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UNIDAD 3. TCNICAS MOLECULARES

3.1 Extraccin de cidos nucleicos

Se cuenta con tres mtodos establecidos para extraccin de ADN de muestras vegetales
y productos procesados, DNAzol modificado, Phytopure modificado y Urea
modificado.

De los tres mtodos evaluados para la extraccin de ADN tanto en muestras vegetales
as como en productos procesados, el DNAzol modificado fue el que produjo mejores
resultados.

A continuacin se esquematizan los tres mtodos de extraccin de ADN (Figura 9):

Buffer de DNAzol Phytopure

Urea

Buffer de Buffer de
Buffer de Extracci
Extraccin a extraccin
base de urea A n

Fenol e Fenol e Fenol e incuba.

incubar incuba Diferentes
tiempos yTs.

Centrifug Centrifug
acin acin
Resina

2 lavado 2 lavado
Centrifug
acin
Obtenci Obtencin de
n de ADN
ADN 2 lavado

Figura 9. Mtodos de extraccin de ADN.

Extraccin de ADN Maxipred (Sambrook y Rusell, 2001).

 35

Considerando que la lisis alcalina, en combinacin con el detergente SDS, ha sido usado
por ms de 20 aos para aislar ADN plasmdico de E. coli. Se observa que durante la
lisis, protenas bacteriales, rompen las clulas y desnaturalizan el ADN cromosomal,
empieza a engranar en grandes complejos que son cubiertos de sulfato dodecil de sodio.
Estos complejos son eficientemente precipitados de solucin, cuando los iones de sodio
son remplazados por iones de potasio. Despus, el material desnaturalizante es
removido por centrifugacin, el ADN plasmdico puede ser recogido del sobrenadante.
La lisis alcalina en presencia de SDS es una tcnica flexible que trabaja bien con clulas
de cepas de E. coli y con cultivos de bacterias en un rango de 1 a > 500 ml.
1. Inocular 100 ml de ETB + 11 ml de sales ETB + antibitico, con la cepa de inters.
Incubar a 37 C en agitacin toda la noche.
2. Al da siguiente, vaciar el cultivo en botellas de centrfuga y centrifugar 10 min a
4500 rpm en rotor GSA.
3. Decantar el sobrenadante y aadir a cada paquete celular 5 ml de solucin Birnboim
I, resuspender las clulas con una pipeta pasteur o agitar en vortex.
4. Agregar a cada botella 10 ml de solucin Birnboim II recin preparada, agitar
lentamente e Incubar de 3 a 5 min.
5. Agregar 7.5 ml de sol. Birnboim III, agitar lentamente hasta que la solucin sea
clara y se ha formado el agregado blanco.
6. Incubar 30 min en hielo.
7. Centrifugar en rotor GSA 10 min a 4500 rpm.
8. Filtrar el sobrenadante a travs de cubrebocas estriles y recuperar el filtrado en
tubos de 50 ml.
9. Agregar 0.6% volmenes de isopropanol fro (-20 C).
10. Agitar y precipitar a - 20 C durante 30 min.
11. Centrifugar 10 min a 10 000 rpm en rotor SS34.
12. Decantar el sobrenadante y resuspender la pastilla en 3 ml de H2O y aadir 3 ml de
LiCl 5 M (- 20 C). Incubar 5 min a temperatura ambiente.
13. Centrifugar 10 min a 10 000 rpm en rotor SS34.
14. Colectar el sobrenadante en un tubo corex y agregar 6 ml de isopropanol - 20 C.
15. Precipitar 1 hr o toda la noche.
16. Centrifugar 10 min a 10 000 rpm.
17. Resuspender la pastilla en 500 l de H2O y aadir RNAsa a una concentracin
final de 50 mg/ml. Incubar 30 min a temperatura ambiente.
 36

18. Agregar 500 l de NaCl 1.6 N + PEG 13%. Incubar 10 min.

19. Agitar y centrifugar a 4 C a 12 000 rpm durante 5 min.
20. Resuspender en 400 l de TE o H2O y hacer una extraccin de fenol, otra de fenol-
cloroformo y otra con cloroformo-alcohol isoamlico.
21. Precipitar con 2.5 volmenes de etanol absoluto (- 20 C) + 100 l de acetato de
amonio 10 M.
22. Incubar 10 min a temperatura ambiente y centrifugar a 12 000 rpm por 5 min a
temperatura ambiente.
23. Lavar la pastilla con 200 l de etanol al 70% fro y centrifugar 2 min.
24. Resuspender en 100 a 500 l de TE o H2O.

3.1.1. Precipitacin
Tcnica utilizada para purificar los cidos nucleicos a partir de oligonucletidos,
nucletidos, sales y otras impurezas, usando alcohol (por ejemplo: etanol, isopropanol,
butanol) y altas concentraciones de sal (por ejemplo: 0.2 a 0.6 M de NaCl), bajo estas
condiciones los polmeros de los cidos nucleicos se agregan y precipitan, mientras que
los componentes de bajo peso molecular se mantienen solubles. El cido nucleico puede
colectarse por centrifugacin (Valadez y Kahl, 2000).

Estos mismos autores mencionan que detergentes como el deodecil sulfato de sodio
(SDS) son utilizados para inhibir las enzimas nucleasas, disocian protenas de ADN y lo
hacen ms accesibles a la degradacin por proteinasas usadas durante la tcnica del
aislamiento. La polivinilpirrolidona (PVP) al 1% inhiben la accin de los compuestos
fenlicos; el bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB), se pega fuertemente al
ADN, desplaza las protenas y previene la degradacin. El CTAB se remueve mediante
extracciones con cloroformo, y el ADN permanece en fase acuosa listo para ser
precipitado con etanol. Los agentes como ADTA, EGTA y fenantrolina, son usados en
diferentes concentraciones tanto en especies vegetales como animales.

3.1.2. Purificacin
La purificacin de ADN implica el rompimiento de la estructura que lo contiene y la
eliminacin de cualquier sustancia contaminante o molcula unida a el cmo son las
protenas, membranas, minerales. Los mtodos ms comunes involucran diferentes
pasos de clarificacin con disolventes para eliminar las fracciones gruesas (membranas
 37

y protenas) y precipitaciones del ADN para la eliminacin de impurezas ms pequeas

(Cuadro 2).

Cuadro 2. Metodologa para la purificacin del ADN.

Pasos Objetivos Mtodos
1. Lisis Liberar los 1. Detergentes fuertes y
componentes internos desnaturalizantes para lisar la
de la clula clula:
a) Detergente inico.
b) Sales de guanidinio.
c) Altas temperaturas.
d) Mezcla de fenol/cloroformo.
2. Mtodos para separar el ncleo
del citoplasma en eucariotas:
a) Detergentes suaves, no inicos
en presencia de Mg.
b) Centrifugacin
2. Separacin Remover los 3. Precipitacin de cidos
inicial contaminantes nucleicos:
mayoritarios. a) Neutralizacin de las cargas
negativas con sales.
b) Reduccin de la solubilidad del
cido nucleico con alcohol fro.
4. Tratamiento con enzimas
especficas:
a) proteasas y RNAsas
3. Purificacin Remover 5. Extraccin:
contaminantes a) Mezcla de fenol/cloroformo.
b) Centrifugacin.
4. Purificacin Remover 6. Mtodos especficos:
final contaminantes a) Extracciones sucesivas.
residuales b) Unin por afinidad a
compuestos.
c) Extraccin con fenol.
d) Centrifugacin en gradiente.
5. Confirmacin Determinar pureza y 7. Espectroscopia con luz UV.
concentracin
Fuente: Balbs, 2002.

3.1.3 Anlisis espectrofotomtrica

 38

Uno de los mtodos ms simples y utilizado con mayor extensin para determinar la
cantidad de protena o de cidos nucleicos presentes en una solucin determinada es
medir la cantidad de luz de una longitud de onda especfica absorbida por la solucin a
travs del espectofotmetro. Para absorber luz de una longitud de onda particular, una
molcula debe de absorber un quantum entero de luz, o sea, la energa que impulsa un
electrn desde un orbital ms bajo a uno ms elevado.

La energa de la luz debe equilibrar exactamente la diferencia de energa del electrn

entre las dos posiciones. Si se conocen las caractersticas de absorbancia de un tipo de
molcula, entonces la cantidad de luz de longitud de onda apropiada absorbida por una
solucin de dicha molcula suministra una medida sensible de su concentracin (Karp,
1998).

Para cuantificar la cantidad de ADN/ARN, la lectura debe hacerse a longitudes de onda

de 260 nm, lo cual permite el clculo de la concentracin de los cidos nucleicos en la
muestra. Una DO = 1 corresponde aproximadamente a 50 g ml-1 de ADN de doble
cadena, 40 g ml-1 de ADN de cadena sencilla y de ARN y 20 g ml-1 de oligonucleicos
de cadena sencilla.

La relacin entre la lectura de absorbencia a 260 y 280 nm (DO260/280) aporta una

estimacin de la pureza de los cidos nucleicos; las preparaciones puras del ADN y del
ARN tienen valores que van desde 1.8 a 2.0 a DO260/280 respectivamente. Si hay
contaminacin con protenas o fenol, el valor obtenido en esta relacin, puede ser
significativamente diferente para los valores antes citados y no ser posible la
cuantificacin correcta de las molculas (Sambrook et al., 1989 citados por Valadez y
Kahl, 2000). Adems de estimar la relacin D260/280 es conveniente realizar otra
medicin a 230 nm ya que sta puede proporcionar informacin valiosa acerca de la
pureza de la muestra debido a que:

a) A 230 nm se localiza la absorbancia mnima de cidos nucleicos y nucletidos,

se localiza la absorbancia mxima de enlaces peptdicos, adems de que
cualquier absorcin a 230 nm es indicativo de contaminacin de protenas.
b) La absorbencia a 230 nm puede indicar la presencia de compuestos orgnicos
(tales como solventes y antibiticos). Por ejemplo, una relacin A260/A230 de una
 39

muestra de ARN debe ser > de 2.0. Si la relacin es menor, la contaminacin

puede deberse, por ejemplo a la presencia de tiocinato de guanidina.
c) La absorbencia a 230 nm tambin puede indicar la contaminacin con
amortiguador, ya que el tris o EDTA, as como otras sales, absorben a esta
longitud de onda.

Protocolo

1. Agregar 20 L de la muestra patrn de ADN a un tubo que contenga 1980 L de

amortiguador TE o agua bidestilada estril, mezclar perfectamente y leer la
absorbencia (DO) en el espectofotmetro a 260 y 280 nm.
2. Calcular la concentracin de ADN en solucin de acuerdo con la siguiente
frmula: Concentracin de ADN (g/L) = [DO260 X 100 (factor de dilucin) X
50 g/ml]/1000 (Valadez y Kahl, 2000).

3.2 Electroforesis

Para estimar la longitud de los fragmentos de ADN producidos por el corte de las
enzimas de restriccin, es necesario utilizar una matriz inerte y semislida. Esta matriz
o soporte puede ser de agarosa o poliacrilamida y dependiendo de la longitud esperada
de los fragmentos se opta por usar alguno de los dos (Valadez y Kahl, 2000).

Migracin de las molculas de ADN en el gel

Las molculas de ADN de diferente tamao pueden ser separadas por electroforesis, un
proceso en donde un campo elctrico es usado en donde se mueven las molculas de
ADN cargadas negativamente a travs de poros de gel de agarosa (Figura 10).

Las molculas del mismo tamao se mueven a la misma velocidad, es decir las
molculas de ADN pequeas se mueven ms rpido en relacin con las de mayor
tamao y se empiezan a separar en bandas. Las bandas sobre este gel contienen
molculas de tamao que va desde 500 pb hasta 12,000 pb, aunque las bandas de ms
de 4000 pb no estn lo suficientemente separadas una de otra para distinguirse. El ADN
es teido con bromuro de etidio, que no es ms que una molcula fluorescente cuando
es iluminada con luz UV (Watson et al., 1998).
 40

Figura 10. Separacin de los fragmentos de ADN por electroforesis en gel de

agarosa.

Gel de agarosa. Los fragmentos de ADN que se han generado por digestin con una
enzima de restriccin y pueden separarse uno del otro por medio de electroforesis en gel
de agarosa. El gel se hace con agarosa, una forma pura del polisacrido que se utiliza
para elaborar las placas de agar en donde crecen las bacterias. El gel se sumerge en un
amortiguador (buffer) y los fragmentos de ADN se cargan en un pozo de uno de los
extremos del gel y se permite que se muevan a travs del gel por aplicacin de una
corriente elctrica (Figura 11).

Figura 11. Gel de agarosa que muestra los fragmentos de ADN.

Esta tcnica se utiliza para purificar fragmentos especficos antes de clonarlos, la
porcin del gel que contiene el fragmento deseado se corta y se recupera el ADN
 41

eluyendo el amortiguador del gel o sometiendo el gel a electroforesis para sacarlo

(Smith y Wood, 1998).

En la figura 11, el ADN es producido por digestin del ADN del bacterifago (virus) I
con varias enzimas de restriccin. Pista 1: BamHI; pista 2: EcoRI; pista 3: PstI; pista 4:
HindIII. Los fragmentos ms pequeos de la pista 3 tienen 1.09 kb y el ms grande de la
pista 2 es de 21 kb.

Gel de poliacrilamida. La tcnica in vitro de mARN purificado muestra cules

protenas puede sintetizar a partir de los diferentes mARN, entre estas se encuentra la
protena del gen de inters, que puede identificarse con facilidad en un gel de
pilacrilamida (pista 1 de la Figura 12).

Figura 12. Separacin de ADN en gel de poliacrilamida por medio de

electroforesis.

Si el mARN se mezcla con ADN purificado del plsmido de uno de los clones de
cADN, entonces el cADN se hibridizar (aparear con bases) con el mRNA a partir del
cual se sintetiz (el cADN se copi del mARN, de modo que tiene que tener una
secuencia de bases complementaria), el ADN del plsmido solo se hibridizar a un tipo
de mARN porque provino de un clon, si se purifica el cADN del mARN restante, el
mARN hibridizado a l puede traducirse nicamente in vitro. Esto significa que solo
 42

aparecer una de las protenas en el gel de poliacrilamida, si esta protena es la que

codifica el gen deseado, entonces el ADN del plsmido utilizado debe ser un clon de ese
gen. Las pistas 3 a 10 de la figura 12 identifican los clones de cADN al menos para tres
protenas diferentes. La pista 2 es una mezcla estndar de protenas con Mr conocida
(Smith y Wood, 1998).

3.3 PCR

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) permite la amplificacin especfica de

segmentos de ADN que se encuentran en baja frecuencia en una mezcla compleja de
otras secuencias de ADN. En un PCR estndar, una enzima ADN polimerasa (Por
ejemplo taq polimerasa) y dos pares de iniciadores son usados. El iniciador 1 en
sentido 5 a 3 y el 2 en sentido reverso 3 a 5. Esos iniciadores son diseados para
hibridar en cadenas opuestas de la secuencia de inters. Una vez apareado, el iniciador
es reconocido por la polimerasa, iniciando la sntesis de la cadena complementaria. A
travs de una serie de ciclos repetidos de 2 3 pasos de diferente temperatura, los
iniciadores dirigirn la amplificacin de la secuencia millones de veces (Figura 13).

Gen blanco Ciclo 1 2 3 4

ADN templado

Figura 13. Amplificacin por PCR de un segmento de ADN.

El segmento amplificado puede ser visto en geles de agarosa y comparado contra

marcadores de peso molecular conocidos. Se han utilizado otro tipo de mtodos de
 43

separacin tales como cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) y electroforesis

capilar (CE). Diferentes cultivos han sido analizados por PCR, como trigo, canola, papa,
arroz, maz, jitomate. Un paso crucial y limitante para la PCR es la extraccin y
purificacin del ADN. Los lmites de deteccin estn en un rango de 20 pg a 10 ng de
ADN blanco y 0.0001 a 1% de la fraccin en masa de OGMs.

Diferentes mtodos pueden ser empleados para confirmar la amplificacin por PCR: (1)
corte especfico del producto amplificado con enzimas de restriccin especficas, (2)
hibridacin con una sonda especfica para la secuencia blanco, (3) Secuenciacin
directa del producto de PCR y (4) PCR anidado, en la cual dos juegos de iniciadores
ligan especficamente a la secuencia de inters, iniciando con el ms externo y luego
otro ms interno en la secuencia.

3.3.1 Variantes de PCR

Las metodologas con base a la PCR permiten identificar variaciones en la secuencia de

nucletidos dentro del fragmento de ADN amplificado, as como en las secuencias
aledaas o flancos que se utilizan para la amplificacin va PCR; de manera general, es
factible clasificar a las metodologas basadas en la PCR en tres tipos;

1. En el primero de ellos, se encuentran las que requieren secuencias conocidas

de amplificacin especfica como: los sitios de secuencia marcada (STS),
repeticiones de secuencia simple (SSR), amplicn alelo-especfico (ASA), y las
regiones de amplificacin de secuencia caracterizada (SCAR).
2. En el segundo grupo se encuentran aquellas que con base en la amplificacin
aleatoria de secuencias como son: el ADN polimrfico amplificado al azar
(RAPD), PCR por hibridacin arbitraria (AP-PCR), amplificacin de huellas
genticas de ADN (DAF), y las inter-secuencias de repeticin simple (ISSR).
3. En el tercer grupo se encuentran las tcnicas que exigen amplificacin selectiva
como: los polimorfismos conformacionales de cadena sencilla (SSCP) y los
poliformismo de la longitud de fragmentos amplificados (AFLP) (Guilln-
Andrade, 2004).

 44

3.5 Elisa

Las protenas se pueden detectar y cuantificar mediante un ensayo de

inmunoabsorcin asociada a enzimas. Los anticuerpos se pueden usar como reactivos
analticos especficos para la determinacin de la cantidad de una protena u otro
antgeno; la tcnica es el ensayo de inmunoabsorcin asociada a enzima (ELISA). Este
mtodo, se utiliza un enzima que reacciona con un sustrato incoloro de forma que
produce un producto coloreado; la enzima se une covalentemente a un anticuerpo
especifico que reconoce a un antgeno diana. S el antgeno esta presente, el complejo
enzima-anticuerpo se unir a l, y el componente enzimtico del complejo enzima-
anticuerpo catalizar la reaccin que generar el producto coloreado, as la presencia
del producto coloreado indica la presencia del antgeno. Este ensayo de
inmunoabsorcin asociada a enzima que es rpida e idnea puede detectar menos de
un nanogramo (10-9 g) de una protena. El ELISA se puede efectuar con anticuerpos
policlonales o monoclonales, pero el uso de anticuerpos monoclonales da resultados
ms fiables.

El ELISA indirecto se utiliza para detectar la presencia de anticuerpo y es la base de la
prueba para la infeccin de HIV, por ejemplo. La prueba HIV detecta la presencia de
anticuerpos que reconocen las protenas del ncleo vrico, el antgeno; la protena del
ncleo del virus, se absorben en el fondo de un pocillo. Los anticuerpos del paciente se
aaden a este pocillo revestido; solamente los pacientes infectados por el HIV tendrn
anticuerpos que se puedan unir al antgeno; finalmente anticuerpos unidos a enzima
contra anticuerpos humanos (por ejemplo, anticuerpos de cabra que reconocen
anticuerpos humanos) pueden reaccionar en el pocillo de forma que los anticuerpos
no unidos se liberan por lavado, se aade el sustrato. Una reaccin enzimtica sugiere
que los anticuerpos asociados a enzima estaban unidos a los anticuerpos humanos, lo
que implica que el paciente tena anticuerpo contra el antgeno vrico (Berg et al.,
2009).

3.6 Microarreglos

Conjunto ordenado de genes en una pequea superficie (10,000 muestras por cm2).
 45

Los microarreglos de DNA son una nueva herramienta de la biologa molecular y las
ciencias genmicas. Posiblemente es una de las aplicaciones ms importantes para la
informacin obtenida de la secuenciacin sistemtica de los genomas completos.

Bibliotecas genmicas.

Con la secuenciacin sistemtica de los genomas completos y los avances en la sntesis

artificial de DNA, ya sea por la reaccin en cadena de la polimerasa o la sntesis
qumica de desoxioligonucleotidos, actualmente es posible obtener en el laboratorio el
genoma completo de un organismo, generando cada uno de los marcos de lectura
abierta (ORF) completos o fragmentos de cada uno de ellos.

Actualmente se pueden adquirir las colecciones completas de los genes de varios

organismos como: Humano, Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisiae y E. coli,
por mencionar algunas.

Por lo general estas bibliotecas se depositan en microplacas de 384 pozos, en donde

podemos conocer la ubicacin exacta de cada uno de los genes. La informacin sobre
los genomas completos y las bibliotecas comerciales, se puede consultar en Internet,
(por ejemplo: http://www.yeastgenome.org/ ).

Los impresores de contacto, son los ms econmicos; su uso es relativamente sencillo

y no se requiere una gran infraestructura para fabricar microarreglos de DNA con estos
equipos. Bsicamente se trata de un brazo robtico con movimiento en los ejes X, Y y Z
y su caracterstica ms importante es poderse desplazar en cualquiera de estas
direcciones con una resolucin de una dcima de mm. Existen dos tipos de estos
robots: los primeros y ms sencillos en los que una superficie conteniendo las
laminillas sobre las que se va a imprimir, se desplaza en los ejes (X, Y) y la cabeza con
los aplicadores sube y baja en el eje Z depositando la muestra sobre la laminilla (Figura
14).

Para la impresin de los microarreglos es importante tomar en cuenta los siguientes

aspectos: de la biblioteca genmica que se desea imprimir se debe tener la mayor
cantidad de informacin de cada gen y esta informacin tiene que estar ordenada en
 46

una base de datos; el ADN que se va a imprimir, debe tener la misma calidad que se
requiere cuando se va a secuenciar; la cantidad de ADN de cada muestra debe ser la
misma y en una solucin con un contenido especifico de sales. Tambin se deben
controlar la humedad y la temperatura.

Una vez impresas las laminillas, el ADN debe ser fijado a la superficie. Esto se puede
lograr horneando los microarreglos a 80C por cuatro horas o con un entrecruzador de
Ramrez,
luz ultravioleta. Adicionalmente se delimita Chvez,
la regin Santilln
donde y Guzmnel
se encuentra
microarreglo
permiten tener y se
un mejor identifica
controlcada
sobrelaminilla,
el dimetro ya de
sea las
con un cdigo ydlae bdistancia
aplicaciones arras o entre
un numero
ellas.
Estas laminillas se pueden conseguir con diferentes recubrimientos como: poli-lisina, aminas y
se serie. las cuales permiten la unin qumica del DNA con la superficie (Figura 5).
aldehdos,

Z d

c
b
a Y

X
FiguraFigura 14. Dde
1. Diagrama iagrama de un
un impresor deimpresor de m
microarreglos deicroarreglos de ctipo
contacto. En este ontacto.
de robot la
superficie (c) conteniendo la microplaca con las muestras (a) y las laminillas (b), se desplaza
en las direcciones X y Y, mientras que la cabeza con los aplicadores (d) sube y baja,
Obtencin de Rlas
depositando NA
muestras , siguiendo el eje Z.

El aislamiento del RNA para su utilizacin en microarreglos, se deben tener en cuenta

d
los siguientes aspectos: obtenerlo lo ms concentrado posible; que la banda ribosomal
X
Z
grande sea al menos dos veces mas que la banda pequea (esta relacin permite tener
Y
una idea de la integridad del mRNA); se requieren al menos 30 g de RNA total para
realizar un experimento; no se requiere aislar el RNAm y puede no ser importante la
c mtodos para purificar RNA es
presencia de DNA genmico. En cuanto a los
b
recomendable utilizar kits comerciales. En la Figura 15 se muestra un ejemplo de RNA
total de levadura con las caractersticas mencionadas.
a
Figura 2. Diagrama de un impresor de microarreglos de contacto. En este tipo de robot la
superficie (c) conteniendo la microplaca con las muestras (a) y las laminillas (b) es fija,
mientras que la cabeza con los aplicadores (d) es un brazo mecnico con movimiento en las
tres direcciones (X, Y y Z).
 Ramrez, Chvez, Santilln y Guzmn

Los puntos verdes o tonalidades entre el amarillo y el verde sern aquellos genes que
disminuyeron su expresin. Y finalmente los puntos amarillos representan a los genes que en
47
ambas condiciones se expresan de igual forma.

DNA GENOMICO
RNA RIBOSOMAL 28S
RNA RIBOSOMAL 18S

RNA TRANSFERENCIA

Figura 6. Fotografa de RNA total de levadura, corrido en un gel desnaturalizante de agarosa
Figura
1%.15. Fotografa de RNA de levadura, corrido en un gel desnaturalizante de

agarosa al 1%.

Marcado del RNA

1 2 3 4 5
RNAtotal { 1 Marcado con Cy3
Para el marcado del RNA (sonda) se utiliza la sntesis
2 Marcadoin vitro con
de cDNA
Cy5 de cadena
3 Vacio
sencilla. En los mtodos ms comunes;
mRNA se coloca
{ 4 Marcado con Cy3
el RNA total junto con un
deoxioligonucletido poli T y un conjunto de hexmeros
5 Marcado al azar,
conpermitiendo
Cy5 que
reconozcan sus sitios en el RNA mensajero. Posteriormente se agregan los
desoxinucletidos A, Cde
Figura 7. Imagen , Gfluorescencia
y T, mas ude
na lasproporcin de desoxinucletido
sondas marcadas T mrojo
con los fluorforos Cy3 arcado
y Cy5 con
verde, corridas en un gel desnaturalizante de poliacrilamida de 12.5%.
una molcula fluorescente (comercialmente se pueden obtener dUTP-Cy3, dUTP-Cy5,
dUTP-alexa3 y dUTP-alexa5; tambin se pueden obtener los mismos fluorforos unidos
a dCTP). A la mezcla se agrega transcriptasa inversa que sintetiza el cDNA a partir del
mRNA, incorporando el desoxinucletido T marcado en dos reacciones estndar.
Finalmente el cDNA marcado se purifica para eliminar el desoxinucletido fluorescente
no incorporado al cDNA y se tiene la sonda marcada, lista para probarla en un
microarreglo. En la Figura 16 se muestra un gel de electroforesis en el que se corrieron
Figura 8. Fotografa de una cmara de hibridizacin para microarreglos.
RNA total y RNA mensajero, marcados con los fluorforos descritos.
103
La hibridizacin de un microarreglo no difiere significativamente de las condiciones
que comnmente se utilizan para un experimento tipo Southern o Northern,
dependiendo del experimento, se fijar la temperatura y la astringencia de la solucin
de hibridizacin. Las diferencias ms importantes entre una hibridizacin tipo
Southern o Northern y una en microarreglos son: que el volumen de hibridizacin no
 DNA GENOMICO
RNA RIBOSOMAL 28S
RNA RIBOSOMAL 18S 48

RNA
es mayor a 50 l, no se requiere agitacin TRANSFERENCIA
y en un microarreglo se prueban dos
condiciones o sondas simultneamente, es decir se compara la condicin control,
contra la experimental en el mismo experimento (Flores et al., 2003).
Figura 6. Fotografa de RNA total de levadura, corrido en un gel desnaturalizante de agarosa
1%.

1 2 3 4 5
RNAtotal { 12 Marcado con Cy3
Marcado con Cy5
3 Vacio
mRNA { 4 Marcado con Cy3
5 Marcado con Cy5

Figura 7. Imagen de fluorescencia de las sondas marcadas con los fluorforos Cy3 rojo y Cy5
Figura verde, corridasden
16. Imagen e fun gel desnaturalizante
luorescencia de las desondas
poliacrilamida de 12.5%.
marcadas con los fluorforos Cy3 rojo
y Cy5 verde, corridas en un gel desnaturalizante de poliacrilamida de 12.5%.

3.7 Marcadores genticos (RFLPs, RAPDs, AFLPs)

En aos recientes, con el progreso de la biologa molecular, principalmente con el

desarrollo de la PCR, se han desarrollado poderosas herramientas que pueden ser
utilizadas para el Figura
anlisis, caracterizacin
8. Fotografa de una cmaray evaluacin de para
de hibridizacin la diversidad
microarreglos.gentica; una
gran variedad de tcnicas puede ser utilizada para detectar polimorfismos en el nivel
103
de ADN, de hecho, la desconcertante similitud de la coleccin de las tcnicas
disponibles, es uno de los primeros problemas a encarar por los usuarios,
considerando las aplicaciones de estas tcnicas para su propio sistema. Esta coleccin
de tcnicas est dentro de dos categoras con respecto a la estrategia bsica: a)
Tcnicas no basadas en PCR, y b) Tcnicas basadas en PCR. En el primer caso, el anlisis
del polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLPs), fue la primera
tecnologa desarrollada que posibilit la deteccin de polimorfismos en el nivel de
secuencia.

El polimorfismo detectado por este tipo de marcadores, se interpreta como la

variacin en la longitud de los fragmentos de ADN cortado por las enzimas de
 49

restriccin y en la hibridacin especfica de la sonda. Estos marcadores son

considerados clsicos por lo ampliamente utilizados y por la consistencia que han
mostrado en diferentes especies vegetales.

RAPDs. ste mtodo consiste en detectar fragmentos de ADN y lo hace directamente

despus de separar los fragmentos de ADN amplificados en un gel de agarosa,
utilizando un compuesto que hace fluorecer al ADN bajo la luz ultravioleta.

AFLPs. Este mtodo involucra una amplificacin de ADN genmico, pero en este caso
las secuencias analizadas no son al azar, sino dirigidas a los sitios de corte de enzimas
de restriccin. Primero se corta el ADN con dos de estas enzimas y en seguida se une a
adaptadores especiales. Los iniciadores utilizados en la reaccin de amplificacin
tienen homologa y se unen especficamente a estos adaptadores; de nuevo se lleva a
cabo la reaccin de PCR, amplificando muchas regiones del genoma. El iniciador est
marcado radioactivamente y se detectan los fragmentos amplificados por
autorradiografa, despus de haberlos separado en un gel de poliacrilamida.

3.8 Clonacin

El trmino clona, del griego kov (klon), significa retoo o vstago; se acu para hacer
referencia a la multiplicacin de una planta mediante el podado y plantado de una
rama, (propagacin asexual sin intercambio de material gentico. Mediante la
clonacin se obtienen de plantas hijas con la misma herencia que la planta
progenitora, de aqu cuando se obtienen organismos genticamente idnticos, se dice
que son clonas idnticas. Se han desarrollado varios procesos de clonacin en diversos
organismos, y popularmente, el trmino clonacin molecular de ADN implica la
manipulacin dirigida del material gentico por recombinacin de ADN in vitro, y su
multiplicacin dentro de una clula hospedera donde se sintetizan copias idnticas
(Balbs, 2002).

Hay tres etapas en el proceso de clonacin de genes:

1. Seleccionar la fuente de ADN para clonacin. La fuente de ADN para clonacin

pueden ser los cromosomas de ADN o una copia de ADN de un mARN o
 50

llamado ADN complementario o cADN; la seleccin depende del problema en

particular que se va tratar. Si un aminocido de la secuencia de la protena es
interesante, esta informacin puede ser obtenida ms fcilmente de la
secuencia de nucletidos de un cADN clonado; si es interesante un gene que
regula la expresin o la secuenciacin de genes no contienen la informacin en
el mARN; entonces esta informacin puede ser obtenida solamente de genes
clonados de ADN cromosomal.
2. La segunda etapa es para producir una coleccin de fragmentos de ADN que
puede ser insertado dentro de vectores apropiados. Esos fragmentos de ADN
cromosomal usando una endonucleasa de restriccin de mARN usando la
enzima transcriptasa reversa para producir molculas de cADN; cada molcula
de cADN es una copia de uno solo mARN, los vectores con los fragmentos
insertados son introducidos dentro de poblaciones de bacterias que pueden
crecer en cajas Petri con agar debido a que las bacterias llevan genes
resistentes a antibiticos, solo que esas bacterias contienen plsmidos que
crecern cuando el medio de cultivo contienen el antibitico; cada clula de la
bacteria resistente crecer en forma de colonias. De tal forma que una
coleccin de fragmentos de ADN clonado de bacterias propagadas es llamado
biblioteca. Idealmente esta biblioteca genmica puede contener todas las
secuencias representativas de ADN cromosomal o de molculas de cADN de
todos los diferentes mARN.
3. Esta biblioteca es una biblioteca fuera de un catlogo para decir cul clon
contiene una secuencia particular y se maneja como una pantalla de todas las
colonias bacterianas para la secuenciacin de inters. Se puede directamente
en la pantalla conocer la secuenciacin usando una sonda complementaria de
cidos nucleicos. Parte de esa secuencia puede ser conocida de forma
inmediata o puede ser deducido de la secuencia de aminocidos de la protena
purificada; alternativamente se puede monitorear para la protena producida
por un gene clonado usando antibiticos para la protena o usando un ensayo
para la funcin de la protena (Watson et al., 1998).

 51

3.9 Southern, Western y Nothern blot

El mtodo Southern. Este tipo de anlisis representa una de las ms poderosas

herramientas disponibles para la caracterizacin de plantas transgnicas. La
informacin que se obtiene con esta tcnica depende de algunos factores como los
que se puede mencionar los siguientes: Complejidad de la insercin del transgen, el
nmero de copias presentes del transgen, el estado de integracin y el nmero de los
sitios cromosmicos en donde el transgen se ha insertado.

Para determinar el nmero de copias del transgen se utiliza la siguiente frmula:

Tamao del plsmido (pb) = ADN equivalente a una copia del transgen en la planta.

Tamao del genoma veg. (pb) Cantidad de ADN vegetal usado en la reconstruccin

Se basa en cortar el ADN genmico del organismo y se separa en un gel de agarosa, el

ADN se desnaturaliza y se transfiere a una membrana de nylon para facilitar su
manipulacin. Por otra parte, se prepara una sonda especfica para la secuencia de
inters y se marca con radioactividad o con mtodos no radioactivos. La sonda se
incuba con la membrana y debido a la propiedad del ADN de aparearse con su
secuencia homloga, la sonda se queda adherida a la membrana en el lugar en donde
se encuentran los fragmentos homlogos del genoma de la planta. Las regiones de
apareamiento se detectan como bandas cuando la membrana se expone a una parte
de rayos X. Las bandas forman huellas caractersticas. La electricidad causa que la
molcula se mueva a travs del gel a velocidad inversamente proporcional a su
tamao; despus de ser fraccionado los segmentos separados son pasados a una
nueva membrana de nylon manteniendo en la misma posicin que en el gel.

Ejemplo:

TAGGCATC Sonda

ACTAATCCATAGCTTA Fragmento de ADN genmico.

El anlisis Southern puede ser utilizado para proporcionar evidencia de la integracin

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del transgen aunque se debe tener cuidado al evaluar los resultados. El anlisis es muy
simple cuando el material que est siendo evaluado fue producido utilizando
Agrobacterium ya que el ADN-T del borde derecho proporciona un empalme definido
entre el vector y el ADN de la planta. En este caso la presencia de bandas mltiples
tambin puede resultar de un rearreglo del transgen (Guilln-Andrade, 2004).

Western blot. La prueba para una protena especfica, se realiza con anticuerpos
debido a que estos contienen una especie de combinacin llave-cerradura con el
antgeno. La mezcla de protena es pasado por electroforesis y posteriormente
transferida a una membrana. La posicin de una protena especfica sobre la
membrana es revelada mediante la inmersin de la membrana en una solucin de
anticuerpo obtenida de un conejo por ejemplo, en el cual la protena se ha inyectado;
la posicin de la protena es revelada por la posicin de la marca que porta el antgeno.

Northern blot. Con esta tcnica, el ARN es inmovilizado sobre una membrana de nylon
y es detectada a travs del uso de sondas marcadas de ARN o ADN; las modificaciones
hechas de Southern a Nothern blotting, incluyen las diferencias en las propiedades
fsicas del ADN y ARN, las ms importantes de estas es que las molculas de ARN son
cadenas sencillas ms que de doble cadena, esto resulta en:

a) El apareamiento de bases entre regiones cortas de secuencias

complementarias causa que la molcula de ARN plegada en un gel de agarosa,
depender no solamente de su longitud sino tambin de lo extenso del
plegamiento; la molcula ms compacta migrar con mayor velocidad.
b) El apareamiento intermolecular de bases entre secuencias complementarias de
diferentes molculas de ARN, causar agregacin del ARN.

Diferencias entre ADN y ARN.

1. Las molculas de ARN debern de estar completamente desplegadas durante la

electroforesis mediante la adicin de agentes desnaturalizantes apropiados.
2. Una segunda diferencia entre el ADN y el ARN, es que el ARN es mucho ms
propenso a la degradacin por enziams; un acomplicacin adicional es que las
ribonucleasas (ARNasas), que son las enzimas que degradan el ARN, son
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extraordinariamente estables y se deben de tener cuidados para evitar la

contaminacin con estas enzimas en cualquier estado del proceso.
3. Una tercera diferencia entre el ADN y el ARN es que el ARN es mucho ms
sensitivo a la hidrlisis por cidos o lcalis. Esto es particularmente importante
para usar soluciones adecuadas con capacidad de amortiguamiento cuando se
maneja el ARN.

Los anlisis de Nothern blotting permite ver si los ARNm especficos estn presentes en
la supuesta planta transgnica como tambin nos da una indicacin de su abundancia
y permite la estimacin del tamao del ARNm. Este tipo de anlisis proporciona una
medida de los niveles de ARNm especifico, en una clula en particular o en un tipo de
tejido. Estos niveles son determinados por la tasa de transcripcin y por la tasa de
degradacin del ADN; de esta forma, si el anlisis revela que una especie de ARN es 10
veces ms abundante en una planta trensgnica que en otra, esto indicara cualquiera
de los siguientes puntos:

El gene correspondiente es transcrito ms eficientemente en la primera planta

transgnica.

Las especies de ARN son ms estables en la primera planta transgnica.

Que ambos incrementos, la transcripcin y la estabilidad actan para incrementar los

niveles de ARN en el primer tipo de clula (Guilln-Andrade, 2004).

3.10 Secuenciacin

Hoy en da existe una gama amplia de mtodos para determinar la secuencia

nucleotdica de los genes. En los ltimos 5 aos ha habido una gran explosin de
plataformas tecnolgicas de secuenciacin. Estas permiten secuenciar genomas
completos en una sola corrida. A continuacin presentamos algunos de los mtodos
clsicos y explicamos los principios en que se basan las tecnologas modernas.

Mtodo Sanger
El mtodo Sanger moderno se basa en la separacin por electroforesis capilar de una
sola reaccin de PCR con nucletidos dideox marcados con fluorforos. Con el tiempo
 3.3.1. Sanger
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El mtodo Sanger moderno se basa en la separacin por electroforesis capilar de u
reaccin de PCR con nucletidos dideox marcados con fluorforos. Antes se
radioactividad, y adems se usaban cuatro reacciones separadas en donde se le agreg
se mejor la tcnica al usar nucletidos marcados con cuatro fluorforos que pueden
un nucletido dideox, el cual terminaba la amplificacin y no dejaba que se extendiera a
ser
cadenadistinguidos
con ese por nucletido
el uso de en
laser con diferentes
especfico. Cadalongitudes una de estasde excitacin y la
cuatro reacciones se cargab
carril por separado y despus se corra en geles de acrilamida.
deteccin con varios filtros de emisin. De esta forma, se puede correr la reaccin en Con el tiempo se m
tcnica al usar nucletidos marcados con cuatro fluorforos diferentes que pue
un distinguidos
solo tubo capilar,
por m elejorando
uso de m ucho con
laser la resolucin
diferentes y la longitudes
economa del
demexcitacin
todo (Figura
y la deteccin co
filtros de emisin. De esta forma, se puede correr la reaccin en un solo tubo capilar, me
17).
mucho la resolucin y la economa del mtodo (Figura 3-6).

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Figura 3-6. Secuenciacin por Sanger con nucletidos fluorescentes.
Figura 17. Secuenciacin por Sanger con nucletidos fluorescentes.

3.3.2. Pirosecuenciacin
Secuenciacin en tiempo real ms rpido, eficiente y masivo que
el mtodo Sanger. El mtodo de pirosecuenciacin se basa en la
liberacin de PPi por cada nucletido incorporado por la
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1. Precursor. Una cadena de ADN puede ser secuenciada ponindola en un

tubo con una enzima para activar la sntesis de ADN y los cuatro trifosfatos
precursores (de color negro, A, T, C y G); tambin se aaden pequeas
cantidades de qumicos similares para cada uno de los trifosfatos
precursores para el crecimiento de la cadena, pero no puede enlazarse en el
siguiente precursor, cada uno de los cuatro tipos de precursores anormales
estn marcados con colores diferentes fluorescentes como: rojo la A, verde
T, azul C y naranja G.
2. Sntesis de ADN. La sntesis de ADN es procesado cuando un precursor
normal de color negro es agragado al template y la cadena se mantiene en
crecimiento, cuando por azar un precursor anormal se agrega en su lugar, la
sntesis de la cadena se detiene, dejando una cadena corta para que la
cadena empiece a secuenciar. Cada cadena es un nucleotido largo o corto en
relacin a los dems; cada secuencia corta se marca la molcula al final con
fluorescencia.
3. Electroforesis. Los segmentos pueden ser separados por tamaos usando
electrophoresis, el tiempo que ocurre depende del fragment que consiste en
el cebador adems de un solo nucleotide (A rojo), podra viajar ms lejos.
Los fragmentos compuestos por el cebador ms dos nucletidos (A negro
ms T verde) podran no emigar tan lejos.
4. Lectura de la secuenciacin. Un detector fluorescente lee cada banda de
gel detectando el color de la banda marcada (Tiesen, 2009).