos.

En primer lugar, se realiz una recta de calibrado de cido glico con


concentraciones entre 1 y 6 mg/l en agua desionizada. Las muestras se
diluyeron en agua en un factor 1:100 1:200.

Como se indica en la Tabla 19, a 3,5 ml de patrn o muestra diluida se aadi


0,1 ml de reactivo de Folin. Tras 3 minutos en reposo, se adicion 0,4 ml
carbonato de sodio al 20 %. Al cabo de una hora, se registr la absorbancia a
725 nm. Todos los anlisis se realizaron por triplicado.

Reactivos Volumen

Patrn/ Muestra diluida en agua (1:100 1:200) 3,500 ml


Reactivo de Folin 0,100 ml
Mezclar y esperar 3 min en reposo.
Carbonato de sodio 20% (p/v) 0,400 ml
Mezclar y esperar 1 hora a temperatura ambiente.
Medir la absorbancia a 725nm.

Tabla 19. Protocolo para la determinacin del ndice de polifenoles totales.

123
III.III. Calidad organolptica

La absorbancia fue registrada en un espectrofotmetro modelo DU-70


(Beckman Instruments, Inc., USA).

III.III.1.3.3. ndice de Flavonoides Totales

El ndice de Flavonoides Totales se determin siguiendo el mtodo de


(Zhishen et al., 1999), (Tabla 20). Para ello, 0,2 ml de muestra o patrn de
calibracin fue mezclado con 0,8 ml de agua desionizada y 60 l de nitrato
sdico al 5%. Tras 5 minutos a temperatura ambiente, se adicion 60 l de
cloruro de aluminio 10%, y tras 6 minutos, 400 l de hidrxido sdico 1M y
agua desionizada hasta ajustar el volumen total a 2 ml. La absorbancia fue
medida a 510 nm.

Reactivos Volumen
Patrn/ Muestra 0,200 ml
Agua Desionizada 0,800 ml
Nitrato de Sodio 5% 0,060 ml
Mezclar y esperar 5min a temperatura ambiente.
Cloruro de aluminio 10% 0,060 ml
Mezclar y esperar 6 min a temperatura ambiente.
Hidrxido sdico 1M 0,400 ml
Agua Desionizada 0,480 ml
Mezclar y medir la absorbancia a 510 nm.

Tabla 20. Protocolo para la determinacin del ndice de flavonoides totales.

Para la recta de calibrado se emple una disolucin estndar de catequina


(1000 mg/l) en metanol a partir de la cual se prepararon puntos de calibracin
entre 20 y 100 ppm por dilucin en agua. La absorbancia fue registrada en un
espectrofotmetro modelo DU-70 (Beckman Instruments, Inc., USA). Todos
los anlisis se realizaron por triplicado.

124
Captulo III. Materiales y Mtodos

Al igual que ocurra con el ndice de polifenoles totales, la concentracin de


azcares de las muestras no interfiri en el anlisis (datos no mostrados).

III.III.1.4. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

A fin de conocer en su conjunto la actividad antioxidante de los constituyentes


de un alimento, es necesario en muchos casos, ms de un ensayo para cubrir
los mltiples factores que pueden contribuir (Ou et al., 2002b; Zulueta et al.,
2009; Serra et al., 2010). Srvase como ejemplo, dos ensayos fluoromtricos,
HORAC (Capacidad de absorcin de radicales hidroxilo) y ORAC (Capacidad
de absorcin de radicales de oxgeno). Ambos estn basados en la capacidad
de inhibicin o retraso de la oxidacin de una molcula fluorescente de
referencia, habitualmente fluorescena, en presencia de un generador de
radicales. Sin embargo, evalan la actividad antioxidante debida a dos
mecanismos de accin diferentes; mientras que el ensayo HORAC refleja
principalmente la capacidad de prevencin de radicales quelantes de metales, el
mtodo ORAC se basa en la capacidad de absorcin de radicales peroxilo,
pudiendo no existir, por tanto, una correlacin entre los valores HORAC y
ORAC (Ou et al., 2001; Ou et al., 2002a).

Para la determinacin de la actividad antioxidante (AA), se emplearon estos


dos ensayos; ORAC (Capacidad de absorcin de los radicales de oxgeno) y
HORAC (Capacidad de absorcin de los radicales hidroxilo).

III.III.1.4.1. Ensayos ORAC

Los anlisis se llevaron a cabo siguiendo una variante del mtodo de Huang et
al., (2002) adaptado para un lector de microplacas de fluorescencia FLx800,
(Feliciano et al., 2008) (Figura 30). Estos ensayos miden la capacidad de las

125
III.III. Calidad organolptica

especies antioxidantes de la muestra para inhibir la oxidacin de fluorescena


disdica (FL) catalizada por los radicales peroxilo generados por
dihidrocloruro de 2,2-azobis (2-amidinopropano) (AAPH).

La composicin de la mezcla de reaccin fue 1,5107 mmol/l FL, 1,9101


mol/l AAPH en tampn fosfato salino 75 mM (pH=7,4) y muestra diluida en
un factor 1:250, 1:500, o 1:1000 con agua en un volumen final total de 200 l.
Estas mezclas se situaron en una microplaca de 96 pocillos a 37 C, y la
reaccin fue iniciada por adicin de AAPH. La fluorescencia emitida por la
forma reducida del FL se midi en un lector de fluorescencia de microplacas
FLx800 (Bioteck Instruments, USA) registrndose cada minuto a una longitud
de onda de excitacin y emisin de 485 20 nm y 530 25 nm
respectivamente durante 30 minutos. Se emplearon tampn fosfato como
blanco, y disoluciones de 10 a 50 mmol/l de Trolox como estndares de
calibracin. Todas las muestras, incluyendo el blanco y los patrones, se
analizaron por triplicado. Los valores ORAC finales se calcularon mediante
una ecuacin de regresin entre la concentracin de Trolox y el rea total bajo
la curva de decaimiento de FL y se expresaron como capacidad antioxidante
equivalente al Trolox (TEAC mol/l).

Figura 30. Lector de fluorescencia de microplacas FLx800.

126
Captulo III. Materiales y Mtodos

III.III.1.4.2. Ensayos HORAC

El mtodo HORAC (Ou et al., 2002a) evala la capacidad de prevencin de


radical hidroxilo de una muestra usando fluorescena (FL) como referencia.
De manera similar al ensayo ORAC, se emple la curva de decaimiento de la
fluorescencia de FL para cuantificar el valor HORAC empleando un lector de
fluorescencia de microplacas FLx800 (Bio-Tek Instruments, USA) siguiendo el
procedimiento descrito por Serra et al., (2010).

Brevemente, a 10 L de muestras diluidas fueron adicionados 180 L de FL (4


10-3 M) y 5L de CoF2 (1,57 mg/ml). La reaccin se inici mediante
adicin de 5 l H2O2 (1,1 M) a la mezcla en una microplaca de 96 pocillos a 37
C. La fluorescencia emitida por la forma reducida del FL se midi y registr
cada minuto durante 35 minutos. El lector de fluorescencia de microplacas
FL800 se utiliz con filtros de fluorescencia para una longitud de onda de
excitacin de 485 20 nm y una longitud de onda de emisin de 530 25
nm. El cido cafeico fue elegido como estndar, expresndose los resultados
como micromoles equivalentes de cido cafeico por litro (CAE). Todas las
muestras se analizaron por triplicado.

127
III.III. Calidad organolptica

III.III.2. COMPUESTOS VOLTILES

III.III.2.1. REACTIVOS

4-metil-2-pentanol (patrn interno) y otros patrones de compuestos


voltiles (Merck, Alemania) y (Sigma, Alemania).

III.III.2.2. METODOLOGA INSTRUMENTAL

Los compuestos voltiles fueron analizados por SBSE-GC-MS siguiendo el


mtodo propuesto por Alves et al., (2005).

III.III.2.3. PREPARACIN DE LAS MUESTRAS

En matraces erlenmeyer de 50 ml se adicionaron cinco mililitros de agua Milli-


Q junto a 5 ml de muestra de vino y 30 l de una disolucin de 4-metil-2-
pentanol (2,52 g/l en agua Milli-Q con 15% v/v de etanol) junto a una barra
agitadora con recubrimiento de PDMS de 20 mm de largo y 0,5 mm de
espesor suministrada por Gerstel (GmbH, Mlheim a/d Ruhr, Alemania).
Tras agitacin durante 1 hora a 800 rpm a una temperatura de 20C, las barras
agitadoras fueron transferidas a un tubo de cristal especfico para la desorcin
trmica.

Dada la naturaleza de las muestras, se evalu la posible interferencia del


elevado contenido en azcar en la eficiencia de la extraccin. Para ello, se
analiz por triplicado una misma disolucin modelo de vino blanco con
diferentes concentraciones de azcar (0-250 g/l de glucosa) no observndose
interferencia alguna (datos no mostrados).

128
Captulo III. Materiales y Mtodos

III.III.2.4. ANLISIS GC-MS

La termodesorcin fue realizada en una unidad de desorcin trmica TDS-2


(Gerstel, Suiza) conectada a un inyector de vaporizacin por temperatura
programada (PTV) CIS-4 (Gerstel, Suiza) por medio de una lnea de
transferencia de calor. El PTV fue instalado en un sistema Agilent 6890 GC-
5973 MS (Agilent Technologies, USA) usando un liner vaco en el inyector del
PTV. La unidad de termodesorcin dispona, adems, de un automuestreador
MPS 2L (Gerstel, Suiza) con capacidad para 98 muestras (Figura 31).

La temperatura de desorcin fue programada desde 40 C hasta 300 C


(permaneciendo a esta temperatura durante 10 minutos) a una velocidad de 60
C/min bajo flujo de helio (75 ml/min) y los analitos desorbidos fueron
crioconcentrados en el sistema PTV con nitrgeno lquido a -140 C.
Finalmente el sistema PTV se program desde -140 C hasta 300 C
(mantenindose durante 5 minutos) a una velocidad de 10 C/s para el anlisis
por GC-MS. Dicho anlisis se realiz en modo impacto electrnico
empleando una columna capilar DB-Wax (J&W Scientific, USA) de 60 m de
longitud x 0,25 mm de dimetro interno, con un recubrimiento de 0,25 m. El
gas portador fue helio a un flujo de 1 ml/min.

Para el horno de GC, el programa de temperaturas establecido fue: 10 minutos


a 35 C, posteriormente una rampa de temperatura a 5 C/min hasta 100 C y
por ltimo un aumento de 3 C/min hasta llegar a 210 C, temperatura que se
mantena durante 40 minutos. El detector de masas oper en modo EI+ a 70
eV con un rango de 30-400 uma. La identificacin de los picos se realiz por
comparacin del espectro de masas del compuesto con la librera Wiley (Wiley
Registry of Mass Spectral Data, 7th Edition, 2000) con un mnimo de 90% de
correspondencia y en conformidad a los tiempos de retencin de los patrones

129
III.III. Calidad organolptica

siempre que fue posible. Adems, para garantizar la correcta identificacin de


los compuestos, los ndices de retencin fueron determinados
experimentalmente en una columna DB-Wax y comparados con aquellos
hallados en la bibliografa. Los datos semicuantitativos de los compuestos
identificados se obtuvieron midiendo el rea de pico del ion molecular
seleccionado para la cuantificacin de cada compuesto, en relacin al rea de
pico del 4-metil-2-pentanol, usado como patrn interno.

Figura 31. SBSE-GC-MS

130
Captulo III. Materiales y Mtodos

III.III.3. ANLISIS SENSORIAL

Las sesiones se llevaron a cabo en una sala de cata normalizada (UNE-EN


ISO 8589), donde se minimiza la influencia de estmulos externos en los juicios
emitidos. La temperatura de la sala se fij en 22 C. Se presentaron 15 ml de
muestra en catadora de aceite de vidrio azul, para as evitar la influencia del
color en el juicio, y tapa para minimizar la prdida de aromas (Figura 32). Las
evaluaciones se hicieron exclusivamente por va ortonasal.

Los descriptores evaluados fueron los siguientes: intensidad aromtica,


afrutado (pera, pltano, manzana), ctrico, frutas maduras, dulce, pasa, floral,
miel, herbceo, madera verde, vinoso, lcteo, qumico, humedad, sucio e
impresin general. stos fueron establecidos en base a un estudio previo de
seleccin de descriptores para este tipo de vinos llevados a cabo al inicio.

Los jueces, pertenecientes todos al personal de laboratorio, tuvieron un


periodo de entrenamiento en aspectos generales y especficos, durante el cual
se evalu la repetibilidad de sus juicios y la homogeneidad del panel.
Adicionalmente, los duplicados de las pruebas discriminativas y descriptivas
del estudio se utilizaron para validar la reproducibilidad de los jueces, mientras
que para cada descriptor, los ANOVAs de dos factores (Jueces x Muestras
Jueces x Semanas) permitieron estudiar la homogeneidad del panel y la
estabilidad de los juicios.

Se realizaron diversos tipos de pruebas (por duplicado).

1. Triangulares (UNE-EN ISO 4120). En ella se presenta tres muestras de las


cuales dos son iguales, y se pide a los jueces que identifiquen la muestra que
es diferente (Figura 32). Se ampli el esquema bsico de la prueba,

131
III.III. Calidad organolptica

interrogando a los jueces sobre el valor cuantitativo aproximado de esa


diferencia (escalas de 5 puntos: ninguna, dbil, media, fuerte, muy fuerte), y
opcionalmente sobre la naturaleza de la caracterstica que marca la
diferencia. Esta variacin no afect a la manera de tratar los datos. El
tratamiento de datos es sencillo, mediante tablas de significancia para un
nivel de certidumbre del 95% y el nmero de juicios que se obtuvo en cada
comparacin. En la ficha de cata 1 (Figura 33) se muestra el cuestionario
utilizado.
2. Descriptivas. Se utilizaron escalas de intervalo (UNE-ISO 4121) de 9
puntos. Los datos generados fueron analizados mediante tcnicas
quimiomtricas univariantes y multivariantes. Se utiliz el cuestionario 2
(Figura 34), que recoge los descriptores finalmente seleccionados para el
estudio.
3. De ordenamiento (UNE 87023), para la evaluacin de las preferencias entre
distintos vinos. Tras presentar a los jueces la serie de vinos, se les pidi que
los evaluaran de izquierda a derecha, y que posteriormente los ordenaran de
menor a mayor preferencia (Figura 35). Para la interpretacin de los
resultados obtenidos se aplic la prueba de Friedman (UNE-EN ISO
8587).

Figura 32. Anlisis Sensorial. Pruebas triangulares.

132
Captulo III. Materiales y Mtodos

Figura 33. Ficha de cata 1. Pruebas triangulares.

Cuestionario para la discriminacin de diferencias entre MOSTOS y VINOS DULCES


mediante pruebas triangulares

Tendr disponibles una serie de tringulos de muestras. Para cada uno, proceda de la siguiente forma:
1. Anote los cdigos de las muestras en la columna Cdigos del tringulo
2. Huela las 3 muestras que se le presentan una vez, o una sola vez ms si es que lo necesita.
3. Indique, rodeando el cdigo con un crculo, cul de ellas es diferente.
4. Especifique el grado de diferencia que encuentra, marcando con una X en la casilla
correspondiente.
5. Describa, si lo desea, en qu consiste la diferencia detectada.
6. Descanse un minuto antes de continuar con el siguiente tringulo.

N de la cabina:
Grado de diferencia
Cdigos del Ausencia Dbil Media Fuerte Muy fuerte
tringulo

Descripcin de la diferencia

Descripcin de la diferencia

Descripcin de la diferencia

Descripcin de la diferencia

Descripcin de la diferencia

MUCHAS GRACIAS

133
III.III. Calidad organolptica

Figura 34. Ficha de cata 2. Pruebas descriptivas.

Cuestionario de evaluacin de MOSTOS Y VINOS DULCES


mediante prueba DESCRIPTIVA

Tendr disponibles una serie de muestras. Para cada una, proceda de la siguiente forma:
1. Destape la copa y huela en su interior.
2. Mueva ligeramente la copa y huela de nuevo.
3. Para cada atributo, seale la marca vertical de la escala de 9 puntos que a su juicio corresponde
con la intensidad del estmulo.
4. Finalmente, punte su impresin general de la muestra en la escala hednica.
5. Descanse un minuto antes de continuar con la siguiente muestra

N DE LA CABINA: CDIGO DE LA
MUESTRA:

Atributos Ausente Dbil Medio Pronunciado Muy pronunciado

Intensidad aromtica | ; | ; | ; | ; |

Afrutado (uva, | ; | ; | ; | ; |
manzana, pera, pltano)

Ctricos | ; | ; | ; | ; |

Frutas maduras | ; | ; | ; | ; |
(pltano, macedonia)

Dulce | ; | ; | ; | ; |

Pasa (uva, ciruela) | ; | ; | ; | ; |

Floral (acacia, | ; | ; | ; | ; |
jazmn, rosa, violeta)

Miel | ; | ; | ; | ; |

Herbceo | ; | ; | ; | ; |

Madera verde, aserradero | ; | ; | ; | ; |

Vinoso | ; | ; | ; | ; |

Lcteo (leche,mantequilla) | ; | ; | ; | ; |

Qumico | ; | ; | ; | ; |
(disolvente, medicinal)

Humedad, hongo, terroso | ; | ; | ; | ; |

Otros (especificar):

. | ; | ; | ; | ; |

. | ; | ; | ; | ; |

Malo Mediocre Aceptable Bueno Muy Bueno


Impresin general | ; | ; | ; | ; |

OBSERVACIONES (Opcional)

MUCHAS GRACIAS

134
Captulo III. Materiales y Mtodos

Figura 35. Ficha de cata 3. Pruebas de ordenamiento.

Producto: MOSTOS /VINOS DULCES

Cuestionario para la evaluacin de la PREFERENCIA entre VINOS DULCES


mediante prueba de ordenamiento

1. Observe, huela y pruebe las N muestras que se le presentan, en el orden de izquierda a derecha.

2. Coloque en la tabla inferior los cdigos de las muestras, por orden creciente de preferencia.

Preferencia Menos Ms

Cdigo

COMENTARIOS:.............................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
...............................................................................................................................

MUCHAS GRACIAS

135
Captulo IV.

Resultados y Discusin.
Captulo IV. Resultados y Discusin

CAPTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIN

IV.I. PARMETROS RELACIONADOS CON LA


SEGURIDAD ALIMENTARIA

IV.I.1. CIDO GLUCNICO

Durante el desarrollo de Botrytis Cinerea se produce la oxidacin de glucosa


formando cido glucnico, por lo que ste cido se utiliza habitualmente en
prcticas enolgicas para evaluar el grado de podredumbre gris de la uva. Por
ello, los mostos obtenidos durante las tres vendimias, 2008, 2009 y 2010,
fueron analizados a fin de determinar el grado de infeccin por dicho hongo.

En la Tabla 21 se recogen los contenidos en cido glucnico de los mostos


extrados de las uvas iniciales y tras los distintos ensayos de pasificacin.

Como puede observarse, los contenidos en cido glucnico en los mostos


elaborados con pasas son superiores a 500 mg/l (lmite mximo aceptable para
vinos de uvas no pasificadas). Este umbral fue alcanzado por los mostos de
Moscatel de 2008 tras el primer muestreo, mientras los de Pedro Ximnez y
Moscatel de 2009 lo hicieron al final de la etapa de secado (Figura 36).

139
IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria

V08 V09 V10 p vendimia


Pedro
Ximnez Ini 2916a,3 401a,1 2324a,2 0.000*

C 289791b,3 166317b,2 12288b,1 0.000*


1T 285871b 325313c 0.016*
2T 176210c 32656c 0.000*
psecado 0.000* 0.000* 0.000*
Moscatel Ini 2131a,3 7401 9510a,2 0.000*
C 3842120b,3 1734302 7550b,1 0.000*
1T 359694b 16266c 0.001*
psecado 0.000 0.000 0.000
p variedad pIni 0.003* 0.001* 0.003*
pC 0.012* 0.100 0.000*
p1T 0.012* 0.000*

Tabla 21. Contenidos (media, mg/l desviacin estndar) en cido glucnico en mostos.
Distintos superndices a, b y c indican diferencias en funcin de pasificacin (muestras Ini, C,
1T y 2T). Distintos superndice 1, 2 y 3 indican diferencias en funcin de vendimia (muestras
V08, V09 y V10). *p < 0,05 indica diferencias significativas.

4000
cido glucnico (mg/L)

3000

2000

1000

0
S0 S1 S2 S3 S4 S5
Tiempo pasificacin

Moscatel 2008 Moscatel 2009 Pedro Ximen 2009

Figura 36. Evolucin del contenido en cido glucnico durante el secado de uvas en cmara (C).
S0: Inicial, S1: 2 das, S2: 3 das, S3: 6 das, S4: 7 das, S5: 8 das.

140
Captulo IV. Resultados y Discusin

Los mostos de uva fresca presentaron los menores valores, mientras los
obtenidos de uva pasificada de acuerdo al sistema tradicional (en terraza, 1T, o
en via, 2T) fueron los que alcanzaron los mayores contenidos.

Adicionalmente, las comparaciones entre las vendimias permiten afirmar que el


ao condiciona de manera significativa la presencia de cido glucnico en
mostos de uvas frescas y pasificadas, independientemente de que la uva se
seque en condiciones controladas o mediante asoleo. Pero resulta necesario
precisar que en 2009 y 2010 los contenidos en los mostos de uvas secadas de
manera tradicional (1T y 2T) son claramente mayores que en los de cmara
(C), mientras en 2008 no se detect diferencia entre ellos. Atendiendo a las
condiciones climticas de estos tres aos durante los meses de agosto y
septiembre (CAPDER, 2015b), que es cuando tiene lugar la etapa de
pasificacin, se observa unos valores excepcionalmente elevados de
precipitaciones en el mes de septiembre en el ao 2008, que pudieron
condicionar el estado inicial de la uva y, por tanto, su evolucin durante la
pasificacin tanto en cmara como mediante el sistema tradicional. Adems, la
humedad relativa mxima en el ao 2010 fue superior a la de los aos
anteriores, lo que pudo favorecer el desarrollo del hongo, especialmente
durante el asoleo de la uva Pedro Ximnez, variedad que se caracteriza por un
hollejo fino y delicado que lo hace sensible a los climas hmedos (Alejandre,
2007). Ambos factores, precipitacin y humedad, son favorecedores del
desarrollo de Botrytis Cinerea (Suarez y Inigo, 2004).

Por otra parte, en estudios a pequea escala del secado de uva en cmara
climtica (Hernndez, 2009), tambin se hallaron menores contenidos de cido
glucnico en mostos procedentes del pasificado artificial frente a aquellos del

141
IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria

asoleo tradicional, fruto de la variabilidad de las condiciones ambientales en


ste ltimo.

Respecto a la variedad, si bien estadsticamente se detectaron diferencias entre


Pedro Ximnez y Moscatel, los resultados obtenidos no permiten concluir el
sentido en el que esto ocurre, lo que hace pensar en la existencia de un efecto
de interaccin con otras variables operacionales, tal como vendimia.

142
Captulo IV. Resultados y Discusin

IV.I.2. OCRATOXINA A

Se consideraron los mostos y vinos obtenidos durante las tres vendimias


estudiadas (2008, 2009 y 2010) de uvas de ambas variedades (Moscatel y Pedro
Ximnez) secadas tanto en asoleo tradicional (1T y 2T) como en cmara
climtica (C) (ver apartado III.I. Muestras). Adems, se sigui la evolucin
del contenido en Ocratoxina A (OTA) durante el envejecimiento de los vinos
dulces elaborados durante un periodo de 12 meses.

En la Figura 37, se representa a modo de ejemplo, la superposicin de


cromatogramas obtenidos para las diferentes muestras analizadas, tanto
mostos como vinos, con un tiempo de retencin de 10,2 min para OTA.

Figura 37. Cromatograma tpico de las muestras estudiadas, mosto y vino. Comparacin con un
blanco.

143
IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria

IV.I.2.1. CONTENIDO EN OTA EN MOSTOS DE UVA PASIFICADA

A excepcin de los mostos obtenidos de uva Moscatel durante la vendimia


2008, cuyos resultados se discutirn posteriormente con ms detalle, todos los
mostos presentaron valores de OTA por debajo del lmite legal de 2 g/l
(Tabla 22).

No se detect presencia de Ocratoxina A en ninguna de las muestras iniciales


previas al pasificado, obtenidas de ambas variedades, Moscatel o Pedro
Ximnez durante las tres vendimias (2008, 2009 y 2010). As mismo, los
valores de OTA estuvieron por debajo del lmite de deteccin en los mostos
de la variedad Pedro Ximnez de la vendimia 2008, en los obtenidos durante la
vendimia 2009 procedentes de ambos secados y ambas variedades y aquellos
procedentes de uva secada en cmara de ambas variedades de la vendimia
2010. En esta ltima, se detect la presencia de OTA en los mostos
procedentes del pasificado tradicional, tanto en la variedad Pedro Ximnez
secada en ambas ubicaciones (1T y 2T, en el centro de investigacin y en via)
con concentraciones de 0,53 y 0,99 g/kg respectivamente, como en la
variedad Moscatel (0,82 g/kg).

Ocratoxina A (g/kg) en mostos.


Moscatel Pedro Ximnez
Inicial C. 1T Inicial C. 1T 2T
2008 n.d. 6,90,01 28,80,02 n.d. n.d. n.d. n.d.
2009 n.d. n.d. - n.d. n.d. - n.d
2010 n.d. n.d. 0,82 n.d. n.d 0,990,01 0,530,01

Tabla 22. Ocratoxina A en mostos. (C: Cmara climtica; 1T: asoleo tradicional en el CAIV; 2T:
asoleo tradicional en Via.)

144
Captulo IV. Resultados y Discusin

No obstante, gran parte de esta toxina no fue transferida al vino final, cuyo
valores de OTA se encontraron por debajo de los lmites de deteccin y
cuantificacin, en todos los vinos correspondientes a la vendimia 2010.

Sin embargo, en el caso de la variedad Moscatel de la vendimia 2008, los


contenidos de OTA en los mostos procedentes de los dos sistemas de secado
evaluados sugirieron una posible existencia previa de contaminacin fngica de
la uva, y que sta, asociada a las condiciones del proceso de secado en s,
condujeron al crecimiento del hongo y, en consecuencia, a la produccin de
Ocratoxina A en ambos sistemas. Estos datos concuerdan con los contenidos
en cido glucnico hallado en estos mostos, no observndose diferencias
significativas entre ambos pasificados en la vendimia 2008 a diferencia de 2009
y 2010, cuyas concentraciones de cido glucnico fueron menores para el
secado en cmara. Adems, atendiendo a la climatologa durante el periodo de
pasificacin (Tabla 12), en el ao 2008 nos encontramos con unos valores de
precipitacin elevados para el mes de septiembre y muy superiores a los
hallados en los aos posteriores, lo que tambin parece haber favorecido el
excepcionalmente elevado contenido en OTA de dicha vendimia.

Este hallazgo est en concordancia con los datos proporcionados por Valero et
al., (2008a), que demostraron que es despus de la vendimia, y particularmente
en el proceso de pasificacin, cuando las especies de Aspergillus se vuelven
predominantes sobre otros hongos presentes en la uva, debido principalmente
a una mayor tolerancia a las altas temperaturas y a la baja actividad del agua
(aw).

145
IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria

Ocratoxina A en mostos Moscatel v.08


30,00
[Ocratoxina A] g/Kg 25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
Inicial Soleo Terraza Cmara

Figura 38. Concentracin de Ocratoxina. Moscatel, v.2008.

Para esta vendimia, la concentracin de OTA del mosto de uvas pasas en la


cmara climtica (6,920,01 g/kg) fue menor que la obtenida en el proceso
natural (28,80,02 g/kg) (Figura 38 y Tabla 22), siendo la diferencia
estadsticamente significativa (p < 0,05), lo que parece indicar que un mayor
control sobre las condiciones de pasificacin origin unas mejores condiciones
higinicas en el mosto final, lo que coincide con lo observado en el estudio del
contenido de cido glucnico durante las vendimias 2009 y 2010.

El mosto obtenido por el sistema de asoleo tradicional no se consider apto


para su fermentacin posterior, ya que difcilmente se podra alcanzar una
contenido de OTA legalmente aceptable en el vino terminado. En el secado
artificial, aunque no fue posible eliminar completamente el crecimiento del
hongo, la capacidad de controlar con mayor precisin temperatura y humedad
redujo la produccin de OTA.

146
Captulo IV. Resultados y Discusin

IV.I.2.2. CONTENIDO EN OTA DURANTE EL PROCESO DE


VINIFICACIN Y CRIANZA, (MOSCATEL, V. 2008)

Dado el contenido en OTA del mosto de uva Moscatel de la vendimia 2008


secada en cmara, se decidi realizar un control exhaustivo durante el proceso
de vinificacin y envejecimiento. Para ello, se realizaron muestreos en cada
uno de los cinco ensayos al final de la fermentacin (V01) y tras el deslo y la
clarificacin (V02); adems se realiz un seguimiento del envejecimiento
durante las primeras etapas (20 das, 2 y 3 meses) y hasta completar los 12
meses (6, 9, 10 y 12 meses) de permanencia en bota.

IV.I.2.2.1. Vinificacin

Durante la vinificacin de los mostos procedentes de uvas secadas en cmara


climtica se observ una disminucin considerable del contenido en OTA
(Tabla 23). Una gran parte de la materia slida que estaba en suspensin, y con
ello parte de la toxina presente en el hollejo de uva, fue eliminado durante el
desfangado y la clarificacin (Kurtbay et al., 2008), siendo la diferencia
estadsticamente significativa entre los vinos antes (V01) y despus (V02) de
estas prcticas enolgicas (p < 0,05). Resultados similares se obtuvieron
durante la vinificacin de mostos de uvas tintas (Grazioli et al., 2006). Adems,
investigaciones recientes sugieren una posible relacin entre Ocratoxina A y la
superficie celular de las levaduras (Cecchini et al., 2006). En este sentido, en
aquellos vinos con maceracin prefermentativa (experiencias 3 y 5), se observ
un mayor contenido en OTA que en los vinos sin maceracin. En estas dos
experiencias el mosto estuvo en contacto con la materia slida (hollejos, etc.)
durante 24 h, lo que parece que facilit una mayor transferencia de la toxina al
mosto.

147
IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria

IV.I.1.2.2. Envejecimiento

Durante el envejecimiento en barricas de roble se observ una disminucin en


el contenido de OTA (Tabla 23), encontrndose en todos los casos
concentraciones ms bajas que en sus correspondientes envejecidos en acero,
siendo la diferencia estadsticamente significativa (p < 0,05). El contenido en
OTA de stas ltimas apenas vari en los distintos ensayos durante los doce
meses de evolucin, no observndose diferencias significativas entre la
concentracin de OTA al inicio (S20d) y al final (S12) del envejecimiento en
acero inoxidable.

Sin embargo, los vinos envejecidos en barricas de roble mostraron un gran


descenso en el inicio, con una leve disminucin progresiva durante el tiempo
de envejecimiento, ms acusada en el caso de los vinos con los contenidos ms
elevados (experiencias 3 y 5) (Tabla 23). En este sentido, durante los primeros
90 das de envejecimiento (V02 a S03), la concentracin de OTA en los vinos
de los diferentes ensayos disminuy desde un 8,7% para la experiencia E2 al
37,2% en la experiencia E3.

En este sentido, el envejecimiento de vinos tintos en botella fue evaluado por


Grazioli et al., (2006), y aunque no se hallaron efectos a corto plazo, hubo una
disminucin de la concentracin de OTA del 17% despus de 12 meses. En
nuestro estudio, en cuatro de las siete barricas estudiadas, esta disminucin fue
incluso mayor del 17% en los primeros tres meses, llegando a descender, como
promedio de todas las experiencias evaluadas, un 56,4 9,3% tras un ao de
envejecimiento en barrica.

148
Captulo IV. Resultados y Discusin

Experimento 1
4,00
V08. M.C.E1C1
[Ocratoxina A] g/L 3,50
V08. M.C.E1C2
3,00
V08. M.C.E1S
2,50 V08. M.C.E1CH
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
V01 V02 S20d S02 S03 S06 S09 S10 S12
Envejecimiento

Figura 39. Evolucin de vinos Moscatel de la v.2008. Ensayo de vinificacin 1 (E1: S. Cerevisiae, t
ambiente), envejecidas en botas de roble (C), acero inoxidable (S) y con chips (CH).

Adems, se observ que los vinos del mismo ensayo envejecido en diferentes
barricas de roble mostraron una tendencia muy similar en el tiempo mostrando
una dispersin muy baja. En el experimento realizado con virutas de madera
(1_Ch), el contenido de OTA del vino se mantuvo constante, mostrando un
comportamiento similar al envejecimiento en acero inoxidable (Figura 39).

Aunque el vino obtenido de la experiencia 5 mostraba, al inicio del


envejecimiento en barrica y durante los primeros meses, una concentracin
superior a 2,0 g/l, el seguimiento peridico durante 12 meses de
envejecimiento, constat un descenso progresivo llegando a valores legalmente
aceptables (Tabla 23).

Por tanto, todos los vinos con crianza en madera de roble durante un periodo
de 12 meses mostraron unos contenidos en OTA por debajo de 2,0 g/l,
lmite legal que establece la Unin Europea, por lo que seran aptos para su
consumo.

149
IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria

Ocratoxina A (g/l) en vinos Moscatel v.2008.


V01 V02 S20d S02 S03 S06 S09 S10 S12
V08. M.C.E1C 0,67 0,04 0,62 0,05 0,59 0,04 0,38 0,03 0,39 0,07 0,33 0,02 0,30 0,02
V08. M.C.E1S 3,75 0,03 1,44 0,02 1,12 0,08 1,12 0,10 1,14 0,06 1,19 0,00 1,23 0,05 1,13 0,06 1,07 0,00
V08. M.C.E1CH 1,10 0,02 1,08 0,01 1,13 0,01 1,22 0,00 1,19 0,01 1,20 0,04 1,02 0,02
V08. M.C.E2C 1,11 0,03 0,86 0,02 0,97 0,01 0,81 0,02 0,72 0,03 0,63 0,03 0,48 0,00
3,64 0,01 1,51 0,11
V08. M.C.E2S 1,52 0,01 1,48 0,03 1,60 0,02 1,54 0,00 1,64 0,02 1,62 0,02 1,36 0,00
V08. M.C.E3C 1,71 0,03 1,29 0,03 1,07 0,01 0,71 0,01 0,73 0,00 0,68 0,00 0,50 0,00
2,55 0,02
V08. M.C.E3S 2,01 0,06 2,03 0,02 2,03 0,02 2,09 0,05 2,05 0,02 1,99 0,03 2,000,02
V08. M.C.E4C 0,68 0,06 0,57 0,02 0,51 0,02 0,34 0,02 0,33 0,02 0,33 0,01 0,33 0,02
4,09 0,02 0,97 0,01
V08. M.C.E4S 1,00 0,01 1,01 0,07 1,00 0,02 1,18 0,01 1,16 0,01 1,39 0,05 1,03 0,00
V08. M.C.E5C 4,44 0,40 3,95 0,01 3,40 0,01 2,36 0,01 1,76 0,01 1,70 0,00 1,59 0,01
3.99 0,03
V08. M.C.E5S 4,92 0,20 4,92 0,02 4,98 0,02 4,94 0,04 4,91 0,02 4,92 0,03 4,96 0,01

Tabla 23. Valores medios (g/l) y desviaciones estndar de la concentracin de OTA en vinos. E1-E5: Experiencias de vinificacin; C: Botas de
roble, S: Depsitos de acero inoxidable, CH: Envejecimiento con chips.

150
Captulo IV. Resultados y Discusin

IV.I.3. CIDOS ORGNICOS

IV.I.3.1. CONTENIDO EN CIDOS ORGNICOS EN MOSTOS

En la evolucin de los cidos orgnicos presentes en la uva durante la


pasificacin se pueden describir dos efectos antagnicos. Por una parte, se
produce un aumento de su concentracin debido a la evaporacin del agua en
las bayas. Por otra, las uvas expuestas continan con el proceso respiratorio
que tiene lugar durante la maduracin, originando la combustin de los cidos
(Hidalgo-Togores, 2003b).

En la Tabla 24 se recogen los contenidos de los mostos extrados de las uvas


iniciales y tras los distintos ensayos de pasificacin.

Los contenidos en cido tartrico de las uvas antes de la pasificacin se


hallaron en el rango 2000-4000 mg/l, valores bajos y frecuentes en climas
clidos como el de la zona de Jerez. Por su parte, el ao de vendimia afect de
manera significativa a los contenidos en la uva, y esto se observ tanto en
Moscatel como en Pedro Ximnez (p < 0,05). Tambin la variedad parece ser
un factor que condicione la presencia de cido tartrico en la uva, mayor en
Pedro Ximnez. Tras la pasificacin, las concentraciones aumentaron por lo
que el efecto de concentracin predomin en ste cido. Adicionalmente, los
mostos se corrigieron hasta 3000 y 4000 mg/l para mantener una acidez que
preservara al vino de desarrollos microbianos no deseados, si bien el Pedro
Ximnez de 2010 pasificado en via alcanz una concentracin anormalmente
elevada.

El cido mlico en la uva se hall dentro del rango normal de concentracin


para climas clidos, esto es, entre 700-2000 mg/l. El ao afect a las

151
IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria

concentraciones, tanto en Moscatel como en Pedro Ximnez, si bien los


contenidos fueron significativamente mayores en Moscatel (p < 0,05). El
sistema de pasificacin tambin contribuy de una manera importante a los
niveles de cido mlico, que fueron mayores en las uvas pasificadas mediante
asoleo que en las sometidas a secado en cmara, aunque las diferencias tras los
distintos sistemas de pasificacin se observaron menores en la variedad
Moscatel. Como es sabido, el cido mlico presenta una alta susceptibilidad a
las altas temperaturas, por lo que los efectos de combustin pueden dar lugar a
una mayor variabilidad en los resultados (Hidalgo-Togores, 2003b). La
importancia de este cido es clara, pues con su caracterstica nota verde aporta
complejidad a la base fuertemente dulce de los mostos concentrados (siempre
que no se halle en exceso y resulte agresiva).

Por problemas con el equipo de anlisis, el cido ctrico solo pudo


determinarse en la vendimia 2008. Este cido, cuya contribucin a la frescura
en boca es su aspecto ms significativo, present concentraciones que se
hallaron en general dentro de los valores normales en mostos sanos (100-500
mg/l), siendo algo ms elevada en Moscatel que en Pedro Ximnez. El
incremento de las concentraciones tras la pasificacin de la uva Pedro
Ximnez fue superior al que se justificara por la disminucin del volumen de
agua, lo que podra relacionarse con un eventual crecimiento de Botrytis cinrea,
hecho que coincide con los contenidos de cido glucnico hallados. Por su
parte, la uva Moscatel debera haber alcanzando unos valores de cido ctrico
tras la concentracin del 35% de 810 mg/l, dato que contrasta con los
obtenidos, sobre todo en la sometida a secado tradicional (1T). Esto podra
indicar la presencia de bacterias lcticas que hubieran utilizado como sustrato
dicho cido, en especial en la pasificada mediante asoleo, sin embargo no
parece ser sta la causa ya que no se detect la presencia de cido lctico en

152
Captulo IV. Resultados y Discusin

estas muestras, por lo que el menor contenido podra justificarse por los
efectos de combustin ya mencionados.

La presencia de los cidos succnico, lctico, frmico y actico denota el inicio


de actividad fermentativa, lo que no resulta extrao en particular en las uvas
pasificadas, dado el elevado contenido en sustrato azucarado de sus mostos.

El cido succnico se hall en las uvas en concentraciones muy por debajo del
rango normal en el vino (500-1500 mg/l), indicando un inicio muy tmido del
proceso fermentativo que se potencia tras la pasificacin, ms en el secado
mediante asoleo que en cmara, probablemente debido a la mayor
disponibilidad de oxgeno en los espacios abiertos. El ao de vendimia result
ser un factor que afect a su presencia en el mosto, no as la variedad.

El cido lctico se encontr en mnimas cantidades en las uvas frescas, por


debajo de las comnmente atribuidas a la fermentacin alcohlica (200-600
mg/l), e incluso ausente en algunas de las muestras. Al analizar los datos para
ambas variedades y vendimias, se observ que el secado de las uvas
increment significativamente estas concentraciones, aunque de manera
aparentemente aleatoria en funcin del sistema aplicado (tradicional o cmara),
sin que se alcanzaran en ninguno de los ensayos los 300 mg/l.

La presencia de pequeas cantidades de cido frmico en algunas uvas sin


secar se ve incrementada tras la pasificacin, ms cuando sta se realiza en
sistema tradicional (1T y 2T) que en cmara, aunque no siempre de manera
estadsticamente significativa. Respecto a la influencia del ao de vendimia,
resulto significativa, no as la variedad.

153
IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria

Por su parte, el cido actico en las uvas sin secar present concentraciones
bastante menores a las propias para vinos sanos (< 500 mg/l), aunque no hay
que olvidar que se trata de uvas aun sin vinificar. Al analizar los datos para
ambas variedades y vendimias, se observ que el secado de las uvas
increment significativamente estas concentraciones, sin que se pueda concluir
un patrn comn para todas las muestras (variedad x vendimia) en lo que se
refiere al efecto de cada sistema de pasificacin: Moscatel aument en mayor
medida sus niveles de actico tras el secado en cmara, mientras Pedro
Ximnez lo hizo con el secado mediante asoleo tradicional. Y si bien vendimia
contribuy de manera significativa al contenido en actico, al igual que
variedad, la existencia de interaccin estadstica entre estos factores y con el
sistema de pasificacin, impiden establecer patrones de comportamiento. Por
otra parte, la concentracin durante el secado de las uvas no justifica en la
mayora de los ensayos el significativo aumento de su contenido, lo que podra
interpretarse como consecuencia de cierta actividad bacteriana (lctica o
actica).

154
Captulo IV. Resultados y Discusin

Tabla 24. Contenidos (media desviacin estndar) en cidos orgnicos de los mostos (mg/l). Distintos superndices a, b y c indican diferencias en
funcin de la variable pasificacin (muestras Ini, C, 1T y 2T). Distintos superndices 1, 2 y 3 indican diferencias en funcin de la variable ao de
vendimia (muestras V08, V09 y V10). p <0.05 indica diferencia significativa.

PX M pvariedad
p p
V08 V09 V10 V08 V09 V10 V08 V09 V10
vendimia vendimia
. tartrico
Ini 2658181a,1 349211a,2 3849232a,2 0,013 201427a,1 26741a,2 294411a,3 0,000 0,038 0,000 0,031
C 334859b,1 34287a,1 4431260 b,2 0,010 313325b,1 415480b,3 3750145b,2 0,004 0,041 0,006 0,084
1T 347276b 3588145a 0,422 31121b 3706212b 0,058 0,021 0,584
2T 417037 b 7973106c 0,000
p secado 0,011 0,000 0,000 0,000 0,001 0,020
. mlico
Ini 125635a,3 75319a,1 99331a,2 0,001 150216c,2 12833a,1 161334a,3 0,001 0,012 0,000 0,003
C 149237b,3 92716 b,1 118470b,2 0,003 11502a,1 155261b,2 186915b,3 0,001 0,006 0,005 0,005
1T 181644c 144523c 0,009 125125b 193266b 0,005 0,004 0,010
2T 119910 c 220662d 0,002
p secado 0,002 0,000 0,000 0,000 0,025 0,010
. ctrico
Ini 31419a - - 5298 b - - 0,004
C 58128 b - - 7148 c - - 0,023
1T 79621 c - - 4325a - - 0,002
2T
p secado 0,000 0,000
. succnico
Ini 00a,1 423a,2 00a,1 0,000 7543 482a,2 00a,1 0,000 0,001 0,139 1,000
C 4725b,1 1193c,2 556b,1 0,031 7121 1447b,2 627b,1 0,001 0,309 0,043 0,394
1T 1452c 9110c 0,016 9521 979c 0,922 0,077 0,583
2T 1011b 918c 0,238
p secado 0,005 0,000 0,000 0,256 0,003 0,001

155
IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria

PX M pvariedad
p p
V08 V09 V10 V08 V09 V10 V08 V09 V10
vendimia vendimia
. lctico
Ini 00a,1 8217a,2 00a,1 0,005 1568b,3 805a,2 00a,1 0,000 0,001 0,871 0,849
C 8060a 1860 b 10613b 0,113 00a,1 2491b,3 1835a,2 0,000 0,196 0,000 0,015
1T 2967b 12623b 0,009 00a 2181a 0,000 0,000 0,029
2T 1561b 27036c 0,047
p secado 0,007 0,004 0,001 0,000 0,000 0,000
. frmico
Ini 320a,2 00a,1 00a,1 0,000 813a,3 501a,2 001 0,000 0,001 0,000 0,956
C 8017b,2 1201b,2 314b,1 0,024 882a,3 701b,2 001 0,000 0,870 0,000 0,007
1T 8321b 377b 0,012 1065b 00 0,001 0,028 0,015
2T 1971c 8011c 0,004
p secado 0,050 0,000 0,001 0,012 0,003 0,465
. actico
Ini 1272a,3 00a,1 295a,2 0,000 1026a,2 123a,1 00a,1 0,000 0,035 0,029 0,013
C 10846a,1 3247b,2 53115c,3 0,001 4922c,1 65212b,3 54510c,2 0,001 0,007 0,000 0,410
1T 45014b 37829b 0,088 32611b 1995b 0,004 0,010 0,013
2T 34620b 63334d 0,009
p secado 0,002 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

156
Captulo IV. Resultados y Discusin

IV.I.3.2. INFLUENCIA DE LAS CONDICIONES DE


VINIFICACIN

A la vista de los resultados de la Tabla 25, pertenecientes a vinos Moscatel de


la vendimia 2008, los contenidos en cidos tartrico, mlico, succnico y lctico
en los vinos elaborados bajo distintas condiciones de fermentacin se hallaron
dentro de los rangos normales para vinos sanos. El cido succnico dota al
vino de sensaciones saladas y amargas sutiles muy apreciadas, mientras los
cidos mlico y lctico ofrecen previsiblemente un interesante contrapunto de
sabores. Por su parte, el contenido en actico supera los 500 mg/l en la
mayora de los vinos elaborados en estos ensayos. La presencia natural de
cido tartrico se reforz en la operacin de ajuste de pH y acidez, por lo que
no se tendr en consideracin en el tratamiento de datos.

La comparacin de los ensayos de fermentacin de los mostos bajo distintas


condiciones de vinificacin permiti confirmar la influencia de algunas de estas
variables operacionales sobre los contenidos en cidos orgnicos (Tabla 25).

La levadura utilizada afect de manera significativa o casi significativa a las


concentraciones de los cidos mlico, ctrico lctico y frmico, siendo stas
mayores en los vinos elaborados con S. cerevisiae. Eglinton et al., (2000)
describieron tambin diferencias significativas en el contenido de cidos
orgnicos de vinos fermentados con ambas levaduras. Sin embargo la
tendencia fue ligeramente diferente, observndose en vinos fermentados con
S. bayanus un mayor contenido en cido succnico y menor en cido actico.
Estas posibles diferencias, pueden ser fruto de las condiciones especiales de
nuestros mostos, procedentes de uvas pasificadas y con una elevada
concentracin de azcares.

157
IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria

La temperatura de fermentacin afect de igual forma a los contenidos en los


cidos procedentes de la uva (mlico y ctrico), mientras los restantes cidos,
los originados durante el proceso fermentativo, presentaron diferencias en
funcin de que se elaborara el vino a baja temperatura (T.B.) o temperatura
ambiente (T.A.). La adicin de sales amnicas como nutrientes de las levaduras
durante el proceso fermentativo no afect a las concentraciones en cidos,
mientras la maceracin pelicular en presencia de enzimas pectolticas pareci
relacionarse con unos mayores niveles de cido succnico y menores de
actico.

158
Captulo IV. Resultados y Discusin

Tabla 25. Contenidos (media, mg/l desviacin estndar) en cidos orgnicos de los vinos obtenidos bajo las distintas condiciones de fermentacin
ensayadas en la v. 2008. p < 0,05 indica diferencia significativa. Distintos superndices a, b y c indican diferencia en funcin de las condiciones de
vinificacin (muestras E1-E5).

Variables Condiciones . tartrico . mlico . ctrico . succnico . lctico . frmico . actico


E1 211338b 113213 a 5008b 4648b 3134c 813a,b 88216b
E2 19592a 13201b 6460 c 6472c 4478d 972a,b 10535c
Ensayo de E3 21055b 15941c 8583 d 7966e 5463e 1091b 10041c
vinificacin E4 207825b 115675 a,b 54530b 4199a 22822b 4325a 102919d
E5 208124b 108511a 3421a 7215d 1763a 320a 3923a
p 0,079 0,001 0,000 0,000 0,000 0,067 0,000
S. cerevisiae 207230 129572 62656 59353 40537 925 95529
Levadura S. bayanus 207917 113250 47747 51964 21018 3916 883156
p 0,873 0,110 0,074 0,387 0,001 0,004 0,609
T.A. 207424 125363 56958 61945 35942 809 84379
Temperatura
T.B. 207825 115675 54530 4199 22822 4325 112919
fermentacin
p 0,934 0,404 0,800 0,018 0,084 0,099 0,045
No 209515 120957 54848 54746 30137 6511 90376
Nutrientes S 19592 13201 6460 6472 4478 972 10535
p 0,004 0,461 0,432 0,406 0,144 0,280 0,449
No 206825 117937 54721 48329 30628 6912 101538
Maceracin
con enzimas S 209312 1339147 600149 75822 361107 7122 698177
pectolticas p 0,565 0,155 0,586 0,000 0,490 0,943 0,023

159
IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria

IV.I.3.3. EFECTO DEL SISTEMA DE SECADO DE LA UVA EN LOS


VINOS JVENES

Dado que los efectos de variedad y vendimia se confirmaron como


significativos en el estudio del contenido en cidos en los mostos, se trataron
de manera independiente los resultados correspondientes a los vinos de cada
vendimia y variedad sin envejecer (Tabla 26). En general, esta influencia se
mantuvo al pasar de mostos a vinos, a juzgar por los p < 0,05 que caracterizan
los efectos vendimia y variedad.

Para cido mlico, an cuando los contenidos respecto a los mostos se


modificaron ligeramente (disminuyeron en los vinos Pedro Ximnez y
Moscatel de 2010, y aumentaron en los de 2009), de acuerdo a los datos de la
Tabla 26, en lo que respecta a los vinos se mantienen los mayores contenidos
en cido mlico de los mostos extrados de uva asoleada (1T y 2T) en relacin
a la secada en cmara (C), diferencias que se observaron ms marcadas en los
mostos procedentes de uva Pedro Ximnez.

Respecto a los cidos succnico y lctico, todos los vinos presentan


concentraciones dentro de los rangos normales, superiores a las halladas en los
correspondientes mostos, como caba esperar. cido frmico tienen una
evolucin similar, aunque menos marcada.

El cido actico se hall sin embargo en cantidades cercanas o superiores a


1000 mg/l en casi todos los vinos estudiados, claramente superiores a las de
los correspondientes mostos, lo que podra ser fruto del propio proceso de
fermentacin o indicar cierta actividad bacteriana.

160
Captulo IV. Resultados y Discusin

Como resumen, se mantienen las tendencias encontradas en los mostos,


aunque las concentraciones no sean las mismas. Si bien se confirman
diferencias significativas entre los contenidos en cidos en funcin del sistema
de secado de la uva, no existe un claro patrn que indique el sentido en que
sta se produce. A juzgar por las medias y los p-valores obtenidos, un eventual
efecto de la variedad, y sobre todo de la vendimia, podran estar
interaccionando, de manera que no se puede asegurar la influencia significativa
del sistema de pasificacin.

161
IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria

Tabla 26. Contenidos (media, mg/l DE) en cidos orgnicos de los vinos sin envejecer. Distintos superndices a, b y c indican diferencias en funcin
de la pasificacin de los vinos (muestras C, 1T y 2T) (Test de Tukey). p < 0.05 indica diferencia significativa.

PX M pvariedad
V09 V10 pvendimia V09 V10 pvendimia V09 V10
. tartrico C 13608 21533b 0,000 255315 267421 0,041 0,000 0,002
1T 155830a 182220 0,018
2T 204713 214012b 0,035
psecado 0,000 0,000 0,001
. mlico C 10161 8990a 0,000 208024 179415 0,022 0,000 0,000
1T 108022b 189226 0,002
2T 15389 203310c 0,000
psecado 0,000 0,000 0,538
. succnico C 7060 3841b 0,000 6955 5292 0,000 0,139 0,000
1T 50812c 3532 0,006
2T 3921 3292a 0,001
psecado 0,000 0,000 0,000
. lctico C 3993 1502a 0,000 1663 2510 0,001 0,000 0,000
1T 2194b 3063 0,004
2T 2752 3476c 0,007
psecado 0,001 0,000 0,004
. frmico C 240 352a 0,027 840 380 0,000 0,000 0,214
1T 401b 462 0,064
2T 420 640c 0,000
psecado 0,001 0,000 0,034
. actico C 8351 15223b 0,000 8424 13441 0,000 0,206 0,000
1T 105422a 4721 0,001
2T 12781 23019c 0,000
psecado 0,000 0,000 0,000

162
Captulo IV. Resultados y Discusin

IV.I.3.4. INFLUENCIA DEL SISTEMA DE ENVEJECIMIENTO

Dado que los efectos de variedad y vendimia se confirmaron en general como


significativos sobre el contenido en cidos de los mostos, y pudiera serlo
tambin el sistema de pasificacin, para el estudio del efecto sobre el sistema
de envejecimiento al que se someta el vino, se trataron los datos de cada
variedad y vendimia de manera independiente, recogindose los resultados en
la Tabla 27. En dicha tabla se incluyen, adems, los p-valores para cada tipo de
envejecimiento (bota, acero inoxidable o en contacto con chips) y tiempo de
envejecimiento en cada uno de los sistemas descritos anteriormente (al inicio y
tras 12 meses).

Los contenidos en cidos variaron de manera significativa durante el


envejecimiento en bota de los vinos, tanto en uva Pedro Ximnez como en
Moscatel, y en las 3 vendimias consideradas, 2008, 2009 y 2010, e
independientemente de que procedieran de mostos pasificados en condiciones
controladas (cmara climtica, C), o mediante el sistema tradicional de asoleo
(1T y 2T). Los incrementos fueron importantes en los vinos de 2009 y 2010,
mientras los del 2008 presentan una evolucin algo distinta en funcin del
cido y del vino (elaborados con diferentes condiciones de vinificacin).

Los vinos madurados en ausencia de madera de roble, sin la porosidad que


favorece la entrada de oxgeno y la salida de agua y etanol, presentaron unos
contenidos en cidos orgnicos ms estables, en especial en los de las
vendimias 2009 y 2010, si bien los cidos lctico y frmico aumentaron en
concentracin, y tartrico disminuy (por precipitacin de bitartratos). Los de
2008 tendieron a disminuir sus contenidos tras el envejecimiento.

163
IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria

Respecto a los vinos envejecidos en contacto con chips de madera de roble, el


vino en que se ensay este sistema disminuy de manera significativa sus
concentraciones en cidos orgnicos si bien, debemos ser cautos con los
resultados obtenidos ante el bajo nmero de vinos estudiados bajo este
sistema.

Al comparar las concentraciones entre los distintos sistemas de


envejecimiento, se observ que en general, fueron mayores en los vinos en
bota, seguidos de los madurados en depsitos inertes de acero, hallndose los
menores contenidos en los envejecidos con chips. Particularmente, las mayores
concentraciones halladas para los cidos mlico, lctico y actico en los vinos
con crianza en madera sugieren que podran haber tenido lugar posibles
actividades microbiolgicas.

El anlisis de los p valores obtenidos de la comparacin entre sistemas de


envejecimiento al inicio de la etapa (S20d/S01) y transcurridos 12 meses (S12),
pone en evidencia que el tiempo tiene un efecto diferenciador en los
contenidos, de manera que las diferencias iniciales se potencian, e incluso
aparecen donde no las haba inicialmente (pS12 << pS20d/S01).

164
Captulo IV. Resultados y Discusin

Tabla 27. Contenidos (media, mg/l desviacin estndar) en cidos orgnicos de los vinos al inicio de la etapa de envejecimiento (S20d S01, segn
las muestras) y tras 12 meses en bota de roble (S12). Diferencias significativas para p < 0,05. En la muestra 1, para cada cido, distintos superndices
indican diferencia en funcin de tipo de envejecimiento (Bota, Acero inoxidable o Chips): superndices a, b y c para S20d/S01 y 1, 2 y 3 para S12.

2008 2009 2010


M PX M PX M
C (E1) C (E4) C 2T C C 1T 2T C 1T
. tartrico
Bota S20d/S01 211338 20782 13257 204525 22731 2607 159227 1760 192818 182028
S12 1449372 159031 15466 208527 272918 201728 14977 24531 218753 172219
p 0,000 0,000 0,000 0,257 0,000 0,036 0,040 0,001 0,022 0,053
Acero S20d/S01 206421 215917 136011 204719 255321 21534 155843 214017 267429 182229
Inox. S12 1441322 10106 133020 19041 216752 183817 13350 199121 187132 179036
p 0,003 0,000 0,209 0,008 0,010 0,001 0,018 0,016 0,001 0,441
Chips S20d/S01 19635
roble S12 106881
p 0,000
ptipo envej pS20d/S01 0,087 0,105 0,066 0,921 0,002 0,006 0,439 0,034 0,001 0,964
pS12 0,001 0,000 0,004 0,010 0,004 0,016 0,000 0,001 0,018 0,140
. mlico
Bota S20d/S01 113213a 115675 9794 150226 20347 1002 110518 2174 17305 186324
S12 835172 108617 107216 16237 22789 10433 11713 252112 212953 20330
p 0,000 0,395 0,014 0,024 0,001 0,050 0,037 0,027 0,008 0,010
Acero S20d/S01 108810a 10860 10161 153813 208034 8991 108031 203314 189421 189237
Inox. S12 816142 7225 96110 13824 187270 8768 10457 200027 179215 181345
p 0,003 0,000 0,016 0,003 0,063 0,057 0,261 0,268 0,030 0,196
Chips S20d/S01 12252b
roble S12 63111
p 0,000

165
IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria

2008 2009 2010


M PX M PX M
C (E1) C (E4) C 2T C C 1T 2T C 1T
ptipo envej pS20d/S01 0,003 0,569 0,005 0,222 0,205 0,005 0,426 0,076 0,008 0,449
pS12 0,000 0,000 0,013 0,000 0,014 0,001 0,001 0,001 0,013 0,020

. succnico
Bota S20d/S01 4648b 4199 7319 4253 7270 450 5474 243 5454 3867
S12 344123 2905 7613 4740 7793 4800 5615 4852 6761 4702
p 0,000 0,000 0,041 0,001 0,002 0,000 0,118 0,005 0,000 0,003
Acero S20d/S01 4372a 4062 7060 3921 6956 3841 50818 3293 5293 3532
Inox. S12 29342 1743 69114 3831 66511 3884 4972 3304 5182 3562
p 0,000 0,000 0,259 0,015 0,078 0,278 0,466 0,868 0,039 0,289
Chips S20d/S01 4900b
roble S12 21741
p 0,000
ptipo envej pS20d/S01 0,017 0,389 0,057 0,004 0,020 0,013 0,092 0,028 0,040 0,022
pS12 0,001 0,000 0,020 0,000 0,005 0,000 0,003 0,000 0,000 0,000
. lctico
Bota S20d/S01 3134c 22822 46923 3002 15881 189 2652 138 2977 36514
S12 41823 37414 54928 3823 3101 2749 3490 6146 4874 5001
p 0,000 0,001 0,086 0,000 0,116 0,079 0,000 0,010 0,000 0,005
Acero S20d/S01 2145a 1783 3995 2753 1664 1503 2196 3478 2510 3065
Inox. S12 20142 1303 4510 2411 19113 1951 2555 4132 3254 3564
p 0,174 0,008 0,004 0,005 0,125 0,002 0,021 0,007 0,001 0,008
Chips S20d/S01 2425b
roble S12 15131
p 0,004
ptipo envej pS20d/S01 0,000 0,200 0,050 0,012 0,904 0,064 0,009 0,030 0,010 0,029
pS12 0,000 0,000 0,038 0,000 0,006 0,006 0,001 0,000 0,000 0,000

166
Captulo IV. Resultados y Discusin

2008 2009 2010


M PX M PX M
C (E1) C (E4) C 2T C C 1T 2T C 1T
.frmico
Bota S20d/S01 813 4325 341 550 835 44 480 15 580 592
S12 8033 653 910 1051 1452 1041 871 1951 1432 1202
p 0,831 0,420 0,000 0,000 0,004 0,011 0,000 0,005 0,000 0,000
Acero S20d/S01 690 0,00,0 240 420 840 352 401 640 380 462
Inox. S12 5012 392 470 791 1121 450 480 802 490 443
p 0,001 0,001 0,000 0,000 0,000 0,025 0,005 0,005 0,000 0,509
Chips S20d/S01 792
roble S12 3701
p 0,001
ptipo envej pS20d/S01 0,067 0,728 0,003 0,001 0,766 0,184 0,005 0,000 0,000 0,021
pS12 0,000 0,003 0,000 0,000 0,002 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
. actico
Bota S20d/S01 88216b 112919 88814 13388 835 1703 11156 2167 13463 5904
S12 861153 98732 11201 14334 1452 18080 130311 24823 17979 9731
p 0,363 0,008 0,001 0,003 0,000 0,003 0,002 0,008 0,000 0,000
Acero S20d/S01 8095a 11213 8352 12781 8425 15224 105431 230113 13441 4722
Inox. S12 62832 5924 85310 12403 8338 160919 10843 234710 13710 4843
p 0,000 0,000 0,112 0,004 0,299 0,024 0,311 0,056 0,000 0,031
Chips S20d/S01 9063 b
roble S12 485121
p 0,000
ptipo envej pS20d/S01 0,024 0,795 0,034 0,008 0,007 0,015 0,115 0,075 0,439 0,000
pS12 0,000 0,001 0,000 0,000 0,000 0,004 0,001 0,002 0,000 0,000

167
IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria

IV.I.4. CARBAMATO DE ETILO

Para el estudio del contenido en carbamato de etilo, se analizaron los vinos


obtenidos en las tres vendimias (v. 2008, 2009 y 2010), de acuerdo a las
condiciones de vinificacin citadas anteriormente (ver Tablas 13 y 14, seccin
III.I. Muestras), de las dos variedades (Moscatel y Pedro Ximnez) tras la
vinificacin y durante la etapa de envejecimiento (S0d: Inicial; S20d: 20 das;
S40d: 40 das; S2: 2 meses; S4: 4 meses; S7: 7 meses; S8: 8 meses; S12: 12
meses; S18: 18 meses; S28: 28 meses.)

IV.I.4.1. INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIN DE ALCOHOL


EN LA DETERMINACIN DE CARBAMATO DE ETILO EN VINOS
DULCES

Existen diversos estudios sobre el efecto del pH y el contenido en alcohol en


la estabilidad del complejo xantil-CE. Rodrguez-Madrera y Surez-Valles,
(2009) demostraron que la seal analtica disminua en promedio un 1% por
cada aumento de la concentracin de alcohol en el rango estudiado (de 20 a
65%). Ajtony et al., (2013), observaron una dependencia del complejo con el
pH, de manera que valores bajos de pH favorecan su descomposicin. En
nuestro caso, se evalu la influencia de diferentes contenidos alcohlicos sobre
la estabilidad de xantil-CE, utilizando un medio de HCl fuerte (valor de pH
aprox. 0,94). Los resultados fueron consistentes con los descritos por
Rodrguez-Madrera y Surez-Valles (2009). Las matrices vnicas al 17 y 20%
(v/v) en etanol mostraron unas respuestas mayores que el vino con 40% (v/v)
debido a la influencia del grado alcohlico en la sustitucin nuclefila (datos
no mostrados). El compuesto xantil-CE, sin embargo, fue estable slo en la
solucin de etanol al 40%, mostrando una desviacin estndar relativa (RSD)

168
Captulo IV. Resultados y Discusin

de menos del 5% entre la primera (30 min) y la ltima inyeccin (11 h y 30


min, Figura 40).

20
Variacin de la seal (%)

10
0
-10 0 2 4 6 8 10 12
-20 Tiempo (horas)
-30
-40
-50
-60
-70

Figura 40. Estabilidad del complejo xantil-CE en disoluciones alcholicas. 20% etanol v/v;
40% etanol v/v; matriz vnica (17% v/v).

A fin de obtener esta concentracin de etanol al 40 % (v/v) en el medio de


reaccin, minimizando la prdida de respuesta debido al factor de dilucin, las
muestras se diluyeron en una proporcin de 83:17 (muestra: etanol), adems, la
disolucin de cido clorhdrico 1,5M fue preparada tambin en etanol. Tal y
como describi Herbert et al., (2002), la dilucin de la muestra a la misma
concentracin de alcohol, mostr algunas ventajas: el ruido cromatogrfico
debido al efecto de la matriz se redujo, y la reaccin de derivatizacin fue ms
homognea.

La posible influencia del contenido de azcar en la reaccin de derivatizacin


no fue evaluada, ya que teniendo en cuenta los resultados obtenidos por
Herbert et al., (2002), dichos compuestos no interfieren en la formacin del
complejo.

169
IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria

IV.I.4.2. ANLISIS DE LA VARIANZA (ANOVA)

La concentracin de CE de los vinos elaborados con la variedad Moscatel de la


vendimia 2008, oscil entre "no detectado" (E4, S0d) y 194 mg/l (E3, S28)
(Tabla 28). Como era de esperar (Kodama et al., 1994), el contenido en
carbamato de etilo aument en todos los ensayos a medida que el tiempo de
envejecimiento aument. Los datos presentados en la Tabla 28 tambin
sugieren que existen diferencias significativas en el contenido en CE de los
vinos, asociadas a las diferentes condiciones de vinificacin ensayadas.

Muestreo E1 E2 E3 E4 E5
S0d 10,22,1 11,03,2 40,81,7 n.d. 13,20,7
S20d 19,56,1 30,38,6 48,61,2 23,91,4 17,21,2
S40d 22,27,1 43,720,2 57,00,3 34,16,6 25,80,3
S2 26,28,1 50,313,6 85,72,9 38,93,6 24,70,9
S4 38,811,5 71,117,0 1033 57,67,0 37,91,2
S7 51,922,2 74,118,7 1092 44,325,8 45,20,7
S8 59,418,1 86,121,3 1231 73,014,1 57,90,3
S12 67,218,8 10019 1462 60,527,7 63,70,3
S18 74,618,7 12110 1821 94,715,7 67,01,1
S28 96,033,8 14716 1946 1069 1252

Tabla 28. Vendimia 2008, variedad Moscatel. Valores medios (g/l) y desviaciones estndar
durante el envejecimiento en madera (E3 y E5) y en barricas y depsitos de acero (E1, E2 y E4).
S0d, S20d y S40d inicial, 20 das y 40 das. S2, S2, S7, S8, S12, S18, S28; 2, 4, 7, 8, 12, 18, 28 meses
respectivamente. n.d.: no detectado.

170
Captulo IV. Resultados y Discusin

En el caso de las vendimias 2009 y 2010, la Figura 41 muestra los valores


medios (g/l) obtenidos para la variedad Pedro Ximnez vinificada bajo las
condiciones correspondientes al ensayo E4. En este caso, para todas las
muestras (dos variedades de uva y tres vendimias), no se detect la presencia
de carbamato de etilo inmediatamente despus de la fermentacin alcohlica
(S0d). Como puede apreciarse en la Figura 41, para ambas vendimias, las
muestras de PX envejecidas en barricas de roble (C) mostraron mayores
concentraciones de CE.

100
Concentracin CE (g/l)

80

60
2009 C
40
2009 S
20 2010 C
0 2010 S

-20
0 20 40 2 4 7 8 12 18 28
Das Meses

Figura 41. CE en vinos PX de las v. 2009 y 2010 correspondientes a E4 durante el envejecimiento


en barricas de roble (C) y depsitos de acero inoxidable (S).

La Tabla 29 muestra los valores medios (DS) de CE correspondientes a las


diferentes vendimias consideradas, variedades de uva estudiadas, condiciones
de vinificacin as como tipo y tiempo de envejecimiento. Para cada uno de
ellos, se consideraron todos los valores de CE correspondientes a los vinos
elaborados bajo las distintas condiciones de los restantes factores. sto
explicara los elevados valores de desviacin estndar obtenidos.

171
IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria

Teniendo en cuenta todas las muestras (dos variedades y tres vendimias), los
valores medios de CE oscilaron entre 6,16 g/l para S0d (despus de la
fermentacin alcohlica) y 120 g/l para S28 (despus de 28 meses de
crianza).

Estudios previos han demostrado la existencia de cantidades variables de CE


en diferentes bebidas alcohlicas (Hasnip et al., 2004; Uthurry et al., 2004;
Weber y Sharypov, 2009; Alberts et al., 2011). En vinos sudafricanos, Alberts et
al., (2011) hallaron valores que oscilaron entre 1,8 y 31 g/l, mientras que para
vinos fortificados estos valores variaron entre 2,8 y 79 g/l. En ambos casos,
se encontr una relacin clara y positiva entre el contenido de CE y la edad del
vino.

172
Captulo IV. Resultados y Discusin

Factor Media (g/l) DS

2008 2009 2010


Vendimia
49,437,8a 43,025,6a 33,724,3b

Variedad Moscatel Pedro Ximnez


de uva 54,444,9a 29,723,9b

Tiempo de S0d S20d S40d S2 S4 S7 S8 S12 S18 S28


envejcimiento 6,1617,22a 19,813,5a 32,914,5a,b 39,319,1a,b 55,522,3b,c 51,727,6b,d 73,624,2c,e 67,230,7c,d 97,735,7e,f 11937f

E1 E2 E3 E4 E5
Vinificacin
50,630,2a 80,539,0b 11150c 43,633,9d 47.832,5a

Tipo de Botas de roble Depsitos de acero inox


envejcimiento 57,442,7a 47,330,1b

Tabla 29. Valores medios de CE y desviaciones estndar para cada factor considerado. En cada fila, diferentes superndices indican diferencias
significativas a p < 0,01 (Test de Tukey).

173
IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria

A fin de estudiar las posibles diferencias significativas entre los distintos


valores obtenidos, los datos fueron sometidos al anlisis de la varianza (Tabla
29 y 30). Para este anlisis, se consideraron los mismos cinco factores
independientes ya mencionados anteriormente concluyndose que todos ellos
influyeron de manera significativa sobre contenido de CE (p < 0,01) (Tabla
30).

Factores F valor P valor


Vendimia 11,05 0,0000*
Variedad de uva 61,31 0,0000*
Tiempo de envejecimiento 123,1 0,0000*
Vinificacin 77,21 0,0000*
Tipo de envejecimiento 54,23 0,0000*
*Factores significantes parar p valor < 0,01.

Tabla 30. Anlisis de la varianza para la concentracin de carbamato de etilo de los diferentes
vinos obtenidos.

Los resultados obtenidos del estudio de comparacin de medias mediante la


prueba de Tukey (p < 0,01) para todos los factores significativos se muestran
en la Tabla 29. La concentracin de CE en los vinos aument durante el
tiempo de envejecimiento, con diferencias ms acusadas tras cuatro meses de
crianza (Tabla 29).

Como ya se ha mencionado, este hallazgo fue descrito previamente por varios


autores (Hasnip et al., 2004; Uthurry et al., 2004; Weber y Sharypov, 2009;
Alberts et al., 2011). En dichos estudios, se demostr que la formacin de CE
a partir de la reaccin de sus precursores (urea y citrulina) con etanol durante
el almacenamiento est favorecida por las altas temperaturas. En nuestros
ensayos, los vinos contenan un grado alcohlico de 17-18% (v/v) y se
envejecieron a temperatura ambiente (<30 C).

174
Captulo IV. Resultados y Discusin

En cuanto a la variedad de uva, el vino elaborado con Pedro Ximnez


present valores ms bajos que los hallados para Moscatel (Tablas 29 y 30). La
proporcin de prolina y arginina juega un rol importante en la determinacin
de la predisposicin de una variedad para producir urea (Bell y Henschke,
2005). Ough et al., (1990) observaron que Cabernet Sauvignon, con un mayor
contenido de prolina que arginina, produca una concentracin relativamente
baja de urea. Otras variedades tales como Sauvignon Blanc y Traminer tienden
a tener una relacin ms baja de prolina/arginina (Bell y Henschke, 2005), y
sto aument su potencial para la formacin de CE. En los vinos elaborados
con Chardonnay, Moscatel Blanco y Moscatel de Alejandra, Soufleros et al.,
(2003) encontraron una elevada concentracin de aminocidos, siendo la
arginina el aminocido ms abundante. Los datos sobre el perfil de
aminocidos de la variedad Pedro Ximnez son escasos: Mauricio et al., (2001)
hallaron en mostos de Pedro Ximnez contenidos ms altos de L-prolina que
de L-arginina (38,2 y 25,2%, respectivamente, del total de aminocidos libres).
Estos valores podran explicar la menor concentracin de CE encontrado en
nuestro estudio para esta variedad.

La vendimia 2010 mostr un menor contenido en CE que 2009 y 2008.


Martnez-Pinilla et al., (2013) observaron una clara influencia del factor
vendimia en el contenido de aminocidos de varios vinos tintos varietales, y
obtuvieron una clara separacin de los vinos segn la vendimia de acuerdo a
dicha concentracin. Las condiciones climticas parecen tener un claro efecto
sobre el contenido de aminocidos en mostos de uva (OrtegaHeras et al.,
2014), y por tanto, una influencia significativa en el contenido de CE de los
vinos. En la DO Jerez-Xrs-Sherry, las precipitaciones totales entre enero y
octubre para las vendimias 2008, 2009 y 2010 fueron 343, 275 y 601 l/m2,
respectivamente (MAGRAMA, 2015a). Para la variedad Verdejo, Ortega

175
IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria

Heras et al., (2014) observaron que un ao ms clido y seco, con bajas


precipitaciones, produca uvas con un mayor contenido de aminocidos. Por
tanto, los valores de precipitaciones, notablemente superiores para la cosecha
2010, podran explicar el menor contenido de carbamato de etilo encontrado
para los vinos correspondientes a esta vendimia; aunque para confirmar este
hecho, sera necesario realizar un estudio en mayor profundidad.

Respecto a la influencia del tipo de vinificacin (experimentos E1-E5), el


contenido ms bajo de CE correspondi a E4 mientras que el valor ms alto
correspondi a E3 (Tablas 28 y 29).

El experimento E4, fermentado con S. bayanus, fue el nico que se llev a cabo
a baja temperatura (10 C) sin uso de nutrientes ni enzimas pectolticas. Ough
et al. (1991) observaron que el empleo de bajas temperaturas durante la
fermentacin alcohlica produca vinos con menor contenido en urea; adems,
varios autores (Daudt et al., 1995; Balcerek y Szopa, 2006; Uthurry et al., 2006)
describieron anteriormente la baja capacidad de S. bayanus para la produccin
de CE. Por otra parte, varios estudios han demostrado que el uso de enzimas
pectolticas en los procesos de maceracin pelicular modifica la composicin
de los mostos, aumentando la concentracin de aminocidos (Kishkovskii et
al., 1974; Aldave, 1992; Bosso y Ponzetto, 1994). Esta conclusin coincide con
el elevado contenido en CE encontrado en el experimento E3, macerado con
enzimas pectolticas y fermentada con S. cerevisiae a temperatura ambiente (
30C). Tanto el experimento E3, fermentado con S. cerevisiae como el
experimento E5, fermentado con S. bayanus, se realizaron bajo las mismas
condiciones de vinificacin. La diferencia encontrada entre el contenido de
carbamato de etilo de estos dos experimentos revela la importante influencia
de la cepa de levadura sobre el contenido en este compuesto.

176
Captulo IV. Resultados y Discusin

Los experimentos E1 y E2 se fermentaron bajo las mismas condiciones, pero


en el caso de E2, para los que se encontr un mayor contenido de CE, se
aadieron nutrientes. Varios estudios previos han demostrado que el uso de
fosfato de diamonio posee una influencia positiva sobre el contenido de CE
del vino obtenido (Henschke y Ough, 1991; Shinohara y Yanagida, 1999;
Adams y van Vuuren, 2010).

Los resultados obtenidos del estudio de vinificacin bajo diferentes


condiciones, como se describe para cada uno de los experimentos, muestran
que el empleo de S. bayanus en lugar de S. cerevisiae redujo significativamente el
contenido de CE, y que tanto el uso de nutrientes como la maceracin
pelicular con enzimas pectolticas increment el contenido en CE.

Por ltimo, en relacin con el efecto del tipo de envejecimiento, como puede
verse en las Tablas 29 y 30, los valores significativamente ms altos de
carbamato de etilo se obtuvieron para los vinos envejecidos en barricas de
roble. Esta diferencia significativa podra explicarse sobre la base de las
posibles modificaciones microbiolgicas favorecidas por la baja aireacin que
tiene lugar a travs de los poros de la barrica de roble (Blouin y Peynaud,
2005). Esto podra aumentar algunos de los precursores de CE para los vinos
envejecidos en madera (Liu et al., 1994). Dependiendo de la cepa bacteriana,
citrulina y fosfato de carbamilo pueden formarse a partir de arginina y su
posterior reaccin con etanol, durante un perodo concreto de tiempo y bajo
una temperatura dada, conduce a la formacin de CE. Los datos sobre el
contenido de cidos orgnicos (cido mlico, cido lctico y cido actico)
fueron sometidos a un anlisis de varianza considerando "tipo de
envejecimiento" como variable independiente (ver IV.I.3.4. cidos Orgnicos.
Influencia del sistema de envejecimiento). Para todos estos cidos, se encontraron

177
IV.I. Parmetros relacionados con la seguridad alimentaria

diferencias significativas entre el envejecimiento en barrica de roble y la crianza


en acero inoxidable. En este sentido, se detectaron concentraciones de cido
actico y lctico inferiores en aquellas muestras envejecidas en acero inoxidable
(ver IV.I.3.4.). Adems, en el estudio sobre el contenido voltil de estos vinos,
que se detallar posteriormente en la seccin IV.II.2. Compuestos voltiles
ciertos steres etlicos mostraron valores significativamente ms altos para los
vinos envejecidos en barricas de roble. Todos estos hechos sugieren que, en el
caso de la crianza en madera, podran haber tenido lugar posibles actividades
microbiolgicas que explicaran el mayor contenido en CE observado para los
vinos envejecidos en barrica.

IV.I.4.2. Anlisis de conglomerados (AC)

La matriz de datos fue sometida a un anlisis de conglomerados con


aglomeracin jerrquica de los casos, tomando la distancia eucldea al cuadrado
como mtrica y el mtodo de Ward como criterio de enlace. El dendrograma
obtenido se muestra en la Figura 42.(a). En l pueden distinguirse dos grupos
principales; un conglomerado que incluye principalmente las muestras de la
variedad Moscatel correspondiente a los experimentos E1, E2 y E3
envejecidos en madera de roble durante 12 meses o ms (S12, S18 y S28) y
otro para el resto de las muestras (Figura 42.(b)).

En el primero, se encuentran las muestras con los valores ms altos de CE


mientras que en el segundo se encuentran incluidas las muestras iniciales (S0d,
S20d y S40d) junto con las muestras envejecidas durante perodos cortos de
tiempo (S2, S4, S7 y S8), todos ellos con un menor contenido de CE.

Por lo tanto, los clusters formados reflejan principalmente las diferencias


debidas al tiempo de envejecimiento.

178
Captulo IV. Resultados y Discusin

Figura 42. (a); AC vinos Moscatel (M) y Pedro Ximnez (PX), vendimias 2008, 2009 y 2010 y envejecidas en barricas de roble (C) y en depsitos de
acero inoxidable (S). Muestreos; S0d: inicial; S20d, S40d: 20 y 40 das; S2, S4, S7, S8, S12, S18 y S28: 2,4, 7, 8, 12, 18 y 28 meses respectivamente. (b);
Ampliacin del rea indicada.

179
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

IV.II. PARMETROS DE INTERS EN LA CALIDAD


ORGANOLPTICA DE VINOS DULCES

IV.II.1. COMPUESTOS POLIFENLICOS

IV.II.1.1. COMPUESTOS POLIFENLICOS Y FURNICOS EN


VINOS DULCES MOSCATEL. INFLUENCIA DE LA VINIFICACIN
Y EL ENVEJECIMIENTO

En este estudio, se analizaron en total 19 compuestos, de los cuales fueron


doce polifenoles identificados y otros cuatro no identificados as como tres
aldehdos furnicos en los diferentes vinos Moscatel elaborados durante la
vendimia 2008 (Tabla 31 y Figura 43). Como ya se describi en el captulo
anterior, todos los mostos se obtuvieron a partir de uvas secadas en cmara
climtica (40C y 10% HR) y se vinificaron empleando diferentes condiciones.
Se realiz un seguimiento peridico de la etapa de envejecimiento durante 28
meses (S20d, 20 das; S40d, 40 das; S3, 3 meses; S5, 5 meses; S9, 9 meses;
S12, 12 meses; S18, 18 meses y S28, 28 meses) que abord tanto la
permanencia en bota como el uso de acero inoxidable slo y/o con chips.

IV.II.1.1.1. Anlisis de Varianza (ANOVA)

El estudio ANOVA para cada uno de los compuestos polifenlicos


estudiados, demostr diferencias significativas (p < 0,05) para la mayora de
ellos en funcin de los tres factores considerados: vinificacin, tipo de
envejecimiento y tiempo de envejecimiento. En la Tabla 31, se muestran

180
Captulo IV. Resultados y Discusin

los valores medios para cada vinificacin (E1-E5), as como los valores-p para
cada factor.

Figura 43. Cromatograma, 280 nm. Identificacin de los picos: 1: cido glico, 2: 5-
hydroximetilfurfural, 3: cido protocatquico, 4: a.caftrico 5: furfural, 6: cido cis/trans p-
cutrico, 7: tirosol, 8: compuesto b, 9: compuesto a, 10: compuesto c, 11: metilfurfural, 12:
siringaldehido.

Respecto al factor vinificacin, todos los compuestos analizados, se vieron


afectados en mayor o menor medida por las diferentes tcnicas empleadas.
Por una parte, se observ un mayor contenido de cido glico y galato de etilo
en los vinos de la experiencia 3 (S. cerevisiae a temperatura ambiente con
maceracin prefermentativa). Asimismo, estos vinos junto a los obtenidos en
el ensayo E2 (S. cerevisiae a temperatura ambiente con adicin de nutrientes)
mostraron contenidos ms elevados de cido p-cumrico y caftrico. Tambin
fueron significativos las menores concentraciones halladas de cido cafeico y
tirosol en las vinificaciones E1 y E4, (ambas sin maceracin con enzimas
pectolticas ni nutrientes). Todo ello parece indicar que tanto la adicin de
nutrientes como la maceracin con enzimas pectolticas, influyen en el

181
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

contenido polifenlico del vino final. En este sentido, Darias-Martn et al.,


(2000) observaron tambin un aumento de compuestos tanto flavonoides
como no flavonoides en vinos blancos que haban sido sometidos a una etapa
prefermentativa de contacto con los hollejos. Adems, el empleo de enzimas
pectolticas, aumenta el contenido de cidos hidroxicinmicos libres (Lao et al.,
1997), lo que explicara el mayor contenido de cido cafeico en los vinos con
maceracin.

Los vinos de las experiencias E4 y E5, fermentados con S. Bayanus mostraron


un menor contenido de los cidos caftrico y cutrico, as como del
compuesto c. No se han encontrado referencias bibliogrficas sobre la
influencia de dicha levadura en compuestos polifenlicos de tipo no
flavonoide. Hayasaka et al., (2007) observaron, en estudios de vinificacin con
S. cerevisiae y S. Bayanus de vinos tintos de Cabernet Sauvignon, un menor
contenido de antocianos en los vinos elaborados con S. Bayanus, lo que parece
indicar, como era de esperar, que el tipo de levadura empleada condiciona el
contenido polifenlico del vino final.

Respecto al tipo de envejecimiento (en botas de roble, acero inoxidable slo o


con chips) se observ una tendencia general, con contenidos ms elevados
para aquellos vinos envejecidos en botas. Los ensayos de envejecimiento
acelerado con chips mostraron un comportamiento similar al hallado para los
vinos que permanecieron en tanques de acero inoxidable. Especficamente, en
aquellos vinos envejecidos en botas de roble se encontraron valores
estadsticamente superiores para todos los derivados hidroxibenzoicos a
excepcin del cido protocatquico. En lo referente a los compuestos
hidroxicinmicos, cabe destacar el incremento de los steres con el tartrico,
caftrico y cis/trans p-cutrico y del cido p-cumrico, al igual que los

182
Captulo IV. Resultados y Discusin

aldehdos furnicos (5-hidroximetilfuraldehido, 5-metilfuraldehido y 2-


furaldehdo) y tirosol.

Por ltimo, la evolucin temporal de los vinos durante la etapa de


envejecimiento, mostr un incremento significativo del contenido en
polifenoles, tanto hidroxibenzoicos como hidroxicinmicos, y furfurales, a
excepcin del cido caftrico y compuesto d. Un gran nmero de los
compuestos citados, como cido glico, los aldehdos benzoicos (vainillina y
siringaldehdo), y los aldehdos furnicos son cedidos por la madera durante el
proceso de envejecimiento (Andrade et al., 1998; Garca Moreno y Barroso,
2002; Schwarz et al., 2012). Andrade et al., (1998) afirmaron que el aumento
significativo de tirosol durante la etapa de envejecimiento, podra estar causado
por reaccin de sustratos no-polifenlicos como ocurre con otros alcoholes
superiores.

183
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

Tabla 31. Valores medios, mg/l desviaciones estndar para los distintos ensayos de vinificacin. * Diferencias significativas a p < 0,05). Diferentes
letras para la misma fila indican diferencias significativas (Test de Tukey).

Compuesto polifenlico Ensayos de vinificacin p


Tipo de Tiempo de
E1 E2 E3 E4 E5 Vinif.
envej. envej.
cidos hidroxibenzoicos y derivados
cido Galico 1,511,80b 1,631,83b 5,471,84c 1,111,30a 3,260,85b 0,0000* 0,0000* 0,0000*
Galato de etilo 1,630,49a 2,070,75b 2,750,41c 1,830,51a 2,000,50a,b 0,0000* 0,0000* 0,0000*
. protocatequico 3,221,97a 5,342,32a 6,462,85a 5,007,57a 4,372,28a 0,0159* 0,1647 0,0000*
Vanillina 1,251,17a,b 1,571,71b 2,321,13a,b 1,301,02a 2,171,23a,b 0,0001* 0,0000* 0,0000*
Siringialdehdo 2,612,95b 3,734,20c 4,402,30a,b 2,482,22a 4,352,66a,b 0,0000* 0,0000* 0,0000*
cidos hidroxicinmicos y derivados
. cafeico 0,4000,220a 0,9510,401b 1,070,51b 0,3580,193a 1,280,60c 0,0000* 0,0001* 0,0000*
. caftarico 3,811,66c 6,841,64d 6,871,48d 1,570,62a 3,190,18b 0,0000* 0,0000* 0,0000*
Cafeato de etilo 0,0750,143a 0,3330,177b,c 0,4230,243c 0,0470,095a 0,2970,093b 0,0000* 0,0123* 0,0000*
. p-cumarico 0,1010,255a 0,2860,295b 0,3690,472b 0,0730,148a 0,1550,240a 0,0000* 0,0001* 0,0000*
cis/trans p-cutarico 2,890,73c 4,310,61d 3,360,39c 2,390,41b 1,950,35a 0,0000* 0,0000* 0,0000*
cumarato de etilo 0,0170,045a,b 0,0670,091c 0,042100b,c 0,0060,019a 0,0170,041a,b 0,0000* 0,3504 0,0000*
Aldehdos furnicos
5-hidroximetilfuraldehdo 5,163,22b 6,173,82b 6,333,50b 8,086,66c 4,252,13a 0,0000* 0,0000* 0,0000*
2-furaldehdo 2,952,17b 3,953,03c 4,601,88b 2,451,53a 5,242,12b,c 0,0000* 0,0000* 0,0000*

184
Captulo IV. Resultados y Discusin

Compuesto polifenlico Ensayos de vinificacin p


Tipo de Tiempo de
E1 E2 E3 E4 E5 Vinif.
envej. envej.
5-metilfuraldehdo 0,3990,287c 0,4810,360c 0,4730,149a,b 0,3080,167a 0,5930,163b,c 0,0000* 0,0000* 0,0000*
Varios
Tirosol 8,511,47a 11,41,81b 14,30,81c 9,111,07a 13,90,96c 0,0000* 0,0000* 0,0000*
a 1,730,24b 2,200,31c 2,340,43c 1,470,25a 1,320,14a 0,0000* 0,0000* 0,0003*
b 3,302,13a 6,454,18c 8,764,94d 5,403,83b 3,182,03a 0,0000* 0,0003* 0,0000*
c 0,6020,071c 0,8320,159d 0,5720,085b,c 0,4190,099a 0,5360,095b 0,0000* 0,0000* 0,0000*
d 1,780,69a 2,320,84b 3,000,59c 2,79+0,51c 2,790,66b,c 0,0000* 0,4447 0,0001*

185
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

IV.II.1.1.2. Anlisis de componentes principales (ACP)

El anlisis de componentes principales, permite evaluar las posibles


correlaciones existentes entre los compuestos cosiderados al tiempo que se
busca explicar la mxima variabilidad entre las muestras con un menor nmero
de variables. En total se extrajeron cinco componentes principales que
explicaban el 87,05% de la varianza total.

Atendiendo a las dos primeras componentes principales, que explican el


62,28% de la variabilidad, se observa que los polifenoles con un mayor peso en
la CP1 fueron cido glico, galato de etilo, vainillina, siringaldehdo, cido
cafeico, cido p-cumrico, cafeato de etilo y 2-furaldehdo, mientras que para
la CP2 fueron cido caftrico, cido cis/trans p-cutrico, compuesto a,
compuesto c y 5-hidroximetilfuraldehido, ste ltimo con signo negativo.
Como puede apreciarse, son varios los polifenoles considerados que muestran
un importante peso (positivo) sobre el CP1 y que bibliogrficamente han
demostrado verse incrementados con el envejecimiento en madera (Garca
Moreno y Barroso, 2002; Schwarz et al., 2012).

Cuando se representan la muestras estudiadas en el plano delimitado por los


dos primero CPs (Figura 44), se observa como es el CP1 el que separa las
muestras envejecidas en madera (1) de aquellas que no han gozado de este tipo
de envejecimiento (2, acero y 3, chips). Las muestras correspondientes a
envejecimiento en madera presentan valores positivos para CP1, presentando
aquellas sometidas a envejecimiento en acero con o sin chips, valores
negativos para este CP.

Considerando tanto la distribucin de las muestras en el plano delimitado por


los dos primeros CPs como los pesos de los compuestos polifenlicos en los

186
Captulo IV. Resultados y Discusin

mismos, podemos concluir, tal y como cabra esperar, que el envejecimiento en


madera aporta un mayor contenido en compuestos directamente relacionados
con su composicin: vanillina, siringialdehido, cido glico, 2-furaldehdo,
principalmente.

Figura 44. ACP por tipo de envejecimiento. 1: Barricas de roble, 2: Depsitos de Acero, 3: Con
chips.

Si representamos las muestras sobre el plano definido por CP1 y CP2


atendiendo al tiempo de envejecimiento (Figura 45), podemos ver como al
aumentar el tiempo de envejecimiento, stas se van situando sobre valores
cada vez ms positivos de la CP1.

187
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

Figura 45. ACP por tiempo de envejecimiento. 1: 20 das, 2: 40 das; 3, 5,9,12,18 y 28 meses.

IV.II.1.2. ESTUDIO DEL CONTENIDO POLIFENLICO DE VINOS


DULCES ANDALUCES. INFLUENCIA DE LA UVA DE PARTIDA
(VARIEDAD, VENDIMIA Y SECADO) Y DEL ENVEJECIMIENTO

En este trabajo, se realiz el seguimiento del contenido polifenlico y en


furfurales de los vinos dulces Moscatel y Pedro Ximnez de las vendimias
2009 y 2010 (Tabla 32). Los muestreos fueron realizados de forma peridica al
inicio de la etapa de envejecimiento y hasta completar los 12 meses de
permanencia en bota (S0, 0 das; S1, 30 das; S7, siete meses; y S12, meses).

En total fueron identificados doce polifenoles y tres aldehdos furnicos que


haban sido descritos previamente en productos enolgicos de Jerez (Alonso
et al., 2004; Schwarz et al., 2009; Schwarz et al., 2012) y en vinos blancos.
(Boselli et al., 2006). Asimismo, se incluyeron en el anlisis cuatro compuestos
fenlicos no identificados.

188
Captulo IV. Resultados y Discusin

IV.II.1.2.1. Anlisis de la Varianza (ANOVA)

El anlisis ANOVA para cada uno de los compuestos estudiados, mostr


diferencias significativas (p < 0,05) en la mayora de ellos en funcin de los
factores considerados: variedad, vendimia, secado y tiempo de
envejecimiento. En la Tabla 32, se muestran los valores medios para
variedad y secado, as como los p-valores para cada factor considerado.

En relacin a la variedad de uva, en trminos generales, se observ un mayor


contenido polifenlico en la variedad Pedro Ximnez. En este sentido, tirosol
y los cidos hidroxicinmicos, cafeico y cutrico, as como sus steres,
caftrico, cis/trans p-cutrico y cafeato de etilo tambin presentaron unas
concentraciones significativamente mayores para dicha variedad. Mayen et al
(1996), observaron en estudios de pardeamientos de vinos de variedad Pedro
Ximnez y Baladi, una diferenciacin de los vinos en funcin de la variedad,
con mayor contenido de cido caftrico y cutrico en los vinos Pedro
Ximnez. Respecto a los compuestos furnicos, no se observaron diferencias
en el contenido de 5-hidroximetilfuraldehdo y 2-furaldehdo para ambas
variedades, Moscatel y Pedro Ximnez, sin embargo, el contenido en 5-
metilfuraldehdo fue mayor en la variedad Pedro Ximnez. Estos datos
coinciden con los resultados descritos por Mrquez et al., (2007), en el que se
evalu el contenido en 2-furaldehdo y 5-metilfuraldehdo junto a otros
compuestos voltiles en vinos dulces andaluces de las variedades Moscatel y
Pedro Ximnez, observndose la misma tendencia que en nuestro estudio para
ambos compuestos.

El sistema de secado de la uva, en cmara climtica o mediante asoleo


tradicional, mostr una especial influencia en los cidos hidroxibenzoicos y
derivados (cido glico, cido protocatquico, galato de etilo, vainillina y

189
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

siringaldehdo), con concentraciones mayores en los vinos de uvas secadas en


cmara climtica. sta misma tendencia se observ para los steres tartricos
de los cidos hidroxicinmicos, caftrico y cis/trans p-cutrico, as como para
tirosol y los compuestos no identificados compuesto a y compuesto c.

Aunque el factor vendimia fue el menos influyente de todos los evaluados,


para los vinos de la vendimia 2009 se observaron mayores concentraciones
de varios de los compuestos analizados; galato de etilo, protocatquico,
siringaldehdo, cis/trans p-cutrico, tirosol, compuesto a, compuesto b y
compuesto c (datos no mostrados). Como es sabido, tirosol se forma a
partir de tirosina durante el proceso fermentativo, por lo que el contenido en
dicho aminocido en la uva de partida, puede tener relacin con las diferencias
halladas. Diversos autores apuntan a que el ao de vendimia (Martnez-Pinilla
et al., 2013), y ms concretamente, las condiciones climticas de dicho periodo
(OrtegaHeras et al., 2014), afectan al perfil de aminocidos de la uva. En este
sentido, aos ms clidos y secos favorecen el aumento del contenido en
aminocidos, por lo que elevados contenidos en tirosol podran deberse, en
parte, a este factor. De las dos vendimias estudiadas, en el marco de Jerez, el
ao 2009 se caracteriz por valores de precipitaciones totales inferiores a los
estimados en 2010, 275 frente a 601 l/m2 respectivamente durante los meses
de enero a octubre (MAGRAMA, 2015a), lo que podra haber favorecido un
mayor contenido en aminocidos que explicara las mayores concentraciones
de tirosol halladas en los vinos de la vendimia 2009.

Por ltimo, el tiempo de envejecimiento aument el contenido de todos los


compuestos polifenlicos y de tipo furnico considerados, a excepcin de los
steres tartricos hidroxicinmicos, cftarico y cis/trans p-cutrico, cuyas
evoluciones temporales no mostraron diferencias significativas. Schwarz et al.,

190
Captulo IV. Resultados y Discusin

(2012), observaron en vinos de Jerez envejecidos por el sistema esttico de


aadas, un aumento significativo de las concentraciones de ciertos compuestos
polifenlicos y furnicos, destacando 5-hidroximetilfurfuraldehido, 2-
furfuraldehdo, cido protocatquico, tirosol, p-cumrico y siringaldehdo.

191
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

Tabla 32. Valores medios (mg/l) desviaciones estndar para variedad y tipo de secado. Valores p para cada uno de los factores considerados
(* p < 0.05)

Compuestos
Variedad Tipo de secado p
polifenlicos
Cmara Tiempo
P.X. Moscatel Asoleo Variedad Vendimia Secado
climtica de envejec.
cidos hidroxibenzoicos y derivados
cido glico 4,424,46 2,713,53 4,504,39 3,023,93 0,0002* 0,4028 0,0020* 0,0000*
Galato de etilo 4,431,19 2,360,91 4,151,28 3,281,57 0,0000* 0,0061* 0,0000* 0,0000*
cido protocatquico 9,065,52 2,782,11 9,046,11 4,383,16 0,0000* 0,0000* 0,0000* 0,0000*
Vainillina 1,601,55 1,892,14 1,891,85 1,411,59 0,0044* 0,8238 0,0039* 0,0000*
Siringaldehdo 3,523,18 3,373,49 3,863,40 2,923,00 0,6422 0,0070* 0,0347* 0,0000*
cidos hidroxicinmicos y derivados
cido cafeico 0,5700,505 0,3190,504 0,4810,450 0,5070,601 0,0042* 0,1649 0,5812 0,0000*
cido caftrico 5,655,90 0,5190,481 5,254,26 2,366,44 0,0000* 0,7720 0,0022* 0,0780
Cafeato de etilo 0,1860,247 0,0680,140 0,1360,185 0,1680,274 0,0001* 0,8953 0,4184 0,0000*
cido cumrico 0,3100,401 0,1720,250 0,2650,345 0,2700,396 0,0005* 0,4235 0,6613 0,0000*
cido cis/trans p-cutrico 4,973,68 0,3120,177 4,893,72 1,602,85 0,0000* 0,0455* 0,0000* 0,1256
Cumarato de etilo 0,0640,125 0,0420,085 0,0510,088 0,0660,144 0,2811 0,3892 0,1302 0,0000*
Aldehdos furnicos
5-hidroximetilfuraldehdo 6,066,27 6,948,98 6,727,43 5,786,89 0,1348 0,2808 0,9716 0,0000*
2-furaldehdo 6,094,63 5,634,91 6,314,65 5,444,77 0,7874 0,5309 0,3665 0,0000*

192
Captulo IV. Resultados y Discusin

Compuestos
Variedad Tipo de secado p
polifenlicos
Cmara Tiempo
P.X. Moscatel Asoleo Variedad Vendimia Secado
climtica de envejec.
5-metilfuraldehdo 0,7880,462 0,5530,474 0,7430,471 0,6760,486 0,0006* 0,0918 0,7520 0,0000*
Varios
tirosol 11,796,77 4,442,12 11,767,58 6,313,07 0,0000* 0,0003* 0,0000* 0,0001*
a 2,351,25 0,6030,308 2,341,34 1,050,86 0,0000* 0,0000* 0,0000* 0,0000*
b 3,022,54 3,423,69 3,663,19 2,432,39 0,0206 0,0001* 0,0503 0,0000*
c 0,6310,372 0,2990,159 0,6450,416 0,3610,124 0,0000* 0,0010* 0,0000* 0,0000*
d 7,243,07 3,711,79 6,323,17 5,883,22 0,0000* 0,1598 0,1755 0,0000*

193
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

IV.II.1.2.2. Anlisis de componentes principales

Cuando la matriz de datos se someti a este tipo de anlisis, se obtuvieron 3


componentes principales (CPs) que explicaban el 83,46% de la variabilidad
existente entre las muestras (autovalor > 1).

Como puede observarse en la Figura 46, el primer componente principal, que


explicaba el 58% de la varianza, est relacionado con el envejecimiento en
madera. Aquellos vinos con un tiempo ms prolongado de envejecimiento
presentaron valores ms elevados de la CP1, en el que el mayor peso lo
desempeaban compuestos tales como cido glico, 5-metilfuraldehido, 2-
furaldehdo, p-cumrico y siringaldehdo, que son caractersticos de la etapa de
envejecimiento en madera (Garca Moreno y Barroso, 2002; Schwarz et al.,
2012).

Figura 46. ACP de vinos v.2009 y 2010. (0, 1, 3, 7 y 12 meses de envejecimiento).

194
Captulo IV. Resultados y Discusin

En resumen, aunque el estudio individualizado de cada uno de los compuestos


mediante anlisis de la varianza, mostr que todos los factores considerados
(variedad, vendimia, tipo de secado, tiempo de envejecimiento) tenan cierta
influencia en el perfil polifenlico y de compuestos tipo furfural de los vinos
estudiados, en el anlisis de componentes principales, se pudo observar una
distribucin de las muestras, acorde al tiempo de envejecimiento, siendo ste,
por tanto, el factor con un mayor peso de todos los evaluados.

IV.II.1.3. IDENTIFICACION DE COMPUESTOS POLIFENLICOS


POR HPLC-DAD-MS/MS Y SU RELACIN CON LA CAPACIDAD
ANTIOXIDANTE

Con motivo de una estancia de investigacin realizada en la Facultad de


Farmacia de la Universidad de Lisboa (Portugal), se llev a cabo la
identificacin de compuestos polifenlicos por HPLC-DAD-MS/MS en una
seleccin representativa de muestras. Asimismo, se evalu la actividad
antioxidante de cada una de ellas por mtodos in-vitro y su posible relacin
con el perfil polifenlico junto a otros ndices globales, ndice de polifenoles
totales (IPT), ndice de flavonoides totales (IFT), el rea cromatogrfica total a
280 nm y 360 nm (A280 y A360) y la suma de reas de cada uno de los picos
obtenidos en el detector electroqumico (AED). Las muestras seleccionadas
fueron vinos de las tres vendimias (2008, 2009 y 2010), de uvas variedad
Moscatel y Pedro Ximnez secadas tanto en cmara climtica como asoleo
tradicional. Para los vinos de la vendimia 2008, se seleccionaron los muestreos
de 40 das, 3, 7 y 28 meses de envejecimiento (botas, chips y acero inoxidable)
mientras que para las vendimias 2009 y 2010, estos correspondieron al inicio (0
das) y tras 7 meses de envejecimiento en bota.

195
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

IV.II.1.3.1. Identificacin de compuestos polifenlicos por HPLC-DAD-


MS/MS

Diseo del mtodo MRM (Monitorizacin de Mltiples Reacciones)

Antes de proceder al anlisis de las muestras en modo MRM, se requiere de un


estudio previo con objeto de identificar los compuestos presentes en las
mismas, as como sus fragmentaciones caractersticas.

Para ello, en primer lugar se realizaron extractos de muestras representativas,


seleccionadas para cubrir las variables de estudio (variedad, secado, vendimia,
tipo y tiempo de envejecimiento) siguiendo el mtodo descrito por Bravo et
al., (2006). Brevemente, diez mililitros de vino fueron extrados 4 veces con 7
ml de acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo fueron combinados y
evaporados hasta sequedad bajo vaco. El residuo fue redisuelto en 250 l de
metanol/agua (6:4, v/v) antes de su anlisis.

Posteriormente, se analizaron los extractos as como sus respectivas muestras


empleando distintos modos de funcionamiento del espectrmetro de masas:

Full Scan (Rango de masas completo). Permite evaluar las masas ms


caractersticas de los compuestos presentes en las muestras.

Estudio SIR (monitorizacin de iones seleccionados) de las masas ms


frecuentes detectadas en el modo full scan, as como en la
bibliografa consultada (Garca Moreno y Barroso, 2002; Monagas et
al., 2005; Bravo et al., 2006).

196
Captulo IV. Resultados y Discusin

Anlisis en modo Daughter Scan (espectro de iones hijo, producto)


para estudiar las fragmentaciones de los ion especficos y la energa de
colisin adecuada. (Entre 5 y 30 eV)

Asimismo, se realizaron ensayos MS/MS tras infusin directa de


compuestos polifenlicos individuales y el anlisis de mezclas de
patrones conocidos.

En base a los resultados obtenidos, se seleccionaron el conjunto de masas y


transiciones que compondran el mtodo de anlisis de todas las muestras en
modo MRM (Monitorizacin de mltiples reacciones). En total, se
seleccionaron 29 polifenoles que fueron identificados y estudiados con objeto
de evaluar la influencia de la etapa de envejecimiento en los mismos (Tabla
33).

TR MRM
Compuesto Polifenlico PM
(min) [M-H] > MS2
15,7 cido glico 170 169 > 125
19,2 Hidroxitirosol 154 153 >123
19,7 cido Protocatquico 154 153 > 109
20,6 cido Caftrico 312 311 > 179
21,9 cido 2-Furoico 112 111 > 67
23,2 Tirosol 138 137 > 119
23,7 cido p-cutarico 296 295 >163
24,3 cido p-Hidroxibenzoico 138 137 > 93
24,9 cido Gentsico 154 153 > 109
25,2 cido Fertrico 326 325 > 193
25,9 cido Cafeico 180 179 > 135
28,8 cido Dihidroxibenzoico 154 153 > 109
29,3 p-hidroxibenzaldehdo 122 121 > 92
31,9 Galato de etilo 198 197 > 169
34,2 Vainillina 152 151 > 136

197
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

TR MRM
Compuesto Polifenlico PM
(min) [M-H] > MS2
34,2 cido p-coumrico 164 163 > 119
35,5 trans-piceido 390 389 > 227
36,7 cido elgico 302 301 > 284
37,4 Quercetina-3-glucuronido 478 477 > 301
37,8 Quercetina-3-glucsido 464 463 > 301
Dihidroquercetina-3-O-
38,5 450 449 > 303
rhamnosido (astilbina)
40,1 Cafeoiltartrato de etilo 340 339 > 177
41,4 Quercetina-3-rhamnosido 448 447 > 301
41,6 cis-piceido 390 389 > 227
Dihidrokaempferol-3-O-
42,0 434 433 > 269
rhamnosido (engeletina)
44,1 Protocatecato de etilo 182 181 > 153
45,3 cido Saliclico 138 137 > 93
48,8 trans-cafeato de etilo 208 207 > 179
53,2 p-cumarato de etilo 192 191 > 163

Tabla 33. Polifenoles y fragmentaciones caractersticas evaluadas.

Anlisis de Componentes Principales (ACP)

Con el fin de identificar posibles patrones en nuestros datos, se llev a cabo un


anlisis de componentes principales (ACP). Se extrajeron un total de siete
componentes principales (CP) significantes de acuerdo al criterio Kraiser
(autovalor > 1). La Figura 47 muestra la distribucin de las muestras en el
plano definido por estos dos primeros CPs, que explican el 49,76% de la
variabilidad total de los compuestos polifenlicos. Como puede observarse,
CP2 divide los vinos dulces en dos grupos, vinos dulces Moscatel (m) y Pedro
Ximnex (px), con valores negativos para sta CP para estos ltimos.

198
Captulo IV. Resultados y Discusin

Los polifenoles con un mayor peso en la CP2 fueron cido p-hidroxibenzoico


y cido 2-furoico (con signo positivo) y quercetina-3-O-gluosido, quercetina-3-
glucuronido, cido trans/cis-p-cutrico, cido gentsico, cido
dihidroxibenzoico e hidroxitirosol (signo negativo).

Figura 47. ACP, vinos dulces Moscatel y PX.

Anlisis Lineal Discriminante

Para obtener las reglas de clasificacin adecuadas para la asignacin de


categoras a las muestras, se emplearon mtodos supervisados de
reconocimiento de modelos. El anlisis lineal discriminante por pasos hacia
adelante se llev a cabo de acuerdo con la estadstica lambda Wilks',
emplendose el mtodo "dejar uno fuera". En el caso de los vinos dulces
Moscatel de la vendimia 2008, de acuerdo con el tiempo de envejecimiento, las
variables incluidas en las funciones discriminantes obtenidas (citadas en
funcin de su poder discriminante) fueron: vainillina, cido glico, cido 2-
furoico y dihidroquercetina-3-o-rhamnosido. El diagrama de dispersin de las
muestras en el plano definido por las dos primeras funciones discriminantes se

199
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

muestran en la Figura 48. Como puede apreciase, se obtuvo una clara


separacin entre las muestras sin envejecimiento y muestras envejecidas
durante 28 meses. Aquellas muestras envejecidas por un breve periodo de
tiempo se distribuyen entre esos dos grupos. El 75,56% de las muestras fueron
clasificadas correctamente en el proceso de verificacin por el mtodo dejar
uno fuera.

Figura 48. ALD para "tiempo de envejecimiento". Vinos Moscatel.

Para el tipo de envejecimiento (en botas de roble, en acero o con chips), el


97,78% de las muestras fueron clasificadas correctamente (Figura 49). Las
variables incluidas en este caso fueron: protocatecato de etilo, cafeato de etilo,
cis/trans cido p-cumrico, cis/trans cido caftrico y dihidroquercitina-3-O-
rhamnosido.

200
Captulo IV. Resultados y Discusin

Figura 49. ALD para "tipo de envejecimiento". Vinos dulces Moscatel.

IV.II.1.3.2. Actividad antioxidante

En este estudio se analiz el uso de dos ensayos in-vitro, ORAC y HORAC,


para evaluar la actividad antioxidante (AA) de vinos dulces andaluces, as como
la interaccin entre ambos mtodos y el contenido polifenlico de las muestras
estudiadas.

Estudios de correlacin

Como puede apreciarse en la Figura 50, no se encontr correlacin entre los


valores ORAC y HORAC en las muestras analizadas (r=0,416). Como ya se
describi previamente, ambos ensayos miden la capacidad antioxidante desde
dos mecanismos de accin diferentes; por lo que es posible, como es nuestro
caso, que no exista correlacin entre ambos ensayos (Ou et al., 2001; Ou et al.,
2002a).

201
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

Figura 50. Correlacin ORAC/HORAC.

En la Tabla 34, se presentan los datos de correlacin de cada uno de los


ndices globales considerados, respecto a cada uno de los ensayos de actividad
antioxidante.

Correlacin Actividad Antioxidante vs ndices Globales


IPT IFT rea Total rea rea
(mg Eq. (mg Eq. 280nm Total Total
A.G./l) Cat/L) 360nm ED
ORAC
0,81* 0,77* 0,61* 0,71* 0,74*
(mol CAET/l)
HORAC
0,40* 0,38* 0,24 0,34* 0,43*
(mol CAE/l)

Tabla 34. Correlacin de los ndices globales con la actividad antioxidante *p < 0,05

Como puede apreciarse, ORAC se relaciona de manera significativa con todos


los indicadores globales considerados, con un coeficiente de correlacin mayor
de 0,6, mientras HORAC no lo hace con ninguno de ellos, alcanzando su
mayor r con AED (0,43). Estos resultados concuerdan con los obtenidos por
Feliciano et al., (2008) en los que se evaluaron diferentes tests para medir la

202
Captulo IV. Resultados y Discusin

actividad antioxidante en vinos Moscatel, siendo AA ORAC la que mayor


correlacin presentaban respecto al contenido polifenlico y flavonoide total.

Anlisis por Regresin Lineal Mltiple

Con el fin de obtener una posible expresin matemtica que nos indique la
capacidad antioxidante de estos vinos en funcin de los valores de los
indicadores individuales y globales de composicin polifenlica, se procedi al
anlisis por regresin lineal mltiple (RLM). Los datos incluidos en ambos
casos fueron los 29 compuestos polifenlicos recogidos en la Tabla 33, ndice
de polifenoles totales (IPT TPC), ndice de flavonoides totales (IFT TFC),
el rea cromatogrfica total a 280 nm y a 360 nm (A280 y A360) y la suma de
reas de cada uno de los picos obtenidos en el detector electroqumico (AED).

En el caso de la AA ORAC, la expresin matemtica obtenida por RLM (con


un buen ajuste, R2 ajustado de 0,876) relacion los valores ORAC con 12
compuestos polifenlicos (vainillina, trans/cis p-cutrico, galato de etilo,
quercetina-3-glucuronido, cido glico, cido elgico, p-hidroxibenzaldehdo,
trans-piceido, dihidrokaempferol-3-rhamnosido, protocatecato de etilo, cafeato
de etilo y quercetina-3-glucsido) y 4 ndices globales (IPT, IFT, A360, AED)
incluidos en la Figura 51. IFT fue el ndice que ms contribuy al clculo de la
actividad antioxidante ORAC. En este sentido, Liang et al., (2014) hallaron
tambin una elevada correlacin del IFT con los valores de AA ORAC, en
estudios de la actividad antioxidante y antiproliferativa en diversas variedades
de uva.

203
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

Figura 51. Regresin lineal mltiple ORAC

De la misma forma, para el test HORAC, la expresin matemtica obtenida


por RLM (con un R2 ajustado de 0,886) relacion la actividad antioxidante
medida por dicho mtodo con 13 compuestos polifenlicos e indicadores
(cido saliclico, cido fertrico, trans/cis cido caftrico, quercetina-3-
glucsido, cido gentsico, hidroxitirosol, trans y cis piceido, cido p-
hidroxibenzoico, cido elgico, dihidroquercitina-3rhamnosido, cido
protocatquico, p-hidroxibenzaldehdo) incluidos en la Figura 52. cido
saliclico fue el compuesto que ms contribuy al clculo de la actividad
antioxidante HORAC (AA HORAC), seguido del ster fertrico, ste ltimo
de manera inversa (signo negativo). El cido saliclico es uno de los
compuestos caractersticos que acta eliminando los radicales hidroxilo
(Zoecklein et al., 2000), por lo que parece lgico que sea uno de los polifenoles
ms influyentes en la AA HORAC que, recordemos, evala la capacidad de
absorcin de dichos radicales hidroxilo.

204
Captulo IV. Resultados y Discusin

Figura 52. Regresin lineal mltiple HORAC

Anlisis de Componentes Principales

A continuacin, se realiz un anlisis de componentes principales en el que se


extrajeron 8 CPs que explicaban el 82,93% de la varianza total. De ellos, los
dos primeros representaban el 48.5% de la variabilidad. Una rotacin
Quartimax normalizada de los CPs extrados consigui la distribucin de las
variables originales que se muestran en Figura 53.

205
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

CP2

CP1

Figura 53. Anlisis de componentes principales.

Atendiendo a CP1, ORAC se correlacion de manera significativa con los


compuestos cido glico, galato de etilo y p-OHbenzaldehdo, adems de con
los ndices globales IPT, IFT, A280, A360 y AED, tal como era previsible a partir
del estudio de correlaciones anterior. Segn la CP2, HORAC se relacion de
manera significativa solo con cido 2-furoico (de manera inversa), y con cido
saliclico (de manera directa).

De acuerdo a los resultados obtenidos, podemos afirmar que el mtodo


ORAC es el que proporciona una mayor correlacin con la composicin
polifenlica y flavonoide de los vinos dulces andaluces analizados. Adems, tal
y como indican Feliciano et al., (2008), mientras que el rea total
cromatogrfica a 280 nm debe ser empleada con cierta precaucin, ya que
pueden incluir compuestos que no intervienen en la capacidad antioxidante, el
rea total de los picos electroqumicos puede ser una herramienta til para
evaluar la actividad antioxidante.

206
Captulo IV. Resultados y Discusin

Relacin entre AA y factores como: variedad de uva, tipo de secado,


vendimia, tipo y tiempo de envejecimiento

Tanto los datos de AA ORAC como de AA HORAC fueron sometidos a


anlisis de la varianza a fin de establecer posibles influencias significativas entre
ambos valores de AA y factores tales como variedad de uva, tipo de secado,
vendimia, tipo y tiempo de envejecimiento.

En la Tabla 35 se muestran los resultados obtenidos, si bien debemos ser


cautos en cuanto a estos, ante el reducido nmero de muestras que pudieron
ser analizadas.

Factor ORAC HORAC


F p F p
Variedad 15,69 0,0005 7,11 0,0134
Vendimia 3,19 0,0582 17,84 0,0000
Tipo de secado 2,49 0,1032 2,73 0,0866
Tipo de fermentacin 4,91 0,0034 4,89 0,0029
Tipo de envejecimiento 0,0448 0,8340 0,2398 0,6287
Tiempo de envejecimiento 1,01 0,4243 3,62 0,0214

Tabla 35. Anlisis de la varianza de los valores de AA ORAC y HORAC.

Dado que el factor fermentacin se mostr como significativo sobre AA


ORAC y AA HORAC, los siguientes factores fueron estudiados considerando
solo las muestras elaboradas bajo las condiciones de fermentacin E4,
detalladas en captulos anteriores (S. bayanus y baja temperatura), y que
resultaron ser seleccionadas en 2008 para las vendimias 2009 y 2010.

Los vinos Pedro Ximnez presentaron mayores valores de AA ORAC. En el


caso de tipo de envejecimiento, aunque esta variable no se mostr significativa
para AA ORAC, el estudio pormenorizado de los datos revel un aumento de

207
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

sta para las muestras de la vendimia 2008 y 2009 sometidas a madera con
respecto a aquellos envejecidos en acero inoxidable, si bien para 2010 estas
diferencias entre ambos sistemas de envejecimiento no fueron significativas.
En el caso del envejecimiento con chips, ste se mostr con valores similares
de AA ORAC a los obtenidos para aquellas muestras envejecidas en bota,
observndose valores menores para los envejecidos en acero inoxidable.

En cuanto a vendimia, no se observaron diferencias significativas entre los


valores de AA ORAC para las tres vendimias estudiadas, 2008, 2009 y 2010, si
bien son las muestras correspondientes a 2008 las que muestran menores
valores de AA ORAC mientras que las correspondientes a 2009 presentan
valores ligeramente superiores a 2010.

Respecto a tiempo de envejecimiento, ste se mostr como no significativo


sobre AA ORAC, si bien un estudio pormenorizado de los datos revel que en
el caso de la variedad Moscatel, variedad de la que se dispone de ms datos, el
valor de AA ORAC experiment un ligero pero constante incremento a
medida que aument el tiempo de envejecimiento en madera, observndose
una tendencia inversa en el caso del envejecimiento en acero inoxidable.
Resultados similares fueron observados para el factor tipo de secado, no
encontrndose diferencias significativas cuando se evaluaron todas las
muestras. Sin embargo, en el estudio individualizado de cada variedad, se
observ que para Moscatel, la mayor AA ORAC corresponda con el secado
en cmara climtica seguido del asoleo en el CAIV. Para PX, el ordenamiento
decreciente puso igualmente en primera posicin al vino de cmara climtica,
luego el asoleo en via y por ltimo el pasificado en el CAIV. Para cada
sistema de secado, la AA de Moscatel fue menor que para Pedro Ximnez.

208
Captulo IV. Resultados y Discusin

Para AA HORAC, fue el tipo de fermentacin bajo las condiciones del ensayo
4 (S. Bayanus y baja temperatura) las que mostraron valores ms elevados. En
este caso, tambin se observ mayor AA HORAC en aquellos vinos
procedentes de la variedad Pedro Ximnez.

Respecto al ao de vendimia, los vinos procedentes de la vendimia de 2010


presentaron valores significativamente mayores de AA HORAC a los de 2009
y estos a los de 2008.

Para el factor tiempo de envejecimiento, aunque significativo sobre AA


HORAC, debemos aclarar que no todas las vendimias estudiadas y variedades
de uvas consideradas experimentaron el mismo comportamiento. Los vinos de
Pedro Ximnez experimentaron un claro incremento de AA HORAC al
aumentar el tiempo de envejecimiento, no observndose el mismo
comportamiento en los de Moscatel.

Por ltimo, al igual que ocurri en el caso de AA ORAC, los valores de AA


HORAC no se vieron significativamente afectados por el factor tipo de
secado.

En definitiva, podemos pues concluir que ambos valores de actividad


antioxidante se ven estadsticamente influenciados por el tipo de vinificacin y
variedad de uva, no observndose un claro efecto de los restantes factores
considerados si bien debemos ser cautelosos con los resultados obtenidos y
ampliar el nmero de muestras estudiadas a fin de corroborar estos resultados.

209
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

IV.II.2. COMPUESTOS VOLTILES

IV.II.2.1. ESTUDIO DEL CONTENIDO EN COMPUESTOS


VOLTILES DURANTE EL ENVECIMIENTO DE VINOS DULCES
MOSCATEL ELABORADOS BAJO DIFERENTES CONDICIONES
DE FERMENTACIN

En este estudio, se identificaron 53 compuestos voltiles en los diferentes


vinos Moscatel elaborados durante la vendimia 2008. (Tabla 36). Como ya se
describi en el captulo anterior (tabla 13), todos los mostos se obtuvieron a
partir de uvas secadas en cmara climtica (40C y 10% HR) y se vinificaron
empleando diferentes condiciones. Adems, se llev a cabo un seguimiento
peridico de la etapa de envejecimiento durante un ao (S20d, 20 das; S40d,
40 das; S3, 3 meses; S4, 4 meses; S8, 8 meses; y S12, 12 meses).

Ruiz et al., (2010), observaron en uvas de la variedad Pedro Ximnez, que los
mostos de uva secada en cmara climtica exhiban el mismo perfil aromtico
que aquellos secados al sol por el mtodo tradicional.

Para vinos de uva Moscatel, la mayora de los compuestos voltiles


encontrados en este estudio haban sido previamente identificados: en la pulpa
de la uva y el hollejo (Sanchez-Palomo et al., 2005), procedente de la
fermentacin alcohlica (Karagiannis et al., 2000; Snchez-Palomo et al., 2007) ;
y/o formado tras el envejecimiento en madera (Karagiannis et al., 2000;
Ortega-Heras et al., 2004; Mrquez et al., 2007).

210
Captulo IV. Resultados y Discusin

LRI Compuestos voltiles m/z Identificacin


1 1038 Butanoato de etilo 71 S, MS
2 1067 3-metilbutanoato de etilo 88 S, MS
3 1080 Acetato de n-butilo 43 MS
4 1088 Hexanal 56 S, MS
5 1108 Acetato de 4-metil-2-pentanol 43 MS
6 1120 Acetato de isoamilo 43 MS
7 1157 -mirceno 93 MS
8 1197 4-metil-2-pentanol (PI) 45 S, MS
9 1214 Dehidroxilinalol xido I 67 MS
10 1218 2-hexenal 41 S, MS
11 1229 Alcohol isoamlico (3-metil-1-butanol) 55 S, MS
12 1231 Hexanoato de etilo 88 S, MS
13 1245 Dehidroxilinalol xido II 67 MS
14 1276 Octanal 43 MS
15 1336 6-metil-5-hepten-2-ona 43 MS
16 1344 1-hexanol 56 S, MS
17 1378 Nonanal 57 MS
18 1414 Octanoato de etilo 88 S, MS
19 1423 2-furaldehido 95 S, MS
20 1441 Nerol xido 68 MS
21 1451 Linalol xido 59 MS
22 1489 Benzaldehido 106 S, MS
23 1547 Linalol 93 S, MS
24 1567 5-metil-2-furaldehido 110 S, MS
25 1613 4-terpineol 111 S, MS
26 1646 Decanoato de etilo 88 MS
27 1711 Succinato de dietilo 101 S, MS
28 1737 -terpineol 93 S, MS
29 1769 -citronelol 69 MS
1,1,6-trimetil-1,2-dihidronaftaleno
30 1783 157 MS
(TDN)
31 1810 2-fenilacetato de etilo 91 S, MS
32 1836 Nerol 69 MS
33 1849 Acetato de 2-feniletilo 104 MS
34 1854 Pentanedioato de dietilo 143 MS
35 1879 Geraniol 69 S, MS
36 1890 Dodecanoato de etilo 101 MS

211
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

LRI Compuestos voltiles m/z Identificacin


37 1944 2-feniletanol 91 S, MS
38 1956 2,6-di-tert-butil-p cresol (BHT) 205 MS
39 1979 cido 2-ethilhexanoico 73 MS
40 1989 Fenol 94 MS
41 2001 Nerolidol 69 MS
42 2101 cido Octanoico 60 S, MS
43 2145 Tetradecanoato de etilo 88 MS
44 2195 Eugenol 164 S, MS
45 2200 cido Nonanoico 73 MS
46 2202 m-timol 135 MS
47 2204 4-etilfenol 107 S, MS
48 2232 Carvacrol 135 MS
49 2317 cido Decanoico 60 S, MS
50 2325 Hexadecanoato de etilo 88 MS
51 2389 Octadecanoato de etilo 88 MS
52 2494 cido Dodecanoico 73 MS
53 2556 cido Tetradecanoico 73 MS
54 2850 cido Hexadecanoico 73 MS
LRI: ndices de retencin lineal, S estndar, MS espectro de masas

Tabla 36. Parmetros de identificacin y cuantificacin de los compuestos voltiles en los vinos,
v. 2008.

IV.II.2.1.1. Anlisis de varianza (ANOVA)

La Tabla 37 muestra los valores medios obtenidos para los vinos


correspondientes a cada vinificacin, tras la fermentacin alcohlica, al inicio
del proceso de envejecimiento (S20d, 20 das) y al final del mismo (S12, 12
meses), considerando, para cada caso, todos los sistemas de envejecimiento.
Debemos recordar que, para los experimentos E3 y E5, solo se evalu el
envejecimiento en botas de roble.

El proceso de secado y vinificacin, junto con el posterior tiempo de


envejecimiento en madera, determinan el perfil de compuestos voltiles del

212
Captulo IV. Resultados y Discusin

vino final. Teniendo en cuenta todos estos factores, con el fin de estudiar
estadsticamente las diferencias en el contenido voltil de todos los vinos
estudiados, los datos fueron sometidos al anlisis de la varianza. Para ello, se
consideraron tres factores independientes: tipo de fermentacin, tiempo de
envejecimiento y tipo de envejecimiento. Como cabra esperar, prcticamente
todos los compuestos voltiles se vieron significativamente afectados (p <
0,01) por estos tres factores (Tabla 37).

steres de etilo

Varios tipos de compuestos voltiles son responsables del aroma de


fermentacin en vinos: etil steres de cidos grasos C6, C8 y C10, alcoholes
superiores y sus acetatos y ciertos cidos voltiles (Karagiannis et al., 2000). En
nuestro estudio, muchos de los steres etlicos mostraron un aumento
significativo conforme aumentaba el tiempo de envejecimiento. Sin embargo,
el efecto del tipo de envejecimiento no mostr una clara influencia en
ninguno de ellos. Butanoato de etilo, etil-3-metilbutanoato de metilo,
hexanoato de etilo, pentanodiato de dietilo y succinato de dietilo mostraron
valores ms elevados en los vinos envejecidos en madera, mientras que los
steres de etilo de elevado peso molecular (octanoato de etilo, decanoato de
etilo, dodecanoato de etilo, hexadecanoato de etilo y octadecanoato de etilo)
mostraron valores ms altos para los vinos de crianza en acero inoxidable
(datos no mostrados). Cmara et al., (2006) encontraron grandes disminuciones
en steres etlicos de cidos grasos (C6-C16) y acetatos y un elevado aumento
de los steres etlicos de cidos diprticos tales como el succinato de dietilo en
vinos de Madeira con crianza en madera de roble durante 25 aos. En este
sentido, Alves et al., (2005) observaron que los compuestos octanoato de etilo,
succinato de dietilo, y cis-oak lactona (lactona de roble) se podran utilizar

213
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

como variables discriminantes para la correcta diferenciacin entre los vinos


de Madeira segn el tipo de vino y el tiempo de envejecimiento, observando la
misma tendencia que Cmara et al., (2006) para octanoato de etilo, decanoato
de etilo y succinato de dietilo.

Durante el envejecimiento, la composicin de steres etlicos del vino vara


debido a cambios en sus equilibrios qumicos. Las reacciones de hidrlisis y
esterificacin que pueden afectar a este tipo de compuestos voltiles son muy
comunes durante este perodo (Cmara et al., 2006) y dependen de varios
factores tales como el pH del vino, temperatura, grado alcohlico y tipo de
cido. Por tanto, todos estos factores deberan tenerse en cuenta con el fin de
explicar las variaciones en el contenido de steres etlicos observadas en este
estudio.

En el caso del factor ''tipo de fermentacin'', en general, se encontraron


valores ms altos para los vinos de los experimentos E2, E3 y E5. Los steres
de etilo se producen durante la fermentacin alcohlica por reaccin del etanol
y derivados de Acil-coenzima A (Nordest et al., 1975), por lo que sus
concentraciones en el vino despus del proceso de fermentacin alcohlica
dependen de las condiciones especficas en las que se llev a cabo este proceso
(temperatura, cepa de levadura, etc.). Los experimentos con los niveles ms
altos de steres etlicos se llevaron a cabo bajo la adicin de nutrientes
(Experimento E2), maceracin pelicular (Experimento E3), y maceracin
pelicular-fermentacin con levadura S. bayanus (Experimento E5), factores que
han provocado un mayor contenido de este tipo de compuestos en el vino.
Selli et al., (2003) demostraron que el tratamiento de contacto de los hollejos
con los mostos de uva Moscatel aumentaba el contenido en compuestos
aromticos libres totales, especialmente terpenos y algunos alcoholes

214
Captulo IV. Resultados y Discusin

superiores. Aleixandre et al., (2003) llegaron a la conclusin de que la


clarificacin esttica del mosto de uva Moscatel con enzimas pectolticas
produca vinos con mayor contenido de alcoholes superiores, steres y
compuestos terpnicos. Pieiro et al., (2006) observaron que la vinificacin de
diversas variedades de uva con maceracin ocasion un mayor contenido en
steres etlicos de cido lctico, actico y succnico. Ugliano et al., (2006)
hallaron que el empleo de levadura S. bayanus proporcionaba una mayor
capacidad para liberar compuestos voltiles a partir de precursores glicosdicos
en condiciones ptimas (pH 5 y 30 C) que S. cerevisiae, y que stas diferencias
eran menos significativas cuando se empleaban cepas de levadura para llevar a
cabo fermentaciones alcohlicas en medios sintticos de mostos que contenan
glucsidos extrados de zumo de uva. Otros autores tambin han obtenido
resultados contradictorios en estudios sobre la actividad de las enzimas
glucosidasas de levadura durante la elaboracin del vino (Gunata et al., 1986;
Gnata et al., 1990; Delcroix et al., 1994).

cidos

En relacin a los cidos, su contenido se vio significativamente afectado por


los tres factores considerados en este estudio.

Respecto al ''tipo de envejecimiento'', se encontraron valores ms bajos para


los vinos envejecidos en barricas de roble. El factor tiempo del
envejecimiento'' influy positivamente sobre el contenido de estos compuestos
voltiles. Cmara et al., (2006) observaron una disminucin significativa en el
contenido de cidos octanoico y hexanoico, mientras que los cidos grasos de
cadena corta y el cido decanoico mostraron incrementos significativos
durante un prolongado periodo de crianza en madera.

215
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

Acetatos

En cuanto a acetatos, los compuestos acetato de n-butilo, acetato de 4-metil-2-


pentanol, y 2-fenilacetato de etilo mostraron una disminucin significativa a
medida que aumentaba el tiempo de envejecimiento. Un comportamiento
similar fue observado por Cmara et al., (2006) en vinos de Madeira durante un
perodo prolongado de envejecimiento en madera de roble. Estos compuestos,
producidos a partir de reacciones enzimticas, se hidrolizan gradualmente
hacia sus correspondientes cidos y alcoholes durante el almacenamiento del
vino.

Sobre el factor tipo de fermentacin los experimentos E1 y E2 mostraron


un mayor contenido en acetatos. Ambos experimentos se llevaron a cabo a
temperatura ambiente por S. cerevisiae y sin maceracin. El factor tipo de
envejecimiento fue el menos significativo para sta familia de compuestos sin
una clara influencia sobre la misma.

Terpenos y terpenoles

Sanchez-Palomo et al., (2005) hallaron que compuestos tales como linalol,


geraniol y nerol eran los principales compuestos en la pulpa y hollejos de uva
Moscatel, siendo los responsables del aroma floral tpico de sta variedad y
contribuyendo al aroma de sus vinos. Fenoll et al., (2009) constataron que los
compuestos voltiles libres ms abundantes en uva Moscatel durante su
maduracin fueron algunos monoalcoholes terpnicos (linalol, geraniol,
citronelol, nerol) con un aumento significativo durante el desarrollo de la uva.

Mientras que en el grupo de compuestos voltiles glicosilados, se encontraron


algunos terpenoles junto con otros compuestos voltiles tales como los xidos

216
Captulo IV. Resultados y Discusin

de trans y cis furan linalol, alcohol benclico y 2-fenil-etanol (Fenoll et al.,


2009).

En cuanto a terpenos y terpenoles, como se puede ver en la Tabla 37, el factor


ms significativo fue tiempo de envejecimiento.

Terpenoles tales como linalol, -terpineol, -citronelol, nerol y geraniol


mostraron una disminucin significativa conforme avanzaba el tiempo de
envejecimiento, mientras que aumentaron sus xidos. Este hecho est en
concordancia con lo observado por Karagiannis et al., (2000) en mistelas
envejecidas de uva Moscatel, con la excepcin de -terpineol, cuya
concentracin aumentaba.

Marais y Van Wyk, (1986) observaron que algunos monoalcoholes terpnicos


(linalol, nerol y geraniol) durante el envejecimiento podan ser transformados
en -terpineol y otros terpenos tales como xido de linalol que poseen
elevados umbrales de percepcin. Sin embargo, Loscos et al., (2010)
observaron que la concentracin de -terpineol aumentaba significativamente
en vinos despus de una semana de envejecimiento acelerado (50C) y, a
continuacin, su concentracin disminua hasta el final del proceso de
envejecimiento. Como cabra esperar, el factor temperatura fue un parmetro
crucial a tener en cuenta durante el almacenamiento. Dichos autores
explicaban estos hechos, teniendo en cuenta la conversin inicial de terpenoles
tales como linalol hacia -terpineol y la posterior conversin de ste en hidrato
de terpina. Observando los datos correspondientes a los experimentos E3 y
E5, para los que el envejecimiento en barrica fue el nico estudiado (Tabla 37),
en comparacin con los restantes se puede observar que la disminucin en
compuestos terpnicos fue mayor para los vinos envejecidos en botas de roble

217
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

donde la micro-oxigenacin continua a travs de los poros de la madera


provoc una mayor oxidacin de estos compuestos.

Sobre el factor tipo de fermentacin, el uso de maceracin pelicular con


enzimas pectolticas (Experimentos E3 y E5) no aument significativamente el
contenido en este tipo de compuestos. La actividad glicosidasa de estas
enzimas depende del pH medio y el contenido en glucosa y glucolactona
(Gnata et al., 1993), con una clara inhibicin de esta actividad cuando el
contenido en estos compuestos aumenta.

Selli et al., (2003) hallaron, en estudios de mostos de uva Moscatel en contacto


con sus hollejos, un ligero aumento de los terpenos, especialmente -terpineol
y -citronelol. Aleixandre et al., (2003) observaron un aumento claro en el
contenido de linalol, -terpineol, -citronelol y nerol, pero no en geraniol en
ensayos de maceracin de mostos de Moscatel con enzimas pectolticas.

En nuestro caso, slo -citronelol y nerol mostraron claramente un mayor


contenido en el vino del Experimento E3, macerado con enzimas pectolticas
y fermentado con S. cerevisiae.

En relacin con la cepa de levadura empleada, slo geraniol exhibi un mayor


contenido para los vinos fermentados con S. bayanus. Gamero et al., (2011)
observaron en vinos Moscatel fermentados por especies de Saccharomyces y
levaduras hbridas que la cantidad de geraniol se redujo en la mayora de los
vinos con respecto al mosto inicial a excepcin de los vinos elaborados con S.
bayanus, mientras que la cantidad de -terpineol fue mayor en los vinos
fermentados por S. cerevisiae y levaduras hbridas. La cantidad de linalol
observada por Gamero et al., (2011) fue similar en todos los vinos. Dichos
autores no encontraron relacin entre la actividad -D-glucosidasa y el perfil

218
Captulo IV. Resultados y Discusin

de terpenos de los vinos obtenidos tras la fermentacin con especies de


Saccharomyces e hbridas. Sin embargo, Eglinton et al., (2000) establecieron que
el uso de cepas de S. bayanus puede producir vinos con diferentes perfiles
sensoriales. En este estudio (Eglinton et al., 2000), los vinos elaborados con S.
bayanus contuvieron ms glicerol, acetaldehdo y cido succnico, y menos
cido actico y acetato de etilo que los elaborados con S. cerevisiae.

Aldehdos, alcoholes y cetonas

Sanchez-Palomo et al., (2009) identificaron en mostos de uva Moscatel,


aldehdos y alcoholes de seis tomos de carbono, monoterpenos, terpenos
polioxigenados, y compuestos benzoicos tales como benzaldehdo y 2-
feniletanol. Tambin se encontraron en estos mostos, cidos y compuestos
voltiles resultantes de las reacciones favorecidas por las altas temperaturas,
tales como 2-furfural y -damascenona (Sanchez-Palomo et al., 2009).

En nuestro estudio, ciertos alcoholes y aldehdos (1-hexanol, hexanal,


benzaldehdo, 2-feniletanol) mostraron valores ms elevados en los vinos
obtenidos tras maceracin (Experimentos E3 y E5). Selli et al., (2003) hallaron
un aumento significativo en el contenido de terpenos y algunos alcoholes
(hexanol y 2-feniletanol) en estudios de mostos de uva Moscatel que haban
estado en contacto con sus hollejos. Algunos autores han descrito un aumento
significativo de alcoholes superiores durante el envejecimiento (Cmara et al.,
2006). En nuestros experimentos, 3-metil-2-butanol y 1-hexanol mostraron un
aumento significativo durante el envejecimiento. Para aldehdos, benzaldehdo
exhibi una clara tendencia al alza durante el envejecimiento, con valores ms
elevados en los vinos envejecidos en madera. Loscos et al., (2010), en estudios
de envejecimiento acelerado (50C y 9 semanas), y Pereira et al., (2010), en

219
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

vinos de licor envejecidos en barricas, observaron esta misma tendencia para


ste compuesto.

Varios

Entre los compuestos voltiles que han demostrado un claro aumento durante
el envejecimiento de los vinos en madera de roble, algunos autores (Cmara et
al., 2006; Mrquez et al., 2007) hallaron 2-furaldehido y 5-metil-2-furaldehido.
Ambos se forman por la degradacin de los hidratos de carbono durante el
tostado de la barrica y luego se transfieren al vino durante su envejecimiento.
En los vinos sin envejecimiento en madera, pueden proceder de la
deshidratacin de azcares durante el proceso de secado (Franco et al., 2004).

En nuestro caso, eugenol, 2-furaldehido, y 5-metil-2-furaldehdo mostraron un


aumento significativo durante el envejecimiento, con valores ms altos para los
vinos envejecidos en madera (Tabla 37, experimentos E3 y E5).

2-furaldehdo y 5-metil-2-furaldehdo se han encontrado en los mostos de uvas


Pedro Ximnez despus de su secado al sol (Franco et al., 2004). Mientras que
el primero se produce por calentamiento de las pentosas (xilosa), 5-metil-2-
furaldehdo surge de la ramnosa. Por lo tanto, el envejecimiento en madera y el
uso de cmara climtica para el pasificado de uvas podra explicar el contenido
encontrado para estos compuestos en los vinos estudiados. Eugenol, presente
en la madera de roble sin tostar y cuya concentracin aumenta con la
temperatura de tostado durante la fabricacin de la barrica, se transfiere al vino
durante su envejecimiento (Chatonnet, 1999).

En relacin con 1,1,6-trimetil-1,2-dihidronaftaleno (TDN), su contenido fue


mayor para los vinos envejecidos en madera durante un ao. La presencia de

220
Captulo IV. Resultados y Discusin

este compuesto en los vinos est principalmente relacionada con el proceso de


maduracin por la degradacin de los carotenoides (Versini et al., 2002).
Parmetros tales como temperatura, luz solar, y tiempo de almacenamiento
tienen una influencia positiva sobre el contenido de este compuesto. Silva
Ferreira et al., (2003) hallaron una elevada concentracin de este compuesto en
un estudio de envejecimiento acelerado.

221
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

Tabla 37. Medias (reas relativas de pico) y desviaciones estndar de los compuestos voltiles. Anlisis de la varianza. S20d: 20 das de envejecimiento en
madera; S12: 12 meses de envejecimiento en madera.

Compuestos p p tiempo p tipo


E1 E2 E3 E4 E5
voltiles ferment. envejec. envejec.

steres de etilo

Butanoato de etilo S20d 0,1800,083 0,2960,158 0,3020,032 0,1490,028 0,6350,064


0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 0,2450,212 0,8180,863 0,6310,062 0,2270,136 1,710,03
3-metilbutanoato
S20d 0,0510,023 0,0640,014 0,0590,039 0,0450,010 0,0770,021
de etilo 0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 0,0700,046 0,1660,110 0,0970,017 0,0720,042 0,1430,039
Hexanoato de S20d 1,631,16 2,782,37 3,250,39 1,100,09 0,790,87
etilo 0,0000a 0,0090a 0,0000a
S12 2,301,93 6,997,54 5,690,36 1,260,04 1,160,39
Pentanediato de S20d 0,0140,005 0,0260,005 0,0400,026 0,0150,006 0,0340,011
dietilo 0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 0,0280,011 0,0800,044 0,0610,003 0,0290,014 0,0610,026
Octanoato de etilo S20d 2,500,62 3,300,69 0,9423,91 2,090,35 1,381,88
0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 3,130,58 6,230,70 1,930,42 2,880,22 2,193,91
Decanoato de S20d 0,8630,408 1,330,694 0,1200,121 0,4360,159 0,2440,489
etilo 0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 2,131,04 4,801,24 0,2340,365 1,000,31 0,7902,52
Succinato de S20d 0,9500,403 1,350,340 1,831,27 0,9450,472 2,300,517
dietilo 0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 1,890,90 4,482,68 3,530,26 1,971,23 4,351,27

222
Captulo IV. Resultados y Discusin

Compuestos p p tiempo p tipo


E1 E2 E3 E4 E5
voltiles ferment. envejec. envejec.

Dodecanoato de S20d 0,0280,028 0,1110,111 0,0140,087 0,0210,007 0,0110,014


etilo 0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 0,0910,071 0,2880,166 0,0160,034 0,0340,014 0,0530,087
Tetradecanoato de S20d 0,0260,021 0,0500,019 0,0260,011 0,0240,011 0,0260,013
etilo 0,0138 0,0000a 0,4404
S12 0,0460,033 0,0290,014 0,0100,026 0,0410,022 0,0840,011
Hexadecanoato de S20d 0,0930,089 0,0620,023 0,0720,040 0,0720,044 0,0790,051
etilo 0,2729 0,1607 0,0065
S12 0,0840,052 0,0890,033 0,0240,113 0,0950,024 0,2730,040
Octadecanoato de S20d 0,0240,023 0,0190,011 0,0120,012 0,0170,012 0,0160,005
etilo 0,0007a 0,0786 0,0000a
S12 0,0170,011 0,0230,006 0,0040,030 0,0100,002 0,0280,012
cidos
cido 2- S20d 0,0380,006 0,0450,004 0,0310,024 0,0420,003 0,0100,019
ethilhexanoico 0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 0,0240,006 0,0480,015 0,0190,004 0,0330,005 0,0030,024
cido Octanoico S20d 0,3480,068 0,3620,064 0,0850,311 0,3060,051 0,2380,202
0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 0,4100,164 0,4660,027 0,1130,074 0,4080,122 0,2440,311
cido Nonanoico S20d 0,0180,001 0,0200,003 0,0080,004 0,0120,002 0,0150,007
0,0351 0,0353 0,7558
S12 0,0110,005 0,0110,006 0,0030,001 0,0160,005 0,0410,004
cido Decanoico S20d 0,4390,077 0,5890,129 0,0740,587 0,1420,054 0,1430,152
0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 0,7650,439 1,100,27 0,0820,038 0,3960,180 0,3540,587
cido S20d 0,0310,009 0,2290,123 0,0250,131 0,0140,002 0,0270,023
Dodecanoico 0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 0,1780,143 0,4650,280 0,0330,006 0,0560,023 0,1430,131

223
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

Compuestos p p tiempo p tipo


E1 E2 E3 E4 E5
voltiles ferment. envejec. envejec.

cido S20d 0,0690,018 0,0840,011 0,0250,050 0,0400,019 0,0890,052


Tetradecanoico 0,0169 0,0003a 0,1
S12 0,1340,095 0,1000,030 0,0340,015 1,1080,035 0,2250,100
cido S20d 0,1420,027 0,1820,034 0,0700,100 0,0820,036 0,1560,117
Hexadecanoico 0,0259 0,0000a 0,0087a
S12 0,3350,224 0,2510,109 0,0380,008 0,2310,065 0,2950,100
Acetatos
Acetato de n- S20d 0,0090,001 0,0090,000 0,0050,002 0,0050,001 0,0070,001
butilo 0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 0,0050,004 0,0130,011 0,0070,001 0,0040,003 0,0090,002
Acetato de 4-
S20d 0,0130,010 0,0060,005 0,0070,000 0,0220,002 0,0270,000
metil-2-pentanol 0,0051a 0,0000a 0,4759
S12 0,0000,000 0,0000,000 0,0000,000 0,0000,000 0,0100,000
Acetato de S20d 0,4970,084 0,6220,075 0,1490,562 0,2600,007 0,2910,159
isoamilo 0,0000a 0,0000a 0,0307
S12 0,4320,054 0,9870,192 0,3100,109 0,3510,126 0,4430,562
Acetato de S20d 0,3410,064 0,3850,003 0,4780,429 0,4410,001 0,3370,394
feniletilo 0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 0,4360,049 0,8220,216 0,5740,082 0,5690,011 0,4560,429
2-fenil acetato de S20d 0,9000,133 1,010,239 0,1550,621 0,4880,049 0,5110,182
etilo 0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 0,4890,195 0,8810,002 0,1580,152 0,2650,008 0,2620,621
Terpenos y terpenoles

Nerol xido S20d 0,0630,018 0,0550,008 0,0700,076 0,0690,003 0,0860,075


0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 0,1050,029 0,1090,002 0,0920,026 0,1250,019 0,1180,076

224
Captulo IV. Resultados y Discusin

Compuestos p p tiempo p tipo


E1 E2 E3 E4 E5
voltiles ferment. envejec. envejec.

Linalol xido S20d 0,0040,001 0,0030,000 0,0060,003 0,0050,000 0,0050,001


0,0000a 0,0000a 0,0788
S12 0,0040,000 0,0040,000 0,0060,001 0,0030,002 0,0070,003
Linalol S20d 0,4590,085 0,3880,035 0,4240,375 0,4260,003 0,3970,329
0,0000a 0,0016a 0,0000a
S12 0,3570,079 0,6380,108 0,3810,110 0,4740,009 0,3780,375
4-terpineol S20d 0,0550,053 0,0710,098 0,0030,001 0,0090,009 0,0110,002
0,0347 0,0071a 0,1862
S12 0,0030,000 0,0030,001 0,0030,036 0,0030,000 0,0040,001
terpineol S20d 0,2140,041 0,2030,092 0,2100,126 0,2000,026 0,1980,129
0,017 0,0014a 0,0312
S12 0,1660,041 0,1790,001 0,1790,048 0,2020,020 0,0710,126
citronelol S20d 0,0660,035 0,0770,017 0,1890,047 0,0890,008 0,0380,027
0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 0,0390,025 0,0840,017 0,0850,040 0,0550,017 0,0170,047
Nerol S20d 0,0620,019 0,0680,010 0,1020,040 0,0730,002 0,0650,027
0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 0,0340,015 0,0680,011 0,0390,023 0,0480,010 0,0280,040
Nerolidol S20d 0,0300,011 0,0520,020 0,0140,014 0,0110,004 0,0230,002
0,0000a 0,0198 0,0000a
S12 0,0210,016 0,0650,044 0,0060,006 0,0110,008 0,0140,014
Geraniol S20d 0,2030,057 0,1800,028 0,3100,134 0,2470,007 0,2300,100
0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 0,1420,071 0,2280,038 0,1300,064 0,2010,059 0,1070,134
Timol S20d 0,0330,052 0,0020,001 0,0010,000 0,0020,001 0,0180,000
0,0853 0,05 0,6645
S12 0,0010,000 0,0020,001 0,0010,065 0,0020,002 0,0030,000
Carvacrol S20d 0,0170,028 0,0020,001 0,0020,000 0,0010,001 0,0030,000 0,5621 0,05 0,0097a

225
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

Compuestos p p tiempo p tipo


E1 E2 E3 E4 E5
voltiles ferment. envejec. envejec.

S12 0,0010,000 0,0030,003 0,0010,034 0,0010,000 0,0030,000


mirceno S20d 0,0090,007 0,0050,004 0,0100,001 0,0080,004 0,0060,001
0,3967 0,0000a 0,0002a
S12 0,0030,002 0,0060,005 0,0020,010 0,0030,002 0,0010,001
Dehidroxilinalol S20d 0,0180,002 0,0150,002 0,0190,013 0,0170,001 0,0420,022
xido I 0,0000a 0,0000a 0,017
S12 0,0320,007 0,0280,010 0,0370,000 0,0370,006 0,0770,013
Dehidroxilinalol S20d 0,0220,009 0,0260,001 0,0180,009 0,0220,002 0,0300,027
xido II 0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 0,0290,012 0,0270,014 0,0150,003 0,0400,002 0,0470,009
Aldehdos, cetonas y alcoholes
Hexanal S20d 0,0090,001 0,0090,002 0,0080,003 0,0080,001 0,0100,002
0,0000a 0,0000a 0,0705
S12 0,0050,000 0,0100,005 0,0070,002 0,0040,001 0,0100,003
2-Hexenal S20d 0,3720,167 0,3070,136 0,4500,186 0,4960,106 0,6400,402 0,1346 0,0002a 0,4616
S12 0,5940,069 1,911,65 1,180,235 0,6630,094 0,8860,186
Octanal S20d 0,0400,015 0,0230,005 0,0130,005 0,0180,009 0,0310,005
0,1942 0,0000a 0,0767
S12 0,0080,003 0,0100,003 0,0040,020 0,0070,000 0,0080,005
6-metil-5-hepten- S20d 0,0080,002 0,0360,037 0,0110,002 0,0110,004 0,0110,005
2-ona 0,0000a 0,0552 0,0000a
S12 0,0070,002 0,0290,032 0,0200,000 0,0100,003 0,0120,002
1-Hexanol S20d 0,0430,008 0,0520,003 0,0770,019 0,0560,003 0,0520,033
0,0000a 0,0213 0,0000a
S12 0,0410,015 0,0820,055 0,1020,007 0,0560,008 0,0700,019
Nonanal S20d 0,0550,020 0,0400,014 0,0250,003 0,0190,001 0,0150,005 0,8073 0,0000a 0,8874

226
Captulo IV. Resultados y Discusin

Compuestos p p tiempo p tipo


E1 E2 E3 E4 E5
voltiles ferment. envejec. envejec.

S12 0,0140,006 0,0120,008 0,0100,025 0,0150,008 0,0220,003


Benzaldehido S20d 0,0720,027 0,0690,028 0,1040,021 0,0720,019 0,0910,032
0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 0,0860,032 0,1490,119 0,1930,035 0,0850,040 0,2150,021
3-metil-2-butanol S20d 0,7370,111 0,7180,430 0,7090,523 0,7720,033 1,000,665
0,0015a 0,0000a 0,1049
S12 0,9790,186 2,371,63 1,910,124 1,030,085 1,130,523
2-feniletanol S20d 0,9250,125 1,060,162 1,260,778 0,9590,011 1,430,652
0,0000a 0,598 0,0083a
S12 0,8600,031 1,470,370 1,190,156 0,9690,047 1,530,778
Varios
Fenol S20d 0,0330,002 0,0340,002 0,0260,014 0,0320,007 0,0330,019
0,0235 0,0505 0,4117
S12 0,0360,012 0,0440,024 0,0240,001 0,0280,001 0,0440,014
Eugenol S20d 0,0120,006 0,0080,005 0,0190,003 0,0140,008 0,0310,001
0,0000a 0,0000a 0,0000a
S12 0,0130,010 0,0250,030 0,0330,008 0,0220,023 0,0550,003
4-Etilfenol S20d 0,0050,004 0,0050,004 0,0030,001 0,0030,002 0,0050,000
0,0001a 0,719 0,0000a
S12 0,0030,003 0,0060,007 0,0060,002 0,0040,005 0,0070,001
2-Furaldehido S20d 0,0580,023 0,0510,016 0,0820,005 0,0550,014 0,0820,009

0,0000a 0,0000a 0,0000a


S12 0,0590,042 0,0580,051 0,1130,017 0,0980,085 0,1800,005

5-metilfuraldehido
S20d 0,0120,013 0,0110,011 0,0170,010 0,0090,009 0,0230,001
0,0000 a 0,0000 a 0,0000 a
S12 0,0250,032 0,0510,065 0,0350,003 0,0260,028 0,0670,010

227
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

Compuestos p p tiempo p tipo


E1 E2 E3 E4 E5
voltiles ferment. envejec. envejec.

1,1,6-trimetil-1,2-
dihidronafthaleno S20d 0,0040,005 0,0080,001 0,0040,023 0,0020,001 0,0040,001
0,0000a 0,0000a 0,0000a
(TDN)
S12 0,0130,008 0,0520,019 0,0150,006 0,0130,014 0,0460,023
2,6 Di-tert-butil-p S20d 0,1780,039 0,1100,069 0,1270,003 0,1420,037 0,1000,007
cresol (BHT) 0,1128 0,0000a 0,0000a
S12 0,3070,296 0,3350,339 0,0660,050 0,2340,244 0,1190,003

228
Captulo IV. Resultados y Discusin

IV.II.2.1.2. Anlisis de conglomerados (AC)

La matriz de datos (compuestos voltiles) se someti tambin a anlisis de


conglomerados, tomando la distancia Eucldea al cuadrado como mtrica y el
mtodo de Ward como criterio de enlace.

El dendrograma obtenido se muestra en la Figura. 54. En l, pueden apreciarse


tres grupos principales: un clster para las muestras de los Experimentos E2 y
E3 envejecido en madera de roble; otro para las muestras de los experimentos
E1, E4, E5 y envejecidas en madera de roble; y finalmente, un tercero para las
muestras de los experimentos envejecidos en acero inoxidable y con chips de
madera.

Figura 54. Anlisis de conglomerados de los vinos Moscatel, vendimia 2008 y


envejecimiento en botas de roble (C), Depsitos de acero inoxidable (S) y con Chips (CH).

229
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

Algunas muestras iniciales (S20d, S40d, y S3) del Experimento E1 se


agruparon junto a aquellas de los Experimentos E2 y E3. Como puede
apreciarse, en relacin con las primeras, aquellas muestras envejecidas en
madera, se obtuvo una clara diferenciacin entre los vinos fermentados con S.
bayanus (Experimentos E4 y E5) y los fermentados con S. cerevisiae
(Experimentos E2 y E3) (Figura 54). Los conglomerados se formaron
especialmente de acuerdo a tipo de envejecimiento (envejecimiento en
madera y en acero inoxidable) y cepa de levadura empleada. Teniendo en
cuenta que slo las muestras iniciales del Experimento E1 (S. cerevisiae sin
nutrientes ni maceracin pelicular) envejecidas en madera se agruparon junto
con aquellas fermentadas con la misma cepa de levadura, se podra concluir
que, para estos vinos, el uso de nutrientes o maceracin pelicular condicion
su posterior evolucin en barrica de roble.

Los grupos obtenidos demuestran que los compuestos voltiles estudiados


poseen suficiente poder explicatorio del tipo de proceso de envejecimiento y
cepa de levadura empleadas.

Por tanto, con el fin de obtener las reglas de clasificacin adecuadas para la
asignacin de categoras a las muestras, se aplic un mtodo de
reconocimiento de modelos supervisado por lo que se llev a cabo un anlisis
lineal discriminante por pasos hacia delante (ALD).

IV.II.2.1.3. Anlisis lineal discriminante (ALD)

El ALD asume un conocimiento previo del nmero de clases y las


pertenencias de las muestras a cada clase. Este anlisis se realiz de acuerdo al
estadstico lambda de Wilks (Wilks, 1960) con el fin de elegir los compuestos
voltiles que mejor distinguan las diferentes clases, emplendose el mtodo

230
Captulo IV. Resultados y Discusin

denominado leave-one-out (dejar uno fuera) (Lachenbruch y Mickey, 1968). Se


consideraron tres posibles criterios de clasificacin: Tipo de fermentacin
(Experimentos E1 a E5), tiempo de envejecimiento (S20d, S40d, S3, S4, S8 y
S12), y tipo de envejecimiento (envejecimiento en madera de roble, con chips
de madera y en acero inoxidable).

Las variables incluidas en las funciones discriminantes obtenidas de acuerdo a


tipo de fermentacin pertenecan principalmente a cuatro familias qumicas
(steres de etilo, terpenos, compuestos furnicos y acetatos). Para la primera
funcin, butanoato de etilo, pentanodiato de dietilo, 2-feniletanol (con signo
negativo) y 5-metil-2-furfural y cido decanoico (con signo positivo) fueron los
compuestos voltiles con mayor peso. Para la segunda funcin, sobre todo, 5-
metil-2-furfural, cido decanoico (con signo negativo) y -citronelol, acetato de
feniletilo y 1-hexanol (con signo positivo) fueron las variables con los
coeficientes estandarizados ms altos. El diagrama de dispersin de las
muestras en el plano definido por las dos primeras funciones discriminantes
para tipo de fermentacin se muestra en la Figura. 55.

Como puede apreciarse en la Figura 55, se obtuvo una separacin clara entre
las muestras correspondientes a distintas condiciones de fermentacin. Las
muestras de los Experimentos E3, E4 y E5 estaban claramente diferenciadas,
mientras que los experimentos E1 y E2 fueron en algunos casos
entremezclados. Estos dos ltimos experimentos se llevaron a cabo sin
maceracin pelicular previa, con S. cerevisiae, y fermentados a la misma
temperatura. En el caso del Experimento E2, se emplearon nutrientes (Tabla
13). El 100% de las muestras fueron clasificadas correctamente en el proceso
de validacin por el mtodo de dejar-uno-fuera.

231
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

14 Experiencias
Experiences
1
10 2
3
6 4
Function 2

5
2

-2

-6 5

-10
-21 -16 -11 -6 -1 4 9
Function 1
Figura 55. ALD tipo de fermentacin. Moscatel, v.2008.

De acuerdo a tipo de envejecimiento, las variables incluidas en las funciones


discriminantes fueron principalmente cidos (cido decanoico con signo
positivo y cido dodecanoico con signo negativo), steres de etilo
(octadecanoato de etilo con signo positivo y succinato de dietilo con signo
negativo) para la primera funcin y nerolidol y nerol xido con signo positivo
y signo negativo, este ltimo, para la primera y segunda funcin,
respectivamente. El diagrama de dispersin de las muestras en el plano
definido por las dos primeras funciones discriminantes para tipo
envejecimiento se muestra en la Figura. 56. Como se puede observar, las
muestras de diferentes tipos de envejecimiento fueron visiblemente separadas
con un 99,24% correctamente clasificadas en el proceso de validacin por el
mtodo dejar uno fuera.

Con respecto al factor tiempo del envejecimiento, fueron principalmente


terpenos, steres etlicos y acetatos las variables incluidas en las dos primeras
funciones discriminantes: nerol xido, decanoato de etilo, pentanodiato

232
Captulo IV. Resultados y Discusin

dietlico con signo positivo, y butanoato de etilo y geraniol con signo negativo
fueron los compuestos voltiles ms importantes para la primera funcin. Para
la segunda funcin, stos fueron 3-metilbutanoato de etilo, hexanoato de etilo,
linalol con signo positivo, y el acetato de n-butilo, xido de nerol, epxido
linalol y acetato de feniletilo con signo negativo. El diagrama de dispersin de
las muestras en el plano definido por las dos primeras funciones
discriminantes se muestra en la Figura 57. Como se puede observar, la funcin
1 separa, de forma clara, las muestras con un breve tiempo de crianza (S20d,
S40d y S3, con valores negativos para esta funcin) de aquellos envejecidos
durante un mayor tiempo (S4, S8 y S12). En el proceso de validacin por el
mtodo dejar-uno-fuera, se obtuvo un 98,48% de clasificacin correcta.

7
Botas
Oak de roble
cask
5 Chips
Chips
Depsitos
Stainlees de
steel
3
acero inox.
Function 2

-1

-3

-5
-5 -3 -1 1 3 5 7
Function 1

Figura 56. ALD "tipo de envejecimiento". Moscatel, v. 2008.

233
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

Tiempo

S20d
S40d
S3
S4
S8
S12

Figura 57. ALD "tiempo de envejecimiento". Moscatel, v. 2008.

IV.II.2.2. PERFIL AROMTICO DE VINOS DULCES MOSCATEL Y


PEDRO XIMNEZ. ESTUDIO COMPARATIVO DEL SISTEMA DE
SECADO: ASOLEO TRADICIONAL VS CMARA CLIMTICA

En este estudio, fueron identificados 51 compuestos voltiles, pertenecientes a


diferentes familias qumicas, en vinos elaborados bajo las mismas condiciones
de fermentacin (S. bayanus, baja temperatura) de uva Moscatel o Pedro
Ximnez secadas de forma tradicional o en cmara climtica durante las
vendimias 2009 y 2010 (Tabla 38). Todos los vinos elaborados fueron
envejecidos en barricas de roble durante 12 meses, realizndose un muestreo
peridico (S0, 0 das; S1, 30 das; S3, tres meses; S5, cinco meses; S9, nueve
meses; y S12, doce meses).

Para ambas variedades, la mayora de los compuestos voltiles descritos en este


estudio haban sido identificados previamente (Franco et al., 2004; Mrquez et
al., 2007; Lpez De Lerma et al., 2012; Ruiz et al., 2014).

234
Captulo IV. Resultados y Discusin

IRL Compuestos voltiles m/z Identificacin


1 1038 Butanoato de etilo 71 S, MS
2 1067 3-metilbutanoato de etilo 88 S, MS
3 1080 Acetato de n-butilo 43 MS
4 1088 Hexanal 56 S, MS
5 1120 Acetato de isoamilo 43 MS
6 1157 -mirceno 93 MS
7 1197 4-metil-2-pentanol (PI) 45 S, MS
8 1218 2-hexenal 41 S, MS
9 1229 Alcohol isoamlico (3-metil-1-butanol) 55 S, MS
10 1231 Hexanoato de etilo 88 S, MS
11 1276 Octanal 43 MS
12 1336 6-metil-5-hepten-2-ona 43 MS
13 1344 1-hexanol 56 S, MS
14 1378 Nonanal 57 MS
15 1414 Octanoato de etilo 88 S, MS
16 1423 2-furaldehido 95 S, MS
17 1441 Nerol xido 68 MS
18 1451 Linalol xido 59 MS
19 1489 Benzaldehido 106 S, MS
20 1547 Linalol 93 S, MS
21 1567 5-metil-2-furaldehido 110 S, MS
22 1613 4-terpineol 111 S, MS
23 1646 Decanoato de etilo 88 MS
24 1711 Succinato de dietilo 101 S, MS
25 1737 -terpineol 93 S, MS
26 1769 -citronelol 69 MS
27 1783 1,1,6-trimetil-1,2-dihidronaftaleno (TDN) 157 MS
28 1810 2-fenilacetato de etilo 91 S, MS
29 1836 Nerol 69 MS
30 1849 Acetato de 2-feniletilo 104 MS
31 1854 Pentanedioato de dietilo 143 MS
32 1879 Geraniol 69 S, MS
33 1890 Dodecanoato de etilo 101 MS
34 1944 2-feniletanol 91 S, MS
35 1956 2,6-di-tert-butil-p cresol (BHT) 205 MS
36 1979 cido 2-ethilhexanoico 73 MS
37 1989 Fenol 94 MS
38 2001 Nerolidol 69 MS
39 2101 cido Octanoico 60 S, MS
40 2145 Tetradecanoato de etilo 88 MS
41 2195 Eugenol 164 S, MS
42 2200 cido Nonanoico 73 MS
43 2202 m-timol 135 MS
44 2204 4-etilfenol 107 S, MS
45 2232 Carvacrol 135 MS

235
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

IRL Compuestos voltiles m/z Identificacin


46 2317 cido Decanoico 60 S, MS
47 2325 Hexadecanoato de etilo 88 MS
48 2371 Farnesol 222 MS
49 2389 Octadecanoato de etilo 88 MS
50 2494 cido Dodecanoico 73 MS
51 2556 cido Tetradecanoico 73 MS
52 2850 cido Hexadecanoico 73 MS
IRL: ndices de retencin lineal, S: estndar, MS espectro de masas
Tabla 38. Parmetros de identificacin y cuantificacin de los compuestos voltiles en los vinos v.
2009 y 2010.

IV.II.2.2.1. Anlisis de la varianza. ANOVA

En la Tabla 39 se muestra los valores medios hallados para las diferentes


familias qumicas consideradas (steres etlicos; cidos; acetatos, terpenos y
terpenoles; aldehdos, cetonas y alcoholes y varios) y para cada factor (tiempo
de envejecimiento, variedad de uva, vendimia y tipo de secado), valores stos
calculados para cada factor considerando los diferentes valores de los factores
restantes. Este hecho podra explicar las elevadas desviaciones estndar
obtenidas. En trminos generales, la mayora de estos cuatro factores parecen
ser significativos para algunas de las familias qumicas estudiadas. Como era de
esperar, los vinos de la variedad de uva Moscatel exhibieron un mayor
contenido en compuestos terpnicos (Sanchez-Palomo et al., 2005) mientras
que los vinos de crianza mostraron mayores contenidos en steres etlicos y
aldehdos, cetonas y alcoholes (Tabla 39).

Con el fin de estudiar estadsticamente las diferencias en el contenido voltil de


todos los vinos estudiados, los datos fueron sometidos al anlisis de la varianza
(ANOVA). Para ello, se consideraron cuatro factores independientes: tiempo
de envejecimiento, variedad de uva, ao de vendimia y tipo de secado. La
Tabla 40 muestra los resultados obtenidos del ANOVA y los valores medios
obtenidos para cada compuesto voltil y variedad de uva, correspondiente al

236
Captulo IV. Resultados y Discusin

muestro inicial (S0) y despus de un ao de crianza en barrica de roble (S12),


teniendo en cuenta, para cada caso, ambos sistemas de secado (asoleo y en
cmara climtica) y vendimias (2009 y 2010). Como puede verse en la Tabla
40, prcticamente todos los compuestos voltiles se vieron afectados
significativamente (p < 0,01) por uno o ms factores.

steres etlicos

Los steres etlicos de cidos grasos C6, C8 y C10, junto con otros compuestos
voltiles tales como alcoholes superiores, acetatos y ciertos cidos voltiles son
los principales responsables del aroma de fermentacin en vinos (Karagiannis
et al., 2000). En cuanto al factor "tiempo de envejecimiento", ambas variedades
de uva mostraron cambios similares. Como ya se observ para los vinos de
uva Moscatel de la vendimia 2008 envejecidos en barricas de roble, el
contenido de varios steres etlicos (3-metilbutanoato de etilo, pentanodioato
de dietilo y succinato de dietilo) aument significativamente mientras que los
compuestos decanoato de etilo y dodecanoato de etilo disminuyeron a medida
que aumentaba el tiempo de envejecimiento. Cmara et al., (2006) hallaron, en
vinos de Madeira envejecidos en madera de roble durante veinticinco aos,
una disminucin de los steres de etilo de cidos grasos (C6-C16) y de acetatos
as como un elevado incremento de steres etlicos de cidos diprticos como
succinato de dietilo. Chaves et al., (2007) observaron un alto contenido en
acetato de etilo y hexanoato de etilo para vinos dulces Pedro Ximnez
envejecidos en madera. Las reacciones de hidrlisis y esterificacin pueden
afectar a este tipo de compuestos voltiles durante el perodo de
envejecimiento en madera (Cmara et al., 2006; Chaves et al., 2007). Adems, el
alto contenido en etanol que nuestros vinos presentan (17) podran explicar
estos incrementos por reacciones de esterificacin. Sin embargo, hay que tener

237
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

en cuenta que ambas reacciones dependen de diferentes factores, tales como el


pH, temperatura, grado alcohlico, y tipo de cido, por lo que todos ellos
deben ser considerados con el fin de explicar las variaciones en el contenido de
steres etlicos de estos vinos.

En relacin con la variedad de uva, los vinos Moscatel mostraron un mayor


contenido en steres etlicos de cadena larga (Tablas 39 y 40; decanoato de
etilo, dodecanaoto de etilo, tetradecanoato de etilo, hexadecanoato de etilo y
octadecanoato de etilo). Este hecho tambin se observ en un estudio previo
sobre la fraccin voltil de vinos dulces andaluces comerciales de uva Moscatel
y Pedro Ximnez (Mrquez et al., 2007).

Respecto al factor "vendimia", los compuestos butanoato de etilo, hexanoato


de etilo, octanoato de etilo, decanoato de etilo y dodecanoato de etilo fueron
encontrados en mayores cantidades para los vinos de la vendimia 2010 (Tablas
39 y 40). Por un lado, las condiciones climticas parecen tener un claro efecto
sobre el contenido de aminocidos en mostos de uvas (OrtegaHeras et al.,
2014), y por lo tanto una influencia significativa en los compuestos voltiles de
un vino (Hernndez-Orte et al., 2002). OrtegaHeras et al., (2014) observaron
que aos de escasas precipitaciones producan uvas con un elevado contenido
en aminocidos. En la DO Jerez-Xrs-Sherry, las precipitaciones totales de
enero a octubre de las vendimias 2009 y 2010 fueron 275 y 601 l/m2,
respectivamente (MAGRAMA, 2015a). Esta notable diferencia entre los
valores de precipitacin de ambos periodos podra explicar que el factor
vendimia sea significativo para este tipo de compuestos y otros como se ver
ms adelante.

En relacin con la variable tipo de secado, nicamente los steres etlicos de


cadena larga (decanoato de etilo, dodecanoato de etilo, tetradecanoato de etilo,

238
Captulo IV. Resultados y Discusin

hexadecanoato de etilo y octadecanoato de etilo) mostraron diferencias


significativas para ambos tipos de secado, con contenidos ms elevados en los
vinos elaborados a partir de uvas secadas al sol (Tablas 39 y 40).

cidos

En relacin a cidos, el factor ms influyente fue vendimia ya que, al igual


que se observ para los steres de etilo, algunos compuestos presentaron
contenidos ms altos para los vinos de la vendimia 2010 (Tabla 39).

Los factores tiempo de envejecimiento, variedad de uva, y tipo de


secado tuvieron una influencia baja en este tipo de compuestos. El factor
tipo de secado fue significativo slo para cido 2-etilhexanoico.

Acetatos

Respecto a acetatos, acetato de n-butilo, acetato de isoamilo y acetato de


feniletilo mostraron un aumento significativo con el tiempo de envejecimiento
(Tabla 39). Sin embargo, esta evolucin fue diferente a la observada en los
vinos de la vendimia 2008 y a lo descrito por Cmara et al., (2006). Bordiga et
al., (2014) hallaron que ciertos steres de etilo y acetatos tales como acetato de
isoamilo, acetato de 1-hexilo o acetato de 2-feniletilo reducan gradualmente
sus concentraciones, mientras que por el contrario, los niveles de succinato de
dietilo y acetato de isobutilo aumentaron progresivamente, en vinos de uva
Nebbiolo durante su crianza en madera. Ramey y Ough, (1980) encontraron
diferentes evoluciones durante el envejecimiento en madera para algunos
acetatos y steres de etilo en funcin de la variedad de uva empleada. El nivel
inicial post-fermentacin de cada compuesto voltil parece ser crucial para su
posterior evolucin durante la etapa de envejecimiento. Ambos tipos de

239
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

compuestos voltiles pueden hidrolizarse, formarse a travs de esterificacin


qumica, o permanecer constante en concentraciones de equilibrio en funcin
de sus contenidos iniciales.

En lo referente a la influencia del tipo de secado, todos los acetatos mostraron


valores ms elevados para los vinos obtenidos de uvas secadas en cmara
climtica (Tablas 39 y 40). Ruiz et al., (2014) observaron diferencias
significativas en el contenido voltil de mostos de uva Pedro Ximnez secadas
en cmara a dos temperaturas diferentes, por lo que, parece lgico considerar
que las condiciones especficas empleadas para el secado pueden jugar un
papel decisivo sobre algunos compuestos voltiles de los mostos y, por ende,
del vino obtenido.

El factor vendimia, fue significativo para acetato de isoamilo, acetato de


feniletilo y 2-fenil acetato de etilo, con contenidos, en general, ms altos en las
muestras de la vendimia 2010 (Tablas 39 y 40). En este sentido, Dennis et al.,
(2012) observaron que la concentracin post-fermentacin de los acetatos
estaba condicionada por la concentracin en la etapa prefermentativa de sus
respectivos precursores alcohlicos, siendo estos ltimos dependientes de las
condiciones especficas, tanto climticas como de la variedad empleada, de
cultivo y vinificacin.

Terpenos y terpenoles

En cuanto a terpenos y terpenoles, como puede verse en la Tabla 40, los


factores ms importantes fueron "variedad de uva", "tipo de secado" y
"tiempo de envejecimiento". Varios autores (Sanchez-Palomo et al., 2005;
Fenoll et al., 2009) han demostrado que compuestos como linalol, geraniol,

240
Captulo IV. Resultados y Discusin

citronelol y nerol son los principales responsables del aroma floral


caracterstico de la uva Moscatel.

En relacin con el factor envejecimiento, en el envejecimiento de los vinos


de la vendimia 2008, terpenoles como linalol, -terpineol, -citronelol, nerol y
geraniol mostraron disminuciones significativas como el tiempo de
envejecimiento, mientras que sus xidos aumentaron. Estos cambios fueron
mayores en los vinos envejecidos en madera que en aquellos envejecidos en
acero inoxidable. En el presente trabajo, slo farnesol disminuy
significativamente mientras que nerol xido, linalol, timol, carvacrol y -
mirceno mostraron aumentos estadsticamente significativos a medida que
avanzaba el tiempo de envejecimiento (Tabla 39). Varios autores (Marais y Van
Wyk, 1986; Loscos et al., 2010) han observado que algunos monoalcoholes
terpnicos (linalol, nerol, geraniol) pueden transformarse en -terpineol y otros
terpenos durante el envejecimiento y que esta conversin depende de
diferentes factores.

En el caso del factor "tipo de secado", se encontraron cantidades ms altas


para los vinos de uvas pasificadas en cmara (Tabla 39). Ruiz et al., (2010)
observaron que los mostos de uva secada en cmara presentaban los mismos
perfiles aromticos que los obtenidos por el asoleo tradicional, aunque con
valores de actividad odorfera ms altos, en particular los trminos florales y
frutales, que son normalmente atribuibles a terpenoles, steres etlicos y
acetatos.

241
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

Aldehdos, alcoholes y cetonas

Para este tipo de compuestos voltiles, el factor ms importante fue "tiempo


de envejecimiento". Como puede observarse en la Tabla 39, la mayora de
alcoholes y aldehdos mostraron un incremento significativo conforme
aument el envejecimiento en madera. Algunos autores han descrito un
aumento significativo de los alcoholes superiores durante el envejecimiento
(Cmara et al., 2006). En este estudio, 3-metil-2-butanol y 1-hexanol mostraron
dicha tendencia durante el envejecimiento. Para aldehdos, benzaldehdo,
nonanal, octanal, hexanal y 2-hexenal mostraron una clara tendencia al alza
durante el envejecimiento. Chaves et al., (2007) hallaron que ciertos aldehdos
tales como decanal junto con 2,3-butanediona y linalol podran ser utilizados
como marcadores fiables del envejecimiento en madera de vinos Pedro
Ximnez. Estos autores sugirieron que el aumento en las concentraciones de
aldehdos durante el envejecimiento podra ser el resultado de reacciones de
oxidacin de sus precursores alcohlicos. En relacin con el factor
"vendimia", ste fue estadsticamente significativo para 2-hexenal, 6-metil-5-
hepten-2-ona, nonanal y 3-metil-2-butanol con los valores ms altos para los
vinos de la vendimia 2010 (Tabla 39).

Respecto al factor tipo de secado, ste solo fue estadsticamente significativo


para los compuestos 1-hexanol y 2-feniletanol. Como ya se observ
previamente para otros compuestos, este factor tuvo una baja influencia en
esta familia de compuestos voltiles.

Varios

Para este grupo de compuestos, el factor ms significativo fue tiempo de


envejecimiento (Tablas 39 y 40). Los vinos con crianza mostraron mayores

242
Captulo IV. Resultados y Discusin

contenidos de eugenol, 4-etilfenol, 2-furfuraldehido, 5-metilfurfuraldehido y


1,1,6-trimetil-1,2-dihidronaftaleno (TDN, Tabla 40). Algunos autores (Cmara
et al., 2006; Mrquez et al., 2007) han descrito claros aumentos en el contenido
de 2-furfuraldehdo y 5-metilfurfuraldehdo en vinos durante su crianza en
madera. Ambos compuestos se forman por la degradacin de los hidratos de
carbono durante el tostado de la barrica que luego son transferidos al vino
durante el perodo de envejecimiento. Adems, 2-furfuraldehdo y 5-
metilfurfuraldehdo se han encontrado en mostos de uva Pedro Ximnez
despus de su secado al sol (Franco et al., 2004). 2-Furfuraldehdo se produce
por el calentamiento de xilosa y 5-metilfurfuraldehdo a partir de ramnosa. Por
lo tanto, ambos factores, la etapa de envejecimiento en madera y el secado,
podran explicar el contenido encontrado para estos compuestos en los vinos
estudiados. Eugenol exhibi un aumento evidente durante envejecimiento. Se
encuentra presente en la madera de roble sin tostar y su concentracin
aumenta con el proceso de tostado barril, siendo transferido al vino durante el
perodo de envejecimiento (Loscos et al., 2010). En cuanto al compuesto
TDN, presente en los vinos despus de la fermentacin, su contenido fue
mayor para los vinos envejecidos en madera durante un ao. La presencia de
este compuesto en los vinos est principalmente relacionada con el proceso de
maduracin, por degradacin de carotenoides (Chatonnet, 1999). Adems,
como indican algunos autores (Silva Ferreira et al., 2003), y pudo observarse en
los vinos elaborados durante la vendimia 2008, las condiciones de temperatura
y tiempo en la etapa de envejecimiento favorecen el aumento de su contenido.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos a partir del estudio ANOVA, en


el que la mayor parte de los compuestos voltiles se vieron afectados
significativamente por algunos de los factores estudiados, se llev a cabo un
estudio multivariante.

243
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

Tabla 39. Valores medios (reas cromatogrficas relativas) y desviaciones estndar para cada familia qumica.

Familias qumicas de Tiempo de envejecimiento


Variedad de uva Vendimia Tipo de Secado
compuestos voltiles (meses)
0 12 Moscatel PX 2009 2010 Cmara Asoleo

steres de etilo 0,4090,946 0,5551,258 0,5781,091 0,4731,018 0,3710,904 0,6281,140 0,4470,961 0,5821,137
cidos 0,0700,081 0,0830,099 0,0750,077 0,0680,085 0,0540,065 0,0860,095 0,0650,072 0,0780,096
Acetatos 0,2640,389 0,3140,373 0,2650,300 0,2820,334 0,2120,193 0,3380,403 0,2990,305 0,2790,350
Terpenos y terpenoles 0,0170,034 0,0180,059 0,0460,077 0,0030,007 0,0130,048 0,0180,044 0,0200,056 0,0090,026
Aldehidos, cetonas y
0,2360,376 0,3300,485 0,3040,453 0,2890,412 0,2780,403 0,3070,443 0,3130,451 0,2650,382
alcoholes
Varios 0,0060,034 0,0320,057 0,0250,044 0,0260,048 0,0260,046 0,0260,048 0,0240,044 0,0280,051

244
Captulo IV. Resultados y Discusin

Tabla 40. Valores medios (reas cromatogrficas relativas) y desviaciones estndar para cada compuesto voltil estudiado.

Compuestos Voltiles Muestreo reas Relativas p p p p


Pedro tiempo de variedad de tipo de
Moscatel vendimia
Ximnez envejecimiento uva secado
steres de etilo
S0 0,1090,047 0,1100,061
Butanoato de etilo 0,733 0,0152 0,0000* 0,3537
S12 0,1340,034 0,1090,056
S0 0,0190,004 0,0170,006
3-metilbutanoato de etilo 0,0000* 0,0338* 0,0237 0,4503
S12 0,1110,012 0,0930,029
S0 0,9990,531 1,011,02 0,6628 0,1201 0,0000* 0,803
Hexanoato de etilo
S12 1,1290,799 0,7400,531
S0 0,0010,000 0,0040,004 0,0000* 0,3594 0,0156 0,1507
Pentanedioato de dietilo
S12 0,0290,008 0,0260,008
S0 1,521,18 2,452,31
Octanoato de etilo 0,0528 0,4729 0,0000* 0,3658
S12 1,681,25 0,9820,827
S0 0,3690,293 0,4950,400
Decanoato de etilo 0,0000* 0,0043* 0,0000* 0,0000*
S12 0,2550,170 0,0960,086
S0 0,3120,139 0,6861,126
Succinato de dietilo 0,0000* 0,0071* 0,0028* 0,0129
S12 5,300,665 4,421,12
S0 0,0630,052 0,0240,001
Dodecanoato de etilo 0,0035* 0,0000* 0,0001* 0,0052*
S12 0,0320,023 0,0080,010
S0 0,0250,003 0,0150,006
Tetradecanoato de etilo 0,1533 0,0003* 0,4078 0,0079*
S12 0,0180,009 0,0100,008

245
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

Compuestos Voltiles Muestreo reas Relativas p p p p


Pedro tiempo de variedad de tipo de
Moscatel vendimia
Ximnez envejecimiento uva secado
S0 0,0990,060 0,0650,052
Hexadecanoato de etilo 0,1362 0,0030* 0,4672 0,0000*
S12 0,0510,017 0,0430,044
S0 0,0140,008 0,0090,009
Octadecanoato de etilo 0,1072 0,0085* 0,9202 0,0000*
S12 0,0050,001 0,0060,006
cidos
S0 0,0060,003 0,0120,015
cido 2-ethilhexanoico 0,9726 0,0000* 0,0000* 0,0000*
S12 0,0060,002 0,0120,010
S0 0,0980,064 0,1570,134
cido Octanoico 0,1887 0,2243 0,0000* 0,0429
S12 0,1130,052 0,0990,068
S0 0,0060,000 0,0070,003
cido Nonanoico 0,0000* 0,1006 0,4415 0,4323
S12 0,0210,005 0,0160,005
S0 0,0930,056 0,1410,105
cido Decanoico 0,0116 0,4005 0,0000* 0,6451
S12 0,1090,053 0,0860,068
S0 0,0500,030 0,0340,015
cido Dodecanoico 0,3468 0,0001* 0,0039* 0,0372
S12 0,0490,018 0,0370,034
S0 0,0360,003 0,0510,029
cido Tetradecanoico 0,0054* 0,4658 0,8695 0,5192
S12 0,0930,015 0,1040,089
S0 0,1270,031 0,1220,054
cido Hexadecanoico 0,2249 0,4442 0,9436 0,5373
S12 0,1740,043 0,2110,189
Acetatos
S0 0,0040,001 0,0040,001
Acetato de n-butilo 0,0000* 0,0003* 0,0436 0,0000*
S12 0,0300,004 0,0400,013

246
Captulo IV. Resultados y Discusin

Compuestos Voltiles Muestreo reas Relativas p p p p


Pedro tiempo de variedad de tipo de
Moscatel vendimia
Ximnez envejecimiento uva secado
S0 0,7850,464 0,7490,455
Acetato de isoamilo 0,0060* 0,0006* 0,0000* 0,0001*
S12 0,8460,291 0,8540,327
S0 0,0840,076 0,0460,025
Acetato de 2-feniletilo 0,0000* 0,0000* 0,0000* 0,0049*
S12 0,2960,062 0,2090,053
S0 0,1310,090 0,2080,147
2-fenilacetato de etilo 0,3938 0,0000* 0,0000* 0,0000*
S12 0,1710,077 0,2200,084
Terpenos y terpenoles
S0 0,0110,000 0,0000,000
Nerol xido 0,0009* 0,0000* 0,0429 0,0021*
S12 0,0480,014 0,0010,000
S0 0,0130,006 0,0010,000
Linalol xido 0,0163 0,0000* 0,8873 0,0084*
S12 0,0150,003 0,0010,000
S0 0,1810,045 0,0040,002
Linalol 0,0011* 0,0000* 0,9931 0,0069*
S12 0,3370,070 0,0040,002
S0 0,0010,000 0,0000,000
4-terpineol 0,0176 0,0000* 0,8557 0,0068*
S12 0,0020,000 0,0010,000
S0 0,0630,004 0,010,009
terpineol 0,0549 0,0000* 0,7817 0,0177
S12 0,0930,027 0,0020,001
S0 0,1230,103 0,0100,005
citronelol 0,0105 0,0000* 0,0001* 0,0002*
S12 0,0330,026 0,0020,002
S0 0,0370,027 0,0020,001
Nerol 0,6397 0,0000* 0,0022* 0,0002*
S12 0,0290,008 0,0010,000

247
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

Compuestos Voltiles Muestreo reas Relativas p p p p


Pedro tiempo de variedad de tipo de
Moscatel vendimia
Ximnez envejecimiento uva secado
S0 0,0070,004 0,0080,004
Nerolidol 0,8796 0,0000* 0,0235 0,0003*
S12 0,0210,020 0,0230,015
S0 0,0650,003 0,0030,001
Geraniol 0,4596 0,0000* 0,0919 0,0102
S12 0,0890,025 0,0010,000
S0 0,0000,000 0,0010,000
Timol 0,0001* 0,5748 0,0046* 0,0090*
S12 0,0010,000 0,0010,001
S0 0,0010,000 0,0010,001
Carvacrol 0,0001* 0,0153 0,0000* 0,0000*
S12 0,0030,002 0,0020,001
S0 0,0020,000 0,0000,000
mirceno 0,0085* 0,0000* 0,4759 0,2776
S12 0,0020,001 0,0010,000
S0 0,0630,059 0,0360,024
Farnesol 0,0000* 0,0436 0,0000* 0,0027*
S12 0,0120,001 0,0050,008
Aldehdos, cetonas y alcoholes
S0 0,0080,001 0,0060,002
Hexanal 0,0000* 0,0346 0,2857 0,6599
S12 0,0120,002 0,0090,002
S0 0,6280,325 0,6010,165
2-hexenal 0,0000* 0,7338 0,0000* 0,0739
S12 1,010,362 0,9090,210
S0 0,0040,000 0,0060,002
Octanal 0,00027* 0,2992 0,253 0,0612
S12 0,0070,001 0,0060,002
S0 0,0140,002 0,0130,009
6-metil-5-hepten-2-ona 0,3028 0,0000* 0,0068* 0,6166
S12 0,0130,001 0,0110,005

248
Captulo IV. Resultados y Discusin

Compuestos Voltiles Muestreo reas Relativas p p p p


Pedro tiempo de variedad de tipo de
Moscatel vendimia
Ximnez envejecimiento uva secado
S0 0,0160,001 0,0220,006
1-hexanol 0,0000* 0,0008* 0,1913 0,0001*
S12 0,0460,021 0,0360,006
S0 0,0270,003 0,0300,013
Nonanal 0,0008* 0,0872 0,0005* 0,4327
S12 0,0450,004 0,0330,009
S0 0,0300,007 0,0280,022
Benzaldehido 0,0000* 0,5868 0,0689 0,5625
S12 0,1470,036 0,1430,035
S0 0,9130,549 0,7790,211
3-metil-2-butanol 0,0000* 0,0419 0,0000* 0,0313
S12 1,510,618 1,270,257
S0 0,6240,095 0,5800,490
2-feniletanol 0,0107 0,0021 0,0909 0,0000*
S12 0,8160,188 0,9490,427
Varios
S0 0,0140,003 0,0160,007
Fenol 0,0193 0,3855 0,0734 0,9031
S12 0,0210,004 0,0230,015
S0 0,0000,000 0,0000,000
Eugenol 0,0000* 0,0000* 0,0001* 0,0523
S12 0,0180,003 0,0120,002
S0 0,0000,000 0,0010,000
4-etilfenol 0,0000* 0,0003* 0,7184 0,1561
S12 0,0010,000 0,0010,000
S0 0,0180,002 0,0190,005
2-furaldehdo 0,0000* 0,547 0,6292 0,045
S12 0,1800,051 0,1940,063
S0 0,0020,001 0,0020,001
5-metilfuraldehdo 0,0000* 0,1261 0,8953 0,0019*
S12 0,0530,017 0,0600,018

249
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

Compuestos Voltiles Muestreo reas Relativas p p p p


Pedro tiempo de variedad de tipo de
Moscatel vendimia
Ximnez envejecimiento uva secado
1,1,6-trimetil-1,2- S0 0,0010,000 0,0020,002
0,0002* 0,2822 0,034 0,0148
dihidronafthaleno (TDN) S12 0,0030,001 0,0040,002
2,6-di-tert-butil-p-cresol S0 0,0020,001 0,0040,002
0,6875 0,0371 0,0000* 0,0068*
(BHT) S12 0,0030,002 0,0030,001
S0: inicial; S12: 12 meses de envejecimiento en madera. *Valores significativos para p 0,01, TDN: 1,1,6-trimetil-1,2-dihidronaftaleno; BHT: 2,6 di-tert-
butil-p cresol.

250
Captulo IV. Resultados y Discusin

IV.II.2.2.2. Anlisis de conglomerados (AC)

La matriz de datos fue sometida a un anlisis de conglomerados de


aglomeracin jerrquica de casos, tomando la distancia eucldea al cuadrado
como mtrica y el mtodo de Ward como criterio de enlace. El dendrograma
obtenido se muestra en la Figura 58. En l, se pueden distinguir dos grandes
grupos: un clster para los vinos de uva Moscatel (1) y otro para los vinos de
uva PX (2). Adems, en el interior de cada uno se puede observar una clara
influencia del factor vendimia.

(X 1000)
8

6
Distance

0
2222222222222222222222222222222222222222 2222222222222222222222222111111
1111
111111111111111
111111111111111111111

2009 2010 2009 2010

Figura 58. Dendograma, v. 2009 y 2010. 1: Moscatel; 2: Pedro Ximnez.

Por lo tanto, teniendo en cuenta globalmente el perfil voltil, podemos decir


que ste ha demostrado poseer suficiente poder explicativo para detectar la
variedad de uva empleada y la vendimia a la que corresponden los vinos.
Parece que estos dos factores, variedad y vendimia, fueron parmetros ms
influyentes en el perfil voltil de los vinos estudiados que el tiempo de
envejecimiento o tipo de secado. Esta misma diferenciacin se observ en un

251
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

estudio previo llevado a cabo sobre la caracterizacin de la fraccin voltil de


vinos dulces andaluces comerciales (Mrquez et al., 2007).

En este sentido, Ortega-Heras et al., (2004) observaron que no todas las


variedades de uva tienen la misma capacidad de extraccin de la madera y que
el envejecimiento en barrica puede acentuar las diferencias del aroma varietal.

IV.II.2.2.3. Anlisis de componentes principales (ACP)

Para corroborar los resultados obtenidos a partir del anlisis de conglomerados


(AC) y evaluar los compuestos voltiles que permitan la diferenciacin de los
vinos estudiados, la matriz de datos fue sometida a un anlisis de componentes
principales (ACP). Se extrajeron 10 CPs (componentes principales) que
explicaron el 87,3% de la varianza total. La Figura 59 muestra la matriz de los
vinos sobre el plano definido por los dos primeros componentes principales.
Estas dos primeras CPs explicaron el 50,1% de la varianza encontrada entre las
muestras (30,8 y 19,1%, respectivamente). Como se puede observar en dicha
figura, los vinos se diferenciaron segn la variedad de uva, con valores
positivos para ambas CPs para los vinos de uva Moscatel. Los compuestos
voltiles con un mayor peso en estos componentes principales fueron:
terpenoles como linalol, 4-terpineol, geraniol, nerol; algunos steres de etilo
(acetato de 3-metilbutanoato, succinato de etilo y pentanodioato de dietilo); y
acetatos (acetato de feniletilo, acetato de n-butilo y octanoato de etilo). Todos
estos compuestos voltiles son compuestos varietales y/o se forman durante el
proceso de fermentacin alcohlica (Schreier y Jennings, 1979; Rapp y
Mandery, 1986).

252
Captulo IV. Resultados y Discusin

11
1
1
7
1 1
2 1
2 1 1
2 22 2 111
2 21
Component 2

3 2 2 1 1
2 12 1 111
22 2 2 2 22
1 11
1 1 1 111
11 1 1
2 22 2 11
2 2 2
22 2 2 12 1
2 22 2 11 1 1
-1 2 22 22 2 2 22
2 2
2
1 11
2 22 2
2 2 2
2 2
22 2 22 2
2 2 2 2 22 2 2 2
22 22
2 2 22 2
2 2
-5 2
22
2
2
2
-9
-7 -4 -1 2 5 8 11
Component 1

Figura 59. Anlisis de componentes principales (ACP) de todas las muestras, V.2009 y 2010. 1:
Moscatel; 2: Pedro Ximnez.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos a partir del ACP realizado para
todas las muestras, se decidi llevar a cabo dos nuevos ACPs, pero en este
caso, se estudiaron por separado ambas variedades de uva. Para los vinos
Moscatel, se obtuvieron nueve CPs, que explicaron el 92,8% de la varianza
total, de los que un 53,8% de sta fue explicada por las dos primeras CPs. En
el caso de los vinos de PX, el 87,4% de la varianza total qued explicada con
diez CPs. La Figura 60 muestra la distribucin de los dos vinos varietales sobre
el plano definido por las primeras CPs. Como puede verse, para cada variedad
de uva, los vinos se separaron de acuerdo a tiempo de envejecimiento. Para los
vinos Moscatel, aquellos vinos envejecidos en madera durante 5, 9 y 12 meses
presentaron valores positivos para la CP1 mientras que para los vinos PX, esos
vinos envejecidos durante un mayor perodo de tiempo (5 meses o ms)
mostraron valores negativos para esta CP. Los pesos de cada compuesto
voltil en la CP1 muestran claramente que los compuestos voltiles
relacionados con el envejecimiento en madera (2-furfuraldehdo, benzaldehdo,
5-metilfurfuraldehdo, eugenol y 4-etilfenol) son los principales responsables

253
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

de la CP1, con valores positivos para los vinos Moscatel y valores negativos
para los vinos PX.

9
a
1
6
1 5 12
12
0 9
3 3
Component 2

0 1 3 3
5 9
1 3
9 12
0
55 9
12

-3 0 1
0 1 3
3 12 12
33 9
5 9 9 12 12
5 9
5
-6
-7 -4 -1 2 5 8

Component 1
Vintage 2009
Vendimia 2009
10
b
12
7 12 9
0
9 0 0
1
12 3
4 12 3
12
Component 2

1 0
12
12 55
5 99 9
12 12 9
12
5 3
1 1
5 12 55 3
129 3
99
3 3
9 9 3
9 00
-2 5 3 5
3 1 1 1
5 5 3 1
11 0 0
3 1 1 0
-5 0 0 0

-9 -6 -3 0 3 6 9
Component 1

Vintage 2009
Vendimia 2009

Figura 60. Anlisis de componentes principales para vinos: a) Moscatel; b) Pedro Ximnez. 0, 1,
3, 5, 9 y 12 meses de envejecimiento.

254
Captulo IV. Resultados y Discusin

Para cada variedad de uva, los vinos de la vendimia 2009 mostraron valores
negativos para la CP2, por lo que esta componente parece estar relacionada
con el factor "vendimia". En ambos casos, los principales contribuyentes, con
valores positivos, a esta CP fueron algunos steres de etilo (butanoato de etilo,
hexanoato de etilo, octanoato de etilo, decanoato de etilo y dodecanaoto de
etilo) y cidos (cido octanoico, cido decanoico y cido dodecanoico). La
mayora de estos compuestos voltiles se forman durante la fermentacin
alcohlica y su contenido en el vino depende de la composicin en
aminocidos del mosto (Hernndez-Orte et al., 2002). En el estudio ANOVA
previo, el factor vendimia mostr una influencia significativa en la mayora
de estos compuestos. Como ya se apunt, la gran diferencia entre los valores
de precipitacin de ambas vendimias (MAGRAMA, 2015a) podra explicar el
alto valor de significancia de este factor en el contenido voltil de los vinos
estudiados.

En resumen, a partir de los resultados obtenidos, podemos afirmar que el tipo


de secado fue el factor menos influyente en los perfiles voltiles de los vinos
dulces de Jerez estudiados, siendo tiempo de envejecimiento, variedad de
uva, y vendimia, factores ms significativos que ste. Teniendo en cuenta el
perfil voltil global, variedad de uva y vendimia han demostrado ser los
factores con mayor influencia sobre el contenido voltil de los vinos.

255
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

IV.II.3. ANLISIS SENSORIAL

Constitucin del panel de cata de vinos dulces, y elaboracin de la ficha


de cata para la evaluacin descriptiva

El grupo de jueces inicial estuvo constituido por PDI y PAS de la Universidad


de Cdiz con experiencia previa en estudios sensoriales de otros productos,
por lo que ya conocan los aspectos generales de esta metodologa. Las
sesiones se llevaron a cabo con periodicidad semanal.

El entrenamiento dur 3 meses, e incluy: pruebas de reconocimiento y


clasificacin de notas aromticas, en extractos concentrados y en disolucin
hidroalcohlica al 15%; identificacin de familias de notas aromticas
mediante agrupamiento de extractos; pruebas de ordenamiento de intensidades
de estmulos olfativos en disolucin hidroalcohlica al 15% para el
establecimiento de niveles de intensidad de algunos de los descriptores; en los
restantes descriptores, los valores medio y/o mximo de referencia se
establecieron en base a los encontrados en determinadas muestras reales
previamente caracterizadas. El panel definitivo estuvo constituido por 14
jueces.

La validacin del mismo (UNE 87024-1, 1995) incluy un anlisis de la


repetibilidad de sus juicios sobre muestras idnticas, calculndose las
desviaciones absolutas de las rplicas y descartndose aquellos jueces que
presentaron un n significativo de desviaciones mayores de 2 unidades en una
escala de 9 puntos. Para confirmar la capacidad de identificacin de aromas de
los jueces seleccionados tras la prueba de repetiblidad, as como su capacidad
de discriminacin, se sometieron a ANOVA los datos recogidos.

256
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55

257

Persistencia
Intensidad aromtica
Fresco
Afrutado
Uva
Manzana
Pera
Pltano
Meln
Frutas exticas/tropicales
Pia
Mango
Melocotn
Ciruela
Ctrico
Naranja
Pomelo
Higo
Macedonia
Pltano maduro
Mermelada
Frutas maduras
Orejones
Higo seco
Frutas secas
Frutos secos
Todas frutas maduras
Todas frutas secas
Todas frutas
Dulces
Dulce, melaza
Pasa, uva pasa
Ciruela pasa
Floral
Jazmn
Acacia
Miel
Rosa, pomarosa
Flores silvestres
Flores blancas
Todas flores
Vegetal
Herbceo
Paja cortada y hmeda
Raspn, escobajo
Madera verde
Madera, roble
menta
hierbabuena
Todo vegetal
Qumico
Pegamento, acetato etilo
Disolvente, barniz
Medicinal, aldehdico
Resina
Plstico
Todos qumicos
Tostados
Regaliz
caf
caramelo tostado
chocolate
Todos tostados
Especiado
Vainilla

Figura 61. Grfico de frecuencia de los descriptores ms empleados.


Tomillo
Clavo
curry
canela
Todos espaciados
Secundarios
Vinoso
Alcohol, licor
Fermentacion, vinoso, alcohol
Oxidacion
Enmohecido, hongo
Terroso
Trufa
Todos humedad
Otros Defectos
Pesado
Cerrado
Sucio
Sudor
Envejecido
Alquitrn
Leja
Limpiador de cristales
Tierra seca, polvo
Todos defectos
Captulo IV. Resultados y Discusin
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

Como etapa previa a la realizacin de pruebas descriptivas, se llevaron a cabo


sesiones para la generacin de los descriptores tiles para definir los vinos
dulces objeto de investigacin. Para ello, se presentaron varios de ellos,
solicitando a los jueces que describieran su aroma tras una tormenta de ideas.
De acuerdo a los grficos de frecuencia obtenidos (Figura 61), los descriptores
ms utilizados, aquellos con frecuencia mayor de 5 en el total, se sometieron a
discusin de grupo, hasta llegar a un consenso respecto a cul deba ser la
seleccin ms apropiada. Se decidi asimismo agrupar los descriptores
negativos en dos subgrupos, llamados qumico (disolvente, medicinal) y humedad
(hongo, terroso y otros relacionados) e incluir la intensidad aromtica,
disendose de esta forma la hoja de cata para vinos dulces mostrada en el
captulo anterior.

IV.II.3.2. ESTUDIO SENSORIAL DE LOS MOSTOS Y LOS


DISTINTOS SISTEMAS DE SECADO DE UVA

En la vendimia 2008, los mostos concentrados obtenidos por secado de las


uvas de acuerdo al sistema tradicional fueron comparados con los secados en
condiciones controladas, en cmara climtica, mediante prueba triangular (14
jueces, nivel de riesgo =0.05), y como resultado, 10 de los jueces para el caso
de los mostos de Moscatel, y 8 para los de PX, identificaron la muestra
distinta. Dado que el mnimo nmero de juicios coincidentes para poder
afirmar que se percibe diferencia es de 8, esta diferencia, entre baja y media
segn el criterio de los jueces, fue detectada. Con objeto de identificar las notas
aromticas que explicaban esta diferencia, se aplic el anlisis de la varianza a
las puntuaciones obtenidas para los distintos descriptores en la prueba
descriptiva a la que se someti a estos mostos. Los resultados se muestran en
la Tabla 41.

258
Captulo IV. Resultados y Discusin

En cuanto a las notas positivas, solo las afrutadas y a pasas parecen diferenciar
con alguna significancia estadstica (p < 0,05) los mostos de uvas pasificadas
mediante los distintos sistemas (1T y C). Adicionalmente, los mostos
procedentes de cmara climtica presentaron una menor intensidad del defecto
aromtico, que se defini como olor a humedad. Segn se deduce de los valores
del descriptor impresin general, el mosto PX secado en cmara climtica se
prefiere claramente al de asoleo, sin que se perciba diferencia entre los
correspondientes mostos de Moscatel.

Moscatel PX

Descriptor Cmara Cmara


Asoleo p Asoleo p
climtica climtica
Intensidad
4,51,4 4,21,3 0,152 4,51,4 4,31,0 0,817
aromtica
Afrutado 3,91,2 4,70,8 0,045* 4,01,5 5,52,8 0,079

Ctrico 1,11,4 0,91,3 0,215 1,21,6 0,71,0 0,535


Fruta madura 3,42,2 2,62,0 0,276 3,31,8 3,01,8 0,876

Dulce 2,91,6 3,01,6 0,138 3,31,9 3,51,7 0,880

Uva pasa 3,31,2 4,51,5 0,049* 2,01,6 2,31,7 0,096


Floral 2,01,9 1,71,6 0,557 1,31,6 2,22,6 0,516
Miel 1,21,6 2,32,5 0,345 1,82,4 2,31,9 0,701
Herbceo 1,91,4 1,21,9 0,219 1,60,6 1,70,7 0,305
Vinoso 0,91,7 1,21,9 0,337 1,22,0 0,30,8 0,375
Lcteo 0,40,9 0,51,1 0,216 0,50,8 0,00,0 0,174
Defecto
1,92,2 1,31,8 0,099 3,21,8 1,20,9 0,104
(humedad)
Qumico 0,10,5 0,20,5 0,125 0,30,5 0,00,0 0,144
Impresin
3,81,9 3,61,7 0,115 2,52,3 4,70,8 0,051*
general
Tabla 41. ANOVA aplicado a los valores de intensidad (media desviacin estndar) de los
atributos usados para describir el perfil aromtico de los mostos de 2008. *p <0.05 indica
diferencia significativa.

259
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

A partir de estos datos, puede observarse que aun cuando el entrenamiento de


los jueces y la deteccin y eliminacin de puntuaciones outliers minimiza la
dispersin en los juicios para una misma muestra, no resulta sencillo confirmar
diferencias estadsticamente significativas tras ANOVA cuando se trabaja con
datos sensoriales. Si se consideran las muestras analizadas a lo largo de 3 aos,
esta dificultad es an mayor, por lo que para el estudio conjunto de los mostos
de las vendimias 2008, 2009 y 2010, evaluados mediante pruebas descriptivas,
se opt por realizarlo de manera multivariante. Para ello se aplic Anlisis de
Componentes Principales al conjunto de las puntuaciones de los mostos de las
tres vendimias, y como resultado se extrajeron 4 componentes principales (en
adelante CP), que explicaron en conjunto un 86.7% de la varianza original. Los
pesos de los descriptores sobre las distintas componentes principales (Tabla
42) parecen relacionar la CP1 con el proceso de secado (al estar altamente
correlacionada con los descriptores fruta madura, dulce y pasa), la CP2 con una
mayor complejidad aromtica (intensidad aromtica, ctrico, floral) que contribuye a
la mejor impresin general, y las CP3 y CP4 con notas negativas.

Varianza explicada CP1 (40,1%) CP2 (22.6%) CP3 (16,1%) CP4 (7,9%)

Intensidad aromtica 0,502003 0,733749 0,027126 -0,038672

Afrutado 0,622845 0,476515 0,455348 0,103179

Ctrico -0,095971 0,955649 -0,081311 0,034791

Fruta madura 0,897554 0,103971 -0,107622 -0,241452

Dulce 0,931977 0,051122 -0,163870 0,140769

Pasa 0,887350 -0,131408 0,199389 0,021934

Floral -0,070104 0,900625 -0,153500 0,184836

Miel 0,614664 0,636950 0,134193 -0,210429

Herbceo -0,146666 0,057705 0,861851 -0,183135

260
Captulo IV. Resultados y Discusin

Varianza explicada CP1 (40,1%) CP2 (22.6%) CP3 (16,1%) CP4 (7,9%)

Vinoso -0,661611 -0,578628 0,039030 0,172800

Lcteo -0,021407 -0,349031 0,815615 0,114907

Humedad 0,201358 -0,099153 0,877597 0,288109

Qumico 0,088378 -0,139244 -0,115207 -0,955202

Impresin general 0,172006 0,940111 -0,189234 0,075440

Tabla 42. Pesos de los distintos descriptores sensoriales sobre los componentes principales
(rotacin varimax).

Cuando se proyectaron las muestras sobre los planos de las CPs del nuevo
espacio (Figura 62), se observ que, respecto a la CP1, las muestras de cmara
climtica se situaban a la derecha de aquellas procedentes del asoleo tradicional
en el centro de investigacin (1T). Por su parte, la CP2 situ los mostos de
Moscatel en la mitad superior, atribuyndoles un carcter aromtico ms
complejo y apreciado (Figura 62.(a)). Resulta interesante que solo el mosto PX
de 2008 secado en cmara se ubicase en esta rea. Respecto a las CP3 y CP4
(Figura 62.(b)), permitieron agrupar y diferenciar de manera clara las tres
vendimias en funcin de descriptores aromticos con connotaciones extraas
o directamente defectuosas, de mayor intensidad hacia la derecha y hacia abajo,
respectivamente. De este modo, los mostos de 2010, independientemente de la
variedad o sistema de pasificado, fueron situados sobre el plano CP3-CP4 en
las posiciones ms alejadas de los descriptores negativos (lctico, humedad,
herbceo y qumico), lo cual podra confirmar el efecto principal que ejerce el
ao de vendimia sobre la calidad de los mostos. Adems, es interesante
destacar que los mostos Moscatel de la vendimia 2009 elaborados con uvas
secadas en cmara climticas se localizaron tambin en esta rea.

261
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

2,0
V10.M.C
a) Asoleo en CAIV: 1T
Cmara climtica: C
V10.M.1T
1,5 Asoleo en via: 2T
Uva fresca: Ini
Ctrico
Impresin General
1,0 Floral
Intensidad Aromtica
V09.M.C Miel
V09.M.Ini Afrutado
0,5 V08.PX.C
Fruta madura
V08.M.Ini
HerbceoV08.M.1T
V08.PX.Ini Dulce
PC2

0,0 Hum
icoedad
P

Qum Pasas
V08.M.C
V09.PX.C
V09.PX.Ini Lcteo
V09.PX.2T
-0,5 Vinoso V08.PX.1T

-1,0 V10.PX.C V10.PX.2T


V10.PX.1T

-1,5
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

PC1

1,5
V10.PX.2T
b) 1,0 V10.PX.1T V10.PX.C
V10.M.C V08.PX.1T
V08.M.Ini
V08.M.C V08.PX.C
0,5 V10.M.1T Floral
Dulce Hmedad
V09.M.CImpresin general
Vinoso
Afrutado LcteoV08.M.1T
Ctrico Pasas
Intensidad Aromtica
0,0
Miel
Fruta Madura Herbceo
V08.PX.Ini

-0,5
PC4

V09.M.Ini Qumico
-1,0
V09.PX.Ini
-1,5
V09.PX.C
V09.PX.2T
-2,0 vendimia 2010: V10
vendimia 2009: V09
vendimia 2008: V08
-2,5
-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

PC3

Figura 62. ACP de los mostos de uvas pasificadas por ambos sistemas de secado, en cmara
climtica (C) y soleo tradicional (1T, en el centro de investigacin; 2T, en via). Proyecciones de
las muestras sobre (a) CP1-CP2 (b) CP3-CP4.

IV.II.3.3. EFECTO DE LAS CONDICIONES DE VINIFICACIN


SOBRE EL PERFIL SENSORIAL DE LOS VINOS DULCES

Los vinos obtenidos de acuerdo a las distintas condiciones de vinificacin


(vendimia 2008) se sometieron a pruebas triangulares para evaluar si los jueces

262
Captulo IV. Resultados y Discusin

detectaban diferencias que indicaran significancia del correspondiente factor


de variacin. Los resultados se muestran en la Tabla 43.

Presentan
N de Intensidad
Vinos los vinos
Factor Niveles respuestas de la
comparados diferencia
correctas diferencia
significativa?
Levadura S.cerevisiae E3
11 S 1,7
(TA) S.bayanus E5

No E1
Adicin de N 9 S 2,5
S E2

Maceracin No E1
9 S 1,8
pelicular S E3

T / T.B./S. bayanus E4
7 No -
Levadura T.A./S. cerevisiae E1

Tabla 43. Resultados de las pruebas discriminativas triangulares realizadas sobre los vinos de
2008. Intensidad de la diferencia: 0=Ausencia; 1=Dbil; 2=Media; 3=Fuerte; 4=Muy fuerte.
T.B.: Temperatura baja. T.B.: Temperatura alta.

Para 13 juicios, y =0,05, el n mnimo de respuestas correctas para confirmar


que existe diferencia perceptible es 8. As, los jueces percibieron diferencia
entre los vinos obtenidos con Saccharomyces cerevisiae frente a los elaborados con
Saccharomyces bayanus, cuando se trabaj a temperatura ambiente (E3 vs E5).
Tambin entre los vinificados con y sin adicin de fosfato amnico como
complemento de nutricin de las levaduras (E2 vs E1). Y adicionalmente,
entre los elaborados con maceracin pelicular en presencia de enzimas
pectolticas y sin ella (E1 vs E3). Sin embargo, no se pudo concluir diferencia
significativa entre los vinos obtenidos a baja temperatura y a temperatura
ambiente, con las levaduras adecuadas en cada caso (S. cerevisiae vs S. bayanus).
Las intensidades de las diferencias detectadas fueron entre medias y fuertes.

263
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

Para la comparacin global de los vinos, en una sesin distinta se pidi a los
jueces que los ordenaran de acuerdo a su preferencia. Siendo N=17, =0,05, y
5 el n de muestras, el valor del estadstico F del test de Friedman (anlisis de
la varianza para ordenaciones) a superar es 9,5. Calculado el valor experimental
(9,8), se confirma la existencia de diferencia significativa entre dos o ms de los
vinos. Para determinar cules son significativamente distintos se calcul la
Mnima Diferencia Significativa (MSD) para el riesgo asumido (=0,05). La
secuencia E41 > E11 > E31,2 > E52 > E22 describe el orden de preferencia
decreciente del panel, donde distintos superndices indican vinos con
diferencia significativa en cuanto a la impresin general. De acuerdo a estos
resultados, parece apuntarse la preferencia por los vinos jvenes fermentados a
baja temperatura con levadura especializada (S. bayanus) (E4), si bien la
diferencia con los obtenidos con S. cerevisiae a TA (E1) no resulto significativa.
Los vinos peor calificados fueron aquellos que utilizaron adicin de nitrgeno
(E2), seguidos de los que practicaron maceracin pelicular en presencia de
enzimas pectolticas (E3 y E5).

Los vinos se sometieron adems a anlisis sensorial descriptivo, utilizando para


ello la hoja de cata que puede encontrarse en la Figura 34 (ver seccin III.III.3.
Anlisis sensorial). El anlisis de la varianza de los datos, cuyos resultados se
muestran en la Tabla 44, sugiri que los descriptores floral y ctrico fueron los
mejores a la hora de diferenciar entre algunos de ellos. El mejor valorado de
acuerdo a la prueba de preferencia, aquel fermentado a baja temperatura con S.
bayanus (E4) present unas ms intensas notas ctricas y florales, mientras que
el elaborado con una fuente adicional de nitrgeno, E2 (que ocup el peor
lugar en el ordenamiento por preferencia), se caracteriz por unas muy bajas
intensidades en aromas ctricos y afrutados y un clara nota qumica.
Sorprendentemente, los vinos en cuya elaboracin se realiz maceracin

264
Captulo IV. Resultados y Discusin

pelicular (E3 y E5), caracterizados por altas puntuaciones en los aromas


florales y afrutados, no fueron sin embargo los preferidos.

Descriptores E1 E2 E3 E4 E5 p
Intensidad
4,10,5 4,20,6 4,40,6 4,10,5 4,20,5 0,97
aromtica
Afrutado 4,20,3 2,70,4 3,80,3 4,10,4 3,80,5 0,11
Ctrico 2,20,72 1,40,51 2,80,32,3 3,10,43 2,70,32,3 0,04
Fruta madura 1,90,4 1,50,6 2,10,4 1,70,5 1,40,4 0,87
Dulce 2,30,6 2,00,6 3,50,6 2,30,7 1,40,5 0,37
Pasas 1,90,5 1,60,5 2,20,4 2,30,4 1,10,3 0,84
Floral 3,60,81,2 3,00,71 3,90,51,2 4,10,62 4,00,82 0,07
Miel 0,90,2 0,80,4 1,50,5 1,20,3 1,10,5 0,54
Herbceo 1,10,4 2,10,6 1,30,6 1,40,5 1,90,7 0,83
Vinoso 2,50,5 2,30,7 2,50,5 2,90,6 2,80,6 0,87
Lcteo 0,20,3 0,50,3 0,50,3 0,50,3 0,50,4 0,99
Humedad 0,60,3 1,10,4 1,10,6 0,90,4 1,50,5 0,86
Qumico 0,80,3 2,10,3 0,60,3 1,00,3 0,80,2 0,43
Impresin
4,40,43 2,50,61 3,10,51,2 4,50,53 3,80,52,3 0,05
general

Tabla 44. ANOVA aplicado a los valores de intensidad (media desviacin estndar) de los
atributos usados para describir el perfil aromtico de los vinos de 2008. p < 0,05 indica diferencia
significativa. Para un descriptor, los vinos con distintos superndices se perciben
significativamente distintos (Test de Tukey).

IV.II.3.4. INFLUENCIA DEL SISTEMA DE SECADO SOBRE EL


PERFIL SENSORIAL DE LOS VINOS DULCES

A la ya confirmada influencia de factores como el ao de cosecha o la variedad


de uva sobre el perfil sensorial de los mostos, se suma en el caso de los vinos
un tercer efecto, el relacionado con el proceso de vinificacin, que dificulta la
extraccin de conclusiones sobre cmo afecta el sistema de secado al perfil
sensorial de los vinos dulces. Por ello, en un intento de identificar los
descriptores con mayor capacidad de discriminacin, los datos sensoriales de

265
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

los distintos vinos elaborados en cada vendimia bajo las mismas condiciones
de fermentacin, y con cada variedad de uva secada por asoleo (1T y 2T) y en
cmara climtica, se estudiaron mediante ANOVA, con el sistema de secado
como factor de variacin. Previamente, se eliminaron del tratamiento de datos
los descriptores lcteo, madera nueva y herbceo, por presentar muy bajas
puntuaciones (< 1).

Solo a los datos correspondientes a los descriptores preseleccionados segn


ANOVA, ctrico, fruta madura, dulce, pasas y roble, se les aplic un Anlisis de
Componentes Principales, del que se extrajeron 3CPs que explicaban un 88,4%
de la varianza inicial de los datos. Tal como se puede ver en la Tabla 45, la CP1
se correlacion de manera positiva con las notas frutas maduras, dulce y pasas,
CP2 con ctrico, mientras que CP3 present una alta correlacin con la nota
aromtica de roble. La proyeccin de las muestras sobre el plano CP1-CP3 se
ha simplificado con el objeto de poder visualizar las diferencias y tendencias,
mostrndose en la Figura 63 tan solo los vinos sin envejecimiento (S0) y tras
un periodo de un ao del mismo (S12), si bien se incluyen datos de las distintas
vendimias y variedades del estudio.

Descriptor CP1 (55,4%) CP2 (20,9%) CP3 (12,1%)


Ctrico -0,030995 -0,985900 -0,087286
Frutas maduras 0,874189 0,035405 0,220500
Dulce 0,916571 0,157877 0,130214
Pasas 0,765362 -0,176469 0,385046
Roble 0,294662 0,121656 0,937320

Tabla 45. Pesos de los descriptores preseleccionados sobre los cuatro CPs. Entre parntesis, la
varianza explicada por cada CP. Rotacin Varimax.

Lo ms caracterstico, y previsible por otra parte, fue el agrupamiento de los


vinos envejecidos en la mitad superior del grfico (muestras S12), dada la

266
Captulo IV. Resultados y Discusin

relacin de este eje CP3 con la intensidad del olor a roble caracterstico del
contacto con la madera. En cuanto a la interpretacin de la posicin de los
vinos en relacin al eje horizontal CP1, las muestras de cmara climtica de
cada vendimia y variedad, se desplazaron hacia la derecha con el tiempo de
envejecimiento (de C.S0 a C.S12), es decir, aumentaron en intesidad las notas
aromticas que estn relacionadas con el proceso de secado (pasas, fruta
madura, dulce). Sin embargo, los vinos elaborados con uvas asoleadas por el
sistema tradicional, que presentaban valores elevados antes del proceso de
envejecimiento (muestras T.S0) mostraron un comportamiento irregular, con
un ligero aumento o incluso un claro descenso tras 12 meses de
envejecimiento (T.S12).

Por ltimo, resulta interesante precisar el efecto del envejecimiento en la


comparacin entre sistemas de secado a la luz de los datos recogidos en la
Figura 63, en la que se observa un claro acercamiento en CP1 de las muestras
correspondientes a un mismo vino procedente de uvas pasificadas mediante
los diferentes sistemas, tras el periodo de envejecimiento. Este ocurre porque
si bien los vinos de cmara aumentan su puntuacin en CP1, los de secado
tradicional, por el contrario, la disminuyen. En definitiva, se confirm un
efecto amortiguador del envejecimiento sobre las diferencias iniciales de los
vinos debidas al sistema de pasificado de la uva de la que proceden.

267
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

3
V08.M
V09.M
V09.PX
2 V10.M
C.S12
V10.PX
C.S12
T.S12

1 RobleT.S12
C.S12
Pasas
Fruta Madura
C.S12 Dulce
C.S0
0 Ctrico T.S12
PC3
P

C.S12 T.S0
C.S0
T.S0
-1 C.S0
C.S0

C.S0
-2 T.S0

-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0

PC1

Figura 63. Proyeccin sobre CP1-CP3 de los vinos con (S12) y sin (S0) envejecimiento de las
distintas vendimias y variedades obtenidos con uva secada en cmara climtica (C) y de manera
tradicional (1T y 2T).

IV.II.3.5. INFLUENCIA DEL SISTEMA Y TIEMPO DE


ENVEJECIMIENTO SOBRE EL PERFIL SENSORIAL DE LOS
VINOS DULCES

Los datos del anlisis sensorial descriptivo de los vinos de 2008 que se
sometieron a envejecimiento en bota de roble, por contacto con chips de roble
y sin presencia de madera, se trataron mediante Anlisis Lineal Discriminante
para seleccionar los descriptores que mejor diferenciasen los sistemas de
envejecimiento. El mtodo usado fue el secuencial hacia adelante, con unos
estadsticos F de entrada y salida de variables en el modelo de 1 y 0
respectivamente. Las variables incluidas en el modelo fueron, de mayor a
menor poder de discriminacin: roble, impresin general, vinoso, pasas, ctrico
(hasta aqu p < 0,05), defecto, miel, afrutado, dulce, frutas maduras. El modelo
permite un 86,9% de clasificacin correcta de las muestras, lo cual confirma

268
Captulo IV. Resultados y Discusin

su bondad y la idoneidad de las variables seleccionadas. De todas ellas, solo las


de p < 0,05 se han utilizado para representar los datos, previa transformacin
en sus Componentes Principales. El ACP (Tabla 46) extrajo 2 CPs que
explicaron un 62% de la varianza inicial, estando la CP1 bien correlacionada
con las notas pasa y roble, y con la impresin general. La CP2 por su parte solo
present una alta correlacin negativa con el aroma ctrico.

Descriptor CP1 (39,5%) CP2 (22,8%)


Ctrico 0,018727 -0,896119
Pasas 0,791534 0,158282
Roble 0,775486 0,155342
Vinoso -0,060317 -0,480197
Impresin General 0,862869 -0,244847

Tabla 46. Anlisis de componentes principales. Pesos de los CP tras rotacin varimax
normalizada. Entre parntesis, la varianza explicada por cada CP.

La Figura 64 muestra la situacin de los vinos Moscatel de 2008 en el plano de


los dos CPs. Los madurados sin contacto alguno con madera, en recipientes de
acero inoxidable y al abrigo del aire (S) se caracterizaron en general por unas
menores puntuaciones en CP2, o lo que es lo mismo, una mayor intensidad en
la nota ctrica caracterstica de la variedad Moscatel, que parece conservarse en
estos vinos. Los vinos envejecidos en bota de roble (B) se proyectaron en la
mitad derecha del eje correspondiente a la CP1, y esto implica una mayor
percepcin de aroma a roble, como era previsible, pero tambin a pasas, lo
cual parecer contribuir a la mejor impresin general. Respecto a los vinos
envejecidos en contacto con chips de roble, su ubicacin en el plano le
confiere atributos atenuados tanto en CP1 como en CP2, es decir, menores
intensidades en los descriptores relacionados, que son todos de carcter
positivo, por lo que no se present como la mejor alternativa de
envejecimiento.

269
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

2 Ch Ch
Ch
Ch Ch Ch B
Ch
1 Ch Ch B
S B
B
ChS Ch B PasasB B B
B S Roble B
S S
Ch
0 S Ch B B
SImpresin B
B General
Vinoso
S B
Ch
Ctrico
PC2

-1 S SS S
P

S S
S Ch

-2

S
-3

-4
-3 -2 -1 0 1 2 3

PC1

Figura 64. Proyeccin sobre el plano CP1-CP2 de los vinos Moscatel de 2008 respecto al tipo de
envejecimiento (B, botas de roble; S; depsitos de acero inoxidable, Ch; en contacto con chips).

Dado que el sistema de envejecimiento que parece percibirse como mejor es el


paso por bota de roble, los datos del anlisis sensorial descriptivo del conjunto
de los vinos envejecidos en bota de las 3 vendimias y las 2 variedades incluidas
en el estudio se trataron mediante Anlisis Lineal Discriminante para
identificar aquellos descriptores que ms evolucionaban durante su estancia en
la barrica. El mtodo usado fue el secuencial hacia adelante, con unos
estadsticos F de entrada y salida de variables en el modelo de 1 y 0
respectivamente. Las variables incluidas en el modelo fueron, de mayor a
menor poder de discriminacin: roble, intensidad aromtica, floral, frutas
maduras, dulce, ctrico, pasas, impresin general, miel, defecto y afrutado. Es
decir casi todas las iniciales, lo que apunt a la multiplicidad de fuentes de
variacin en el conjunto de las muestras, y a la dificultad para aislar el efecto
tiempo de envejecimiento del resto. El modelo obtenido clasific
correctamente el 75,7% de las muestras. Tras el estudio de anlisis de
componentes principales de stos, se extrajeron 2 CPs que explicaban un

270
Captulo IV. Resultados y Discusin

62,7% de la varianza inicial, estando la CP1 altamente correlacionada con las


nota a roble, mientras la CP2 contiene las percepciones a frutas maduras y miel,
adems de la impresin general (Tabla 47).

Descriptor CP1 (41,2%) CP2 (21,5%)


Roble 0,82382 0,39449
Ctrico -0,35390 -0,03910
Pasas -0,09537 -0,26342
Frutas maduras 0,11590 0,64130
Impresin General -0,20698 0,85801
Floral -0,62588 -0,40490
Miel -0,64287 0,76916
Dulce 0,70021 -0,07153
Intensidad Aromtica -0,52849 -0,06782
Defecto -0,57467 0,17774
Afrutado 0,61524 0,33211

Tabla 47. Anlisis de componentes principales. Pesos de los CP tras rotacin varimax
normalizada. Entre parntesis, la varianza explicada por cada CP.

En la Figura 65 se presenta la proyeccin de los vinos envejecidos sobre el


plano CP1-CP2, si bien para facilitar la visibilidad, no se han representado
todos los muestreos. El anlisis del grfico permite realizar algunas
observaciones de inters. La primera es que en contra de lo que pudiera
pensarse, la nota a roble (CP1) no aument con el tiempo de envejecimiento,
sino que alcanz la mxima percepcin tras el primer mes, momento a partir
del cual disminuy lentamente. Este hecho podra deberse a un intensa
maderizacin inicial que se percibe como agresiva hasta que poco a poco el
roble se va integrando con el resto de las notas aromticas. Respecto a la CP2,
que contiene informacin de notas muy apreciadas (miel), lo cual se traduce en
su correlacin con la mejor impresin general, el ordenamiento en el eje

271
IV.II. Parmetros de inters en la calidad organolptica de vinos dulces

presenta una clara tendencia, aumentando las puntuaciones (hacia la derecha)


cuanto mayor es el tiempo de envejecimiento en bota.

4
S01
3 S01 S01

2 S03 S01
S01 S03 S01 S07
S03
S01 S03 S03 S07 S01 S07S07
1 S07S03 S07 S12
Impresin S07 General
MielFruta Madura S12
S01 Roble
S03 Afrutado
Defecto
S07 S12
0 IntensidadCtrico
Aromtica Dulce S12
S03 Floral Pasas S28
PC2

S12 S12 S18


P

-1 S12
S12 S03
S0
S07
S0
-2
S0 S0 S12
S0
S0 S0
-3

S0 S0
-4
-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

PC1

Figura 65. Proyeccin sobre el plano CP1-CP2 de los vinos de las v. 2008, 2009 y 2010 en
funcin del tiempo de envejecimiento (S0, S01, S03, S07, S12, S18, S28: 0, 1, 3, 7, 12, 18 y 28
meses de envejecimiento en botas de roble, respectivamente).

272
Captulo V.

Conclusiones.
Captulo V. Conclusiones

CAPTULO V. CONCLUSIONES

A la vista de los resultados obtenidos de esta investigacin, se pueden


enumerar las siguientes conclusiones:

Desde el punto de vista del control de la seguridad alimentaria y la evaluacin


de las caractersticas higinico-sanitarias de mostos y vinos podemos concluir
que:

- En trminos generales, se ha observado una influencia significativa del ao


de vendimia, que condiciona el estado sanitario de la uva de partida y en
consecuencia su evolucin durante el proceso de pasificado. Sin embargo,
el mayor control del proceso de secado en cmara climtica, con
condiciones estables de temperatura y humedad, permiti reducir la
contaminacin fngica, observndose una menor concentracin de los
parmetros indicadores que han sido objeto de estudio, principalmente
cido glucnico y Ocratoxina A.
Adems, el uso de una cmara climtica para el secado de uvas para la
produccin de vinos dulces, combinado con las tcnicas tradicionales de
vinificacin (sin maceracin pelicular ni adicin de nutrientes), y una fase
final de crianza en barricas de roble ha producido vinos con un contenido
bajo en OTA.

- Respecto al contenido en cidos orgnicos, se observ un aumento general


durante el proceso de pasificacin, as como una fuerte influencia de la
variedad de uva empleada y el ao de vendimia. Durante la etapa de
envejecimiento, se hallaron mayores concentraciones de cidos en los
vinos envejecidos en barrica de roble, seguidos de aquellos que

275
Captulo V. Conclusiones

permanecieron en depsitos de acero inoxidable, y por ltimo, el ensayo


con chips.

- El contenido en carbamato de etilo, se vio afectado principalmente por el


tipo de levadura empleada y el tiempo de envejecimiento. Las mayores
concentraciones de CE se observaron en vinos Moscatel fermentados con
S. cerevisiae y envejecidos en barricas de roble por un tiempo mximo de 28
meses.

En lo que respecta a la calidad organolptica de los vinos obtenidos, destacar:

- El contenido polifenlico de los vinos estudiados vari en funcin de las


tcnicas de vinificacin empleadas (tipo de levadura, empleo de maceracin
o adicin de nutrientes). Adems, se observaron concentraciones ms
elevadas para la variedad Pedro Ximnez, el secado en cmara climtica y el
envejecimiento en botas de roble durante un tiempo prolongado (doce
meses o ms), siendo ste ltimo, el proceso de envejecimiento, el que tuvo
un mayor carcter diferenciador de las muestras.
Por otra parte, el estudio de la actividad antioxidante de los vinos, mostr
una mayor correlacin de los valores ORAC con el contenido polifenlico
de las muestras analizadas que los respectivos HORAC, vindose ambos
valores de AA estadsticamente influenciados por el tipo de vinificacin y la
variedad de uva.

- Respecto al perfil de compuestos voltiles, en el estudio de las condiciones


de fermentacin y su implicacin en el envejecimiento (vinos Moscatel
2008), se observ una influencia significativa del tipo de levadura empleada
as como del tipo de envejecimiento. En el caso de los vinos 2009 y 2010,
donde se evalu el efecto de la uva de partida y el proceso de

276
Captulo V. Conclusiones

envejecimiento en bota, fueron la variedad de uva y el ao de vendimia, los


factores ms influyentes, seguidos del tiempo de envejecimiento. El secado
en cmara climtica fue el menos significativo de todos los evaluados.

- Por ltimo, el anlisis sensorial de los mostos y vinos elaborados, reflej una
influencia de la variedad de uva y el ao de vendimia. El secado en cmara
mostr un ligero aumento de las notas afrutado y pasas y menor olor a
humedad. Los vinos elaborados con S. Bayanus a baja temperatura
mostraron mayores notas ctricas y florales en vinos jvenes. El
contacto con madera en las botas mejor la impresin general de los vinos,
mostrando al inicio una intensa maderizacin que fue integrada tras unos
meses de envejecimiento.

Por lo tanto, podemos concluir que el secado en cmara climtica da lugar a


vinos dulces andaluces de caractersticas organolpticas similares a los
obtenidos por el mtodo tradicional, logrando acortar el tiempo de secado as
como reducir los daos generados por el ataque de insectos o condiciones
climticas adversas que pueden ocasionar infecciones fngicas o bacterianas
tanto desde el punto de vista operativo (menores prdidas de materia prima)
como desde un punto de vista composicional (menores contenidos de
parmetros adversos como son OTA y cido glucnico).

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301
English Summary.
English summary

ENGLISH SUMMARY

I. Justification & Objectives

II. Backgrounds: Andalusian sweet wines

III. Experimental and results

III.I. Samples

III.II. Evaluation of Food Safety parameters in Andalusian


sweet wines
III.II.1. Gluconic acid

III.II.2. Ochratoxin A

III.II.3. Organics acids

III.II.4. Ethyl Carbamate

III.III. Organoleptic Quality analysis in Andalusian sweet


wines
III.III.1. Phenolic Compounds

III.III.2. Volatile Compounds

III.III.3. Sensory analysis

IV. Conclusions

V. References

305
English summary

I. JUSTIFICATION AND OBJECTIVES

Natural sweet wines of Andalusia have considerable renown. Their traditional


elaboration is based in a first stage, known as asoleo (sunning), to increase
the sugar concentration of the grapes, and the latter dynamic aging system
criaderas and soleras. Moreover, sweet wines combined with generosos
wines, mainly amontillado or oloroso are employed for the production of
liqueur wines or cabeceo wines. Likewise, they are also used by suitable
blend for other quality products like vinegar and brandy.

In the sunning process, which is one of the most characteristic stages of the
Andalusian sweet wines production, the grapes are dehydrated and
concentrated mainly in sugars by direct exposition to the sun.

However, this traditional system is susceptible to climatological variations, the


attack of insects and the growth of fungi that can give rise to the formation of
dangerous toxins in the wine. In particular, rains during this period can cause
the grapes to rot.

It would be therefore useful to devise alternative systems of raisining that


allow a greater control of the process, but which would not have any negative
influence on the sensory properties of the final product. In these last years, a
possible alternative to this traditional sun-drying methodology has appeared. It
is being used for the drying of horticultural products and consists in forcing
the loss of water by means of forced convection with hot air in drying
chambers (Vega-Mercado et al., 2001).

307
Justification and Objectives

The results obtained in small-scale studies developed by the research group


Analytical Chemistry of Wine and Agrifood Products (PAI AGR-122)
demonstrated that the employment of a climatic chamber allows the process
of drying to be carried out in a controlled way, and that the content of
polyphenols and volatile compounds in the resulting musts was similar for
both types of grape drying. The use of a climatic chamber for the raisining of
grapes (Castro et al., 2005) allows the temperature and humidity of the drying
process to be adjusted, reduces the length of time required for adequate
raisining from 15-20 days to 6-7 days, without significantly differences in the
essential parameters with the exception of volatile compounds content, which
is slightly reduced in the treated grapes. Based on the above, in order to
improve the production of sweet wine in Andalusia, it is interesting to carry
out a controlled artificial drying under conditions which accelerate the process
with a minimum volatile loss or the recuperation of them as well studying the
aging wines obtained by dried grape.

I.I. OBJECTIVES

I.I.1. GENERAL OBJECTIVE

The main objective of this thesis is to obtain natural sweet wines from grapes
dried under controlled-conditions with both, composition and organoleptic
properties, similar to those of traditional sweet wines. For that purpose, the
drying will be carried out in a climatic chamber with temperature and humidity
control and a capacity to allow the treatment of enough amounts of grapes for
the subsequent vinification up to 100 liters.

308
English summary

In the first small-scale trials, many advantages of the climatic-chamber drying


have been found, diminishing the indicator parameters related to unsuitable
climatic conditions (Ochratoxin A, gluconic acid). However, there are small
reductions in volatile compounds, which must be taken aware when large
quantities of grapes have to be treated for a later winemaking. Besides of
grapes drying, another important factor of this type of wines is the aging
process, therefore the behavior of the wines obtained from artificially-dried
grapes during this stage must be studied.

I.I.2. SPECIFIC OBJECTIVES

1. Obtaining dried grapes in a pilot-scale climatic chamber for subsequent


winemaking.

Since, as cited above, the raisining of grapes is one of the most important
stages in the sweet wines production, it becomes necessary to monitor the
parameters related with fungi or microbial infections in the musts obtained
from climate chamber dried grapes and compare them with those from the
traditional sunning.

2. Optimization of vinification system for musts from artificially-dried grapes.

This section aims to increase the extraction of aromatic compounds in the


must by maceration of grape as well as conserving the aromatic compounds
during fermentation and rising the fermentative aroma by studying
fermentations at low temperatures (approx. 10 C) and nitrogen additions.

3. Aging of sweet wines made with artificially-dried grapes.

309
Justification and Objectives

To evaluate the influence of the grapes drying process on the final product and
the evolution of the wines throughout the entire process of aging comparing
the wines obtained from both analytical and sensorial point of view.

4. Analytical control of parameters related to food safety in sweet wines.

By the nature of the samples under study, It is important to monitor those


parameters directly related to food safety. Ochratoxin A, gluconic acid and
organic acids are clear indicators of fungal contamination during raisining.
Likewise, other compounds should be studied such as furfurals, which are
indicators of excessive high temperature during grapes drying, and ethyl
carbamate, a known carcinogen compound found in wines, especially in
fortified wine.

5. Analytical evaluation of quality parameters in wines.

Due to the genuineness of Andalusian sweet wines, the aromatic potential of


the wines produced from artificially-dried grapes should be investigated as an
indicator of their quality. Additionally, phenolic compounds have also a
significant influence on the organoleptic characteristics of the wine and must
be taken into account.

6. Organoleptic characterization of sweet wines by sensory analysis.

Sensory analysis of the wines obtained in the different experiments provides


data about the organoleptic properties of each wine evaluating the possible
differences among them.

310
English summary

II. BACKGROUNDS: ANDALUSIAN SWEET


WINES. WINEMAKING AND ASSOCIATED
RISK

In Andalusia, special sweet wines are obtained using dried grapes by direct
exposition to the sun in the process known as asoleo or sunning. They are
elaborated, mainly, in Malaga, Montilla-Moriles, and Jerez in a traditional
method dating many years ago using two grapes varieties, Muscat and Pedro
Ximnez.

II.I. ASOLEO (SUNNING)

After harvesting, Muscat or Pedro Ximnez grapes, in bunches, are spread out
on esparto grass mats to toast in the sun before pressing. The bunches are
turned over on a regular basis and covered at night to avoid the adverse effects
of high air moisture.

When subjected to hours of intense sunshine, the grapes gradually lose water,
resulting in a significant increase in the concentration of sugars, a variation in
the aromatic profile (Franco et al., 2004) and a certain degree of colouring,
among other changes. In this way, concerning phenolic compounds, two
different effects should be described during the raisining: on the one hand, the
increase in their content due to the concentration factor; on the other hand,
oxidative enzymes such as polyphenol oxidases (PPO) catalyse the oxidation
of phenolic compounds in the presence of molecular oxygen, leading to
quinones which subsequently evolves to brown pigments (melanins).
Moreover, the Maillard reactions between free carbonyl and amino groups,

311
Backgrounds: Andalusian sweet wines. Winemaking and associated risk

mainly monosaccharides and amino acids, produce a substantial change in the


grapes, altering their color, flavor and nutritional properties. In addition,
Squadrito et al., (2009) and Eberle et al., (2007) found significant decreases in
terpenols during the sun-drying process of Muscat grapes.

However, this traditional process could be affected, in many occasions, by the


attack of insects and the growth of fungi that can give rise to the formation of
dangerous toxins in the wine (Valero et al., 2008). In the disease known as gray
mold, the grape is infected by Botrytis cinerea, one of the pathogenic agents with
the most serious adverse consequences for the quality of wines, which affects
the composition, stability and sensory properties; it can cause the loss of the
typical fruity character of these wines and instability of the fermentation
aromas, and it gives the wines a bitter flavor (Flanzy, 2003).

Similarly rains during the sunning process make the grapes more disposed to
infection by bacteria, which cause acetic disease, and facilitates the
development of other molds such as Penicillium and Aspergillus species, which
give rise to the formation of ochratoxin A (OTA) (Suarez and Inigo, 2004), a
highly toxic metabolite.

During the drying of the grape, there is an increase in the incidence of


Aspergillus nigri section (A. carbonarius and A. niger) compared with other types
of fungi. A. carbonarius presents a greater ochratoxigenic potential, whereas A.
niger is the predominant strain (Valero et al., 2005).

The growth of these fungi in the grape is subject to the climatic conditions of
the region (Belli et al., 2005; Battilani et al., 2006; Bell et al., 2007). A.
carbonarius, which is highly resistant to solar radiation and high temperatures,
up to a maximum in excess of 40 C, is the major source of OTA in grapes,

312
English summary

wines and other enological products (Cabaes et al., 2002; Battilani et al., 2004;
Chiodini et al., 2006; Brera et al., 2008). Furthermore the existence of high
levels of ochratoxin A has been demonstrated in wines originating from grapes
dried in the sun (Valero et al., 2008).

About OTA pathologies and toxic effects (Pavlovi et al., 1979; Fuchs and
Peraica, 2005; Pfohl-Leszkowicz and Manderville, 2007), OTA causes chronic
nephropathies in diverse species of mammals and birds. In the human, it has
been associated with a nephropathy endemic to the Balkans region, although
this is still an unconfirmed hypothesis. OTA also possesses teratogenic,
hepatotoxic, neurotoxic and immunotoxic effects, and is classified by the
International Agency for Research on Cancer as a possible human carcinogen
(class 2B) (IARC, 1993). In the European Union the OTA content is regulated
in foods susceptible to contamination. In the case of wine, other drinks based
on wine and/or musts, the maximum limit is set at 2.0 g/L ((CE) No
1881/2006).

II.II. VINIFICATION

The grapes attain sugar levels above 300 g/L and are crushed and pressed
employing vertical presses. After this, musts with high sugar content are
submitted to partial alcoholic fermentation and fortified with ethanol to ensure
that the wine will contain at least 1518 % alcohol.

In the production of these wines, the fortification may favour the formation of
ethyl carbamate, a known carcinogen that has been found in wines as a by-
product of fermentation.

313
Backgrounds: Andalusian sweet wines. Winemaking and associated risk

Ethyl carbamate is formed from various precursors, notably urea and


citrulline, in reactions promoted by heat and a high concentration of ethanol
(Ough et al., 1988; Ough et al., 1990; Canas et al., 1993; Matsudo et al., 1993;
Kodama et al., 1994). Urea is often formed during the early and middle stages
of fermentation, with subsequent generations of yeast utilising it during the
later stages. If the fermentation process is stopped early by fortification, wines
with higher urea concentration may be obtained (Daudt et al., 1992).

Maximum allowable concentration of EC for several types of wines has been


established in Canada, USA, Japan and Korea (Liang et al., 2009; Rodrguez-
Madrera and Surez-Valles, 2009). Although EC has been designated a key
substance to be monitored by the Food and Agriculture Organization (Food
and Agriculture Organization 2002), there is currently no harmonized
maximum concentration stipulated for EC in the European Union (EFSA,
2007). Because EC has shown potential carcinogenic activity when
administered in high doses in animal tests (Baumann and Zimmerli, 1987;
Matsudo et al., 1993), there is considerable interest in reducing the
concentration of EC in all food products.

II.III. AGING

After vinification, the young sweet wine is, generally, submitted to aging in
American oak wood following an oxidative aging. The aging must be
prolonged for a minimum period of two years, being possible to carry out in a
static system or in a traditional dynamic process known as soleras and
criaderas by which wines from different stages of the aging are blended
together in order to conserve the specific characteristics of the wine (D.O.
"Jerez-Xrs-Sherry", 2015).

314
English summary

During oxidative aging in wood, wines become gradually darker due to direct
contact with oxygen in the air and are affected by the phenomenon of
concentration produced as a consequence of the transpiration of specific
elements in the wine through the walls of the oak cask (D.O. "Jerez-Xrs-
Sherry", 2015). In addition, the wine acquires aromatic complexity as a result
of important and diverse reactions (Ortega-Heras et al., 2004). New volatile
and nonvolatile compounds are extracted from the wood, modifying the
wines bouquet. As a consequence of all of these processes, the fruity and
fermentative volatile compounds decrease during the process of aging in wood
(Escalona et al., 2002).

315
Experimental and results

III. EXPERIMENTAL AND RESULTS

III.I. SAMPLES

Two grape varieties (Muscat, M and Pedro Ximnez, PX) and three vintages
(2008, 2009 and 2010) were studied. The grapes were subjected to two
different drying procedures: natural sunning (on the terrace of the research
centre, designated 1T, and/or in the vineyard, 2T), and controlled drying in a
climate chamber (C).

In the case of chamber drying, for each grape variety and vintage, about 2000
kg of ripe grape bunches were collected from a local winery in the Jerez-
Xeres-Sherry D.O. (Denomination of Origin) region and dried using a climate
chamber (Ibercex A. S. L., S. A., Spain) at 40 C and relative humidity of 10%.
For the sun drying process, grapes were dried for about 10-15 days, spread out
on esparto grass mats, turned over daily and covered at night. In both
systems, bunches were distributed uniformly forming a single layer and the
drying process was monitored periodically finalizing when the water loss was
about 35% of the original weight and the grapes were at least 20 B.

Dried grapes were de-stemmed, crushed and pressed with a vertical press. The
highest pressure in each of the three cycles was 30 MPa. For those
experiments with skin contact (pellicular maceration), grapes were crushed
without de-stemming and then submitted to maceration. In the next stage, the
pH of the must was adjusted to 3.5 with tartaric acid (Agrovin, Spain). The
concentration of total sulfur dioxide was also set at 120 mg/l by adding
potassium metabisulfite (Agrovin, Spain). Five experimental conditions (in

316
English summary

duplicate) of vinification were tested during the vintage 2008 while wines from
2009 and 2010 were elaborated following the experiment E4 conditions:

Experiment E1 the must was fermented with a S. cerevisiae yeast (40 g/hl,
Lalvin D254, Lallemand, Australia) at room temperature (below 30 C).

Experiment E2 the must was fermented as in E1, but with the addition of
yeast nutrients (10 g/hl diammonium phosphate) (Actimax Plus+, Agrovin,
Spain).

Experiment E3 the fermentation conditions were as in E1; however, the


crushed grapes were subject to a prefermentation cold maceration for 24 h at
4C using 3 g/hl of pectolytic enzymes (Enozym Arome, Agrovin, Spain);
after which, the macerated grapes were pressed in a vertical press.

Experiment E4 must was fermented at low temperature (below 10 C) with


S. bayanus (40 g/hl, Uvaferm 43, Lallemand, Australia).

Experiment E5 the crushed grapes were subjected to a prefermentation


cold maceration for 24 h at 4 C using 3 g/hl of pectolytic enzymes (Enozym
Arome, Agrovin, Spain); after which, the macerated grapes were pressed and
the must was fermented with S. bayanus at room temperature.

When the sugar concentration of the fermenting must was about 90100 g/l,
the fermentation was stopped by adding alcohol up to 1718 % (v/v). Then,
the sweet wines obtained were aged in 30-L medium-toasted oak casks or in
10-L stainless steel vessels. During this aging period, wines were stored in the
same room at approximately 20 C. Sampling commenced at the end of
fermentation and continued periodically for a minimum of 12 months.
Samples were stored at 4 C until they were analysed.

317
Experimental and results

III.II. EVALUATION OF FOOD SAFETY PARAMETERS

III.II.1. GLUCONIC ACID

During the development of Botrytis cinerea, the oxidation of glucose to form


gluconic acid is produced. For that reason, this acid is commonly used in
oenological practices to assess the degree of gray rot of grapes. Therefore,
musts obtained during the three vintages 2008, 2009 and 2010 were analyzed
to determine the degree of infection by the fungus.

Table 1 shows mean values of gluconic acid of the musts obtained during the
initial sampling and after the different drying process. As shown, gluconic acid
contents in musts from raisins were greater than 500 mg/l (limit considered
acceptable for wines from fresh grapes). This threshold was reached after the
first sampling in Muscat 2008. However, for Pedro Ximnez and Muscat
samples from 2009, it happened at the end of the drying step (Figure 1).

V08 V09 V10 p vintage


PX Ini 2916a,3 401a,1 2324a,2 0.000
C 289791b,3 166317b,2 12288b,1 0.000
1T 285871b 325313c 0.016
2T 176210c 32656c 0.000
p drying 0.000 0.000 0.000
Muscat
Ini 2131a,3 7401 9510a,2 0.000
C 3842120b,3 1734302 7550b,1 0.000
1T 359694b 16266c 0.001
p drying 0.000 0.000 0.000
pIni 0.003 0.001 0.003
p variety pC 0.012 0.100 0.000
p1T 0.012 0.000
Table 1. Gluconic acid concentration (mean, mg/l SD) found for each factor considered
(vintage, grape variety, drying process). Superscripts : For each column and variety, different
letters show significant differences between drying systems (Ini, C, 1T and 2T) and, for each row,
different numbers (1, 2, 3) show a significant difference due to vintage (v08, v09 and v10) at p
< 0.05 (Tukeys test).

318
English summary

4000

Gluconic acid (mg/L) 3000

2000

1000

0
S0 S1 S2 S3 S4 S5
Drying Time
Muscat 2008
Moscatel2008 Moscatel2009
Muscat 2009 PX 2009
PedroXimen2009

Figure 1. Evolution of gluconic acid content during the drying of grapes in climatic chamber (C).
S0: Initial, S1: 2 days, S2: 3 days, S3: 6 days, S4: 7 days, S5: 8 days.

Fresh grape musts showed the lowest values of gluconic acid, while those
obtained from dried grapes according to the traditional system (in terrace, T1,
or vineyard, T2) achieved the highest contents. Moreover, the comparison
between the three vintages showed that the year significantly affected the
presence of gluconic acid in must from both, fresh and raisining grapes,
whether that were dried under controlled conditions or by traditional system.
But it should be noted that, in 2009 and 2010, gluconic acid content in musts
of traditionally dried grapes (T1 and T2) were clearly higher than those
obtained from grapes dried in climatic chamber (C), while from 2008, no
differences were found between them.

Considering the climatic conditions of the three years during the months of
August and September, when the raisining stage takes place, exceptionally high
rainfall values were observed for September in 2008, which could affect the
state of the initial grapes and therefore their evolution during raisining in both
systems: climatic chamber and traditional process.

319
Experimental and results

In addition, the maximum relative humidity in 2010 was higher than in


previous years, which could have favored the development of the fungus,
especially during the sunning of Pedro Ximnez grapes due to this variety is
characterized by a thin, delicate skin that makes sensitive to humid climates
(Alejandre, 2007). Both factors, precipitation and humidity are favorable for
the development of Botrytis cinerea (Suarez and Inigo, 2004). Moreover, small-
scale studies of drying grapes in a climatic chamber (Hernndez, 2009),
showed also a lower content of gluconic acid in musts from the artificial
raisining versus traditional sunning as a result of the variability of
environmental conditions in the last one.

Regarding the variety, although statistically differences between Pedro


Ximnez and Muscat were detected, not the sense in which this occurs is
concluded. It suggests the existence of an interaction effect with other
operational variables, such as vintage.

III.II.2. OCHRATOXIN A (OTA): OPTIMIZING THE PROCESS OF


MAKING SWEET WINES TO MINIMIZE THE OTA CONTENT

In order to optimize the process of making sweet wines to minimize the


content of ochratoxin A, a study of the evolution of OTA content throughout
the entire process of production of Muscat sweet wines (vintage 2008), from
the raisining of the grapes to vinification and the aging of the resulting wine in
oak cask, is presented.

The methods chosen for the determination of ochratoxin A in musts and


wines were devised by the Analytical Chemistry of Wine and Agrifood
Products Research Group (PAI AGR122) (Hernndez et al., 2006;
Hernndez, 2009). They are based on an initial extraction followed by

320
English summary

separation using liquid chromatography (HPLC) and detection of the toxin by


fluorescence.

III.II.2.1. Musts

The OTA contents in the musts from the two different systems of raisining
tested suggested that a previously existing fungal contamination in the grape
could occur, and this contamination, associated with the conditions of the
drying process itself, led to the growth of the fungus and, consequently, of
ochratoxin A in both systems. This finding is related to the data provided by
Valero et al., (2008) which demonstrated that it is after the harvesting, and
particularly in the process of raisining, when the Aspergillus species becomes
predominant over other fungi present on the grape.

However, the OTA concentration of the must from grapes dried in the
climatic chamber (6.920.01 g/kg) was lower than that obtained in the
natural process (28.80.02 g/kg), the difference being statistically significant
(p < 0.05), so it seems the increased control over the conditions of raisining
resulted in better hygienic conditions for the final must. The must obtained in
the traditional system presented a very high concentration of OTA which was
not suitable for subsequent fermentation.

III.II.2.2. Vinification

During the vinification of the musts from grapes dried in the climatic chamber
a considerable decrease of the OTA content was observed (averages and
standard deviations shown in Table 2). A large part of the solid matter that
was in suspension, and with it part of the toxin present in the grape marc, was
eliminated in the desludging and clarification (Kurtbay et al., 2008), the

321
Experimental and results

difference being statistically significant between the two wines before (V01)
and after (V02) these enological practices (p < 0.05). Similar results have been
obtained during the vinification of musts of red grapes (Grazioli et al., 2006).
Similarly, in those wines with prefermentative maceration (experiences 3 and
5), the must was in contact with the solid matter (skins, etc.) for 24 h, and this
facilitated the transfer of the toxin to the must.

III.II.2.3. Aging

During the aging in oak casks (C) a decrease was observed in the OTA content
(Table 2); in all the cases, lower concentrations than in the corresponding
controls (S) were found, the difference being statistically significant (p < 0.05).
The OTA content in these controls hardly varied at all during the assays, while
those of the wines aged in oak casks showed a large decrease at the beginning,
with a slight progressive decrease throughout the aging time in the case of the
wines with the higher contents (experiences 3 and 5). The aging of red wines
in bottle was evaluated by Grazioli et al., (2006), and no short term effect was
found, but there was a decrease of 17% in OTA after 12 months. With regard
to our samples, in four of the seven barrels studied this decrease was greater
than 17% in the first three months, even reducing up to 56.49.3%, as an
average of all the oak cask assays, after 12 months of aging.

In addition, it was observed that wines of the same assay aged in different oak
casks showed a very similar trend over time. In the experiment conducted with
wood shavings (or chips, E1_Ch), the OTA content of the wine remained
constant, showing behavior more comparable to that of the control than the
wine aged in cask.

322
English summary

Ochratoxin A (g/l) in Muscat wines v.2008.


V01 V02 S20d S12
V08. M.C.E1C 0.67 0.04 0.30 0.02
V08. M.C.E1S 3.75 0.03 1.44 0.02 1.12 0.08 1.07 0.00
V08. M.C.E1CH 1.10 0.02 1.02 0.02
V08. M.C.E2C 1.11 0.03 0.48 0.00
3.64 0.01 1.51 0.11
V08. M.C.E2S 1.52 0.01 1.36 0.00
V08. M.C.E3C 1.71 0.03 0.50 0.00
2.55 0.02
V08. M.C.E3S 2.01 0.06 2.000.02
V08. M.C.E4C 0.68 0.06 0.33 0.02
4.09 0.02 0.97 0.01
V08. M.C.E4S 1.00 0.01 1.03 0.00
V08. M.C.E5C 4.44 0.40 1.59 0.01
3.99 0.03
V08. M.C.E5S 4.92 0.20 4.96 0.01

Table 2. Ochratoxin A in wine after vinification (V01 and V02) and aging (S20d and S12).

Although wine of experiment 5 showed an OTA content, at the beginning of


aging in oak cask and during the first months, of more than 2.0 g/l, regular
monitoring for 12 months of aging exhibited a progressive decrease reaching
legally acceptable values (Table 2).

Therefore, all wines aged in oak for a period of 12 months showed an OTA
content below 2.0 g/l, legal limit established by the European Union, so
these wines would be suitable for consumption.

III.II.3. ORGANIC ACIDS

The acid content of a wine influences on many parameters such as the color
stability, aroma, taste properties and hygienic status (Garcia-Romero et al.,
1993; Lpez-Tamames et al., 1996). In addition, the individualized study of the
different organic acids in musts and wines is indicative of possible
microbiological infections which are, in many occasions, undesirable.

In relation to this, the organic acid content for must and wines from the
different experiments carried out during the three vintages (2008, 2009 and

323
Experimental and results

2010) was measured by ion-exclusion chromatography according to Guilln et


al., (1998).

III.II.3.1. Musts

The evolution of organic acids in the grapes during raisining can be described
by two antagonistic effects. On one hand, their concentration increase due to
the evaporation of water in the berries. Moreover, exposed grapes continue
with the respiratory process which takes place during ripening and produce the
combustion of the different acids (Hidalgo-Togores, 2003).

Table 3 shows the organic acids content of the musts at the beginning and
after the different raisining experiences. Overall, the three factors under study;
variety, vintage and type of drying, significantly affected the content of
different organic acids in grapes (p < 0.05), prevailng the concentration effect
during the drying process.

Malic acid levels were higher in dehydrated grapes by sunning than in those
dried in a climatic chamber. However, the differences between both systems
were lower for Muscat variety. It is known that malic acid has a large
susceptibility to high temperatures (Hidalgo-Togores, 2003), so the effects of
combustion may explain the greater variability in the results.

Concerning to citric acid, which only could be determined in vintage 2008 due
to a technical problem; its concentrations were generally within the normal
range. The increased concentrations after the raisining of Pedro Ximnez
grapes were higher than it would be justified by the decrease in the volume of
water, which could be related to a possible growth of Botrytis cinerea. This result
agreed with the contents of gluconic acid described previously for these musts.

324
English summary

The presence of succinic, lactic, formic and acetic acids denoted the start of
fermentation activity, which was not surprising particularly in dried grapes, due
to the high sugar content of the musts.

Succinic acid was found in greater concentration in musts from sunning grapes
than in those from grapes dried in a climatic chamber, probably due to the
high availability of oxygen in the open air.

The drying of grapes significantly increased the levels of acetic acid. Although
the factor vintage contributed significantly to the content of acetic acid, like
variety, the existence of statistical interaction between these factors and the
drying system, impeded to establish patterns of behavior. Moreover, the
concentration effect during the drying of the grapes can not justify in most
assays the significant increase in its content, which could be interpreted as a
consequence of some bacterial activity (lactic and acetic bacteria).

III.II.3.2. Vinification conditions

Table 4 shows the results obtained for Muscat wines from the vintage 2008.
The contents in tartaric, malic, succinic and lactic acids in wines made under
different fermentation conditions were within normal ranges for healthy wines.
Although, the influence of some of the operational variables studied on the
organic acids contents during the winemaking process was observed (Table 4).

The employed yeast significantly or near-significantly affected the


concentrations of malic, lactic, citric and formic acids, being higher in the
wines made from S. cerevisiae. Eglinton et al., (2000) also described significant
differences in the content of organic acids in wines fermented by both yeast.
However, the trend observed by these authors was slightly different, with

325
Experimental and results

higher content in succinic and lower in acetic acid for wines fermented by S.
bayanus. These potential differences may result from the special conditions of
our musts, from dried grapes and consequently with a high concentration of
sugars.

The fermentation temperature affected, in the same way, the content in acids
derived from grapes (malic and citric acid). The remaining acids, which are
originated during the fermentation process, differed depending on the
fermentation temperature of the wines. The addition of ammonium salts as
yeast nutrients during fermentation did not affect the concentrations of acids,
while the maceration with pectolytic enzymes seemed to be related with a
higher level of succinic acid and a decrease in the acetic acid content.

III.II.3.3. Effect of grapes-drying system in young wines

Since the effects of variety and vintage were confirmed as significant in the
study of the musts, results corresponding to unaged wines from each vintage
and variety were independently treated (data not shown). In general, this
influence was kept from musts to wines, judging by the p < 0.05 which
characterized the vintage and variety effects.

In addition, the trends found previously in the must remained, although the
concentrations were not the same: while significant differences in the acid
content were confirmed depending on the drying system of grapes, there was
no clear pattern indicating the direction in which it happened. In view of the
means and calculated p-values, a possible effect of variety, and especially
vintage, might be interacting, so this content could not be ensured a significant
influence of the raisining system.

326
English summary

III.II.3.4. Aging system

The contents of organic acids changed significantly during the aging in oak
cask. The increases were important in the wines of 2009 and 2010, while the
evolution during 2008 showed a slightly differences depending on the acid and
the different winemaking conditions.

Comparing the different systems of aging, it is observed that, the wines


matured in stainless steel, without the porosity of the wood which favors the
oxygen inlet and water and ethanol outlet, had a more stable content in organic
acids. For wine aged in contact with oak chips, a decrease in organic acid
concentrations was observed. The highest concentrations found for malic,
lactic and acetic acids in wines aged in wood suggested that possible
microbiological activity had taken place during aging in oak casks.

The comparison p-values between the aging systems at the beginning of the
stage (S20d/S01) and after 12 months (S12), showed that time had a
differentiating effect on the contents in organic acids. In this way, the initial
differences were enhanced, even, these appeared where none previously
existed (pS12 << pS20d/S01).

327
Experimental and results

Table 3. Organic acids (mean, mg/l standard deviation) for musts..For each column and variety, different letters show significant differences between
drying systems (Ini, C, 1T y 2T) and, for each row, different numbers (1, 2, 3) show a significant difference due to vintage (V08, V09 y V10) at p <
0.01 (Tukeys test).

P.X. Muscat pvariety


V08 V09 V10 pvintage V08 V09 V10 pvintage V08 V09 V10
Tartaric A.
Ini 2658181a,1 349211a,2 3849232a,2 0.013 201427a,1 26741a,2 294411a,3 0.000 0.038 0.000 0.031
C 334859b,1 34287a,1 4431260 b,2 0.010 313325b,1 415480b,3 3750145b,2 0.004 0.041 0.006 0.084
1T 347276b 3588145a 0.422 31121b 3706212b 0.058 0.021 0.584
2T 417037 b 7973106c 0.000
pdrying 0.011 0.000 0.000 0.000 0.001 0.020
Malic A.
Ini 125635a,3 75319a,1 99331a,2 0.001 150216c,2 12833a,1 161334a,3 0.001 0.012 0.000 0.003
C 149237b,3 92716 b,1 118470b,2 0.003 11502a,1 155261b,2 186915b,3 0.001 0.006 0.005 0.005
1T 181644c 144523c 0.009 125125b 193266b 0.005 0.004 0.010
2T 119910 c 220662d 0.002
pdrying 0.002 0.000 0.000 0.000 0.025 0.010
Succinic A.
Ini 00a,1 423a,2 00a,1 0.000 7543 482a,2 00a,1 0.000 0.001 0.139 1.000
C 4725b,1 1193c,2 556b,1 0.031 7121 1447b,2 627b,1 0.001 0.309 0.043 0.394
1T 1452c 9110c 0.016 9521 979c 0.922 0.077 0.583
2T 1011b 918c 0.238
pdrying 0.005 0.000 0.000 0.256 0.003 0.001
Lactic A.
Ini 00a,1 8217a,2 00a,1 0.005 1568b,3 805a,2 00a,1 0.000 0.001 0.871 0.849
C 8060a 1860 b 10613b 0.113 00a,1 2491b,3 1835a,2 0.000 0.196 0.000 0.015
1T 2967b 12623b 0.009 00a 2181a 0.000 0.000 0.029
2T 1561b 27036c 0.047
pdrying 0.007 0.004 0.001 0.000 0.000 0.000
Formic A.
Ini 320a,2 00a,1 00a,1 0.000 813a,3 501a,2 001 0.000 0.001 0.000 0.956
C 8017b,2 1201b,2 314b,1 0.024 882a,3 701b,2 001 0.000 0.870 0.000 0.007

328
English summary

P.X. Muscat pvariety


V08 V09 V10 pvintage V08 V09 V10 pvintage V08 V09 V10
1T 8321b 377b 0.012 1065b 00 0.001 0.028 0.015
2T 1971c 8011c 0.004
pdrying 0.050 0.000 0.001 0.012 0.003 0.465
Acetic A.
Ini 1272a,3 00a,1 295a,2 0.000 1026a,2 123a,1 00a,1 0.000 0.035 0.029 0.013
C 10846a,1 3247b,2 53115c,3 0.001 4922c,1 65212b,3 54510c,2 0.001 0.007 0.000 0.410
1T 45014b 37829b 0.088 32611b 1995b 0.004 0.010 0.013
2T 34620b 63334d 0.009
pdrying 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

329
Experimental and results

Table 4. Means (mg/l) and standard deviations for organic acids of young wines obtained under different vinification conditions. ANOVA. Different
letters show a significant difference at p < 0.05 (Tukeys test) for each experiment (E1-E5).

Tartaric A. Malic A. Citric A. Succinic A. Lactic A. Formic A. Acetic A.


E1 211338b 113213 a 5008b 4648b 3134c 813a,b 88216b
E2 19592a 13201b 6460 c 6472c 4478d 972a,b 10535c
Aging E3 21055b 15941c 8583 d 7966e 5463e 1091b 10041c
system E4 207825b 115675 a,b 54530b 4199a 22822b 4325a 102919d
E5 208124b 108511a 3421a 7215d 1763a 320a 3923a
p 0.079 0.001 0.000 0.000 0.000 0.067 0.00000
S.c. 207230 129572 62656 59353 40537 925 95529
Yeast1 S.b. 207917 113250 47747 51964 21018 3916 883156
p 0.872878 0.109556 0.073910 0.387474 0.00114 0.00383 0.609336
r.t. 207424 125363 56958 61945 35942 809 84379
Fermentation
l.t. 207825 115675 54530 4199 22822 4325 112919
temperature2
p 0.934198 0.404541 0.800538 0.017896 0.08397 0.099594 0.04495
No 209515 120957 54848 54746 30137 6511 90376
Nutrients Yes 19592 13201 6460 6472 4478 972 10535
p 0.003600 0.461305 0.431753 0.406333 0.144265 0.279862 0.449211
Maceration with No 206825 117937 54721 48329 30628 6912 101538
pectolytic Yes 209312 1339147 600149 75822 361107 7122 698177
enzimes p 0.564842 0.155046 0.58611 0.00009 0.490484 0.94294 0.022972
1
S.c.: Saccharomyces cerevisiae; S.b.: Saccharomyces bayanus. 2rt: room temperature (<30C), lt: low temperature (<10C).

330
English summary

III.II.4. ETHYL CARBAMATE (EC): EFFECT OF AGING OF SWEET


SHERRY WINES OBTAINED FROM CVS MUSCAT AND PEDRO
XIMNEZ ON EC CONCENTRATION

Before and during aging, the wines obtained were periodically sampled, and
ethyl carbamate (EC) content was determined by HPLC with fluorescence
detection. Sampling commenced at the end of fermentation (S0d) and
continued periodically for 28 months (S20d, 20 days; S40d, 40 days; S2, 2
months; S4, 4 months; S7, 7 months; S8, 8 months; S12, 12 months; S18, 18
months and S28, 28 months).

III.II.4.1. Influence of alcohol concentration on the determination of EC


in sweet wines

In this work, the influence of variable alcohol concentration on the stability of


xanthylEC, using a strong HCl medium (pH value at about 0.94) was
evaluated. Our results were consistent with those described by Rodrguez-
Madrera and Surez-Valles, (2009). Matrix wine with 17 and 20% (v/v) ethanol
showed a greater response than wine with 40% (v/v) due to the influence of
the alcoholic strength on nucleophilic substitution (data not shown). The
xanthylEC compound, however, was stable only in the 40% ethanol solution,
showing an RSD of less than 5% between the first (30 min) and the last
injection (11 h and 30 min, data not shown).

III.II.4.2. Ethyl carbamate content in wines

The EC concentration of the wines made from the Muscat grapes (vintage
2008) ranged from not detected (E4, S0d) to 194 g/l (E3, S28) (Table 5). As
could be expected (Kodama et al., 1994), for all experiments, the EC

331
Experimental and results

concentration increased in line with increasing time of aging. The data


reported in Table 5 also suggested that there were significant differences in the
EC concentration of the wines associated with the different vinification
conditions tested.

Sampling Ethyl carbamate concentration ( g/L)


time
E1 E2 E3 E4 E5
0 Days 10.2 2.1 11.0 3.2 40.8 1.7 n.d. 13.2 0.7
20 Days 19.5 6.1 30.3 8.6 48.6 1.2 23.9 1.4 17.2 1.2
40 Days 22.2 7.1 43.7 20.2 57.0 0.3 34.1 6.6 25.8 0.3
2 Months 26.2 8.1 50.3 13.6 85.7 2.9 38.9 3.6 24.7 0.9
4 Months 38.8 11.5 71.1 17.0 103 3 57.6 7.0 37.9 1.2
7 Months 51.9 22.2 74.1 18.7 109 2 44.3 25.8 45.2 0.7
8 Months 59.4 18.1 86.1 21.3 123 1 73.0 14.1 57.9 0.3
12 Months 67.2 18.8 100 19 146 2 60.5 27.7 63.7 0.3
18 Months 74.6 18.7 121 10 182 1 94.7 15.7 67.0 1.1
28 Months 96.0 33.8 147 16 194 6 106 9 125 2
Aged in stainless steel tanks and oak casks, n = 8. Only aged in oak casks, n = 4. Values are
means standard deviation.
Table 5. Effect of aging for vintage 2008 Muscat wines, aged in stainless steel tanks and in oak
casks.

Table 6 shows mean EC concentration and standard deviation values obtained


when the different conditions described in the experimental were tested:
vintage, variety, time of aging, vinification and type of aging. Taking into
account all samples (two varieties and three vintages), mean values found for
EC ranged from 6.16 g/l for S0d (after alcoholic fermentation) to 120 g/l
for S28 (after 28 months of aging).

The EC concentration of the wines obtained under different conditions


conditions were subjected to ANOVA (Table 6). For this analysis, the same
five independent factors previously mentioned were considered. Table 6
shows that all five factors considered were statistically significant for EC
concentration (p < 0.01).

332
English summary

The results obtained from the study of comparison of means using the
Tukeys test (p < 0.01) for all significant factors are shown in Table 6. The EC
concentration of wines increased during aging, with the differences more
important after 4 months of aging. From Table 6, it is possible to conclude
that the differences were significant among wines prepared according to the
several factors.

Factor p value Ethyl carbamate concentration (g/L)


2008 2009 2010

Vintage 0.0000 49.4 37.8a 43.0 25,6a 33.7 24.3b

Muscat Pedro Ximnez


Variety 0.0000
54.4 44,9a 29.7 23.9b
0 20 40 2 4
(Days) (Months)
6.16 17.22a 19.8 13.5a 32.9 14.5a,b 39.3 19.1a,b 55.5 22.3b,c
Time of
0.0000 7 8 12 18 28
aging
(Months, continued)
51.7 27.6b,d 73.6 24.2c,e 67.2 30.7c,d 97.7 35.7e,f 119 37f
E1 E2 E3 E4 E5
Vinific. 0.0000
50.6 30.2a 80.5 39,0b 111 50c 43.6 33.9d 47.8 32.5a
Type of Oak cask Stainless steel tank
0.0000
aging 57.4 42.7a 47.3 30.1b
Table 6. Mean ethyl carbamate concentration and standard deviation found for each factor.
ANOVA. For each row, different letters show a significant difference at p < 0.01 (Tukeys test).

When considering the grape variety, the wine made from Pedro Ximnez
presented a lower value than that for Muscat (Tables 6). The ratio of proline to
arginine plays a significant role in determining the predisposition of a variety
to produce urea (Bell and Henschke, 2005). In wines made from Chardonnay,
Muscat White and Muscat dAlexandrie, Soufleros et al., (2003) found a high
amino acid concentration, with arginine being the most abundant amino acid.
Data on the amino acid concentration of Pedro Ximnez are scarce: Mauricio

333
Experimental and results

et al., (2001) found that Pedro Ximnez musts contained more L-proline than
L-arginine (38.2 and 25.2%, respectively, of the total free amino acids). These
values could explain the lower EC concentration found for this variety in our
study.

The year 2010 exhibited a significantly lower EC concentration than that of


2008 and 2009. Climatic conditions appear to have a clear effect on amino acid
concentration of grape must (OrtegaHeras et al., 2014), and therefore a
significant influence on EC concentration of wine. Therefore, the notably
higher precipitations for the vintage 2010 (MAGRAMA, 2015) could explain
the lower EC concentration found for the wines of this vintage; however, a
more thorough study needs to be made in order to confirm this observation.

Results obtained from the vinification under different conditions, as described


for each experiment, showed that the use of S. bayanus instead of S. cerevisiae
significantly reduced the EC concentration, and that both the use of nutrients
and skin contact with pectolytic enzymes increased EC concentration.

Finally, the type of aging influences the EC concentration, with significantly


higher values for EC obtained for those wines aged in oak casks (Tables 6).
This significant difference could be explained by possible microbiological
modifications, favoured under the low aeration that takes place through the
pores of the oak cask (Blouin and Peynaud, 2005). This would increase some
of the precursors of EC for those wines aged in wood (Liu et al., 1994).

The data matrix was subjected to a hierarchical agglomerative CA of cases and


the dendrogram obtained is shown in Figure 2. The two clusters formed
therefore reflect the length of aging time. This finding is considered to reveal

334
English summary

that in general, the main factor contributing to the EC concentration in these


wines was time of aging.

Figure 2. (a) Dendrogram obtained taking the squared Euclidean distance as metric and Ward
method as amalgamation rule and (b) magnification of the area indicated.

335
Experimental and results

III.III. ORGANOLEPTIC QUALITY

III.III.1. PHENOLIC COMPOUNDS

III.III.1.1. Phenolic and furanic compounds in Muscat sweet wine.


Influence of vinification and aging conditions

In this research work, a total of 19 compounds (12 identified and 4 unknown


phenolic compounds and 3 furanic aldehydes), have been identified in the
different Muscat wines studies (Table 7).

As was stated in section III.I. Samples, all musts were obtained from grapes
dried using a climatic chamber (40 C and 10% RH) during vintage 2008 and
the corresponding wines were elaborated following different vinification
conditions. After fermentation, the sampling was carried out periodically for
28 months of aging (S0, 20 days; S1, 40 days; S3, 3 months; S5, 5 months; S9,
9 months; S12, 12 months; S18, 18 months and S28, 28 months).

In order to study statistically the differences among the phenolic compounds


of all the wines studied, data were submitted to analysis of variance. For this
one, three independent factors were considered: type of fermentation (E1-E5),
time of aging, and type of aging (oak cask, stainless steel, with chips). As can
be seen in Table 7, practically all the volatile compounds were significantly
affected (p < 0.05) by these three factors.

In the case of the factor fermentation type, the results suggested that the
addition of nutrients, the maceration with pectolytic enzymes and the
employment of different yeasts (S. cerevisiae or S. bayanus) influenced on the
polyphenol content of the final wine.

336
English summary

Regarding the type of aging (in oak cask, stainless steel or with chips) a general
trend, with higher levels for those wines aged in casks, was observed. The
accelerated aging with chips showed similar behavior to those wines maturated
in stainless steel tanks.

Finally, the evolution of the wines during the time of aging showed a
significant increase in the polyphenol content. Both hydroxybenzoic and
hydroxycinnamic acids as well as furanic aldehydes with the exception of
caftaric acid and "compound d" increased their concentrations.

337
Experimental and results

Table 7. Means (mg/l) and standard deviations for phenolic and furanic compounds of wines obtained under different vinification conditions. Different
letters show a significant difference at p < 0.05 (Tukeys test) for each experiment (E1-E5).

Phenolic compound Fermentation p-value

E1 E2 E3 E4 E5 Fermentation Aging type Aging Time


Hydroxybenzoic acid and derivatives
Gallic Acid 1.511.80b 1.631.83b 5.471.84c 1.111.30a 3.260.85b 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Ethyl gallate 1.630.49a 2.070.75b 2.750.41c 1.830.51a 2.000.50a.b 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Protocatechuic Acid 3.221.97a 5.342.32a 6.462.85a 5.007.57a 4.372.28a 0.0159* 0.1647 0.0000*
Vanillin 1.251.17a.b 1.571.71b 2.321.13a.b 1.301.02a 2.171.23a.b 0.0001* 0.0000* 0.0000*
Syringaldehyde 2.612.95b 3.734.20c 4.402.30a.b 2.482.22a 4.352.66a.b 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Hydroxycinnamic acid and derivatives
Caffeic acid 0.4000.220a 0.9510.401b 1.070.51b 0.3580.193a 1.280.60c 0.0000* 0.0001* 0.0000*
Caftaric acid 3.811.66c 6.841.64d 6.871.48d 1.570.62a 3.190.18b 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Ethyl caffeate 0.0750.143a 0.3330.177b.c 0.4230.243c 0.0470.095a 0.2970.093b 0.0000* 0.0123* 0.0000*
p-coumaric acid 0.1010.255a 0.2860.295b 0.3690.472b 0.0730.148a 0.1550.240a 0.0000* 0.0001* 0.0000*
cis/trans p-coutaric acid 2.890.73c 4.310.61d 3.360.39c 2.390.41b 1.950.35a 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Ethyl coumarate 0.0170.045a.b 0.0670.091c 0.042100b.c 0.0060.019a 0.0170.041a.b 0.0000* 0.3504 0.0000*
Furanic Aldehydes
5-hydroxymethyl
5.163.22b 6.173.82b 6.333.50b 8.086.66c 4.252.13a 0.0000* 0.0000* 0.0000*
furaldehyde
2-furaldehyde 2.952.17b 3.953.03c 4.601.88b 2.451.53a 5.242.12b.c 0.0000* 0.0000* 0.0000*

338
English summary

Phenolic compound Fermentation p-value

E1 E2 E3 E4 E5 Fermentation Aging type Aging Time


5-methylfuraldehyde 0.3990.287c 0.4810.360c 0.4730.149a.b 0.3080.167a 0.5930.163b.c 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Miscellanous
Tyrosol 8.511.47a 11.41.81b 14.30.81c 9.111.07a 13.90.96c 0.0000* 0.0000* 0.0000*
a 1.730.24b 2.200.31c 2.340.43c 1.470.25a 1.320.14a 0.0000* 0.0000* 0.0003*
b 3.302.13a 6.454.18c 8.764.94d 5.403.83b 3.182.03a 0.0000* 0.0003* 0.0000*
c 0.6020.071c 0.8320.159d 0.5720.085b.c 0.4190.099a 0.5360.095b 0.0000* 0.0000* 0.0000*
d 1.780.69a 2.320.84b 3.000.59c 2.79+0.51c 2.790.66b.c 0.0000* 0.4447 0.0001*

* Significant difference at p < 0.05

339
Experimental and results

Principal component analysis (PCA) was carried out in order to evaluate the
phenolic and furanic compounds which were involved in the differentiation of
the wines studied. As a result, five principal components that explained
87.05% of the total variance were extracted.

Attending to the first two principal components, that explained the 62.28% of
the variability, it was observed that polyphenols with greater weight in the PC1
were gallic acid, ethyl gallate, vanillin, syringaldehyde, caffeic acid, p-coumaric
acid, ethyl caffeate and 2-furaldehyde. Several of these compounds have been
previously related with the aging in wood (Garca Moreno and Barroso, 2002;
Schwarz et al., 2012).

Therefore, the samples corresponding to aging in wood had positive values for
PC1, while those wines subjected to aging in stainless steel or with chips,
presented negative values for this PC (Figure 3).

Figure 3. PCA for type of aging. 1: Oak Cask, 2: Stainless steel tanks, 3: with chips.

The representation of the samples on the plane defined by PC1 and PC2,
showed that the increase of the aging time displaced the samples to positive

340
English summary

values of PC1 (data no shown) with those samples more time aged in wood
with higher values from this PC.

III.III.1.2. Phenolic and furanic compounds in sweet wines. Influence of


raw material (grape variety, vintage, drying type) and aging

In this work, phenolic and furanic compounds of Muscat and Pedro Ximnez
sweet wines from vintages 2009 and 2010 (see III.I. Samples) were
evaluated. The period of aging in oak cask was also monitored at the beginning
and during 12 months (S0, 0 days; S1, 30 days; S7, seven months and S12,
twelve months).

Twelve phenolic compounds and three furanic aldehydes that had been
previously described in oenological products from Jerez-Sherry D.O. (Alonso
et al., 2004; Schwarz et al., 2009; Schwarz et al., 2012) and white wines (Boselli et
al., 2006) were identified. Four unknown polyphenols were also included in the
analysis.

Analysis of variance for each of the compounds studied showed significant


differences (p < 0.05) in most of them depending on the factors considered,
grape variety, vintage, drying type and aging time. Means for grape
variety and drying type and p-values for each factor considered are shown
in Table 8.

Regarding grape variety, in general, a higher phenolic content in Pedro


Ximnez was observed. In relation to furanic aldehydes, no differences in the
content of 5-hydroxymethylfuraldehyde and 2-furaldehyde for both varieties,
Muscat and Pedro Ximnez, were found; however, 5-methylfuraldehyde

341
Experimental and results

content was higher in the Pedro Ximnez grapes. These data were consistent
with the results described by Mrquez et al., (2007).

The drying system of the grapes showed particular influence on


hydroxybenzoic acids and derivatives, with higher concentrations in wines
from grapes dried in climatic chamber. This same tendency was observed for
hydroxycinnamic acid-tartaric acid esters as well as tyrosol and unknown
compounds a and c.

Although the factor vintage was the least influential of all factors evaluated,
wines from vintage 2009 showed higher concentrations for several of the
compounds studied; ethyl gallate, protocatechuic acid, syringaldehyde,
cis/trans p-coutaric acid, tyrosol and unknown compounds a, b and c were
found in higher amount in wines from vintage 2009.

Lastly, the aging time increased the content of all phenolic and furanic
compounds evaluated, except hydroxycinnamic acid-tartaric acid esters,
caftaric and cis/trans p-coutaric, which showed no significant differences
during their temporary evolution.

342
English summary

Table 8. Means (mg/l) and standard deviations for phenolic and furanic compounds according to grape variety and drying type. p-values for each
factor under study. Significant difference at * p < 0.05).

Phenolic compounds Grape Variety Drying Type p values


Climatic Aging
P.X. Muscat Sunning Variety Vintage Drying
Chamber Time
Hydroxybenzoic acid and derivatives
Gallic Acid 4.424.46 2.713.53 4.504.39 3.023.93 0.0002* 0.4028 0.0020* 0.0000*
Ethyl gallate 4.431.19 2.360.91 4.151.28 3.281.57 0.0000* 0.0061* 0.0000* 0.0000*
Protocatechuic Acid 9.065.52 2.782.11 9.046.11 4.383.16 0.0000* 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Vanillin 1.601.55 1.892.14 1.891.85 1.411.59 0.0044* 0.8238 0.0039* 0.0000*
Syringaldehyde 3.523.18 3.373.49 3.863.40 2.923.00 0.6422 0.0070* 0.0347* 0.0000*
Hydroxycinnamic acid and derivatives
Caffeic acid 0.5700.505 0.3190.504 0.4810.450 0.5070.601 0.0042* 0.1649 0.5812 0.0000*
Caftaric acid 5.655.90 0.5190.481 5.254.26 2.366.44 0.0000* 0.7720 0.0022* 0.0780
Ethyl caffeate 0.1860.247 0.0680.140 0.1360.185 0.1680.274 0.0001* 0.8953 0.4184 0.0000*
p-coumaric acid 0.3100.401 0.1720.250 0.2650.345 0.2700.396 0.0005* 0.4235 0.6613 0.0000*
cis/trans p-coutaric acid 4.973.68 0.3120.177 4.893.72 1.602.85 0.0000* 0.0455* 0.0000* 0.1256
Ethyl coumarate 0.0640.125 0.0420.085 0.0510.088 0.0660.144 0.2811 0.3892 0.1302 0.0000*
Furanic Aldehydes
5-hydroxymethyl
6.066.27 6.948.98 6.727.43 5.786.89 0.1348 0.2808 0.9716 0.0000*
furaldehyde
2-furaldehyde 6.094.63 5.634.91 6.314.65 5.444.77 0.7874 0.5309 0.3665 0.0000*

343
Experimental and results

Phenolic compounds Grape Variety Drying Type p values


Climatic Aging
P.X. Muscat Sunning Variety Vintage Drying
Chamber Time
5-methylfuraldehyde 0.7880.462 0.5530.474 0.7430.471 0.6760.486 0.0006* 0.0918 0.7520 0.0000*
Miscellanous
Tyrosol 11.796.77 4.442.12 11.767.58 6.313.07 0.0000* 0.0003* 0.0000* 0.0001*
a 2.351.25 0.6030.308 2.341.34 1.050.86 0.0000* 0.0000* 0.0000* 0.0000*
b 3.022.54 3.423.69 3.663.19 2.432.39 0.0206 0.0001* 0.0503 0.0000*
c 0.6310.372 0.2990.159 0.6450.416 0.3610.124 0.0000* 0.0010* 0.0000* 0.0000*
d 7.243.07 3.711.79 6.323.17 5.883.22 0.0000* 0.1598 0.1755 0.0000*

344
English summary

When the data matrix was subjected to a principal component analysis, three
major components (PCs) which explained the 83.46% of the total variance
were extracted. As shown in Figure 4, the first principal component, which
explains the 58% of the variance, was related with aging in wood. Those wines
with longer aging time showed higher values for PC1, in which the greatest
weights were for compounds such as gallic acid, 5-methylfuraldehyde, 2-
furaldehyde, p-coumaric and syringaldehyde, that are characteristic of aging
stage (Garca Moreno and Barroso, 2002; Schwarz et al., 2012).

Figure 4. PCA for wines from v.2009 and 2010. (Aging time: 0, 1, 3, 7 y 12 months ).

In summary, while the individualized study of each compound by analysis of


variance showed that all factors considered (grape variety, vintage, drying type
and aging time) have some influence on the phenolic and furfural profile of
the wines studied, the PCA showed that the aging time were the most
influential factor.

345
Experimental and results

III.III.1.3. Identification of phenolic compounds by HPLC-MS/MS and


their relationship with the antioxidant activity (AA)

During a research stay at the Faculty of Pharmacy of the University of Lisbon


(Portugal), the identification of phenolic compounds by HPLC-MS/MS in a
representative samples selection was carried out. In addition, the antioxidant
activity of each sample was evaluated by in-vitro methods (ORAC and
HORAC). Its possible relationship with the phenolic profile and other global
indexes: total phenolic and total flavonoids contents (TPC and TFC), total
chromatographic areas at 280 nm and 360 nm (A280 and A360) and total sum
of peak areas obtained in the electrochemical detector (AED), were also
evaluated. Selected samples were wines corresponding to the three vintages
(2008, 2009 and 2010) from Muscat and Pedro Ximnez grapes dried by both
traditional sunning and climate chamber. For wines from vintage 2008,
sampling at 40 days, 3, 7 and 28 months of aging (oak cask, stainless steel and
with chips) were chosen whereas for 2009 and 2010 vintages, this was at the
beginning (0 days) and after 7 months of aging in oak cask.

Identification of phenolic compounds by HPLC-MS/MS

MRM method was previously selected and developed according to:


- Results from analyses performed in SCAN, SIR, DS and MRM modes
of reference samples (set of samples selected according to grape
variety, drying type, vintage and aging time) and their extracts obtained
following the method described by Bravo et al., (2006).
- MS/MS assays after infusion of individual standard solutions of some
phenolic compounds.

346
English summary

- Comparison of MS and DAD results with results from standard


solutions and bibliography (Garca Moreno and Barroso, 2002;
Monagas et al., 2005; Bravo et al., 2006).
After the method design, 29 phenolic compounds were identified (Table
9).
RT MRM
Phenolic Compound MW
(min) [M-H] > MS2
15.7 Gallic acid 170 169 > 125
19.2 Hydroxytyrosol 154 153 >123
19.7 Protocatechuic acid 154 153 > 109
20.6 Caftaric acid 312 311 > 179
21.9 2-Furoic Acid 112 111 > 67
23.2 Tyrosol 138 137 > 119
23.7 p-coutaric acid 296 295 >163
24.3 p-Hydroxybenzoic acid 138 137 > 93
24.9 Gentisic acid 154 153 > 109
25.2 Fertaric acid 326 325 > 193
25.9 Caffeic acid 180 179 > 135
28.8 Dihydroxybenzoic acid 154 153 > 109
29.3 p-hydroxybenzaldehyde 122 121 > 92
31.9 Ethyl gallate 198 197 > 169
34.2 Vanillin 152 151 > 136
34.2 p-coumaric acid 164 163 > 119
35.5 trans-piceid 390 389 > 227
36.7 Ellagic Acid 302 301 > 284
37.4 Quercetin-3-glucuronide 478 477 > 301
37.8 Quercetin-3-glucoside 464 463 > 301
38.5 Dihydroquercetin-3-O-rhamnoside (astilbin) 450 449 > 303
40.1 Ethyl caffeoyltartrate 340 339 > 177
41.4 Quercetin-3-rhamnoside 448 447 > 301
41.6 cis-piceid 390 389 > 227
Dihydrokaempferol-3-O-rhamnoside
42.0 434 433 > 269
(engeletin)
44.1 Ethyl protocatechuate 182 181 > 153
45.3 Salicylic Acid 138 137 > 93
48.8 trans-ethyl caffeate 208 207 > 179
53.2 Ethyl p-coumarate 192 191 > 163

Table 9. Phenolic compounds identified in wines by HPLC-MS/MS.

347
Experimental and results

A PCA was carried out in order to identify possible patterns. Seven significant
Principal Components (PCs) were obtained (eigenvalues>1). Figure 5 shows
the score plot of the first two PCs, which explained 49.76% of the total
variability of the phenolic compounds. As can be seen, PC2 divides the sweet
wines into two groups, sweet wines from cv. Muscat and sweet wines from cv.
Pedro Ximnez, with negative values for this PC for these last ones (Figure 5).
PC2 was related with p-hydroxybenzoic acid and 2-furoic acid (positive sign)
and quercetin-3-O-gluoside, quercetin-3-glucuronide, trans/cis-p-coutaric acid,
gentisic acid, dihydroxybenzoic acid and hydroxytyrosol (negative sign).

Figure 5. PCA. Sweet wines from cv. Muscat and PX.

In order to obtain suitable classification rules for assigning categories to


samples, supervised learning pattern recognition methods were applied. A
forward stepwise linear discriminant analysis was carried out according to the
Wilks lambda statistic (Wilks, 1960). The so-called leave one out method
has been employed. For sweet wines from cv. Muscat, according to aging time,
the variables included in the discriminant functions obtained (cited according
to their discriminant power) were: vanillin, gallic acid, 2-furoic acid and

348
English summary

dihydroquercetin-3-o-rhamnoside. The scatterplot of the samples onto the


plane defined by the first two discriminant functions is shown in Figure 6. As
shown, a clear separation among samples without aging and samples aged for
twenty eight months was obtained. Samples aged for shorter times were
located between these two groups. 75.56% of the samples were correctly
classified in the check process by the leave one out method.

Figure 6. LDA for aging time. Sweet wines from cv. Muscat.

For aging type, 97.78% of the samples were correctly classified in the check
process (data no shown). The discriminative variables included were: ethyl
protocatechuate, ethyl caffeate, ethyl gallate, trans/cis-p-coumaric acid,
trans/cis-caftaric acid, and dihydroquercetin-3-o-rhamnoside.

Antioxidant activity

In this study, two in vitro assays, ORAC and HORAC have been employed to
analyze the antioxidant activity of Andalusian sweet wines. Possible
correlations between both methods and phenolic content were also studied.

349
Experimental and results

No correlation was found between ORAC and HORAC values for the wines
analyzed (r=0.416). This result was according with those obtained by Ou et al.,
(2002). HORAC and ORAC assays measure two different aspects of
antioxidant properties, radical chain breaking and radical prevention
respectively, so that, high HORAC values do not necessarily correspond with
high ORAC values.

Correlation Antioxidant Activity (AA) vs Global Indicators


TPC TFC Total Total Total
(mg Eq. (mg Eq. area area area
G.A./l) Cat/L) 280nm 360nm ED
ORAC
0.81* 0.77* 0.61* 0.71* 0.74*
(mol CAET/l)
HORAC
0.40* 0.38* 0.24 0.34* 0.43*
(mol CAE/l)
Table 10. Correlation study between Antioxidant Activity (HORAC and ORAC) and Global
Indicators.

As can be seen in Table 10, ORAC was related significantly with all global
indicators evaluated and correlation coefficients greater than 0.6 were
obtained, while HORAC not provided good correlation with any of them,
reaching its highest r-value with AED (0.43). These results agree with those
obtained by Feliciano et al., (2008), in which different tests to measure
antioxidant activity in Muscat wines were evaluated, being ORAC the AA
method that showed highest correlation values with total phenolic and
flavonoid content.

PCA was carried out and eight factors were extracted (Figure 7). The first two
ones represented the 48.5% of variability. PC1 related ORAC to gallic acid,
ethyl gallate, TPC, TFC, A280, A360, and AED while PC2 associated HORAC
with salicylic and 2-furoic acid (in a reverse way). As can be seen, these results
are in agreement with those obtained in the previous correlation study.

350
English summary

PC2

PC1

Figure 7. PCA. Projection of the original variables.

Relationship between AA and winemaking factors: grape variety, drying


type, vinification, vintage, type and time of aging

Both data, AA HORAC and AA ORAC, were subjected to analysis of variance


according to factors: grape variety, type of drying, type of vinification, vintage
and type and time of aging.

Factor ORAC HORAC


F p F p
Grape Variety 15.69 0.0005* 7.11 0.0134*
Vintage 3.19 0.0582 17.84 0.0000*
Drying type 2.49 0.1032 2.73 0.0866
Vinification 4.91 0.0034* 4.89 0.0029*
Aging type 0.0448 0.8340 0.2398 0.6287
Aging time 1.01 0.4243 3.62 0.0214*

Table 11. ANOVA for AA ORAC and HORAC. F values and p-values for each factor evaluated.
*values are significant at p < 0.05.

351
Experimental and results

As shown in table 11, both values of antioxidant activity were statistically


influenced by type of vinification (maximum values of the AA_ORAC were
found in experiment 3 and AA_HORAC in experiment 4) and grape variety
(PX was characterized for higher AA ORAC and HORAC values than
Muscat), not observing a clear effect of the other factors evaluated. However,
these results should be treated with caution, since a larger number of samples
would be considered in order to guarantee the results obtained.

III.III.2.VOLATILE COMPOUNDS

III.III.2.1. Study of the content in volatile compounds of Muscat sweet


Sherry wines obtained under different conditions.

In this research work, a total of 53 individual volatile compounds have been


identified in the different Muscat wines studies from vintage 2008 (table 12).
In our case, all musts were obtained from grapes dried using drying chamber
(40C and 10% RH). After fermentation, the sampling was carried out
periodically for 1 year of aging (S0, 20 days; S1, 40 days; S2, 3 months; S3, 4
months; S4, 8 months; and S5, 12 months).

Volatile compounds were analyzed by SBSEGCMS according to the


method proposed by Alves et al., (2005). For wines from Muscat grapes, most
volatile compounds found in this study had been previously identified: from
grape pulp and skins (Sanchez-Palomo et al., 2005); coming from the alcoholic
fermentation (Karagiannis et al., 2000; Snchez-Palomo et al., 2007); and/or
appearing after the period of aging in wood (Karagiannis et al., 2000; Ortega-
Heras et al., 2004; Mrquez et al., 2007).

352
English summary

In order to study statistically the differences in the volatile content of all the
wines studied, data were submitted to the analysis of variance. For this one,
three independent factors were considered: type of fermentation, time of aging
and type of aging. As can be seen in table 12, practically all the volatile
compounds were significantly affected (p < 0.01) by these three factors.

p value p value p value


Volatile Compounds
fermentation aging time aging type
Ethyl Esters
Ethyl butanoate 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Ethyl 3-methylbutanoate 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Ethyl hexanoate 0.0000* 0.0090* 0.0000*
Ethyl octanoate 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Ethyl decanoate 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Diethyl succinate 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Diethyl pentanedioate 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Ethyl dodecanoate 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Ethyl tetradecanoate 0.0138 0.0000* 0.4404
Ethyl hexadecanoate 0.2729 0.1607 0.0065
Ethyl octadecanoate 0.0007* 0.0786 0.0000*
Acids
2-ethylhexanoic acid 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Octanoic acid 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Nonanoic acid 0.0351 0.0353 0.7558
Decanoic acid 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Dodecanoic acid 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Tetradecanoic acid 0.0169 0.0003* 0.1000
Hexadecanoic acid 0.0259 0.0000* 0.0087*
Acetates
n-butyl acetate 0.0000* 0.0000* 0.0000*
4-methyl-2-pentanol acetate 0.0051* 0.0000* 0.4759
Isoamyl acetate 0.0000* 0.0000* 0.0307
Phenylethyl acetate 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Ethyl 2-phenyl acetate 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Terpenes and terpenols
Nerol oxide 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Linalool oxide 0.0000* 0.0000* 0.0788
Linalool 0.0000* 0.0016* 0.0000*
4-terpineol 0.0347 0.0071* 0.1862
terpineol 0.0170 0.0014* 0.0312
-citronellol 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Nerol 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Nerolidol 0.0000* 0.0198 0.0000*
Geraniol 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Thymol 0.0853 0.0500 0.6645
Carvacrol 0.5621 0.0500 0.0097*
-myrcene 0.3967 0.0000* 0.0002*

353
Experimental and results

p value p value p value


Volatile Compounds
fermentation aging time aging type
Dehydroxylinalool oxide I 0.0000* 0.0000* 0.0170
Dehydroxylinalool oxide II 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Aldehydes, ketones and alcoholes
Hexanal 0.0000* 0.0000* 0.0705
2-Hexenal 0.1346 0.0002* 0.4616
Octanal 0.1942 0.0000* 0.0767
6-methyl-5-hepten-2-ona 0.0000* 0.0552 0.0000*
1-Hexanol 0.0000* 0.0213 0.0000*
Nonanal 0.8073 0.0000* 0.8874
Benzaldehyde 0.0000* 0.0000* 0.0000*
3-methyl-2-butanol 0.0015* 0.0000* 0.1049
2-phenylethanol 0.0000* 0.5980 0.0083*
Miscellaneous
Phenol 0.0235 0.0505 0.4117
Eugenol 0.0000* 0.0000* 0.0000*
4-Ethylphenol 0.0001* 0.7190 0.0000*
2-Furaldehyde 0.0000* 0.0000* 0.0000*
5-methylfuraldehyde 0.0000 * 0.0000 * 0.0000 *
1,1,6-trimethyl-1,2-dihydronaphthalene (TDN) 0.0000* 0.0000* 0.0000*
2,6 Di-tert-butyl-p cresol (BHT) 0.1128 0.0000* 0.0000*
Table 12. Volatile compounds identified in sweet wines and p-values for "fermentation", "aging
time" and "aging type".*values are significant at p < 0.01.

The data matrix (volatile compounds) was subjected to a hierarchical


agglomerative cluster analysis (CA) of cases. Three main clusters can be
appreciated (Figure 8): one cluster for the samples from Experiments D2 (E2)
and D3 (E3) aged in oak wood; another one for the samples from
Experiments D1, D4, and D5 (E1, E4 and E5 respectively) aged in oak wood;
and finally, a third one for the samples from the experiments submitted to
aging in stainless steel and aged with chips. Some initial samples (S0, S1, and
S2) from Experiment D1 are grouped together with those ones from
Experiments D2 and D3.

Clusters formed demonstrate that the volatile compounds studied possess


sufficient explanatory power to detect the type of aging process and
differentiate two yeast strains. Taking into account that only the initial samples
from Experiment D1 (E1; S. cerevisiae without nutrients and pellicular

354
English summary

maceration) aged in wood were grouped together with those ones fermented
with the same yeast strain, it could be concluded that, for these wines, the use
of nutrients or pellicular maceration conditioned their later evolution in oak
cask.

Figure 8. Cluster analysis (CA). Dendrogram obtained using squared Euclidean distance and the
Ward method as amalgamation rule.

Thus, in order to obtain suitable classification rules for assigning categories to


samples, a supervised learning pattern recognition method was applied. A
forward stepwise linear discriminate analysis (LDA) was carried out.

Three possible differentiation criteria have been considered: fermentation type


(Experiments from D1 to D5), time of aging (S0, S1, S2, S3, S4, and S5), and
aging type (aging in oak wood, aging with chips, and aging in stainless steel).

The variables included in the discriminant functions obtained according to


fermentation type mainly belonged to four chemical families (ethyl esters,
terpenes, furanic compounds, and acetates. Clear separations among the
samples of different vinification experiments were obtained (data no shown).

355
Experimental and results

Samples from Experiments D3, D4, and D5 were clearly differentiated,


whereas Experiments D1 and D2 were in some cases intermingled. Both these
last experiments were carried out without previous pellicular maceration, with
S. cerevisiae, and fermented at the same temperature. In the case of
Experiment D2, nutrients were employed. The 100 % of the samples were
correctly classified in the check process by the leave-one-out method.

According to the criterion aging type, the variables included in the


discriminant functions mainly were acids, ethyl esters for the first function,
and nerolidol and nerol oxide with positive sign and negative sign, this last
one, for the first and the second functions, respectively. As can be seen in
Figure 9, samples from different aging type are undoubtedly separated with a
99.24 % of correct classification in the check process by the leave-one-out
method.

7
Oak cask
5
Chips

3 Stainlees steel
Function 2

-1

-3

-5
-5 -3 -1 1 3 5 7
Function 1

Figure 9. LDA for "type of aging". Muscat, v.2008.

With regard to the criterion time of aging, mainly terpenes, ethyl esters and
acetates were the variables included in the two first discriminant functions

356
English summary

(data no shown). Function 1 separated undoubtedly those samples with short


aging (S0, S1, and S2, with negative values for this function) from those aged
during a long time (S3, S4, and S5). A 98.48 % of correct classification was
obtained in the check process by the leave-one-out method.

From the results obtained, it can be observed an important influence of the


three factors considered, fermentation type, aging type, and aging time, on
volatile compounds and sensorial characteristics of the wines studied. Taking
into account the global volatile profile, the factor aging type has
demonstrated the highest influence on the volatile content of the wines (Figure
8), with wines from Experiments D4 and D5 (fermented with S. bayanus) and
aged in oak wood clearly differentiated from those fermented with S. cerevisiae
and aged in wood or stainless steel.

III.III.2.2. Volatile composition of Pedro Ximnez and Muscat sweet


Sherry wines from sun and chamber dried grapes: a feasible alternative
to the traditional sun-drying

The objective of this work was to evaluate the volatile profiles of sweet Sherry
wines obtained from chamber and sun dried grapes after their aging in wood
in order to establish the use of climatic chambers as alternative to the
traditional sun drying. Both ways of drying together with other factors such as
grape variety, vintage and aging time have been considered in this study. Two
grape varieties (Muscat and Pedro Ximnez) and two vintages (2009 and 2010)
were studied. For each grape variety and vintage, musts from grapes dried by
sun and chamber, were separately fermented in duplicate at low temperature
(about 10C) with S. Bayanus (40 g/hl, Uvaferm 43, Lallemand, Australia).
After vinification, the sampling was carried out periodically for one year of

357
Experimental and results

aging (S0, 0 days; S1, 30 days; S3, three months; S5, 5 months; S9, nine
months; and S12, twelve months).

In this study, 51 individual volatile compounds, belong to different chemical


families (ethyl esters; acids; acetates; terpenes and terpenols; aldehydes,
ketones and alcohols; and miscellaneous), have been identified in the different
wines.

For both varieties, volatile compounds found in this study had been previously
identified (Franco et al., 2004; Mrquez et al., 2007; Lpez De Lerma et al.,
2012; Ruiz et al., 2014). Table 13 shows mean values found for the different
chemical families evaluated according to each factor (aging time, grape variety,
vintage and drying type) considering the different values of the remaining
factors. Most of these factors seem to be significant for some of the chemical
families. As could be expected, wines from Muscat grape variety exhibited a
higher content in terpenic compounds (Snchez-Palomo et al. 2005) whereas
aged wines showed higher contents in ethyl esters and aldehydes, ketones and
alcohols (Table 13).

In order to study statistically the differences in the volatile content of all the
wines studied, data were submitted to analysis of variance (ANOVA). For this
one, four independent factors were considered: aging time, grape variety,
vintage, and type of drying. As a result, practically all the volatile compounds
were significant affected (p < 0.01) by one or more factors (data no shown).
Taking into account the results obtained from ANOVA study, in which most
of the volatile compounds were significantly affected by some of the factors
studied, a multivariate study was carried out.

358
English summary

Table 13. Mean values (relative chromatographic area) and standard deviations for each chemical family of volatile compounds.

Volatile Aging time (months) Grape variety Vintage Drying type


Compounds
0 12 Muscat PX 2009 2010 Chamber Sun

Ethyl esters 0.4090.946 0.5551.258 0.5781.091 0.4731.018 0.3710.904 0.6281.140 0.4470.961 0.5821.137

Acids 0.0700.081 0.0830.099 0.0750.077 0.0680.085 0.0540.065 0.0860.095 0.0650.072 0.0780.096

Acetates 0.2640.389 0.3140.373 0.2650.300 0.2820.334 0.2120.193 0.3380.403 0.2990.305 0.2790.350

Terpenes and
terpenols 0.0170.034 0.0180.059 0.0460.077 0.0030.007 0.0130.048 0.0180.044 0.0200.056 0.0090.026

Aldehydes,
ketones and 0.2360.376 0.3300.485 0.3040.453 0.2890.412 0.2780.403 0.3070.443 0.3130.451 0.2650.382
alcohols

Miscellaneous 0.0060.034 0.0320.057 0.0250.044 0.0260.048 0.0260.046 0.0260.048 0.0240.044 0.0280.051

359
Experimental and results

The data matrix was subjected to a cluster analysis of cases. Two main clusters
could be appreciated: one cluster for wines from Muscat grapes and another
one for wines from PX grapes. Later, a clear influence of the factor vintage
could be observed inside of each one (data no shown).

Therefore, considering all volatile compounds studied, it seems that these two
factors, variety and vintage, were more influential in the volatile profile of
wines studied than aging time and drying type. This same differentiation was
observed in a previous study carried out about the characterization of the
volatile fraction of Andalusian sweet wines (Mrquez et al., 2007).

To corroborate the results obtained from cluster analysis (CA) and check
which volatile compounds can allow the differentiation of wines studied, a
principal component analysis (PCA) was performed. 10 PCs (principal
components) which explained the 87.3% of the total variance were extracted.
In the score plot of all wines onto the plane defined by the two first PCs,
wines were differentiated according to grape variety (data no shown) so that, a
new PCA was performed, but in this case, both grape varieties were separately
studied.

For Muscat wines, nine PCs were obtained, which explained the 92.8% of the
total variance, with 53.8% of this one explained by the two first PCs. In the
case of PX wines, the 87.4% of the total variance was explained by ten PCs.

Figure 10 shows the distribution of both varietal wines onto the plane defined
by the first PCs. As can be seen, for each grape variety, wines were separated
according to their aging time.

360
English summary

For both grape varieties, those wines from vintage 2009 showed negative
values for PC2, so this PC seems to be related to the factor vintage. In the
previous ANOVA study, the factor vintage had showed a significant influence
on most of these compounds. The high difference between the precipitation
values of both vintages (MAGRAMA, 2015) could explain the high
significance found for this factor in the volatile content of wines studied.

Taking into account the global volatile profile, the factor drying type was the
least influential on the volatile profiles of sweet Sherry wines studied, with
aging time, grape variety, and vintage showing to be significant on them.

361
Experimental and results

9
a
1
6
1 5 12
12
0 9
3 3
Component 2

0 1 3 3
5 9
1 3
9 12
0
55 9
12

-3 0 1
0 1 3
3 12 12
33 9
5 9 9 12 12
5 9
5
-6
-7 -4 -1 2 5 8

Component 1
Vintage 2009

10
b
12
7 12 9
0
9 0 0
1
12 3
4 12 3
12
Component 2

1 0
12
12 55
5 99 9
12 12 9
12
5 3
1 1
5 12 55 3
129 3
99
3 3
9 9 3
9 00
-2 5 3 5
3 1 1 1
5 5 3 1
11 0 0
3 1 1 0
-5 0 0 0

-9 -6 -3 0 3 6 9
Component 1

Vintage 2009

Figure 10. Principal component analysis (PCA) for: a; Muscat wines; b: Pedro Ximnez wines. 0,
1, 3, 5, 9 and 12: months of aging in wood.

362
English summary

III.III.3. SENSORY ANALYSIS

Musts and wines from the three vintages (V08, V09 and V10) were studied.
Must samples were taken at the start and the end of both drying processes; by
sunning (1T and 2T) and controlled drying in a climate chamber (C). In
addition, after vinification, aged wines were periodically monitored for one
year, for wines from vintages 2009 and 2010, and for 28 months in the case of
the v. 2008.

Sensory evaluation of musts and wines, exclusively orthonasal, was carried out
in duplicate by a panel of 14 to 17 assessors, all with a moderate degree of
experience in sensory analysis of sweet wines. Both triangular and ranking
sensory tests, and descriptive profiling, were performed. In addition, to
validate the reproducibility of the judgesopinion, a duplicated discrimination
test was performed and the descriptive profiles of 2 reference samples were
obtained.

III.III.3.1. Effect of the raisining system on the sensory profile of the


musts

Musts obtained by drying grapes in the traditional way were compared to those
dried in a climate chamber, by applying a triangular test (N=14 judges,
=0.05). The result showed that there was a perceptible difference between
musts, and according to the notes of the judges, the intensity of the detected
difference was low-to-medium.

In order to identify the aromatic notes responsible for the difference detected,
an analysis of the variance was applied to the scores obtained in a descriptive
test. The results obtained are shown in Table 14.

363
Experimental and results

Grape Muscat Pedro Ximnez


Climate Climatic
Descriptor Sunning p Sunning p
chamber chamber
Aromatic
4.51.4 4.21.3 0.152 4.51.4 4.31.0 0.817
intensity
Fruity 3.91.2 4.70.8 0.045* 4.01.5 5.52.8 0.079
Citric 1.11.4 0.91.3 0.215 1.21.6 0.71.0 0.535
Ripe fruit 3.42.2 2.62.0 0.276 3.31.8 3.01.8 0.876
Sweet 2.91.6 3.01.6 0.138 3.31.9 3.51.7 0.880
Raisin 3.31.2 4.51.5 0.049* 2.01.6 2.31.7 0.096
Floral 2.01.9 1.71.6 0.557 1.31.6 2.22.6 0.516
Honey 1.21.6 2.32.5 0.345 1.82.4 2.31.9 0.701
Herbaceous 1.91.4 1.21.9 0.219 1.60.6 1.70.7 0.305
Winery 0.91.7 1.21.9 0.337 1.22.0 0.30.8 0.375
Dairy 0.40.9 0.51.1 0.216 0.50.8 0.00.0 0.174
Musty 1.92.2 1.31.8 0.099 3.21.8 1.20.9 0.104
Chemical
0.10.5 0.20.5 0.125 0.30.5 0.00.0 0.144
character
Overall
3.81.9 3.61.7 0.115 2.52.3 4.70.8 0.051*
impression
Table 14. ANOVA of sensorial scores of musts, 2008 vintage. Mean values and standard
deviations are shown. *Values are statistically significant at p < 0.05.

Among the positive notes, only fruity and raisin were capable of discriminating
between musts from raisins obtained by the two drying systems (sunning, 1T,
and climatic chamber, C) at a level of statistical significance (p < 0.05). It is
important to note that musts from the climate chamber showed a lower
intensity of the musty off-odour. According to the overall impression, the must
from PX grape dried in the climate chamber was more appreciated than that
from the sunning. However, that difference was not perceived when must
from Muscat grape raisins was evaluated.

A principal component analysis (PCA) was applied to the scores of the


descriptive study obtained for musts of three vintages (2008, 2009 and 2010).
Four principal components (PC) that explain 86.7% of the overall variance
were extracted. Their loadings seems to confirm, on the one hand, a
relationship between PC1 (40.1% of variance explained) and the drying

364
English summary

process, as it was highly correlated with ripe fruits, sweet and raisin attributes, and
PC2 (22.6% of variance explained) with a higher aromatic complexity
characterized by greater intensity and clear citric and floral notes, all of which
contribute to a better overall impression. On the other hand, both PC3 (16.1% of
variance explained) and PC4 (7.9% of variance explained) were related to
negative aromatic notes (dairy, musty, chemical character).

When all the musts were placed in the new space, it is shown that on PC1
(Figure 11.(a)) musts from grapes raisined in the climate chamber were located
to the right of those from traditional sun drying on the terrace of the research
centre (1T). According to PC2 the Muscat musts (in bold) were located at the
higher values, which means they had a more complex and appreciated
aromatic profile. The sensory profile of the musts was affected by the variety,
as it could be expected. It is interesting that the only PX wine which was
located in this higher value area was the one made with raisins dried in the
climatic chamber in 2008.

Regarding PC3 and PC4, these components could discriminate musts from
different vintages (Figure 11.(b)). Those 2010 musts, independent of variety
and raisining system, were located in the furthest positions to the negative
descriptors (dairy, musty, herbaceous and chemical character). So that, the
major effect that vintage had on the quality of musts was confirmed. It is very
interesting for us that the Muscat must from vintage 2009 elaborated from
climatic chamber dried grapes was also located onto this area.

365
Experimental and results

2,0
V10.M.C
Terrace: 1T
Climate Chamber: C
a) 1,5 V10.M.1T
Vineyard: 2T
Fresh grape: Ini
Citric
Overall impression
1,0 Floral
Aromatic intensity
V09.M.C Honey

0,5 V09.M.Ini Fruity


V08.PX.C
Ripe fruit
V08.M.Ini
PC2

Herbaceous
V08.PX.Ini V08.M.1T Sweet
0,0 Musty
P

Chemical character Raisin


V08.M.C
V09.PX.Ini V09.PX.C
Dairy
V09.PX.2T
-0,5 Winery V08.PX.1T

-1,0 V10.PX.C V10.PX.2T


V10.PX.1T

-1,5
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

PC1

1,5
V10.PX.2T

1,0 V10.PX.1T V10.PX.C


b) V10.M.C V08.PX.1T
V08.M.Ini
V08.M.C V08.PX.C
0,5 V10.M.1T Floral
Sweet Musty
V09.M.COverall impression
Winery
Fruity Dairy V08.M.1T
Citric Raisin
Aromatic intensity
0,0
Ripe fruit Honey Herbaceous
V08.PX.Ini
PC4

-0,5

V09.M.IniChemical character
P

-1,0
V09.PX.Ini
-1,5
V09.PX.C
V09.PX.2T
-2,0 2010 vintage: V10
2009 vintage: V09
2008 vintage: V08
-2,5
-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

PC3

Figure 11. PCA of the sensory scores of musts from raisins obtained by both drying systems
under study. Projection of the musts onto the new space defined by: a) PC1 and PC2; b) PC3 and
PC4.

III.III.3.2. Effect of the fermentation conditions on sensory profile of


sweet wines

The wines obtained from different fermentation conditions (2008 vintage)


were analyzed by triangular tests (data no shown). A perceptible difference was
found between wines fermented by S. cerevisiae and those by S. bayanus, (E3 vs

366
English summary

E5). The difference was also perceived both when nitrogen was added (E2 vs
E1) and when pellicular maceration with added pectolytic enzymes was used
(E3 vs E1). The intensities of the differences detected were medium-to-strong.
In order to determine which wine was different from another, the least
significant difference was calculated, with =0.05. The ranking of the panel,
from major to minor preference, was E41 > E11 > E31,2 > E52 > E22 .
Different superscript numbers indicate wines that tasters perceived as quite
different from an overall point of view.

Wines were also analyzed by the descriptive test. The results obtained after the
variance analysis of the data (data no shown) suggested that floral and citric
notes were the most sensitive for discriminating among most of these wines.
The preferred wine from the ranking test, that fermented at low temperature
with S. bayanus (E4), scored the highest in citric and floral notes, while that
fermented with added nitrogen (E2) (the lowest rated in the ranking test)
presented very low citric and floral notes, and a clear chemical off-odour. The fruity
and floral scores of wines made under pellicular maceration (E3 and E5) were
both quite high, although they were not the preferred wines.

III.III.3.3. Effect of the raisining system on the sensory profile of the


wines

As has been seen, the sensory profile of the musts was affected by both
vintage and variety. In the case of the wines, they were also affected by the
fermentation stage, so data of all wines fermented under the same conditions
from each vintage and variety were studied separately, in order to identify
those descriptors with the highest discriminating power for drying system.

367
Experimental and results

After removing those descriptors with very low scores, (< 1, that was dairy,
young wood, and herbaceous), the analysis of the variance for the factor drying
system allowed us to select the citric, ripe fruit, sweet, raisin and oak aromatic
notes as discriminators. A PCA was applied to the scores of these descriptors,
and 3 PCs explaining 88.4% of the original variance were extracted. PC1
(55.4% of variance explained) was correlated well with ripe fruit, sweet and raisins
notes, PC2 (20.9%) with citric, while PC3 (12.3% variance explained) was
highly correlated with oak. Figure 12 shows the projection of the wine without
aging (S0) and aged for one year (S12) onto the new plane PC1-PC3. The aged
wines were grouped in the upper part of the graph (S12 wines), and this was
foreseeable since PC3 was highly correlated with the oak note. With respect to
PC1, the samples from climatic chamber for each vintage and variety increased
their scores with the aging time (C.S0 to C.S12), so it means higher intensities
in aromatic notes which were closely related to the drying process (raisin, ripe
fruit and sweet). However, the wines made with sun-dryed grapes, which had a
higher score before the aging process (T.S0 samples), showed an irregular
behaviour, with low increase or even a clear decrease after 12 months of aging
(T.S12 codes).

Finally, it is interesting to analyze the effect of the aging in the comparison


between drying systems. Figure 12 shows that the aged wines were located
more closely together in comparison with the corresponding wines without
aging; that is, it was verified that the aging process exerts a dampening effect
on the initial differences in sensory profile of wines due to the type of drying
used to obtain the raisins.

368
English summary

3
V08.M
V09.M
V09.PX
2 V10.M
C.S12
V10.PX
C.S12
T.S12

1 Oak T.S12
C.S12
Raisin
Ripe fruit
PC3

C.S12 Sweet
C.S0
0 Citric T.S12
P

C.S12 T.S0
C.S0
T.S0
-1 C.S0
C.S0

C.S0
-2 T.S0

-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0

PC1

Figure 12. . PCA of the sensory scores for drying system. Projection of the wines with (S12) and
without (S0) aging, onto the new plane defined by PC1 and PC3.

III.III.3.4. Effect of the type and time of aging on the sensory profile of
sweet wines

Sensory data of those 2008 wines aged by contact with oak chips (Ch), in oak
barrel (B) and in stainless steel container without wood (S), were studied by
Linear Discriminant Analysis (LDA) (data no shown). The model obtained
provides a high capacity of discrimination (correct classification for 86.9%).
Those variables with p < 0.05 were graphically represented, by means of their
previously calculated 2 principal components. In the new space, PC1 (39.5%
of variance explained) was well-correlated with both raisin and oak aromatic
notes, and also with the overall impression, while PC2 (22.8% of variance
explained) had a high and negative loading for citric odour.

The wines aged in stainless steel containers (S), had lower scores in PC2; so
they presented higher intensities in the citric aromatic note, a typical
characteristic of the Muscat variety which is preserved in the wines assessed.

369
Experimental and results

Wines aged in oak barrels (B) appeared on the right-hand side on the plane
PC1-PC2 (data no shown); this means that the oak note was perceived more
strongly, as was foreseeable, but the raisin note was also important, and both of
them contribute to a better overall impression. With respect to wines aged in the
presence of oak chips, their locations on the plane gave them, in general, lower
intensities in the descriptors correlated to PC1 and PC2, all of which were
well-appreciated aromatic notes, so this type of aging does not appear to be
the best.

As the best aging system seems to be aging in oak barrels (B), LDA was
applied for all wines aged in this way. The model constructed, which correctly
classifies 75.1% of all the samples, included most of the descriptors (oak,
aromatic intensity, floral, ripe fruit, sweet, citric, raisins, overall impression, honey, off-odour
and fruity), confirming the difficulty in separating the aging time from the other
factors. The PCA of these selected descriptors offered 2 new components; the
first PC (41.2% of variance explained) included high loadings in oak note,
while the second PC (21.5% of variance explained) was well correlated with
ripe fruit and honey, in addition to overall impression. The projection of the
samples onto the new plane PC1-PC2 (Figure 13) showed that the oak note
(PC1) did not always increase with aging time: it reached a maximum
perception after one month, and thereafter the oak intensity slowly decreased.
This could be because the initial maderization was very intense, almost
aggressive, but then it slowly became integrated with the other aromatic notes.
In relation to PC2 (with a high loading in the appreciated honey note, and in
overall impression) the ranking on the axis shows a clear tendency: the scores
increased with the time in contact with the wood of the oak barrel.

370
English summary

4
S01
3 S01 S01

2 S03 S01
S01 S03 S01 S07
S03
S01 S03 S03 S07 S01 S07S07
S07 S03 S07 S12
1 ImpresinS07 General
MielFruta Madura S12
S01 Roble
S03 Afrutado
Defecto
S07 S12
0 IntensidadCtrico
Aromtica Dulce S12
S03 Floral Pasas S28
S12 S12 S18
P

-1 S12
S12 S03
S0
S07
S0
-2
S0 S0 S12
S0
S0 S0
-3

S0 S0
-4
-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

PC1

Figure 13. PCA (PC1-PC2) of sensory data of wines, aged for, at least, one year (S0: Wine before
aging; S01, S03, S07, S12:, S18, S28: 1, 3, 7, 12, 18 and 28 months of aging ).

371
Conclusions

IV. CONCLUSIONS

Taking into account the results obtained from this research, the following
conclusions can be enumerated:

From the point of view of food safety control,

- In general, a significant influence of the factor vintage has been observed,


which affects the initial conditions of the grapes and thus its evolution
during raisining. However, the ability to control more precisely the
temperature and humidity of the grapes dried in the climatic chamber
produced lower concentrations in gluconic acid and Ochratoxin A reducing
therefore the fungal contamination.

Moreover, the use of the climatic chamber for drying grapes for the
production of sweet wines, combined with the traditional techniques of
vinification (without pellicular maceration nor nutrients), and a final stage
of aging in oak cask had yielded wines with a low content in OTA.

- Regarding the organic acids, an overall increase of their content during


raisining as well as the influence of both factors grape variety and vintage
were observed. During the aging stage, higher concentrations of acids were
found for wines aged in oak cask, followed by those which remained in
stainless steel tanks, and finally the wines aging in contact with chips.

- The content of ethyl carbamate, was influenced particularly by the strain of


yeast and the length of aging time. The highest EC concentration was

372
English summary

obtained for wines made from Muscat grapes, fermented with S. cerevisiae
and aged in oak cask for up to 28 months (S12, S18 and S28).

With regard to the organoleptic quality,

- The phenolic content of the wines was influenced by the vinification


techniques employed (type of yeast, pellicular maceration or nutrients
addition). In addition, higher concentrations were observed for Pedro
Ximnez grapes, dried in a climatic chamber and aged in oak cask for a
long time (twelve months or more). In this regard, the aging showed the
highest discriminant power.

Furthemore, the study of the antioxidant activity (AA) of wines, showed a


higher correlation between the phenolic content and the AA-ORAC values,
being both AA values (ORAC and HORAC) statistically influenced by
grape variety and type of vinification.

- Concerning volatile profiles, the study of the fermentation conditions of


wines and their subsequently aging (Muscat wine from 2008) showed a
significant influence of the type of yeast employed as well as the type of
aging. In the case of wines from 2009 and 2010, both factors grape variety
and vintage, demonstrated the highest influence on the volatile content of
the wines, followed by aging time. Drying system was the least significant
of all factors evaluated.

- Finally, the sensory analysis of musts and wines showed the influence of the
grape variety and the vintage on this parameter. The artificial drying was
characterized by a slight increase in "fruity" and "raisin" notes and less
musty off-odour. Wines fermented at low temperature with S. bayanus scored

373
Conclusions

the highest in citric and floral notes, and it was the preferred ones. The wood
contact in oak cask improved the overall impression of the wines, showing
a very intense maderization at the beginning of the stage. It took a few
months that the aromatic profiles of wines were well integrated.

Therefore, we can conclude that the raisining in climatic chamber of Muscat


and PX grapes leads to Andalusian sweet wines with similar organoleptic
characteristics to those ones obtained by the traditional sunning, with the
advantage of reducing the damage caused by insect attacks or adverse weather
conditions that could cause fungal or bacterial infections and, consequently, a
loss of raw material.

374
English summary

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13006 J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 1300613012
DOI:10.1021/jf103245z

Optimizing the Process of Making Sweet Wines To Minimize the


Content of Ochratoxin A
M. JESUS RUIZ BEJARANO, M. CARMEN RODRIGUEZ DODERO,* AND
CARMELO GARCIA BARROSO
Grupo de Investigacion Qu mico-Anal tica del Vino y Productos Agroalimentarios, Universidad de Cadiz,
Departamento Qu mica Anal tica, Facultad de Ciencias, Campus de Puerto Real, Avenida Republica
Saharaui s/n, 11510 Puerto Real, Cadiz, Spain

During the drying process of raisins, the grapes are subjected to climatic variations that can result in
heavy infections of some fungal species that produce ochratoxin A (OTA), a powerful toxic metab-
olite, whose maximum permitted content is set by the European Union at 2.0 g/L for grapes, wine
and other drinks derived from the grape. The aim of this paper is to optimize the process of making
sweet wines in order to minimize the content of ochratoxin A. The results reflect a reduction of the
OTA content in grapes dried under controlled conditions in a climatic chamber up to 24% compared
to those sunned in the traditional way. A decrease of the concentrations of OTA is also observed
during the processes of vinification. Those wines with prefermentative maceration reached a higher
OTA content than the wines without maceration, but unexpectedly were not those preferred from a
sensorial point of view. In addition, the process of aging in oak casks has been shown to serve as a
natural method for reducing the OTA content of these wines.

KEYWORDS: Ochratoxin A; food safety; sweet wine; Muscat; climatic chamber; raisining; pellicular
maceration; oak aging; sensory evaluation

INTRODUCTION and Aspergillus species, which give rise to the formation of


The sweet wines of Andalusia are made from grapes of white ochratoxin A (OTA) (5), a highly toxic metabolite.
varieties, particularly Muscat and Pedro Ximen, dried in the open During the drying of the grape, there is an increase in the
air exposed sun, in the process known as soleo or sunning. incidence of Aspergillus nigri section (A. carbonarius and A. niger)
In this sunning process, after harvesting, the bunches of grapes compared with other types of fungi. A. carbonarius presents a
are spread out on mats of esparto grass, known as redores, or on greater ochratoxigenic potential, whereas A. niger is the predom-
large areas of plastic sheeting that can cover as much as fifteen inant strain (6).
hectares of surface area. When subjected to hours of intense The growth of these fungi in the grape is subject to the climatic
sunshine, the grapes gradually lose water, resulting in a significant conditions of the region (7-9). A. carbonarius, which is highly
increase in the concentration of sugars and a variation in the resistant to solar radiation and high temperatures, up to a maxi-
aromatic profile (1). Depending on the external conditions, the mum in excess of 40 C, is the major source of OTA in grapes,
process can last from seven to twenty days (2, 3). However, this wine and other enological products (10-13). Furthermore the
traditional system is susceptible to climatological variations that existence of high levels of ochratoxin A has been demonstrated in
can alter the final product; in particular, rains during this period wines originating from grapes dried in the sun (14).
can cause the grapes to rot. It would be therefore useful to devise alternative systems of
In the disease known as gray mold, the grape is infected by raisining that allow a greater control of the process (15), but
Botrytis cinerea, one of the pathogenic agents with the most which would not have any negative influence on the sensorial
serious adverse consequences for the quality of wines, which properties of the final product. The use of a climatic chamber for
affects the composition, stability and sensorial properties; it can the raisining of grapes (16, 17) allows the temperature and
cause the loss of the typical fruity character of these wines and humidity of the drying process to be adjusted, reduces the length
instability of the aromas of fermentation, and it gives the wines a of time required for adequate raisining, and makes the process
bitter flavor (4). independent of the external meteorological conditions. The
Similarly rain during the sunning process makes the grapes results obtained in the studies cited demonstrated that the
more disposed to infection by bacteria, which cause acetic disease, employment of the climatic chamber allows the process of drying
and facilitates the development of other molds such as Penicillium to be carried out in a controlled way, and that the content of
polyphenols and volatile compounds in the resulting musts is
similar for both types of grape drying.
*Corresponding author. E-mail address: maricarmen.dodero@uca.es; About OTA pathologies and toxic effects (18-20), OTA causes
Fax number:34-956-016460. chronic nephropathies in diverse species of mammals and birds.

pubs.acs.org/JAFC Published on Web 12/01/2010 2010 American Chemical Society


Article J. Agric. Food Chem., Vol. 58, No. 24, 2010 13007
Table 1. Conditions of the Different Vinification Experiences and Aging Assays and Their Codes
aging

fermentation experiences fermentation nutrients pellicular maceration with control with oak
(vessel no.) yeast tempa (diammonium phosphate) pectolytic enzymes (4 C, 24 h) (without aging) with oak casks shavings(chips)

1 S. cerevisiae rt no no 1_C 1_OC1 1_OC2 1_Ch


2 S. cerevisiae rt yes no 2_C 2_OC
3 S. cerevisiae rt no yes 3_C 3_OC
4 S. bayanus lt no no 4_C 4_OC1 4_OC2
5 S. bayanus rt no yes 5_C 5_OC
a
rt, room temperature (<30 C); lt, low temperature (<10 C).

In the human, it has been associated with a nephropathy endemic wines. The chromatographic conditions set were the same in both cases.
to the Balkans region, although this is still an unconfirmed All the analyses were performed in duplicate.
hypothesis. OTA also possesses teratogenic, hepatotoxic, neuro- Sample Preparation. For the preparation of must samples aliquots each
toxic and immunotoxic effects, and is classified by the Interna- of 5 g of the musts were taken. To each was added 75 mg of polyethylene
tional Agency for Research on Cancer as a possible human car- glycol 8000 and 250 mg of sodium bicarbonate. Each preparation was then
cinogen (class 2B). In the European Union the OTA content is mixed using a magnetic agitator for 30 min and centrifuged for 5 min at
4000 rpm. The supernatant obtained was passed through syringe filters of
regulated in foods susceptible to contamination. In the case of
0.45 m (Millipore). The extraction of the wine samples was performed
wine, other drinks based on wine and/or musts, the maximum
using solid phase extraction (SPE) following the method proposed by
limit is set at 2.0 g/L (21, 22). Hernandez et al. (24). Bond Elut C-18 cartridges (500 mg, 3 mL) were
In order to optimize the process of making sweet wines to employed; the solid phase extraction was performed in several stages in a
minimize the content of ochratoxin A, a study of the evolution of Rapid Trace, SPE Workstation system (Zymark). First the cartridge
OTA content throughout the entire process of production of was conditioned with 5 mL of methanol and 5 mL of Milli-Q water, both at
sweet wine, from the raisining of the grapes to vinification and the a flow rate of 2 mL/min. A volume of 10 mL of a 1:2 dilution of the sample
aging of the resulting wine in oak barrels, is presented. An in Milli-Q water was passed through the cartridge at 0.5 mL/min. The
alternative to the traditional sun-drying is proposed. cartridge was then washed with 2 mL of Milli-Q water and 2 mL of
methanol/water (60/40 v/v), and dried under a stream of N2 for 10 min.
MATERIALS AND METHODS Lastly the extract was collected in 2 mL of methanol at a flow rate of
0.5 mL/min.
Samples. The musts analyzed were obtained from grapes of the Muscat
Chromatographic Separation. The HPLC system employed for the
variety, subjected to two different drying procedures: natural sunning on a
analysis was a Waters Alliance 2695, with a 110A C18 Gemini reverse
roof terrace and artificial sunning in a climatic chamber. In the first,
phase column, of 250 mm length  4.6 mm i.d. and particle size of 5 m
bunches were placed on esparto mats exposed to the air, without any type
(Phenomenex). The alkaline mobile phase was composed of acetonitrile/
of protection against environmental conditions. In the artificial sunning,
ammonium chloride-ammonia buffer (205 mM, pH 9.4), in a proportion
bunches were placed in a climatic chamber with controlled temperature of
20:80 (v/v), by isocratic flow at 30 C and at a flow rate of 0.75 mL/min.
40 C and humidity of 10%.
The volume of sample injected was 25 L. A Waters 474 scanning fluores-
In both systems, the loss of weight of the grapes was monitored
periodically and the assays were completed when this loss reached about cence detector was used for the measurement of fluorescence. The wavelengths
30%. Samples were taken at the start and the end of both the traditional of excitation and emission were 333 and 460 nm, respectively. The data
sun-drying and the raisining in the climatic chamber; these samples were acquisition time for each of the samples was set at 14 min; the software
pressed and the must obtained was preserved at -20 C for subsequent employed for the recording and processing of the data was Empower Pro 2002
analysis. (Waters). Figure 1 shows typical chromatograms of the samples studied, a
Five different conditions (two of them by duplicate) were tested for the must and a wine, with a retention time of 10.2 min for OTA.
vinification of the must obtained from grapes dried in the climatic chamber Calibration. For the quantification in musts, a calibration curve was
(experiences 1 to 5, Table 1). The sweet wines obtained in the various obtained from eight different concentrations of a standard solution of
experiments were aged in 30 L oak casks (_OC). In addition, one of them OTA (0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0, 20.0, and 40.0 g/kg). All the dilutions
was aged by contact with oak shavings (chips, _Ch). were prepared in duplicate, in a matrix of synthetic must (1 g/L of malic
Samplings were performed for each of the assays at the finish of the acid, 6 g/L of tartaric acid and 200 g/L of glucose), and were treated in the
fermentation (V01) and after desludging and clarification (V02 or _C); at same way as the real samples. For the samples of wines, the calibration
the beginning of the aging stage (A01, after 30 days) and after 60 (A02) and curve was obtained in HPLC grade methanol, from known volumes of a
90 (A03) days of aging. working solution of 50 g/L (0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0, and 20.0 g/L).
Chemicals. Hydrochloric acid 37%, ammonia 30%, sodium bicarbon- Lastly, the OTA peak areas obtained in the chromatograms were
ate and glucose were obtained from Panreac (Panreac Quimica S.A., represented graphically against their corresponding concentrations. Two
Barcelona, Spain). Polyethylene glycol 8000 and methanol were supplied replicates of all the dilutions were prepared, and these were analyzed in
by Scharlau (Scharlab S.L., Barcelona, Spain). Acetonitrile (HPLC gradient duplicate.
grade), tartaric acid (analytical quality) and acetic acid (analytical quality) Validation of the Analytical Methods. Samples of musts and wines are
were obtained from Merck (Darmstadt, Germany). The OTA standard of great chemical complexity and are difficult to reproduce accurately. In
and malic acid were supplied by Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, addition, the fluorescence detection is a very sensitive method that could
USA). The ultrapure water employed was purified using a Milli-Q system cause interference from the matrices. As a result, two different studies, one
(Millipore, Bedford, MA, USA). for each type of sample under study, were carried out to ensure the matrix
Analysis of Ochratoxin A. The methods chosen for the determination effects did not affect the quantitation. The method of standard additions to
of ochratoxin A in musts and wines was devised by the Analytical the real samples was used. The slope values of the regression curves
Chemistry of Wine and Agrofood Products Research Group (PAI obtained with standard solutions were then compared with the slope values
AGR122) (23, 24). They are based on an initial extraction followed by obtained by the method of standard additions using the Student t test. In
separation using liquid chromatography (HPLC) and subsequent detec- both studies, for musts and wines, the slopes obtained were similar for a
tion of the toxin by fluorescence. The extraction in musts was performed 95% confidence limit, so it was concluded that matrix effects were absent.
by the addition of sodium bicarbonate and polyethylene glycol. Since wine Regarding the validation of other analytical parameters, it was per-
is a more complex matrix, solid phase extraction (SPE) was used for the formed in a different way for musts and wines. On one hand, two studies of
13008 J. Agric. Food Chem., Vol. 58, No. 24, 2010 Ruz Bejarano et al.

Figure 1. Typical chromatograms of must and wine samples under study, with the one of a blank superimposed, showing the OTA peak at 10.2 min.

the repeatability of wines were carried out, concluding that relative stan- since it minimizes the consumption of samples and the sensorial fatigue of
dard deviations (RSD) both intraday repeatability and interday were low the judges. After presenting the series of wines to the judges, they were
(1.11% and 1.14% respectively). In addition, a series of standard additions asked to assess them from left to right, and then to rank them by preference
(at four levels, in duplicate) from 0.75 to 6 g OTA/L was prepared in from least to most. The test of Friedman was applied for the interpretation
order to obtain the recoveries. These were from 93 to 99%. Finally, the of the results obtained.
limit of detection and limit of quantification were established at 0.22 and Statistical Analysis. One and two factor variance analysis (ANOVA)
0.77 g/L, respectively. On the other hand, samples of grapes and musts and multivariate analysis of data included factor analysis (FA) using
spiked with 2 g/kg of OTA were used for the studies of repeatability per- the statistical computer package Statistica 7.0 (Tulsa, OK, USA) were
formed. The relative standard deviations (RSD %) of the intraday and the performed.
interday studies were both 0.14%. The accuracy of the analysis method
was established by using the method of standard additions. Five levels of
OTA addition, from 0.5 to 5 g/kg, and two samples per level were RESULTS AND DISCUSSION
prepared by evaporation of known volumes of the OTA working solution Musts. The OTA contents in the musts from the two different
under nitrogen stream, followed by dissolution in real samples of grape. systems of raisining tested suggested that a previously existing
The method presented recovery values close to 100% for most of the con- fungal contamination in the grape could occur, and this contam-
centrations analyzed and low values of standard deviations (from 94.7 (
ination, associated with the conditions of the drying process itself,
0.8 to 107.8 ( 0.9). About the limits of detection and quantification, they
were established at 0.13 and 0.43 g/kg of OTA respectively. led to the growth of the fungus and, consequently, of ochratoxin
Sensory Analysis. The sessions were carried out in a standard tasting A in both systems. This finding is related to the data provided by
room (25). All evaluations, exclusively orthonasal, were carried out at Valero et al. (14) which demonstrated that it is after the harvest-
22 C. Twenty milliliters of sample were presented in blue glasses, generally ing, and particularly in the process of raisining, when the Asper-
used for olive oil sensory analysis, and covered with a glass top in order to gillus species becomes predominant over other fungi present on
minimize the possible losses of aroma. The panel judges, all of them the grape, due principally to greater tolerance of high tempera-
laboratory personnel, were submitted to a training period about general tures and low activity of the water (aw).
and specific sensorial aspects. During this stage, the judgment repeatability However, the OTA concentration of the must from grapes
and the panel homogeneity were evaluated. Duplicated discrimination dried in the climatic chamber (6.9 ( g/kg) was lower than that
testing and descriptive profiling were employed to validate the judges re-
obtained in the natural process (28.8 ( g/kg), the difference
producibility, whereas for each descriptor, a two factor ANOVA (judges
samples) allowed study of the homogeneity of the panel. being statistically significant (p < 0.05), so it seems the increased
Triangular test and descriptive profiling were performed. For the first control over the conditions of raisining resulted in better hygienic
case, the triangular test (26), the judges were asked about the quantitative conditions for the final must. The must obtained in the traditional
value of the detected differences. A scale with five points was used: not system presented a very high concentration of OTA which is not
present, poor, regular, strong, and very strong. For the second study, the suitable for subsequent fermentation since it will be difficult to
descriptive profiling (27), as a preliminary stage of generating appropriate achieve a legally acceptable OTA content in the finished wine.
descriptors to define the samples, the judges were presented with a group of With respect to the sensory analysis, the musts obtained from
musts and wines, representative of the complete set, and were asked to the grapes dried by the traditional method of sunning were com-
describe them qualitatively. The final selection included those with a pared by triangular test with those from grapes dried under con-
frequency of appearance greater than 5. A structured nine-point scale was
trolled conditions in the climatic chamber. A significant differ-
employed to evaluate each descriptor (28). The descriptors evaluated were
as follows: aromatic intensity, fruity, citric, ripe fruit, sweet, raisin, floral, ence between them was detected (according to 10 of the 14 judges,
honey, herbaceous, oak, wine character, dairy, wetness, chemical character, p<0.05), with the intensity of difference reported ranging be-
and general impression. A ranking test (29) was carried out to assess the tween weak and moderate with a mean ( standard deviation
judges preferences among the different wines produced. This type of value equal to 1.9 ( 0.8. Then, with the aim of identifying the
discrimination test is indicated when there are several samples to compare, descriptors that best explained the differences detected between
Article J. Agric. Food Chem., Vol. 58, No. 24, 2010 13009
Table 2. Analysis of Variance Applied to the Intensity Values of the Attributes
Used To Describe the Sensory Profiles of the Musts under Studya
descriptors traditional sun drying climatic chamber F p

aromatic intensity 4.5 ( 1.4 4.2 ( 1.3 7.54 0.052


fruity 3.9 ( 1.2 4.7 ( 0.8 8.95 0.045
citric 1.1 ( 1.4 0.9 ( 1.3 2.45 0.215
ripe fruit 3.4 ( 2.2 2.6 ( 2.0 2.10 0.276
sweet 2.9 ( 1.6 3.0 ( 1.6 2.51 0.138
raisin 3.3 ( 1.2 4.5 ( 1.5 7.80 0.049
floral 2.0 ( 1.9 1.7 ( 1.6 0.12 0.557
honey 1.2 ( 1.6 2.3 ( 2.5 1.06 0.345
herbaceous 1.9 ( 1.4 1.2 ( 1.9 2.41 0.219
wine character 0.9 ( 1.7 1.2 ( 1.9 1.18 0.337
dairy 0.4 ( 0.9 0.5 ( 1.1 2.45 0.216
wetness 1.9 ( 2.2 1.3 ( 1.8 4.57 0.099
chemical character 0.1 ( 0.5 0.2 ( 0.5 3.00 0.125
general impression 3.8 ( 1.9 3.6 ( 1.7 3.12 0.115
a
Mean values ( standard deviation (n = 14) are shown. The differences are
significant at p < 0.05. The lowest p (in bold) indicate the most significant descriptors
in order to discriminate the musts obtained both by traditional sun-dried and climatic
chamber.

the systems of traditional and controlled raisining, an analysis of


the variance was performed for the various descriptors (Table 2).
Only raisin and fruity descriptors differentiated the musts to any
extent, and a greater but not significant aromatic intensity and
wetness in the traditionally sunned grapes was confirmed. Ac-
cording to the general impression, the must obtained from grapes
naturally sunned on the roof terrace was slightly preferred to that
obtained from grapes dried in the climatic chamber, with a
stastistically nonsignificant difference.
Vinification. During the vinification of the musts made from
grapes dried in the climatic chamber a considerable decrease of
the OTA content was observed (averages and standard deviations
shown in Figure 2 and Table 3). A large part of the solid matter
that was in suspension, and with it part of the toxin present in the
grape marc, was eliminated in the desludging and clarifica-
tion (30), the difference being statistically significant between
the two wines before (V01) and after (V02) these enological prac-
tices (p < 0.05). Similar results have been obtained during the vini-
fication of musts of red grapes (31). In addition recent investiga-
tions suggest a possible link between ochratoxin A and the
cellular surface of yeasts (32). Similarly, in those wines with pre-
fermentative maceration (experiences 3 and 5), a smaller decrease
in OTA content than in the wines without maceration was
exhibited. In these two experiences the must was in contact with
the solid matter (skins, etc.) for 24 h, and this facilitated the trans-
fer of the toxin to the must.
The wines made under different conditions of vinification were
compared by sensory analysis. The analysis of variance of the
descriptive data (Table 4) suggested that the descriptors floral and
citric were the best to discriminate between some of the wines.
Regarding the preference, the 5 wines were ordered from the
lowest to the highest preference as shown: 2_V02, 5_V02, 3_V02,
1_V02, 4_V02. The wine fermented at low temperature with
S. bayanus yeast (4_V02) and characterized by more intense citric
and floral notes was assessed as the best, whereas the wine made
Figure 2. Time evolution of the OTA contents in the five sweet wines
with an additional source of nitrogen (2_V02) was the least liked
elaborated according to the fermentation conditions specified in Table 1.
and presented the lowest intensities in both fruity and citric notes
V01, wine after fermentation; V02, wine after desludging and clarification;
and a certain chemical character. Unexpectedly, the wines with
A01, wine aged for 1 month in oak cask; A02, wine aged for 2 months in oak
pellicular maceration (3_V02 and 5_V02), characterized by high
cask; A03, wine aged for 3 months in oak cask; C, wine without aging; Ch,
both floral and fruity notes, were not those preferred.
wine aged with oak chips; OC, wine aged in oak cask.
Aging. During the aging in oak barrels a decrease was observed
in the OTA content (Figure 2 and Table 3); in all the cases, lower content in these controls hardly varied at all during the assays,
concentrations than in the corresponding controls were found, while those of the wines aged in oak barrels showed a large
the difference being statistically significant (p < 0.05). The OTA decrease at the beginning, with a slight progressive decrease
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throughout the aging time in the case of the wines with the higher the OTA content, it is quite possible that the wine of experiment 5
contents (experiences 3 and 5). The decrease of OTA during the 90 would also fall within the legally acceptable limit in the next
days of aging in the wines of the different assays ranged from samplings, although this concern needs to be confirmed.
8.7% in experience 2 to 37.2% in experience 3. The aging of red The sensorial data of all the wines were analyzed from a
wines in bottle was evaluated by Grazioli et al. (29), and no short- multivariate perspective. A factor analysis was performed includ-
term effect was found, but there was a decrease of 17% in OTA ing the base wines and those aged in barrel and with wood
after 12 months. With regard to our samples, in four of the seven shavings; from this, three major factors were extracted that
barrels studied this decrease was even greater than 17%. In explained 68% of the total variability. According to what can
addition, in experiences 1 and 4, it was observed that wines of be deduced from the graph of loadings of the factors presented
the same assay aged in different oak barrels (1_OC1-1_OC2 and as Figure 3 (loadings values shown in Table 5), factor 1 (which
4-OC1-4_OC2) showed a very similar trend over time. In the accounts for 36.8% of the variance) was correlated positively with
experiment conducted with wood shavings (1_Ch), the OTA the general impression, to which the sweet notes (especially raisin,
content of the wine remained constant, showing behavior more sweet, ripe fruit, and honey), together with the oak note due to the
comparable to that of the control than the wine aged in barrel. All aging, seemed to contribute in particular. On the other hand,
the aged wines, with the exception of that obtained in experiment 5, factor 2 (16.1% of the explained variance) presented high loadings
showed an OTA content of less than 2.0 g/L, the legal maximum for fruit, citric and floral notes; therefore, this could be a measure of
set by the European Union; therefore these wines are suitable for the primary and variety aromas, which are fully expressed after the
consumption. However, given that the aging in oak barrel reduces fermentation. Factor 3 (14.5% of explained variance), for its part,
was a measure of the defects, since it included the descriptors
Table 3. Mean and Standard Deviation Values of the OTA Contents in the
Studied Sweet Wines through the Different Stages of the Elaboration Processa
V01 V02 A01 A02 A03

Experience 1

OC1 3.75 ( 0.03 1.44 ( 0.02 0.64 ( 0.05 0.65 ( 0.05 0.62 ( 0.02
OC2 0.69 ( 0.03 0.58 ( 0.02 0.55 ( 0.02
C 1.12 ( 0.08 1.12 ( 0.10 1.14 ( 0.06
Ch 1.10 ( 0.02 1.08 ( 0.01 1.13 ( 0.01
Experience 2

OCC 3.64 ( 0.01 1.51 ( 0.11 1.11 ( 0.03 0.86 ( 0.02 0.97 ( 0.01
C 1.52 ( 0.01 1.48 ( 0.03 1.60 ( 0.02
Experience 3

OC 2.55 ( 0.02 1.71 ( 0.01 1.29 ( 0.03 1.07 ( 0.01


C 2.01 ( 0.06 2.03 ( 0.02 2.03 ( 0.02
Experience 4

OC1 4.09 ( 0.02 0.97 ( 0.01 0.73 ( 0.01 0.58 ( 0.02 0.50 ( 0.02
OC2 0.62 ( 0.02 0.56 ( 0.02 0.52 ( 0.01
C 1.00 ( 0.01 1.01 ( 0.07 1.00 ( 0.02
Experience 5
OC 3.99 ( 0.03 4.44 ( 0.4 3.95 ( 0.01 3.40 ( 0.01
C 4.92 ( 0.2 4.92 ( 0.02 4.98 ( 0.02
a Figure 3. Factor analysis of sensory data of sweet wines made from
V01, wine after fermentation; V02, wine after desludging and clarification; A01,
wine aged for 1 month in oak cask; A02, wine aged for 2 months in oak cask; A03, raisins dried in a climatic chamber. Location of the sensorial attributes onto
wine aged for 3 months in oak cask; C, wine without aging; Ch, wine aged with oak the new space defined by the three major factors: x axis, factor 1 (36.8%);
chips; OC, wine aged in oak cask. y axis, factor 2 (16.1%); and z axis, factor 3 (14.5%).

Table 4. Analysis of Variance Applied to the Intensity Values of the Attributes Used To Describe the Sensory Profiles of the Sweet Wines Produceda
descriptors 1_V02 2_V02 3_V02 4_V02 5_V02 F p
aromatic intensity 4.1 ( 0.5 4.2 ( 0.6 4.4 ( 0.6 4.1 ( 0.5 4.2 ( 0.5 0.114 0.97
fruity 4.2 ( 0.3 2.7 ( 0.4 3.8 ( 0.3 4.1 ( 0.4 3.8 ( 0.5 2.164 0.11
citric 2.2 ( 0.7 1.4 ( 0.5 2.8 ( 0.3 3.1 ( 0.4 2.7 ( 0.3 3.184 0.04
ripe fruit 1.9 ( 0.4 1.5 ( 0.6 2.1 ( 0.4 1.7 ( 0.5 1.4 ( 0.4 0.307 0.87
sweet 2.3 ( 0.6 2.0 ( 0.6 3.5 ( 0.6 2.3 ( 0.7 1.4 ( 0.5 1.312 0.37
raisin 1.9 ( 0.5 1.6 ( 0.5 2.2 ( 0.4 2.3 ( 0.4 1.1 ( 0.3 0.349 0.84
floral 3.6 ( 0.8 3.0 ( 0.7 3.9 ( 0.5 4.1 ( 0.6 4.0 ( 0.8 2.647 0.07
honey 0.9 ( 0.2 0.8 ( 0.4 1.5 ( 0.5 1.2 ( 0.3 1.1 ( 0.5 0.806 0.54
herbaceous 1.1 ( 0.4 2.1 ( 0.6 1.3 ( 0.6 1.4 ( 0.5 1.9 ( 0.7 0.351 0.83
wine character 2.5 ( 0.5 2.3 ( 0.7 2.5 ( 0.5 2.9 ( 0.6 2.8 ( 0.6 0.298 0.87
dairy 0.2 ( 0.3 0.5 ( 0.3 0.5 ( 0.3 0.5 ( 0.3 0.5 ( 0.4 0.033 0.99
wetness 0.6 ( 0.3 1.1 ( 0.4 1.1 ( 0.6 0.9 ( 0.4 1.5 ( 0.5 0.322 0.86
chemical character 0.8 ( 0.3 2.1 ( 0.3 0.6 ( 0.3 1.0 ( 0.3 0.8 ( 0.2 0.908 0.43
general impression 4.4 ( 0.4 2.5 ( 0.6 3.1 ( 0.5 4.5 ( 0.5 3.8 ( 0.5 2.994 0.05
a
Values are given as mean ( standard deviation (n = 17). The differences are significant at p < 0.05. The lowest p (in bold) indicate the most significant descriptors in order to
discriminate the 5 sweet wines produced.
Article J. Agric. Food Chem., Vol. 58, No. 24, 2010 13011
Table 5. Loadings of the Sensory Descriptors from Raisins Dried in a Climatic
Chamber in the New Space Defined by the Three Major Factors 1, 2 and 3a
factor 1 factor 2 factor 3
descriptor (36.8% expl. var.) (16.1% expl. var.) (14.5% expl. var.)

aromatic intensity 0.480 0.243 0.447


fruity 0.226 0.867 -0.035
citric -0.039 0.889 0.135
ripe fruit 0.758 0.303 0.128
sweet 0.885 0.046 0.144
raisin 0.790 -0.044 -0.223
floral 0.398 0.703 -0.399
honey 0.677 0.179 -0.516
oak 0.774 -0.296 0.033
wine character 0.122 -0.067 -0.437
chemical -0.122 0.068 -0.925
wetness -0.344 -0.159 -0.742
general impression 0.776 0.258 0.209
a
Numbers in bold indicate the descriptors with the highest correlations to each
factor.

Table 6. Loadings of the Wines Made from Raisins Dried in a Climatic


Chamber in the New Space Defined by the Three Major Factors 1, 2 and 3
factor 1 factor 2 factor 2
wine (36.8% expl. var.) (16.1% expl. var.) (14.5% expl. var.)
Figure 4. Factor analysis of sensory data of sweet wines made from
1_V02 -0.041 0.740 -0.882 raisins dried in a climatic chamber. Location of all the sweet wines (aged or
2_V02 -1.651 0.403 -2.824 not) onto the new space defined by factors 1, 2, and 3. Symbols: cross,
3_V02 -0.748 1.824 -0.945 A01, sweet wines aged for 3 months; starburst, A02, sweet wines aged for
4_V02 -2.748 0.053 -0.250 6 months; box, A03, sweet wines aged for 9 months.
5_V02 -0.088 2.726 -0.748
1_Ch_A01 -1.112 0.820 1.038 In conclusion, throughout the aging period, the oak note
1_OC2_A01 -0.107 -1.104 1.033 increased, and those of the primary aromas (citric, floral, and
1_OC1_A01 -0.992 0.030 0.495 fruity notes), together with the initial defects, generally dimin-
2_OC1_A01 -0.153 -0.916 -0.085 ished. The wines became more acceptable with aging in barrel (the
3_OC1_A01 0.488 -0.577 1.047 general impression of all the wines tested improved), and this stage
4_OC1_A01 0.170 -1.612 1.110 had the effect of diminishing the initial differences between the
4_OC2_A01 -0.557 -0.943 0.870 different methods of vinification.
5_OC1_A01 -0.621 -0.422 1.099 We can conclude that the final concentration of ochratoxin A
1_OC2_A02 0.963 -0.283 0.204
in the must obtained after controlled drying was much less than
1_OC1_A02 1.185 0.711 0.761
1_Ch_A02 -0.312 -0.214 0.141
that found in the musts originating from the traditional system.
2_OC1_A02 1.154 0.184 0.062 Although it was not possible to eliminate completely the growth
3_OC1_A02 1.026 0.582 0.613 of the fungus, the ability to control more precisely the tempera-
4_OC1_A02 0.363 0.820 0.796 ture and humidity of the grapes dried in the climatic chamber
4_OC2_A02 0.511 -1.651 0.490 reduced the production of OTA. Therefore, the use of the climatic
5_OC1_A02 0.238 -0.518 -0.163 chamber for drying grapes for the production of sweet wines,
1_OC1_A03 1.553 -0.899 -0.313 combined with the traditional techniques of vinification (without
1_OC2_A03 1.244 0.683 -0.741 pellicular maceration), and a final stage of aging in oak barrels
1_Ch_A03 -0.581 0.006 -1.462 has yielded wines with a low content in OTA and well-accepted
2_OC1_A03 1.653 0.029 -0.758
from a sensorial point of view.
3_OC1_A03 1.459 -0.800 -0.525
4_OC1_A03 0.892 -0.472 -0.696 ABBREVIATIONS USED
4_OC2_A03 1.407 -0.747 -0.149
5_OC1_A03 1.346 -0.303 -0.811 OTA, ochratoxin A; TSD, raisin obtained by traditional sun
drying; CC, raisin dried in the climatic chamber; V01, wine after
fermentation; V02, wine after desludging and clarification; A01,
chemical and wetness with high and negative loadings. When the
wine aged for 1 month in oak cask; A02, wine aged for 2 months
samples were placed in the new space (Table 6 and Figure 4), the
in oak cask; A03, wine aged for 3 months in oak cask; C, wine
interpretation of the dimensions of the factors was confirmed,
without aging; Ch, wine aged with oak chips; OC, wine aged in
since the wines increase their time of aging in oak barrel to the
oak cask; HPLC, high performance liquid chromatography;
right of factor 1 (from A01 to A03), while the control wine pro-
ANOVA, analysis of the variance; FA, factor analysis.
duced with an additional nitrogen supply (2_V02) reaches the
lowest values for factor 3, confirming the results obtained in the LITERATURE CITED
preference test. Additionally, it seems that the wine aged with
(1) Franco, M.; Peinado, R. A.; Medina, M.; Moreno, J. Off-Vine
wood shavings (1_Ch) acquired an aromatic defect along the Grape Drying Effect on Volatile Compounds and Aromatic Series in
time, as a decreasing value for factor 3 indicates. Regarding factor 2 Must from Pedro Xime nez Grape Variety. J. Agric. Food Chem.
associated with primary aromas, as expected, the initial wines 2004, 52, 3905-3910.
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Fraction. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 10739-10746. November 10, 2010. Accepted November 12, 2010. This study has
(18) Fuchs, R; Peraica, M. Ochratoxin A in human kidney diseases. Food been supported by the Spanish Government (CICYT, AGL2006-
Addit. Contam. 2005, 22 (Suppl. 1), 53-57. 12852). M.J.R. thanks MEC for her fellowship.
Author's personal copy
Eur Food Res Technol (2013) 237:905922
DOI 10.1007/s00217-013-2061-3

ORIGINAL PAPER

Study of the content in volatile compounds during the aging


of sweet Sherry wines obtained from grapes cv. Muscat
and fermented under different conditions
Mara Jesus Ruiz-Bejarano Remedios Castro-Mejas

Mara del Carmen Rodrguez-Dodero


Carmelo Garca-Barroso

Received: 5 March 2013 / Accepted: 29 June 2013 / Published online: 30 July 2013
Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2013

Abstract Several experiments of aging in oak wood and S. cerevisiae and aged in wood or stainless steel. From a
stainless steel of sweet Sherry wines obtained from grapes sensorial point of view, the wines fermented with S. Ce-
cv. Muscat fermented under different enological conditions revisiae and aged in wood (D1C and D2C) were the most
have been carried out. These wines were periodically valued ones.
sampled and their volatile content was analyzed using
SBSEGCMS. A sensory study was also carried out. Data Keywords Sweet Sherry wines 
were submitted to different statistical techniques. An Volatile compounds  Oak cask  Stainless steel 
important inuence of the three factors considered, fer- Fermentation conditions
mentation type, aging type, and aging time, have been
observed. In cluster analysis, the grouping obtained dem-
onstrated that the volatile compounds considered possess Introduction
sufcient explanatory power to detect the type of aging
process and differentiate the two yeast strains studied. In The volatile fraction of wine is determined by several
the case of the linear discriminant analysis, high percent- hundreds of chemically different compounds. Alcohols,
ages of correct classication were obtained for the three aldehydes, esters, acids, monoterpenes, and other minor
factors considered. Taking into account the global volatile compounds usually constitute the volatile fraction of this
prole, the factor aging type (oak cask or stainless steel) product. Their presence or absence in a particular wine
has demonstrated the highest inuence on the volatile depends on several factors: environment (climate and soil),
content of the wines, with those wines from Experiments ripeness and grape variety, winemaking conditions, and
D4 and D5 (fermented with S. bayanus) and aged in oak aging. Some of these compounds are already present in the
wood clearly differentiated from those ones fermented with grapes; others are formed during the processes of fermen-
tation and aging [13].
In many cases, the variety of grape employed in making
M. J. Ruiz-Bejarano  R. Castro-Mejas (&)  a particular wine completely determines the aroma of that
M. C. Rodrguez-Dodero  C. Garca-Barroso wine because volatile compounds that are present in the
Analytical Chemistry Department, Faculty of Sciences-CAIV, grape persist throughout the entire process of vinication
University of Cadiz, Agrifood Campus of International
and aging. The extent to which these compounds persist
Excellence, Post Ofce Box 40, 11510 Pol. Ro San Pedro,
Puerto Real, Cadiz, Spain from the grape through to the nished wine will be inu-
e-mail: remedios.castro@uca.es enced by the conditions of its vinication and the aging [4].
M. J. Ruiz-Bejarano However, it should be remarked that the process of
e-mail: mariajesus.ruiz@uca.es vinication itself, and particularly the alcoholic fermenta-
M. C. Rodrguez-Dodero tion, generates the greater part of the aromatic compounds
e-mail: maricarmen.dodero@uca.es present in the wine [5, 6].
C. Garca-Barroso In most wines, all of these compounds are subjected to
e-mail: carmelo.garcia@uca.es the subsequent process of aging in wood. During aging in

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wood, the wine acquires aromatic complexity as a result of about the volatile prole of Muscat sweet wines and its
important and diverse reactions [7]. Additionally, new relationship, in an individual way, to different vinication
volatile and nonvolatile compounds are extracted from the or aging processes [7, 1618], but not studying both factors
wood, modifying the wines bouquet. As a consequence jointly.
of all of these processes, the fruity and fermentative vol- Several different chemometric tools have been applied
atile compounds decrease during the process of aging in for the analysis of the results.
wood [8].
In Andalusia, special sweet wines are obtained using
dried grapes by direct exposition to the sun. They are Materials and methods
elaborated in Malaga, Montilla-Moriles, and Jerez in a
traditional method dating many years ago using two grapes Samples
varieties, Muscat and Pedro Ximenez. Grapes of these
varieties, in bunches, are spread out on esparto grass mats About 2,000 kg of ripe grape bunches from cv. Muscat
to toast in the sun before pressing. The bunches are turned were collected from a local winery in the Jerez-Xere`s-
over on a regular basis and covered at night to avoid the Sherry D.O. They were dried using a climatic chamber
adverse effects of high air moisture. This traditional pro- (Ibercex A. S. L., S. A., Spain) for 5 days at 40 C and
cess is affected, in many occasions, by the attack of insects relative humidity of 10 %. These bunches were distrib-
and the growth of fungi that can give rise to the formation uted uniformly into the chamber forming a single layer.
of dangerous toxins in the wine [9, 10]. The water loss was daily controlled. At the end of the
During this period, important reactions take place in the drying process, this one was about 35 % with 25
grape. Squadrito et al. [11] and Eberle et al. [12] found Baume.
signicant decreases in terpenols during the sun-drying Grapes were destemmed, crushed, and pressed using a
process of Muscat grapes. vertical press. For those experiments with pellicular mac-
In this way, the grapes attain sugar levels above 300 g/L eration, grapes were crushed without destemming and
and are crushed and pressed employing vertical presses. submitted to maceration for 24 h at 4 C.
After this, musts with high sugar content and, conse- The highest pressure in each cycle was 300 bars. Three
quently, a difcult fermentation are fortied with ethanol cycles were employed.
to ensure that the wine will contain at least 1518 % After that, must pH was adjusted to 3.5 with tartaric acid
alcohol. The young sweet wine is then, generally, sub- (Agrovin, Spain). The concentration of total sulfur dioxide
mitted to aging in American oak wood following a system was also set at 120 mg/L by adding potassium metabisul-
of dynamic oxidative aging [13]. te (Agrovin, Spain).
In these last years, a possible alternative to this tradi- Five different conditions (by duplicate) of vinication
tional sun-drying methodology has appeared. It is being were tested (experimental treatments 15, Table 1).
used for the drying of horticultural products and consists in In Experiment 1, a Saccharomyces cerevisiae yeast
forcing the loss of water by means of forced convection inoculum (40 g/hL, Lalvin D254, Lallemand, Australia)
with hot air in drying chambers [14]. This drying system was employed. The fermentation was carried out at room
avoids the problems mentioned above about fungi and temperature (less than 30 C).
insects that generate a high level of ochratoxin A and The conditions of Experiment D2 were the same as
causes high losses of product during the sun-drying [10]. Experiment D1 with the addition of yeast nutrients
Ruiz et al. [15] found for the grape variety Pedro (diammonium phosphate, 10 g/hL) (Actimax Plus?, Ag-
Ximenez that the musts from chamber-dried grapes exhib- rovin, Spain).
ited the same aroma terms than those obtained from grapes In Experiment D4, must was fermented at low temper-
dried traditionally under the inuence of the sun. These ature (less than 10 C) with S. bayanus (40 g/hL, Uvaferm
authors suggest that the use of chamber-drying can con- 43, Lallemand, Australia).
tribute to improve the drying process of the grapes. In addition, prefermentative cold maceration at 4 C
The objective of this work is to study the evolution, using 3 g/hL of pectolytic enzymes (Enozym Arome, Ag-
under different types of aging, of the main volatile com- rovin, Spain) was tested in Experiments D3 and D5. After
pounds of sweet Sherry wines obtained from grapes cv. 24 h, the grape paste was pressed, using a vertical press
Muscat dried using drying chambers and fermented under under the same conditions mentioned before (3 cycles and
different enological conditions. Therefore, two factors and 300 bars as the highest pressure in each cycle), and fer-
their possible inuence on the volatile prole have been mented. In Experiment D3, the fermentation conditions
considered together: aging and vinication conditions. were the same as Experiment D1 (S. cerevisiae at room
Only a few studies can be found into the bibliography temperature). Must from Experiment D5 was fermented

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Table 1 Conditions under which the vinication assays and aging experiments were carried out
Vinication Yeast Fermentation Nutrients (diammonium Pellicular maceration Aging
experiments temperaturea phosphate, 10 g/Hl with pectolytic
enzymes (4 C, 24 h) Stainless steel Oak cask Chips

D1 S. cerevisiae Rt No No D1S D1C D1CH


D2 S. cerevisiae Rt Yes No D2S D2C
D3 S. cerevisiae Rt No Yes D3C
D4 S. bayanus Lt No No D4S D4C
D5 S. bayanus Rt No Yes D5C
a
Rt room temperature (\30 C), Lt low temperature (\10 C)

following the conditions of Experiment D4 (S. bayanus at thermal desorption tube and then thermal desorption was
low temperature). carried out.
When the sugar content of the wine was around Previously, taking into account the nature of the sam-
90100 g/L, the fermentation was stopped by adding ples, the possible interference of the high sugar content on
alcohol up to 17. Then, the sweet wines obtained were the SBSE efciency was studied. Consequently, the same
aged in 30-L medium toasted oak casks (samples D1C to model white wine with different amounts of sugar
D5C). In order to compare the evolution of volatile com- (0250 g/L, glucose) was analyzed in triplicate. No inter-
pounds during this period, the same wines were aged in ference was observed (data not shown).
10-L stainless steel (Experiments D1S, D2S, and D4S). In
addition, one of them was aged in contact with 4 g/L of oak Instrumentation
chips for 3 months (Roblemor T, medium toast, Agrovin,
Spain) (sample D1CH). During the aging, all the experi- A commercial TDS-2 thermal desorption unit (Gerstel)
ments were situated in the same room at about 20 C. connected to a programmed temperature vaporization
The sampling was carried out after fermentation and (PTV) injector CIS-4 (Gerstel) by a heated transfer line
periodically for 1 year of aging (S0, 20 days; S1, 40 days; was used for the thermal desorption of the coated stir bars.
S2, 3 months; S3, 4 months; S4, 8 months; and S5, The PTV was installed in an Agilent 6890 GC-5973 MS
12 months). Samples were stored at 4 C until their system (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). An
analysis. empty bafed liner was used in the PTV. The thermode-
sorption unit was equipped with a MPS 2L autosampler
Analysis of volatile compounds (Gerstel) capable of handling the program for 98 coated stir
bars. The desorption temperature was programmed from
Chemicals and reagents 40 C to 300 C (held for 10 min) at 60 C/min under a
helium ow (75 ml/min), and the desorbed analytes were
All the aroma standards employed in this work were sup- cryofocused in the PTV system with liquid nitrogen at
plied by Merck (Darmstadt, Germany) and Sigma (Stein- -140 C. Finally, the PTV system was programmed from
heim, Germany). 4-methyl-2-pentanol was used as internal -140 C to 300 C (held for 5 min) at 10 C/s for the
standard. analysis by GCMS. A DB-Wax capillary column (J&W
Scientic, Folsom, CA, USA), 60 m 9 0.25 mm I.D., with
Sample preparation a 0.25 lm coating was used in order to perform the cap-
illary GCMS analysis in the electron impact mode. The
Volatile compounds were analyzed by SBSEGCMS carrier gas was helium at a ow rate of 1.0 ml/min. The GC
according to the method proposed by Alves et al. [19]. oven was programmed as follows: held at 35 C for 10 min
Briey, ve milliliters of ultrapure water, 5 ml of and then ramped at 5 C/min to 100 C. Then, it was raised
wine sample, 30 ll of a solution of 4-methyl-2-pentanol to 210 C at 3 C/min and held for 40 min. The mass
(2.52 g/L in Milli-Q water containing 15 % v/v of ethanol), detector operated in EI? mode at 70 eV in a range of
and a PDMS stir bar (20 mm 9 0.5 mm (length 9 lm 30400 amu.
thickness)) supplied by Gerstel (GmbH, Mulheim a/d Ruhr, Peak identication was carried out using the Wiley 7 N
Germany) were used for the extractions. For each extrac- Edition Library (Wiley Registry of Mass Spectral Data, 7th
tion, the stir bar was stirred for 1 h (800 rpm) at room Edition, 2000) by analogy of mass spectra (with a mini-
temperature (20 C). Then, it was transferred into a glass mum of 90 % of correspondence) and conformed by

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908 Eur Food Res Technol (2013) 237:905922

retention times of standards when they were available. Results and discussion
Additionally, in order to guarantee the identications, the
retention indices were experimentally determined on a Volatile compounds
polar column (DB-Wax) and compared with those found in
the bibliography. Semiquantitative data were obtained by In this research work, a total of 53 individual volatile
measuring the relative quantifying ion peak area in relation compounds have been identied in the different Muscat
to that of the area of 4-methyl-2-pentanol, the internal wines studies (Table 2). In our case, all musts were
standard. obtained from grapes dried using drying chamber (40 C
and 10 % RH). Ruiz et al. [15], in grapes from Pedro
Sensory Analysis Ximenez variety, observed that musts from chamber-dried
grapes exhibited the same aroma terms as those from sun-
The sessions were carried out in a standard tasting room dried grapes.
[20]. All evaluations, exclusively orthonasal, were carried For wines from Muscat grapes, most volatile compounds
out at 22 C. Twenty milliliters of sample was presented in found in this study had been previously identied: from
blue glasses, generally used for olive oil sensory analysis grape pulp and skins [25]; coming from the alcoholic fer-
[21], and covered with a glass top in order to minimize the mentation [26, 27]; and/or appearing after the period of
possible losses of aroma. The panel judges (12 judges), all aging in wood [7, 18, 27].
of them laboratory personnel, were submitted to a training
period about general and specic sensorial aspects. During Analysis of variance (ANOVA)
this stage, the judgment repeatability and the panel
homogeneity were evaluated. Duplicated discrimination Table 3 shows mean values obtained for each vinication
testing and descriptive proling were employed to validate experiment, at the initial (S0, 20 days) and at the nal (S5,
the judges repeatability, whereas for each descriptor, a 12 months) of aging, taking into account, for each case, all
two-factor ANOVA (judges 9 samples) allowed the study different ways of aging. In the case of Experiments D3 and
of the homogeneity of the panel [22]. After this, a D5, only one aging system, aging in oak cask, was studied.
descriptive proling was performed [23]. As a preliminary The process of drying and vinication, together with the
stage of generating appropriate descriptors to dene the later time of aging in wood, determines the prole of
samples, a group of wines, representative of the complete volatile compounds in a nal wine. Taking into account all
set, were presented to the judges. They were asked to of these facts, in order to study statistically the differences
describe them qualitatively. The nal selection included in the volatile content of all the wines studied, data were
those descriptors with a frequency of appearance greater submitted to the analysis of variance. For this one, three
than 5: fruity, citric, sweet, dried fruit/raisin, oral, honey, independent factors were considered: type of fermentation,
herbaceous, young wood/sawmill, oak, wine character, time of aging, and type of aging. As can be seen in Table 3,
dairy, wetness, and chemical character. In order to con- practically all the volatile compounds are signicantly
struct the nal worksheet (Fig. 1), wetness and chemical affected (p \ 0.01) by these three factors.
character were considered jointly in the off-odor descrip-
tor, and aromatic intensity and general impression were Ethyl esters It is well known that several volatile com-
also included. A structured nine-point scale was employed pounds are responsible for the fermentation aroma in wines
to evaluate each descriptor [24]. such as: ethyl ester of C6, C8, and C10 fatty acids, higher
alcohols and their acetates, and certain volatile acids [27].
Statistical analysis In our study, most of ethyl esters showed signicant
increases as the time of aging increased. However, the
Statistical analyses were carried out by using the SPSS effect of the type of aging did not exhibit a clear inuence
version 15.0 for Windows statistical package (SPSS Inc., on all of them. Ethyl butanoate, ethyl-3-methylbutanoate,
IL, USA) and Statgraphics Centurion, version 15.0 (Stat- ethyl hexanoate, diethyl pentanedioate, and diethyl succi-
point Inc., USA) for Windows XP. Analysis of variance nate showed higher values for those wines aged in wood,
(ANOVA) was applied to establish the possible signicant whereas ethyl esters with higher molecular weight (ethyl
differences among the samples for each volatile compound. octanoate, ethyl decanoate, ethyl dodecanoate, ethyl hex-
Furthermore, cluster analysis (CA), factor analysis (FA), adecanoate, and ethyl octadecanoate) exhibited higher
and linear discriminant analysis (LDA) were carried out values for wines aging in stainless steel (data not shown).
with the aim of highlighting the similarity of the samples Camara et al. [28] found great decreases in fatty acids ethyl
and the main contributors to the variance found among esters (C6C16) and acetates, and high increases in ethyl
them. esters of diprotic acids such as diethyl succinate for

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Eur Food Res Technol (2013) 237:905922 909

Fig. 1 Sensory analysis. Final


worksheet used for the
descriptive proling

Madeira wines aged in oak wood during 25 years. In this During the course of aging of the wine, the ethyl ester
sense, Alves et al. [19] observed that ethyl octanoate, composition changes due to shifts toward chemical equilib-
diethyl succinate, and cis-oak lactone could be used as rium. The hydrolysis and esterication reactions that can affect
discriminating variables for the correct differentiation this type of volatile compounds are very common during this
among Madeira wines according to wine type and time of period [28] and depend on several factors such as wine pH,
aging, observing the same tendency that Camara et al. [28] temperature, alcoholic degree, and type of acid. Therefore, all
observed for ethyl octanoate, ethyl decanoate, and diethyl these factors should be taken into account in order to explain the
succinate. variations in the ethyl ester content observed in this study.

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910 Eur Food Res Technol (2013) 237:905922

Table 2 Identication and quantication parameters for volatile compounds identied in the commercial aromatized vinegar samples
Number LRI Compound m/z Identication

1 1,038 Ethyl butanoate 71 S, MS


2 1,067 Ethyl isovalerate 88 S, MS
3 1,080 n-butyl acetate 43 MS
4 1,088 Hexanal 56 S, MS
5 1,108 4-methyl-2-pentyl acetate 43 MS
6 1,120 Isoamyl acetate 43 MS
7 1,157 b-myrcene 93 MS
8 1,197 4-methyl-2-pentanol (IS) 45 S, MS
9 1,214 Herboxide isomer I (dehydroxylinalool oxide) 67 MS
10 1,218 2-hexenal 41 S, MS
11 1,229 Isoamyl alcohol 55 S, MS
12 1,231 Hexanoic acid ethyl ester 88 S, MS
13 1,245 Herboxide isomer II (dehydroxylinalool oxide) 67 MS
14 1,276 Octanal 43 MS
15 1,336 6-methyl-5-hepten-2-one 43 MS
16 1,344 1-hexanol 56 S, MS
17 1,378 Nonanal 57 MS
18 1,414 Octanoic acid ethyl ester 88 S, MS
19 1,423 2-furaldehyde 95 S, MS
20 1,441 Nerol oxide 68 MS
21 1,451 Linalool oxide 59 MS
22 1,489 Benzaldehyde 106 S, MS
23 1,547 Linalool 93 S, MS
24 1,567 5-methyl-2-furaldehyde 110 S, MS
25 1,613 4-terpineol 111 S, MS
26 1,646 Decanoic acid ethyl ester 88 MS
27 1,711 Diethyl succinate 101 S, MS
28 1,737 a-terpineol 93 S, MS
29 1,769 b-citronellol 69 MS
30 1,783 Naphthalene,1,2-dihydro-1,1,6-trimethyl (TDN) 157 MS
31 1,810 Ethyl phenyl acetate 91 S, MS
32 1,836 Nerol 69 MS
33 1,849 Phenylethyl acetate 104 MS
34 1,854 Diethyl pentanedioate 143 MS
35 1,879 Geraniol 69 S, MS
36 1,890 Ethyl dodecanoate 101 MS
37 1,944 2-phenylethanol 91 S, MS
38 1,956 2,6-di-tert-butyl-p cresol (BHT) 205 MS
39 1,979 2-ethylhexanoic acid 73 MS
40 1,989 Phenol 94 MS
41 2,001 Nerolidol 69 MS
42 2,101 Octanoic acid 60 S, MS
43 2,145 Ethyl myristate 88 MS
44 2,195 Eugenol 164 S, MS
45 2,200 Nonanoic acid 73 MS
46 2,202 m-thymol 135 MS
47 2,204 4-ethylphenol 107 S, MS
48 2,232 Carvacrol 135 MS

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Table 2 continued
Number LRI Compound m/z Identication

49 2,317 Decanoic acid 60 S, MS


50 2,325 Ethyl hexadecanoate 88 MS
51 2,389 Ethyl octadecanoate 88 MS
52 2,494 Lauric acid 73 MS
53 2,556 Tetradecanoic acid 73 MS
54 2,850 Hexadecanoic acid 73 MS
LRI linear retention indices, S standard, MS mass spectrum

In the case of the factor fermentation type, in general, whereas decanoic and short-chain fatty acids exhibited
higher values were found for those wines of the Experi- signicant increases during a high period of aging in wood.
ments D2, D3, and D5. Ethyl esters are produced during
alcoholic fermentation from the reactions of ethanol and Acetates Regarding acetates, n-butyl acetate, 4-methyl-2-
acyl-coenzyme A derivates [29], and their concentrations pentanol acetate, and ethyl-2-phenyl acetate showed sig-
in the wine after the process of alcoholic fermentation nicant decreases as the aging time increased. Similar
depend on the specic conditions under which this process behavior was observed by Camara et al. [28] in Madeira
was carried out (temperature, yeast strain, etc.). The wines during a prolonged period of aging in oak wood. The
experiments with the highest values for ethyl esters were compounds, produced from enzymatic reactions, are
conducted under the addition of nutrients (Experiment D2), gradually hydrolyzed toward their corresponding acids and
pellicular maceration (Experiment D3), and pellicular alcohols during the storage of the wine.
maceration and fermentation with S. bayanus yeast About the factor fermentation type, Experiments D1
(Experiment D5), factors that have provoked a higher and D2 revealed a higher content in acetates. Both exper-
content of this type of compounds in the wine. Selli et al. iments were carried out at room temperature by S. cere-
[16] found that the skin contact treatment for musts from visiae and without maceration. The factor aging type
Muscat grapes increased the total free aroma compounds, was the least signicant for acetates with no clear inuence
especially terpenes and some higher alcohols. Aleixandre on these ones.
et al. [30] concluded that static clarication of must from
Muscat grapes with pectolytic enzymes produced wines Terpenes and terpenols Sanchez-Palomo et al. [25] found
with larger content of higher alcohols, esters, and terpenic that compounds such as linalool, geraniol, and nerol were
compounds. Pineiro et al. [17] observed that the vinica- the major compounds in pulp and skins of this grape
tion of several grape varieties with maceration provoked a variety, being the responsible for the typical oral aroma of
higher content in ethyl esters of lactic, acetic, and succinic Muscat grapes and contributing to the aroma of their wines.
acids. Ugliano et al. [31] observed that S. bayanus exhib- Fenoll et al. [35] found that the most abundant free volatile
ited a higher ability to release volatile compounds from compounds in Muscat grape during ripening, with signi-
glycosidic precursors under optimal conditions (pH 5 and cant increases during grape development, were some ter-
30 C) than S. cerevisiae, and that these differences were penic monoalcohols (linalool, geraniol, citronellol, nerol).
less signicant when the yeast strains were used to conduct In the group of glycosidically bound volatile compounds,
alcoholic fermentations in a chemically dened grape some terpenols together with other volatile compounds
juice-like medium containing glycosides extracted from such as trans and cis furan linalool oxides, benzyl alcohol,
grape juice. Other authors had also obtained contradictory and 2-phenylethanol were found [35].
results in studies about the activity of yeast glycosidase Concerning terpenes and terpenols, as can be seen in
enzymes during winemaking [3234]. Table 3, the most signicant factor was time of aging.
Terpenols such as linalool, a-terpineol, b-citronellol, nerol,
Acids In relation to acids, their contents were signicant and geraniol showed signicant decreases as the time of
inuenced by the three factors considered in this study. aging increased, whereas their oxides increased. This fact
About aging type, the lowest values were found for is in concordance with that observed by Karagiannis et al.
those wines aged in oak casks. The factor time of aging [27] in aged mistelles from Muscat grapes, with the
inuenced positively on the content of these volatile exception of a-terpineol, whose concentration increased.
compounds. Camara et al. [28] observed signicant Marais and van Wyk [36] observed that some terpenic
decreases in the content of octanoic and hexanoic acids, monoalcohols (linalool, nerol, and geraniol) during the

123
Table 3 Means (relative peak area) and SD for volatile compounds of each experiment
912
Volatile compounds D1 D2 D3 D4 D5 p value p value p value
fermentation aging aging

123
time type

Ethyl esters
Ethyl butanoate 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Initial 0.180 0.083 0.296 0.158 0.302 0.032 0.149 0.028 0.635 0.064
Final 0.245 0.212 0.818 0.863 0.631 0.062 0.227 0.136 1.71 0.03
Ethyl 3-methylbutanoate 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Initial 0.051 0.023 0.064 0.014 0.059 0.039 0.045 0.010 0.077 0.021
Final 0.070 0.046 0.166 0.110 0.097 0.017 0.072 0.042 0.143 0.039
Ethyl hexanoate 0.0000* 0.0090* 0.0000*
Initial 1.63 1.16 2.78 2.37 3.25 0.39 1.10 0.09 0.79 0.87
Final 2.30 1.93 6.99 7.54 5.69 0.36 1.26 0.04 1.16 0.39
Diethyl pentanedioate 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Initial 0.014 0.005 0.026 0.005 0.040 0.026 0.015 0.006 0.034 0.011
Final 0.028 0.011 0.080 0.044 0.061 0.003 0.029 0.014 0.061 0.026
Ethyl octanoate 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Initial 2.50 0.62 3.30 0.69 0.942 3.91 2.09 0.35 1.38 1.88
Final 3.13 0.58 6.23 0.70 1.93 0.42 2.88 0.22 2.19 3.91
Ethyl decanoate 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Initial 0.863 0.408 1.33 0.694 0.120 0.121 0.436 0.159 0.244 0.489
Final 2.13 1.04 4.80 1.24 0.234 0.365 1.00 0.31 0.790 2.52
Diethyl succinate 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Initial 0.950 0.403 1.35 0.340 1.83 1.27 0.945 0.472 2.30 0.517
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Final 1.89 0.90 4.48 2.68 3.53 0.26 1.97 1.23 4.35 1.27
Ethyl dodecanoate 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Initial 0.028 0.028 0.111 0.111 0.014 0.087 0.021 0.007 0.011 0.014
Final 0.091 0.071 0.288 0.166 0.016 0.034 0.034 0.014 0.053 0.087
Ethyl tetradecanoate 0.0138 0.0000* 0.4404
Initial 0.026 0.021 0.050 0.019 0.026 0.011 0.024 0.011 0.026 0.013
Final 0.046 0.033 0.029 0.014 0.010 0.026 0.041 0.022 0.084 0.011
Ethyl hexadecanoate 0.2729 0.1607 0.0065
Initial 0.093 0.089 0.062 0.023 0.072 0.040 0.072 0.044 0.079 0.051
Final 0.084 0.052 0.089 0.033 0.024 0.113 0.095 0.024 0.273 0.040
Ethyl octadecanoate 0.0007* 0.0786 0.0000*
Initial 0.024 0.023 0.019 0.011 0.012 0.012 0.017 0.012 0.016 0.005
Final 0.017 0.011 0.023 0.006 0.004 0.030 0.010 0.002 0.028 0.012
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Table 3 continued
Volatile compounds D1 D2 D3 D4 D5 p value p value p value
fermentation aging aging
time type

Acids
2-ethylhexanoic acid 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Initial 0.038 0.006 0.045 0.004 0.031 0.024 0.042 0.003 0.010 0.019
Final 0.024 0.006 0.048 0.015 0.019 0.004 0.033 0.005 0.003 0.024
Octanoic acid 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Initial 0.348 0.068 0.362 0.064 0.085 0.311 0.306 0.051 0.238 0.202
Final 0.410 0.164 0.466 0.027 0.113 0.074 0.408 0.122 0.244 0.311
Eur Food Res Technol (2013) 237:905922

Nonanoic acid 0.0351 0.0353 0.7558


Initial 0.018 0.001 0.020 0.003 0.008 0.004 0.012 0.002 0.015 0.007
Final 0.011 0.005 0.011 0.006 0.003 0.001 0.016 0.005 0.041 0.004
Decanoic acid 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Initial 0.439 0.077 0.589 0.129 0.074 0.587 0.142 0.054 0.143 0.152
Final 0.765 0.439 1.10 0.27 0.082 0.038 0.396 0.180 0.354 0.587
Dodecanoic acid 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Initial 0.031 0.009 0.229 0.123 0.025 0.131 0.014 0.002 0.027 0.023
Final 0.178 0.143 0.465 0.280 0.033 0.006 0.056 0.023 0.143 0.131
Tetradecanoic acid 0.0169 0.0003* 0.1000
Initial 0.069 0.018 0.084 0.011 0.025 0.050 0.040 0.019 0.089 0.052
Final 0.134 0.095 0.100 0.030 0.034 0.015 1.108 0.035 0.225 0.100
Hexadecanoic acid 0.0259 0.0000* 0.0087*
Initial 0.142 0.027 0.182 0.034 0.070 0.100 0.082 0.036 0.156 0.117
Author's personal copy

Final 0.335 0.224 0.251 0.109 0.038 0.008 0.231 0.065 0.295 0.100
Acetates
n-butyl acetate 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Initial 0.009 0.001 0.009 0.000 0.005 0.002 0.005 0.001 0.007 0.001
Final 0.005 0.004 0.013 0.011 0.007 0.001 0.004 0.003 0.009 0.002
4-methyl-2-pentanol acetate 0.0051* 0.0000* 0.4759
Initial 0.013 0.010 0.006 0.005 0.007 0.000 0.022 0.002 0.027 0.000
Final 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.010 0.000
Isoamyl acetate 0.0000* 0.0000* 0.0307
Initial 0.497 0.084 0.622 0.075 0.149 0.562 0.260 0.007 0.291 0.159
Final 0.432 0.054 0.987 0.192 0.310 0.109 0.351 0.126 0.443 0.562
Phenylethyl acetate 0.0000* 0.0000* 0.0000*
913

123
Table 3 continued
914
Volatile compounds D1 D2 D3 D4 D5 p value p value p value
fermentation aging aging

123
time type

Initial 0.341 0.064 0.385 0.003 0.478 0.429 0.441 0.001 0.337 0.394
Final 0.436 0.049 0.822 0.216 0.574 0.082 0.569 0.011 0.456 0.429
Ethyl 2-phenyl acetate 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Initial 0.900 0.133 1.01 0.239 0.155 0.621 0.488 0.049 0.511 0.182
Final 0.489 0.195 0.881 0.002 0.158 0.152 0.265 0.008 0.262 0.621
Terpenes and terpenols
Nerol oxide 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Initial 0.063 0.018 0.055 0.008 0.070 0.076 0.069 0.003 0.086 0.075
Final 0.105 0.029 0.109 0.002 0.092 0.026 0.125 0.019 0.118 0.076
Linalool oxide 0.0000* 0.0000* 0.0788
Initial 0.004 0.001 0.003 0.000 0.006 0.003 0.005 0.000 0.005 0.001
Final 0.004 0.000 0.004 0.000 0.006 0.001 0.003 0.002 0.007 0.003
Linalool 0.0000* 0.0016* 0.0000*
Initial 0.459 0.085 0.388 0.035 0.424 0.375 0.426 0.003 0.397 0.329
Final 0.357 0.079 0.638 0.108 0.381 0.110 0.474 0.009 0.378 0.375
4-terpineol 0.0347 0.0071* 0.1862
Initial 0.055 0.053 0.071 0.098 0.003 0.001 0.009 0.009 0.011 0.002
Final 0.003 0.000 0.003 0.001 0.003 0.036 0.003 0.000 0.004 0.001
a-terpineol 0.0170 0.0014* 0.0312
Initial 0.214 0.041 0.203 0.092 0.210 0.126 0.200 0.026 0.198 0.129
Final 0.166 0.041 0.179 0.001 0.179 0.048 0.202 0.020 0.071 0.126
personal copy

b-citronellol 0.0000* 0.0000* 0.0000*


Initial 0.066 0.035 0.077 0.017 0.189 0.047 0.089 0.008 0.038 0.027
Final 0.039 0.025 0.084 0.017 0.085 0.040 0.055 0.017 0.017 0.047
Nerol 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Initial 0.062 0.019 0.068 0.010 0.102 0.040 0.073 0.002 0.065 0.027
Final 0.034 0.015 0.068 0.011 0.039 0.023 0.048 0.010 0.028 0.040
Nerolidol 0.0000* 0.0198 0.0000*
Initial 0.030 0.011 0.052 0.020 0.014 0.014 0.011 0.004 0.023 0.002
Final 0.021 0.016 0.065 0.044 0.006 0.006 0.011 0.008 0.014 0.014
Geraniol 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Initial 0.203 0.057 0.180 0.028 0.310 0.134 0.247 0.007 0.230 0.100
Final 0.142 0.071 0.228 0.038 0.130 0.064 0.201 0.059 0.107 0.134
Thymol 0.0853 0.0500 0.6645
Eur Food Res Technol (2013) 237:905922
Table 3 continued
Volatile compounds D1 D2 D3 D4 D5 p value p value p value
fermentation aging aging
time type

Initial 0.033 0.052 0.002 0.001 0.001 0.000 0.002 0.001 0.018 0.000
Final 0.001 0.000 0.002 0.001 0.001 0.065 0.002 0.002 0.003 0.000
Carvacrol 0.5621 0.0500 0.0097*
Initial 0.017 0.028 0.002 0.001 0.002 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000
Final 0.001 0.000 0.003 0.003 0.001 0.034 0.001 0.000 0.003 0.000
b-myrcene 0.3967 0.0000* 0.0002*
Initial 0.009 0.007 0.005 0.004 0.010 0.001 0.008 0.004 0.006 0.001
Eur Food Res Technol (2013) 237:905922

Final 0.003 0.002 0.006 0.005 0.002 0.010 0.003 0.002 0.001 0.001
Dehydroxylinalool oxide I 0.0000* 0.0000* 0.0170
Initial 0.018 0.002 0.015 0.002 0.019 0.013 0.017 0.001 0.042 0.022
Final 0.032 0.007 0.028 0.010 0.037 0.000 0.037 0.006 0.077 0.013
Dehydroxylinalool oxide II 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Initial 0.022 0.009 0.026 0.001 0.018 0.009 0.022 0.002 0.030 0.027
Final 0.029 0.012 0.027 0.014 0.015 0.003 0.040 0.002 0.047 0.009
Aldehydes, acetones and alcohols
Hexanal 0.0000* 0.0000* 0.0705
Initial 0.009 0.001 0.009 0.002 0.008 0.003 0.008 0.001 0.010 0.002
Final 0.005 0.000 0.010 0.005 0.007 0.002 0.004 0.001 0.010 0.003
2-hexenal 0.1346 0.0002* 0.4616
Initial 0.372 0.167 0.307 0.136 0.450 0.186 0.496 0.106 0.640 0.402
Final 0.594 0.069 1.91 1.65 1.18 0.235 0.663 0.094 0.886 0.186
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Octanal 0.1942 0.0000* 0.0767


Initial 0.040 0.015 0.023 0.005 0.013 0.005 0.018 0.009 0.031 0.005
Final 0.008 0.003 0.010 0.003 0.004 0.020 0.007 0.000 0.008 0.005
6-methyl-5-hepten-2-one 0.0000* 0.0552 0.0000*
Initial 0.008 0.002 0.036 0.037 0.011 0.002 0.011 0.004 0.011 0.005
Final 0.007 0.002 0.029 0.032 0.020 0.000 0.010 0.003 0.012 0.002
1-hexanol 0.0000* 0.0213 0.0000*
Initial 0.043 0.008 0.052 0.003 0.077 0.019 0.056 0.003 0.052 0.033
Final 0.041 0.015 0.082 0.055 0.102 0.007 0.056 0.008 0.070 0.019
Nonanal 0.8073 0.0000* 0.8874
Initial 0.055 0.020 0.040 0.014 0.025 0.003 0.019 0.001 0.015 0.005
Final 0.014 0.006 0.012 0.008 0.010 0.025 0.015 0.008 0.022 0.003
Benzaldehyde 0.0000* 0.0000* 0.0000*
915

123
Table 3 continued
916
Volatile compounds D1 D2 D3 D4 D5 p value p value p value
fermentation aging aging

123
time type

Initial 0.072 0.027 0.069 0.028 0.104 0.021 0.072 0.019 0.091 0.032
Final 0.086 0.032 0.149 0.119 0.193 0.035 0.085 0.040 0.215 0.021
3-methyl-2-butanol 0.0015* 0.0000* 0.1049
Initial 0.737 0.111 0.718 0.430 0.709 0.523 0.772 0.033 1.00 0.665
Final 0.979 0.186 2.37 1.63 1.91 0.124 1.03 0.085 1.13 0.523
2-phenylethanol 0.0000* 0.5980 0.0083*
Initial 0.925 0.125 1.06 0.162 1.26 0.778 0.959 0.011 1.43 0.652
Final 0.860 0.031 1.47 0.370 1.19 0.156 0.969 0.047 1.53 0.778
Miscellaneous
Phenol 0.0235 0.0505 0.4117
Initial 0.033 0.002 0.034 0.002 0.026 0.014 0.032 0.007 0.033 0.019
Final 0.036 0.012 0.044 0.024 0.024 0.001 0.028 0.001 0.044 0.014
Eugenol 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Initial 0.012 0.006 0.008 0.005 0.019 0.003 0.014 0.008 0.031 0.001
Final 0.013 0.010 0.025 0.030 0.033 0.008 0.022 0.023 0.055 0.003
4-ethylphenol 0.0001* 0.7190 0.0000*
Initial 0.005 0.004 0.005 0.004 0.003 0.001 0.003 0.002 0.005 0.000
Final 0.003 0.003 0.006 0.007 0.006 0.002 0.004 0.005 0.007 0.001
2-furaldehyde 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Initial 0.058 0.023 0.051 0.016 0.082 0.005 0.055 0.014 0.082 0.009
Final 0.059 0.042 0.058 0.051 0.113 0.017 0.098 0.085 0.180 0.005
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5-methylfuraldehyde 0.0000* 0.0000* 0.0000*


Initial 0.012 0.013 0.011 0.011 0.017 0.010 0.009 0.009 0.023 0.001
Final 0.025 0.032 0.051 0.065 0.035 0.003 0.026 0.028 0.067 0.010
1,1,6-trimethyl-1,2-dihydronaphthalene (TDN) 0.0000* 0.0000* 0.0000*
Initial 0.004 0.005 0.008 0.001 0.004 0.023 0.002 0.001 0.004 0.001
Final 0.013 0.008 0.052 0.019 0.015 0.006 0.013 0.014 0.046 0.023
2,6-di-tert-butyl-p cresol (BHT) 0.1128 0.0000* 0.0000*
Initial 0.178 0.039 0.110 0.069 0.127 0.003 0.142 0.037 0.100 0.007
Final 0.307 0.296 0.335 0.339 0.066 0.050 0.234 0.244 0.119 0.003
Analysis of variance. Initial: S0, 20 days; S5, Final: 12 months of aging
* Values are signicant at p \ 0.01
Eur Food Res Technol (2013) 237:905922
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aging may be transformed into a-terpineol and other terp- Aldehydes, alcohols, and ketones Sanchez-Palomo et al.
enes such as linalool oxide with higher aroma thresholds. [41] identied, in musts from Muscat grapes, aldehydes
However, Loscos et al. [37] observed that the concentration and alcohols of six carbon atoms, monoterpenes, poly-
of a-terpineol increased signicantly after a week of oxygenated terpenes, and benzoic compounds such as
accelerated wine aging (50 C), and then, its concentration benzaldehyde and 2-phenylethanol. Acids and volatile
fell until the end of the aging process. As could be compounds resulting from reactions favoured by high
expected, the factor temperature is a crucial parameter that temperatures such as 2-furfuraldehyde and b-damascenone
has to be taken into account during the storage. These were also found in these musts [41].
authors explained these facts taking into account the initial In our studies, certain alcohols and aldehydes (1-hexa-
conversion of terpenols such as linalool into a-terpineol nol, hexanal, benzaldehyde, 2-phenylethanol) showed
and the subsequent conversion of this one into terpin increases for those wines obtained after maceration
hydrate. Observing the data correspond to Experiments D3 (Experiments D3 and D5). Selli et al. [16] found signicant
and D5 in comparison with the remaining ones, for which increases in the content of terpenes and some alcohols
the aging in cask was the only one studied (Table 3), it can (hexanol and 2-phenylethanol) in studies of skin contact
be observed that the decreases in terpenic compounds were treatment for musts from Muscat grapes.
higher for those wines aged in oak casks where the con- Some authors have found signicant increases for higher
tinuous micro-oxygenation favoured through the pores of alcohols during aging [28]. In our experiments, 3-methyl-2-
the wood provoked a higher oxidation of these compounds. butanol and 1-hexanol exhibited signicant increases dur-
About the factor fermentation type, the use of pel- ing aging. For aldehydes, benzaldehyde exhibited a clear
licular maceration with pectolytic enzymes (Experiments rising tendency during aging, with higher values for those
D3 and D5) did not clearly increase the content in this type wines aged in wood. Loscos et al. [37], in studies of
of compounds. The glycosidase activity of these enzymes accelerated aging (50 C and 9 weeks), and Pereira et al.
depends on the medium pH and the content in glucose and [42], in liqueur wines aged in casks, observed this same
glucolactone [38] with a clear inhibition of this activity as tendency for benzaldehyde.
the content in these compounds increases.
Selli et al. [16] found in studies of skin contact for Miscellaneous Among the volatile compounds that have
musts from Muscat grapes that terpenes increased slightly, demonstrated a clear increase in wines during their aging in
especially a-terpineol and b-citronellol. Aleixandre et al. oak wood, some authors [18, 28] have found 2-furaldehyde
[30] found clear increases in the content of linalool, and 5-methyl-2-furaldehyde. Both of them are formed by
a-terpineol, b-citronellol, nerol but not geraniol in assays the degradation of carbohydrates during the toasting of the
of maceration of Muscat musts with pectolytic enzymes. barrel and then are transferred to the wine during its aging.
In our case, only b-citronellol and nerol showed a clear In wines without aging in wood, both of them can provide
higher content for that wine from the Experiment D3, from the dehydration of sugars during the process of drying
macerated with pectolytic enzymes and fermented with [43].
S. cerevisiae. Eugenol, 2-furaldehyde, and 5-methyl-2-furaldehyde
In relation to the yeast strain employed, only geraniol demonstrated signicant increases during the aging, with
exhibited an obvious higher content for those wines fer- the highest values found for those wines aged in wood
mented with S. bayanus. Gamero et al. [39] observed in (Table 3, Experiments D3 and D5). 2-furaldehyde and
Muscat wines fermented by Saccharomyces species and 5-methyl-2-furaldehyde have been found in musts from
hybrid yeast that the amount of geraniol decreased in most Pedro Ximenez grapes after their sun-drying [43]. 2-fur-
wines with respect to the initial must except for S. bayanus furaldehyde is produced when pentoses (xylose) are heated
wines, whereas the a-terpineol amount was higher in wines and 5-methyl-2-furfuraldehyde arises from the rhamnose.
fermented by S. cerevisiae and hybrid yeasts. The amount Therefore, aging in wood and the use of a drying chamber
of linalool observed by Gamero et al. [39] was similar in all could explain the content found for these compounds in the
wines. No relationship between b-D-glucosidase activity wines studied. Eugenol, present in oak wood without
and terpenes prole of wines obtained after fermentation toasting and whose concentration augments with the
with Saccharomyce species and hybrids was found by these toasting temperature during the barrel making, is trans-
authors. However, Henschke et al. [40] established that the ferred to the wine during its aging [44].
use of S. bayanus strains can produce wines with different In relation to 1,1,6-trimethyl-1,2-dihydronaphthalene
sensory proles. In this study [40], wines made with S. (TDN), its content was higher for those wines aged in wood
bayanus contained more glycerol, acetaldehyde and suc- for a year. The presence of this compound in wines is
cinic acid, and less acetic acid and ethyl acetate than those principally related to the maturation process by carotenoid
made with S. cerevisiae. degradation [45]. Parameters such as temperature, sunlight,

123
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and storage time have a positive inuence on the content of use of nutrients or pellicular maceration conditioned their
this compound. Silva et al. [46] found a high concentration later evolution in oak cask.
for this compound in a forced aging study. The groups obtained demonstrate that the volatile
compounds studied possess sufcient explanatory power to
Cluster analysis (CA) detect the type of aging process and differentiate two yeast
strains.
The data matrix (volatile compounds) was subjected to a Thus, in order to obtain suitable classication rules for
hierarchical agglomerative cluster analysis of cases, taking assigning categories to samples, a supervised learning
the squared Euclidean distance as metric and the Ward pattern recognition method was applied. A forward step-
method as amalgamation rule. The dendrogram obtained is wise linear discriminate analysis (LDA) was carried out.
shown in Fig. 2.
Three main clusters can be appreciated: one cluster for Linear discriminant analysis (LDA)
the samples from Experiments D2 and D3 aged in oak
wood; another one for the samples from Experiments D1, LDA assumes an a priori knowledge of the number of
D4, and D5 aged in oak wood; and nally, a third one for classes and the sample class memberships. This analysis
the samples from the experiments submitted to aging in was performed according to the Wilks0 lambda statistic
stainless steel and aged with chips. Some initial samples [47] in order to choose the descriptors that best distinguish
(S0, S1, and S2) from Experiment D1 are grouped together the different classes. The so-called leave-one-out method
with those ones from Experiments D2 and D3. As can be has been employed [48]. Three possible differentiation
seen, in relation to the rst ones, those samples aged in criteria have been considered: fermentation type (Experi-
wood, a clear differentiation between wines fermented with ments from D1 to D5), time of aging (S0, S1, S2, S3, S4,
S. bayanus (Experiments D4 and D5) and those fermented and S5), and aging type (aging in oak wood, aging with
with S. cerevisiae (Experiments D2 and D3) was obtained chips, and aging in stainless steel).
(Fig. 2). Clusters were formed especially according to the The variables included in the discriminant functions
aging type (aging in wood and in stainless steel) and to the obtained according to fermentation type mainly belon-
yeast strain employed. Taking into account that only the ged to four chemical families (ethyl esters, terpenes, fur-
initial samples from Experiment D1 (S. cerevisiae without anic compounds, and acetates). For the rst function, ethyl
nutrients and pellicular maceration) aged in wood were butanoate, diethyl pentanedioate, 2-phenylethanol (with
grouped together with those ones fermented with the same negative sign) and 5-methyl-2-furfuraldehyde, and deca-
yeast strain, it could be concluded that, for these wines, the noic acid (with positive sign) were the volatile compounds

Fig. 2 Volatile compounds.


320
Cluster analysis (CA).
Dendrogram obtained using
squared Euclidean distance and 280
the Ward method as
amalgamation rule. The codes
240
are indicated in Table 1

200
Distance

160

120

80

40

0
S5D2S
S4D2S
S3D2S
S2D2S
S1D2S
S5D1CH
S5D1S
S4D1S
S4D1CH
S3D1S
S1D1CH
S3D4S
S0D2S
S2D1S
S2D1S
S2D4S
S0D4S
S4D4S
S1D4S
S1D1S
S2D1CH
S0D1CH
S5D4C
S5D4C
S5D1C
S3D4C
S4D1C
S4D4C
S4D4C
S3D4C
S3D1C
S5D5C
S4D5C
S3D5C
S2D5C
S1D5C
S0D5C
S5D4S
S2D4C
S2D4C
S1D4C
S1D4C
S4D1C
S5D1C
S0D4C
S0D4C
S0D1S
S3D1C
S2D1C
S5D1C
S5D2C
S3D2C
S4D2C
S1D1C
S2D1C
S1D1C
S2D2C
S4D3C
S4D3C
S3D3C
S2D3C
S1D3C
S0D3C
S1D2C
S0D1C
S0D1C

Chips and stainless steel Oak wood. Experiments 1, 4 and 5 Oak wood. Experiments 2 and 3

123
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Eur Food Res Technol (2013) 237:905922 919

with the highest weight. For the second function, particu- 7


larly, 5-methyl-2-furfuraldehyde, decanoic acid (with
5
negative sign) and b-citronellol, phenylethyl acetate, and
1-hexanol (with positive sign) were the variables with the 3

Function 2
highest standardized coefcients. The scatterplot of the
1
samples onto the plane dened by the rst two discriminant
functions for fermentation type is shown in Fig. 3. As -1
can be seen in Fig. 3, clear separations among the samples
of different vinication experiments were obtained. Sam- -3

ples from Experiments D3, D4, and D5 were clearly dif- -5


ferentiated, whereas Experiments D1 and D2 were in some -5 -3 -1 1 3 5 7
cases intermingled. Both these last experiments were car- Function 1
ried out without previous pellicular maceration, with S. Fig. 4 Volatile compounds. Linear discriminant analysis (LDA).
cerevisiae, and fermented at the same temperature. In the Scatterplot of the samples on the plane dened by the rst two
case of Experiment D2, nutrients were employed (Table 1). discriminant functions for the factor aging type. , oak cask; ,
The 100 % of the samples were correctly classied in the chips; , stainless steel
check process by the leave-one-out method.
According to the criterion aging type, the variables 8
included in the discriminant functions mainly were acids
(decanoic acid with positive sign and dodecanoic acid with 5

negative sign), ethyl esters (ethyl octadecanoate with


Function 2

2
positive sign and diethyl succinate with negative sign) for
the rst function, and nerolidol and nerol oxide with -1
positive sign and negative sign, this last one, for the rst
and the second functions, respectively. The scatterplot of -4
the samples onto the plane dened by the rst two dis-
criminant functions for aging type is shown in Fig. 4. As -7
-8 -4 0 4 8
can be seen, samples from different aging type are Function 1
undoubtedly separated with a 99.24 % of correct classi-
cation in the check process by the leave-one-out method. Fig. 5 Volatile compounds. Linear discriminant analysis (LDA).
With regard to the criterion time of aging, mainly Scatterplot of the samples on the plane dened by the rst two
discriminant functions for the factor aging time. , S0; , S1; ,
terpenes, ethyl esters and acetates were the variables
S2; , S3; , S4; , S5
included in the two rst discriminant functions: nerol

oxide, ethyl decanoate, diethyl pentanedioate with positive


14 sign, and ethyl butanoate and geraniol with negative sign
were the most signicant volatile compounds for the rst
10
function. For the second function, these ones were ethyl-3-
methylbutanoate, ethyl hexanoate, linalool with positive
6
sign, and n-butyl acetate, nerol oxide, linalool epoxide, and
Function 2

2
phenylethyl acetate with negative sign. The scatterplot of
the samples onto the plane dened by the rst two dis-
-2 criminant functions is shown in Fig. 5. As can be observed,
Function 1 separates undoubtedly those samples with short
-6 aging (S0, S1, and S2, with negative values for this func-
tion) from those aged during a long time (S3, S4, and S5).
-10 A 98.48 % of correct classication was obtained in the
-21 -16 -11 -6 -1 4 9
Function 1 check process by the leave-one-out method.

Fig. 3 Volatile compounds. Linear discriminant analysis (LDA). Sensory analysis


Scatterplot of the samples on the plane dened by the rst two
discriminant functions for the factor fermentation type. ,
Experiment 1; , Experiment 2; , Experiment 3; , Experiment The sensorial data of all the wines were analyzed from a
4; , Experiment 5 multivariate perspective. A factor analysis (FA) was

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920 Eur Food Res Technol (2013) 237:905922

1,0 4
CITRIC D1S
FRUITY D1C
0,8 3 D1CH
D2S
D2C
FLORAL 2 D3C
0,6
D4S
D4C
Factor 2

Factor 2
1 D5C
0,4
DRIED FRUITS
AROMATIC INTENSITY
GENERAL IMPRESSION
0
0,2
HONEY
-1
WINE CHARACTER
0,0
SWEET
OFF-ODOUR OAK -2

-0,2
-0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 -3
-2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Factor 1
Factor 1
Fig. 6 Sensory analysis. Factor analysis (FA). Loadings of the
different descriptors considered on the plane dened by the rst two Fig. 7 Sensory analysis. Factor analysis. Scatterplot of the samples
factors extracted on the plane dened by the rst two factors

performed. As a previous stage, those descriptors with very sensorial characteristics. From a sensorial point of view,
low intensities (minor to 1) were excluded, i.e., herba- wines D1C and D2C, placed in the rst quadrant (Fig. 7),
ceous, young wood/sawmill, and dairy. showed more complex aromatic proles with higher
When FA was carried out, two major factors were intensities in aging and varietal aromas.
extracted, which explained 57 % of the total variability. In summary, from the results obtained, it can be
According to Fig. 6, which represents the loadings of the observed an important inuence of the three factors con-
different descriptors on the Factors 1 and 2, Factor 1 sidered, fermentation type, aging type, and aging time, on
(which accounts for 42.2 % of the variance) was correlated volatile compounds and sensorial characteristics of the
positively with general impression (loading value: 0.82). wines studied. Taking into account the global volatile
The sweet notes (especially sweet0.86and ripe fruit prole, the factor aging type has demonstrated the
0.71), a higher aromatic intensity (0.89), and the oak highest inuence on the volatile content of the wines
note due to the aging (0.71), also seem to contribute to this (Fig. 2), with wines from Experiments D4 and D5 (fer-
factor. Factor 2 (14.7 % of the explained variance) pre- mented with S. bayanus) and aged in oak wood clearly
sented high loadings for fruit (0.86), citric (0.89), and oral differentiated from those fermented with S. cerevisiae and
notes (0.73); therefore, it seems that Factor 2 could be aged in wood or stainless steel.
related to primary and variety aromas, which are fully Sensorially, wines fermented with S. Cerevisiae and
expressed after the fermentation process. aged in wood were the most valued ones.
When the samples were placed in the new plane dened
by F1F2 (Fig. 7), some comments could be done if we Conict of interest None.
take into account the interpretation of the dimensions of the
Compliance with ethics requirements This article does not con-
factors extracted. On the one hand, according to the load- tain any studies with human or animal subjects.
ings of F1, the wines located to the right (D1C, D2C, D3C,
and some of the D4C set) are the most appreciated. The
presence of both aging and sweet notes, and also a higher
aromatic intensity, can be related to its preference. On the References
other hand, some of the wines from the rst sampling (S0),
those ones aged in contact with oak chips (D1CH), and 1. Garca-Jares C, Garca-Martn S, Cela-Torrijos R (1995) Analysis
those stored in stainless steel containers (D1S, D2S and of some highly volatile compounds of wine by means of purge
and cold trapping injector capillary gas chromatography. Appli-
D4S), were all located to the left of F1. They were the cation to the differentiation of rias baixas Spanish white wines.
worst valued. D5C wines and some of the D4C set were J Agric Food Chem 43:764768
placed in the middle of F1. As we can see, the sensorial 2. Schreier P (1979) Flavor composition of wines: a review. Crit
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Ruiz-Bejarano et al. Ethyl carbamate in sweet Sherry wines 1

Effect of ageing of sweet Sherry wines obtained from cvs


Muscat and Pedro Ximnez on ethyl carbamate concentration
M.J. RUIZ-BEJARANO, R. CASTRO-MEJAS, M.C. RODRGUEZ-DODERO and C. GARCA-BARROSO
Analytical Chemistry Department, Faculty of Sciences-Andalusian Center of Vinicultural Research (CAIV), Agrifood
Campus of International Excellence, University of Cdiz, Puerto Real, Cdiz, Spain
Corresponding author: Dr Remedios Castro-Mejas, email remedios.castro@uca.es

Abstract
Background and Aims: Ethyl carbamate (EC) is a known carcinogen that has been found in wines. The aims of this
study were: (i) to study the effect of fermentation under different enological conditions on the EC concentration in
sweet Sherry wines made from the two grape cultivars, Muscat and Pedro Ximnez, during three consecutive
vintages (20082010); and (ii) to investigate the evolution of EC concentration during ageing in oak and in stainless
steel.
Methods and Results: Before and during ageing, the wines obtained were periodically sampled, and EC content
was determined by HPLC with uorescence detection. Mean values of EC ranged from 6.16 g/L for samples after
alcoholic fermentation to 120 g/L for samples after 28 months of ageing in oak. Data were submitted for ANOVA
and cluster analysis. It has been observed that the various factors considered (vinication conditions, ageing type,
ageing time, grape cultivar and vintage) have signicant inuence on the EC concentration of the wines. The use of
Saccharomyces bayanus instead of Saccharomyces cerevisiae reduced the EC concentration signicantly. Both the use of
nutrients and skin contact with pectolytic enzymes increased EC concentration. Ageing increased the EC content for
all vinication conditions.
Conclusions: Ageing was the most signicant factor affecting EC concentration of the wines. Wines made from
Muscat, fermented with S. cerevisiae and aged in oak cask for up to 28 months presented the highest EC concentration.
Signicance of the Study: The ageing of sweet Sherry wines in oak results in a concentration of EC higher than
that from ageing of similar wines in stainless steel.

Keywords: ethyl carbamate, oak cask, stainless steel, sweet Sherry wine, yeast strain

Introduction the accumulation of urea during fermentation depends on the


Ethyl carbamate (EC, urethane, C2H5OCONH2) is a known car- strain of yeast and the conditions of fermentation (Ough et al.
cinogen that has been found in wines as a by-product of fer- 1990, 1991). Ough et al. (1991) studied the effect on urea
mentation. Ethyl carbamate is formed from various precursors, secretion by varying the temperature during alcoholic fermen-
notably urea and citrulline, in reactions promoted by heat and a tation; they found that a high temperature led to a higher
high concentration of ethanol (Ough et al. 1988, Matsudo et al. concentration of urea in the wines.
1993, Ough and Stevens 1993, Canas et al. 1994, Kodama et al. Several studies have demonstrated that the addition of
1994). Other sources have been identied, such as cyanide in diammonium phosphate to musts to stimulate the alcoholic
stone fruit spirits (Baumann and Zimmerli 1987). fermentation increases the EC content of the wine obtained and
Maximum allowable concentration of EC for several types of that this effect depends on the yeast strain and the timing of
wines has been established in Canada, USA, Japan and Korea addition of diammonium phosphate during the fermentation
(Liang et al. 2009, Madrera and Valles 2009). Although EC process at the beginning, middle or end (Henschke and Ough
has been designated a key substance to be monitored by the 1991, Shinohara and Yanagida 1999, Adams and Van Vuuren
Food and Agriculture Organization (Food and Agriculture 2010).
Organization 2002), there is currently no harmonised In fermentation experiments with a single strain of
maximum concentration stipulated for EC in the European S. cerevisiae and employing ammonium sulfate and amino acids,
Union (European Food Safety Authority 2007). Because EC has Torricelli et al. (1995) found that the formation of urea was
shown potential carcinogenic activity when administered in inuenced by the amount and quality of the N-source.
high doses in animal tests (Baumann and Zimmerli 1987, The presence of amino acids, such as arginine, citrulline and
Matsudo et al. 1993), there is considerable interest in reducing alanine, also favoured the formation of urea. Ough et al. (1991)
the concentration of EC in all food products. observed that a high concentration of amino acids slowed down
The EC present in wine is produced mainly by the chemical the consumption of arginine during alcoholic fermentation and
reaction of ethanol with urea, although citrulline and carbamyl minimised the secretion of urea.
phosphate can also participate (Ough et al. 1988). Urea is The yeast strain can inuence EC concentration; Daudt et al.
formed and secreted by yeast as a consequence of arginine (1995) observed that the urea concentration in Cabernet
degradation during fermentation. It has been established that Sauvignon wines fermented with S. bayanus was lower than that

doi: 10.1111/ajgw.12147
2015 Australian Society of Viticulture and Oenology Inc.
2 Ethyl carbamate in sweet Sherry wines Australian Journal of Grape and Wine Research 2015

in those fermented with S. montrachet. Balcerek and Szopa different enological conditions, over three consecutive vintages
(2006) found that the EC of plum mashes fermented with (20082010).
S. bayanus was lower than that of mashes fermented with other
strains of selected wine yeasts. Materials and methods
No signicant difference was found by Uthurry et al. (2006)
in the EC content of wines fermented by S. bayanus and Chemicals and reagents
S. cerevisiae at 25 and 30C and at pH 3.2 and 3.8. In these same Hydrochloric acid (37%) and absolute ethanol were obtained
studies, however, it was observed that the urea concentration from Panreac Quimica (Barcelona, Spain). Methanol (HPLC
was higher for those wines fermented by S. cerevisiae at 30C and grade) was supplied by Fisher Scientic (Loughborough,
pH 3.8, suggesting that this strain of yeast has a greater capacity England) and 1-propanol (analytical quality) was obtained from
for yielding urea and, consequently, for producing EC. Merck (Darmstadt, Germany). Ethyl carbamate and
Several preventive actions have been recommended by the 9-xanthydrol (analytical grade and a minimum purity of 98%)
US Food and Drug Administration to reduce EC in wine; these were purchased from TCI Europe (Zwyndrecht, Belgium) and
actions include control of vineyard fertilisation techniques, Aldrich (Madrid, Spain), respectively. Ultrapure water was
adjustment of nutrient content in grape musts, use of suitable obtained from a Milli-Q system (Millipore Corporation,
yeast and lactic acid bacteria strains and application of urease Bedford, MA, USA).
(Butzke and Bisson 1997, Coulon et al. 2006).
It has also been demonstrated that physicochemical condi- Samples
tions during the ageing and storage of wines noticeably inu- Grapes of the cvs Muscat and Pedro Ximnez from vintages
ence the formation of EC (Kodama et al. 1994). Larcher et al. 2008, 2009 and 2010 were obtained from a local winery in the
(2013) found that storage temperature was crucial for the for- Jerez-Xrs-Sherry DO (Denomination of Origin) region. About
mation of EC in white wines stored at 12 and 40C. Those wines 2000 kg of ripe bunches of each cultivar were dried using a
with a urea concentration higher than 20 mg/L and exposed to climatic chamber (Ibercex, Madrid, Spain) for 5 days at 40C
40C had an EC concentration that ranged from 15 to 30 g/L in and relative humidity of 10%. The bunches were distributed
less than 5 days. Similar results were obtained by Koch-Wilk uniformly inside the chamber forming a single layer. Water loss
et al. (2006) in fruit wines stored in the dark at cellar tempera- was monitored daily, and at the end of the drying process, it was
ture (610C) or in daylight at room temperature (2030C). In about 35%; after drying, grapes were 45Brix.
this study, these latter conditions signicantly increased the EC Grapes were de-stemmed, crushed and pressed with a ver-
concentration. tical press. The highest pressure in each of the three cycles was
In Andalusia, Spain, sweet wines are obtained from grapes 30 MPa. For those experiments with skin contact (pellicular
dried by direct exposure to the sun. These wines are elabo- maceration), grapes were crushed without de-stemming and
rated in Malaga, Montilla-Moriles and Jerez by a traditional then submitted to maceration. In the next stage, the pH of the
method, using the grape cvs Muscat and Pedro Ximnez. This must was adjusted to 3.5 with tartaric acid (Agrovin, Alcazar de
traditional process is frequently affected adversely by the San Juan, Spain). The concentration of total sulfur dioxide was
attack of insects and by the growth of fungi, which can give also set at 120 mg/L by adding potassium metabisulte
rise to the formation of toxins in the wine (Valero et al. 2008, (Agrovin). Five experimental conditions (in duplicate) of
Ruiz et al. 2010). In this process, the grapes attain a sugar vinication were tested Table 1):
concentration of more than 300 g/L and are crushed and
Experiment E1 the must was fermented with a S. cerevisiae
pressed in a vertical press. Subsequently, the musts, with high
yeast (40 g/hL, Lalvin D254, Lallemand, Edwardstown, SA,
sugar content and thus difcult to ferment, are partially forti-
Australia) at room temperature (below 30C).
ed with ethanol to ensure that the wine will contain at least
Experiment E2 the must was fermented as in E1, but with
1518% alcohol.
the addition of yeast nutrients (10 g/hL diammonium phos-
In the production of fortied wines, the fortication may
phate) (Actimax Plus+, Agrovin).
aggravate the problem of urea excretion by yeast. Urea is often
Experiment E3 the fermentation conditions were as in E1;
formed during the early and middle stages of fermentation, with
however, the crushed grapes were subject to a pre-
subsequent generations of yeast utilising it during the later
fermentation cold maceration for 24 h at 4C using 3 g/hL of
stages. If the fermentation process is stopped early by fortica-
pectolytic enzymes (Enozym Arome, Agrovin); after which,
tion, wines with higher urea concentration may be obtained
the macerated grapes were pressed in a vertical press under
(Daudt et al. 1992). In the production of sweet Sherry wines,
the same conditions previously mentioned.
after fermentation and fortication, the young sweet wine is,
Experiment E4 must was fermented at low temperature
generally, aged in oak following a system of dynamic oxidative
(below 10C) with S. bayanus (40 g/hL, Uvaferm 43,
ageing (Casas 1985).
Lallemand).
In recent years, a possible alternative to this traditional
Experiment E5 the crushed grapes were subject to a pre-
sun-drying technique has appeared. It is being used for the
fermentation cold maceration for 24 h at 4C using 3 g/hL of
drying of horticultural products and consists of the removal of
pectolytic enzymes (Enozym Arome, Agrovin); after which,
water from the grapes by means of forced convection with hot
the macerated grapes were pressed in a vertical press under
air in drying chambers (Vega-Mercado et al. 2001). This drying
the same conditions previously mentioned; the must was
system avoids the problems mentioned above involving insects
fermented with S. bayanus at room temperature.
and fungi, which generate a high level of ochratoxin A and
cause a signicant loss of product during the sun drying (Ruiz When the sugar concentration of the fermenting must was
et al. 2010). about 90100 g/L, the fermentation was stopped by adding
The objective of our work was to study the evolution, under alcohol up to 1718% (v/v). Then, the sweet wines obtained
two types of ageing (oak and stainless steel), of the EC concen- were aged in 30-L medium-toasted oak casks (samples E1C to
tration of sweet Sherry wines obtained from the cvs Muscat and E5C) and in 10-L stainless steel vessels (samples E1S, E2S and
Pedro Ximnez dried in drying chambers and fermented under E4S). During this ageing period, wines were stored in the same

2015 Australian Society of Viticulture and Oenology Inc.


Ruiz-Bejarano et al. Ethyl carbamate in sweet Sherry wines 3

Table 1. Experimental design for determining the effect of must handling, fermentation conditions and ageing on the ethyl carbamate
concentration of wine.

Vinication Yeast Fermentation Nutrient Skin Ageing


experiments temperature addition contact
Stainless steel (S) Oak cask (C)

E1 Saccharomyces cerevisiae rt No No Yes (E1S) Yes (E1C)


E2 S. cerevisiae rt Yes No Yes (E2S) Yes (E2C)
E3 S. cerevisiae rt No Yes No Yes (E3C)
E4 S. bayanus lt No No Yes (E4S) Yes (E4C)
E5 S. bayanus rt No Yes No Yes (E5C)

rt, room temperature (<30C), lt, low temperature (<10C). Addition of 10 g/hL diammonium phosphate. Must held at 4C for 24 h with the addition of pectic
enzyme preparation.

room at approximately 20C. Sampling commenced at the end and equilibrated with 39% Milli-Q water for 2 min in order to
of fermentation (S0d) and continued periodically for 28 months prepare the system for the next sample. The volume of sample
(S20d, 20 days; S40d, 40 days; S2, 2 months; S4, 4 months; S7, injected was 60 L. A Waters 2475 scanning uorescence detec-
7 months; S8, 8 months; S12, 12 months; S18, 18 months and tor (FLD) was used. The wavelengths of excitation and emission
S28, 28 months). Samples were stored at 4C until they were were 233 and 600 nm, respectively. The data acquisition time
analysed. for each of the samples was set at 37 min; the software
employed for the recording and processing of the data was
Analysis of ethyl carbamate Empower Pro 2002 (Waters Corporation).
The method chosen for the determination of EC in wines, A calibration curve was prepared with a standard solution of
described by Madrera and Valles (2009), is based on an initial EC at a concentration ranging from 10 to 350 g/L. All solutions
derivatisation followed by separation by HPLC with uores- were prepared in duplicate, in a 17% v/v hydro-alcoholic
cence detection. This methodology was originally applied to matrix and were treated in the same way as samples.
cider spirits, so some modications were made. The calibration curve obtained was linear over the range,
with a regression coefcient of 0.999. The limit of detection
[three times the relative standard deviation (RSD) of the ana-
Sample derivatisation. The stability of xanthylEC was lytical blank values calculated from the calibration curve] and
tested in alcoholic solutions of variable alcohol concentration. A limit of quantitation (10 times the RSD of the analytical blank
solution of 250 g/L of EC was prepared in a matrix of synthetic values calculated from the calibration curve) were established at
wine: Milli-Q water with 3 g/L tartaric acid and an alcohol 2.69 and 8.98 g/L, respectively.
concentration of 17, 20 and 40% v/v, was analysed at intervals
from 30 min to 11 h and 30 min after the reaction with
9-xanthydrol started.
Statistical treatments
Statistical analyses were carried out with Statgraphics Centu-
After modifying and adapting the methodology to the
rion, version 15.0 (Statpoint Technologies, Warrenton, VA,
wine samples studied in this work, a solution of 0.02 mol
USA) for Windows XP. The possible signicant difference among
9-xanthydrol in 1-propanol and 1.5 mol HCl in ethanol was
samples according to the different factors considered in this
prepared. Wine samples were diluted in ethanol in a ratio 83:17
study was established by ANOVA. Furthermore, cluster analysis
(v/v) and ltered through a 0.45-m lter syringe (Millipore).
(CA) was carried out with the aim of highlighting the similarity
Diluted sample (1 mL), 0.2 mL of xanthydrol solution and
of the samples and the main contributors to the variance found
0.1 mL of 1.5 mol HCl were added to a chromatographic vial
among them.
and mixed. After waiting for 30 min to ensure the reaction was
complete, the mixture was injected into the HPLC system.
Results and discussion
Analysis by HPLC scanning uorescence detector. The Inuence of alcohol concentration on the determination of EC in
HPLC system used was a Waters Alliance 2695 (Waters Cor- sweet wines
poration, Milford, MA, USA) with a 110A C18 Gemini reverse Several studies have been undertaken of the effect of pH and
phase column of 250 mm length 3.0 mm i.d., particle size alcohol concentration on the stability of xanthylEC. Madrera
of 5 m (Phenomenex, Torrance, CA, USA) and a security and Valles (2009) found that the analytical signal decreased on
guard Gemini C18 4 2.0-mm cartridge. The column tempera- average by 1% for each increase in alcohol concentration within
ture was maintained at 35C. Chromatographic conditions, the studied range (from 20 to 65%). Ajtony et al. (2013),
gradient and ow, injection volume and temperature applied observed that xanthyl-EC was pH dependent, with low pH
to the chromatographic column (from 30 to 40C) were values favouring its decomposition. We have examined the
optimised to obtain the best resolution of xanthylEC (data inuence of variable alcohol concentration on the stability of
not shown). xanthylEC, using a strong HCl medium (pH value at about
The binary system phases were Milli-Q water and methanol 0.94). Our results were consistent with those described by
with a ow rate of 0.4 mL/min. The gradient used was as Madrera and Valles (2009). Matrix wine with 17 and 20% (v/v)
follows: 0 min, 39% Milli-Q water; 25 min, 39% Milli-Q water; ethanol showed a greater response than wine with 40% (v/v)
and 26 min, 0% Milli-Q water. Finally, the column was washed due to the inuence of the alcoholic strength on nucleophilic
with 100% methanol for 10 min at a ow rate of 0.8 mL/min substitution (data not shown). The xanthylEC compound,

2015 Australian Society of Viticulture and Oenology Inc.


4 Ethyl carbamate in sweet Sherry wines Australian Journal of Grape and Wine Research 2015

Table 2. Effect of ageing 2008 vintage Muscat wines in stainless steel tanks and in oak casks.

Sampling Ethyl carbamate concentration (g/L)


time
E1 E2 E3 E4 E5

0 Days 10.2 2.1 11.0 3.2 40.8 1.7 n.d. 13.2 0.7
20 Days 19.5 6.1 30.3 8.6 48.6 1.2 23.9 1.4 17.2 1.2
40 Days 22.2 7.1 43.7 20.2 57.0 0.3 34.1 6.6 25.8 0.3
2 Months 26.2 8.1 50.3 13.6 85.7 2.9 38.9 3.6 24.7 0.9
4 Months 38.8 11.5 71.1 17.0 103 3 57.6 7.0 37.9 1.2
7 Months 51.9 22.2 74.1 18.7 109 2 44.3 25.8 45.2 0.7
8 Months 59.4 18.1 86.1 21.3 123 1 73.0 14.1 57.9 0.3
12 Months 67.2 18.8 100 19 146 2 60.5 27.7 63.7 0.3
18 Months 74.6 18.7 121 10 182 1 94.7 15.7 67.0 1.1
28 Months 96.0 33.8 147 16 194 6 106 9 125 2

Aged in stainless steel tanks and oak casks, n = 8. Only aged in oak casks, n = 4. Values are means standard deviation. E1, must
fermented at room temperature with Saccharomyces cerevisiae; E2, must fermented as in E1 but with addition of 10 g/L diammonium
phosphate; E3, must subjected to skin contact for 24 h at 4C with added pectic enzyme preparation, pressed and fermented as in E1; E4,
must fermented with S. bayanus at <10C; E5, must treated as in E3 and fermented with S. bayanus at room temperature. n.d., not
detected.

Figure 1. Effect of time on the stability of xanthylethyl carbamate


in aqueous solutions containing () 20% ethanol v/v, () 40%
ethanol v/v and () wine matrix (17% v/v).

Figure 2. Effect of storage of wine in oak and in stainless steel


however, was stable only in the 40% ethanol solution, showing containers on ethyl carbamate concentration. Pedro Ximnez musts
an RSD of less than 5% between the rst (30 min) and the last from the 2009 (, ) and 2010 (, ) vintages were fermented at
injection (11 h and 30 min, Figure 1). low temperature (<10C) with Saccharomyces bayanus and stored in
To obtain 40% ethanol (v/v) concentration in the reaction oak (, ) and in stainless steel (, ) containers. Wines were
medium while minimising the loss of response owing to the sampled for analysis at 040 days and at 228 months after the
completion of alcoholic fermentation.
dilution factor, samples were diluted in a ratio of 83:17
(sample : ethanol), and hydrochloric acid was also dissolved in
ethanol. As observed by Herbert et al. (2002), the dilution of Figure 2 shows mean values (g/L) obtained for experiment
the sample to the same alcohol concentration showed some E4 and wine made from Pedro Ximnez from vintages 2009 and
advantages: the chromatographic noise due to the matrix 2010. In this case, for all samples (two grape cultivars and three
effect was reduced, and the derivatisation reaction was more vintages), EC was not detected immediately after alcoholic fer-
homogeneous. mentation (S0d). As can be seen (Figure 2), for both vintages,
The possible inuence of the sugar concentration in the Pedro Ximnez samples aged in oak cask (C) exhibited the
derivatisation reaction was not studied as Herbert et al. (2002) highest EC concentration. Table 3 shows mean EC concentra-
had showed that there was no interference. tion and standard deviation values obtained when the different
conditions described in the experimental were tested: vintage
(2008, 2009 and 2010), cultivar (Muscat and Pedro Ximnez),
ANOVA time of ageing (from S0d to S28), vinication conditions
The EC concentration of the wines made from the Muscat (experiments from E1 to E5) and type of ageing (oak cask and
cultivar (vintage 2008) ranged from not detected (E4, S0d) to stainless steel). For each one, all the EC values corresponding to
194 g/L (E3, S28) (Table 2). As could be expected (Kodama wines produced under the different conditions of the remaining
et al. 1994), for all experiments, the EC concentration increases factors were taken into account. This would explain the high
in line with increasing time of ageing. The data reported in standard deviation values obtained. Taking into account all
Table 2 also suggest that there are signicant differences in the samples (two cultivars and three vintages), mean values found
EC concentration of the wines associated with the different for EC ranged from 6.16 g/L for S0d (after alcoholic fermen-
vinication conditions tested. tation) to 120 g/L for S28 (after 28 months of ageing).

2015 Australian Society of Viticulture and Oenology Inc.


Ruiz-Bejarano et al. Ethyl carbamate in sweet Sherry wines 5

Table 4. Analysis of variance of ethyl carbamate concentration of

ANOVA. For each row, different letters show a signicant difference at P < 0.01 (Tukeys test). Initial: S0d; 20 days: S20d; 40 days: S40d; 2 months: S2; 4 months: S4; 7 months: S7; 8 months: S8; 12 months: S12; 18 months: S18; 28
months: S28. E1, must fermented at room temperature with Saccharomyces cerevisiae; E2, must fermented as in E1, but with an addition of 10 g/L diammonium phosphate; E3, must subjected to skin contact for 24 h at 4C with added
Table 3. Mean ethyl carbamate concentration and standard deviation found for each factor considered (vintage, grape cultivar, ageing time, ageing type and vinication conditions). For each factor, all

119 37f
wines obtained from the cvs Muscat and Pedro Ximnez fermented
under different enological conditions, over three consecutive vin-

28
tages (20082010), and aged in oak casks and stainless steel tanks
for 28 months.

97.7 35.7e.f
Factors F value P value

18 Vintage 11.05 0.0000*


Cultivar 61.31 0.0000*
67.2 30.7c,d Time of ageing 123.1 0.0000*

47.8 32.5a
Type of vinication 77.21 0.0000*
Type of ageing 54.23 0.0000*

pectic enzyme preparation, pressed and fermented as in E1; E4, must fermented with S. bayanus at <10C; E5, must treated as in E3 and fermented with S. bayanus at room temperature.
E5
12

*Factors are signicant for P value < 0.01.


73.6 24.2c,e

43.6 33.9d
33.7 24.3b

Previous studies have shown that varying amounts of EC are


present in different alcoholic beverages (Hasnip et al. 2004,
Uthurry et al. 2004, Weber and Sharypov 2009, Alberts et al.
2010

E4

2011). In South African wines, Alberts et al. (2011) found


8

values ranging from 1.8 to 31 g/L, whereas for fortied wines,


Ethyl carbamate concentration (g/L)

these values ranged from 2.8 to 79 g/L. In both cases, a clear


51.7 27.6b,d

and positive relationship was found between EC content and


wine age.
EC values corresponding to wines produced under the different conditions of the remaining factors were taken into account.

The EC concentration of the wines obtained under the con-


ditions detailed in Table 1 was subjected to ANOVA (Tables 3,4).
7

Stainless steel tank

For this analysis, the same ve independent factors previously


Pedro Ximnez

mentioned were considered. Table 4 shows that all ve factors


55.5 22.3b,c
29.7 23.9b

47.3 30.1b

considered were statistically signicant for EC concentration


111 50c

(P < 0.01).
The results obtained from the study of comparison of means
E3

using the Tukeys test (P < 0.01) for all signicant factors are
4

shown in Table 3. The EC concentration of wines increased


during ageing (Table 3), with the differences more important
39.3 19.1a,b
43.0 25.6a

after 4 months of ageing. From Table 4, it is possible to conclude


(Months)

that the differences are signicant among wines prepared


2009

according to the several factors.


As already mentioned, this nding has been reported pre-
2

viously by various authors (Hasnip et al. 2004, Uthurry et al.


2004, Weber and Sharypov 2009, Alberts et al. 2011). In those
32.9 14.5a,b

80.5 39.0b

studies, it was demonstrated that the formation of EC from the


reaction of its precursors (urea and citrulline) with ethanol
during storage is accelerated by high temperature. In our study,
E2
40

wines with a 1718% alcoholic content (v/v) were aged at room


temperature (<30C).
When considering the grape cultivar, the wine made from
19.8 13.5a

Pedro Ximnez presented a lower value than that for Muscat


(Tables 3,4). The ratio of proline to arginine plays a signicant
role in determining the predisposition of a cultivar to produce
20

urea (Bell and Henschke 2005). Ough et al. (1990) observed


that Cabernet Sauvignon, with a concentration of proline
6.16 17.22a
49.4 37.8a

54.4 44.9a

50.6 30.2a

57.4 42.7a

higher than that of arginine, produced a relatively low concen-


Oak cask

tration of urea. Other cultivars such as Sauvignon Blanc and


Muscat

(Days)

Traminer tend to have a lower ratio of proline to arginine (Bell


2008

E1

and Henschke 2005), and this increases their potential for EC


0

formation. In wines made from Chardonnay, Muscat White


and Muscat dAlexandrie, Soueros et al. (2003) found a high
Vinication experiment

amino acid concentration, with arginine being the most abun-


dant amino acid. Data on the amino acid concentration of the
Time of ageing

Pedro Ximnez are scarce: Mauricio et al. (2001) found that


Type of ageing

Pedro Ximnez musts contained more L-proline than L-arginine


(38.2 and 25.2%, respectively, of the total free amino acids).
Cultivar
Vintage
Factor

These values could explain the lower EC concentration found


for this cultivar in our study.

2015 Australian Society of Viticulture and Oenology Inc.


6 Ethyl carbamate in sweet Sherry wines Australian Journal of Grape and Wine Research 2015

The year 2010 exhibited a signicantly lower EC concentra- between the EC concentration for these two experiments
tion than that of 2008 and 2009. Martnez-Pinilla et al. (2013) reveals the important inuence of the yeast strain on the for-
observed a clear inuence of the vintage factor on the amino mation of EC.
acid concentration for several red varietal wines, and obtained a Experiments E2 and E1 were fermented under the same
clear separation of wines by vintage according to this concen- conditions, but for E2, which had a higher EC concentration,
tration. Climatic conditions appear to have a clear effect on nutrients were added. Several previous studies have demon-
amino acid concentration of grape must (Ortega-Heras et al. strated that the addition of diammonium phosphate has a sig-
2014), and therefore a signicant inuence on EC concentra- nicant inuence on the EC concentration of the wine obtained
tion of wine. In the Jerez-Xrs-Sherry DO, the total precipita- (Henschke and Ough 1991, Shinohara and Yanagida 1999,
tion from January to October for the vintages 2008, 2009 and Adams and Van Vuuren 2010).
2010 was 343, 275 and 601 L/m2, respectively (Ministerio de Results obtained from the vinication under different con-
Agricultura, Alimentacin y Medioambiente 2014). For Verdejo ditions, as described for each experiment, show that the use of
grapes, Ortega-Heras et al. (2014) observed that a warmer and S. bayanus instead of S. cerevisiae signicantly reduced the EC
drier year, with lower rainfall, produced grapes with higher concentration, and that both the use of nutrients and skin
amino acid concentration. Therefore, the notably higher pre- contact with pectolytic enzymes increased EC concentration.
cipitation for the vintage 2010 could explain the lower EC Finally, the type of ageing inuences the EC concentration,
concentration found for the wines of this vintage; however, a with signicantly higher values for EC obtained for those
more thorough study needs to be made in order to conrm this wines aged in oak casks (Tables 3,4). This signicant difference
observation. could be explained by possible microbiological modications,
When the inuence of the type of vinication (experiments) favoured under the low aeration that takes place through the
is considered, it can be seen (Tables 2,3) that the lowest EC pores of the oak cask (Blouin and Peynaud 2005). This would
concentration corresponds to E4, whereas the highest value increase some of the precursors of EC for those wines aged in
corresponds to E3. Experiment E4, fermented with S. bayanus, wood (Liu et al. 1994). Depending on the bacterial strain,
was the only experiment that was carried out at low tempera- citrulline and carbamyl phosphate can be formed from arginine
ture (<10C) without the addition of nutrients and pectolytic and their subsequent reaction with ethanol, during a specic
enzymes. Ough et al. (1991) observed that the employment of period of time and under a given temperature, leads to the
low temperature during alcoholic fermentation produced wines formation of EC. In relation to this, the organic acid content for
with a lower urea concentration; and the lower capacity of all wines was measured according to Guilln et al. (1998).
S. bayanus for EC production has been previously observed by Data for the organic acid concentration (malic acid, lactic
several authors (Daudt et al. 1995, Balcerek and Szopa 2006, acid and acetic acid) were submitted to ANOVA considering
Uthurry et al. 2006). In addition, several studies have demon- type of ageing as the independent variable. For all of these
strated that the application of pectolytic enzymes in the process acids, a signicant difference was found between ageing in oak
of skin contact modies the composition of musts, increasing cask and ageing in stainless steel. Lower acetic and lactic acid
the concentration of amino acids (Kishkovskii et al. 1974, values were found for samples aged in stainless steel (data not
Aldave 1992, Bosso and Ponzetto 1994). That nding is in shown). A previous study on the volatile content of some of
agreement with the high EC concentration found for experi- these wines showed that some ethyl esters had signicantly
ment E3, macerated with pectolytic enzymes and fermented higher values for those wines aged in oak casks (Ruiz-Bejarano
with S. cerevisiae at room temperature (<30C). Experiment E3 et al. 2013). This suggests that possible microbiological activity
(S. cerevisiae) and experiment E5 (S. bayanus) were fermented has taken place during ageing in oak. However, further studies
under the same vinication conditions. The difference found should be made in order to clarify this point.

Figure 3. (a) Dendrogram


obtained taking the squared
Euclidean distance as metric
and Ward method as
amalgamation rule and (b)
magnication of the area
indicated. Cluster analysis of
wines from Muscat (M) and
Pedro Ximnez (PX) grapes
corresponding to vintages
2008, 2009 and 2010 and aged
in oak casks (C) and stainless
steel tanks (S) for the following
periods of time: initial, S0d; 20
days, S20d; 40 days, S40d; 2
months, S2; 4 months, S4; 7
months, S7; 8 months, S8;
12 months, S12; 18 months,
S18; and 28 months, S28.
The design of the experiments
E1E5 carried out is detailed in
Table 1.

2015 Australian Society of Viticulture and Oenology Inc.


Ruiz-Bejarano et al. Ethyl carbamate in sweet Sherry wines 7

Cluster analysis chromatography with mass selective detection: collaborative study.


The data matrix was subjected to a hierarchical agglomerative Journal of AOAC International 77, 15301536.
Casas, J. (1985) Descripcin resumida de la tcnica enolgica de los vinos de
CA of cases, taking the squared Euclidean distance as metric and Jerez. Jimenez-Mena, A., ed. III Jornadas universitarias sobre el Jerez
the Ward method as amalgamation rule. The dendrogram (University of Cadiz Press: Cdiz, Spain) pp. 333361.
obtained is shown in Figure 3a. Two main clusters can be seen; Coulon, J., Husnik, J.I., Inglis, D.L., van der Merwe, G.K., Lonvaud, A.,
one cluster that mainly included the samples from the Muscat Erasmus, D.J. and van Vuuren, H.J.J. (2006) Metabolic engineering of
Saccharomyces cerevisiae to minimize the production of ethyl carbamate in
cultivar corresponding to experiments E1, E2 and E3 aged in wine. American Journal of Enology and Viticulture 57, 113124.
oak wood for 12 or more months (S12, S18 and S28; Figure 3b); Daudt, C.E., Ough, C.S., Stevens, D. and Herraiz, T. (1992) Investigations
and another one for the rest of the samples. In the former into ethyl carbamate, n-propyl carbamate, and urea in fortied wines.
cluster, the samples with the highest EC values can be found, American Journal of Enology and Viticulture 43, 318322.
whereas in the other cluster, the initial samples (S0d, S20d and Daudt, C.E., Boeira, L.S. and Pereira, C.N. (1995) Total nitrogen, arginine
and urea in musts from different nitrogen vineyard treatments and fer-
S40d) together with those samples aged for short periods of time mented with four different yeasts of Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon.
(S2, S4, S7 and S8), all of them with lower EC concentration, Ciencia y Tecnologa de los Alimentos 15, 166169.
can be found. The two clusters formed therefore reect the European Food Safety Authority (2007) Opinion of the Scientic Panel on
length of ageing time. This nding is considered to reveal that in contaminants in the food chain on a request from the European Commis-
sion on ethyl carbamate and hydrocyanic acid in food and beverages.
general, the main factor contributing to the EC concentration in European Food Safety Authority Journal 551, 144.
these wines is time of ageing. Food and Agriculture Organization (2002) Report of the codex committee
on food addities and contaminants. FAO Corporate Document Repository.
http://www.fao.org [accessed 26/03/15].
Conclusions Guilln, D.A., Barroso, C.G., Zorro, L., Carrascal, V. and Prez-Bustamante,
The aim of this study was to evaluate the inuence of several J.A. (1998) Organic acids analysis in Brandy de Jerez by ion-exclusion
factors, such as vintage (2008, 2009 and 2010), grape cultivar chromatography, post-column buffering and conductimetric detection.
Analusis 26, 186189.
(Muscat and Pedro Ximnez), time of ageing, vinication con- Hasnip, S., Caputi, A. and Crews, C. (2004) Effects of storage time and
ditions and type of ageing (oak casks and stainless steel tanks) temperature on the concentration of ethyl carbamate and its precursors in
on the EC concentration of wine. wine. Food Additives and Contaminants 21, 11551161.
The statistical study of the factors considered (vintage, grape Henschke, P.A. and Ough, C.S. (1991) Urea accumulation in fermenting
cultivar, time and type of ageing, and vinication conditions) grape juice. American Journal of Enology and Viticulture 42, 317321.
Herbert, P., Santos, L., Bastos, M., Barros, M. and Alves, A. (2002) New
showed that they had a signicant inuence on EC concentra- HPLC method to determine ethyl carbamate in alcoholic beverages using
tion, particularly with the strain of yeast and the length of uorescence detection. Journal of Food Science 67, 16161625.
ageing time having the major inuences. The highest EC con- Kishkovskii, Z.N., Kalunyants, K.A. and Rokhlenko, S.G. (1974) Use of
centration was seen in wines made from Muscat grapes, fer- pectolytic enzyme preparations during production of wines from goose-
berries and black currants. Vinodelie i Vinogradarstvo SSSR 7, 2125.
mented with S. cerevisiae and aged in oak cask for up to 28 Koch-Wilk, M., Pogorzelski, E., Kobus, M. and Wilkowska, A. (2006) Effect
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