Ao de la consolidacin del Mar de Grau

UNIVERSIDAD NORBERT WIENER

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE

FARMACIA Y BIOQUMICA

CONTROL MICROBIOLOGICO DE LOS MEDICAMENTOS

PRACTICA N3: CULTIVO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE

BACTERIAS GRAM (+) DE IMPORTANCIA MEDICA E INDUSTRIAL:
COCOS Y BACILOS GRAM (+).

INTEGRANTES:
Curipaco La Riva, Jose.
Gamboa Salcedo, Dennis.
Guimarey Martn, Tatiana.
Reategui Curimozon, Judy.

SECCIN : FB6N1
TURNO : Noche.
NOMBRE DE DOCENTE: Gallardo Teresa.
FECHA DE ENTREGA: 26-09-12016

LIMA - PERU
 I. MARCO TEORICO
Staphylococcus

Es un gnero de bacterias estafilococceas de la clase Cocci. Comprende

microorganismos que estn presentes en la mucosa y en la piel de los humanos y de
otros mamferos y aves, incluyendo a 35 especies y 17 subespecies, muchas de las
cuales se encuentran en los humanos.

Caractersticas generales

Morfolgicamente los Staphylococcus son cocos grampositivos. Los estafilococos

crecen fcilmente sobre casi todos los medios bacteriolgicos, en cultivos su
crecimiento es mejor en el medio sal manitol y agar sangre. Es un coco anaerobio
facultativo, esto significa que puede crecer tanto en condiciones con oxgeno como
carente de ste. Su mayor velocidad de crecimiento es a 5 - 25 C; pero tambin se
puede ver en activa fisin binaria entre 30 y 27 C. Adems, producen catalasa, lo que
los diferencia de los estreptococos. Tiene importancia mdica principalmente el S.
aureus, y en humanos adems de ste, el S. saprophyticus y el S. epidermidis.

Estudio de los Estafilococos

La patogenia de una especie de Estafilococos, se determina por produccion de

hemolisina.Fermentacin del mannitol y produccion de las enzimas coaguladas y
desoxiribonucleasa.

Streptococcus

El gnero Streptococcus es un grupo de bacterias formado por cocos grampositivos

pertenecientes al filo firmicutes1 y al grupo de las bacterias cido lcticas. Estas
bacterias crecen en cadenas o pares, donde cada divisin celular ocurre a lo largo de un
eje. De all que su nombre, del griego streptos, significa que se dobla o
retuerce con facilidad, como una cadena. Los Streptococci son oxidasa y catalasa
negativos.
Las especies conocidas de estreptococus que producen enfermedades a humanos son:
Estreptococos del grupo A: Streptococcus pyogenes producen amigdalitis e imptigo.
Estreptococos del grupo B: Streptococcus agalactiae producen meningitis en neonatos y
trastornos del embarazo en la mujer.
Neumococo: Streptococcus pneumoniae es la principal causa de neumona adquirida en
lacomunidad.
Streptococcus viridans es una causa importante de endocarditis y de abscesos dentales.
Streptococcus mutans causa importante de caries dental. Pertenece al grupo de
estreptococos viridans.

Caractersticas
La mayora de las especies de Streptococcus son anaerobios facultativos, y algunos
crecennicamente en una atmsfera enriquecida con dixido de carbono (crecimiento
capnoflico).
Sus exigencias nutricionales son complejas, y su aislamiento requiere el uso de
mediosenriquecidos con sangre o suero. Son capaces de fermentar carbohidratos
produciendo cido lctico y tambin son catalasa negativos a diferencia de los
estafilococos.

Estudio de los Estreptococos

Agrupados originalmente por su capacidad para producir lisis de los hemates, as

tenemos los estreptococos alfa, beta y gama hemolticos, segn sea la lisis parcial, total
o nula. Existen varias pruebas especficas para el estudio de estos microorganismos
comoson:
- Prueba de la bacitracina, que se usa para la diferenciacin de un estreptococo Beta
hemoltico del Grupo A, de los Beta hemolticos del Grupo No A.
- Prueba de CAMP, que se usa para la diferenciacin de un estreptococo beta hemoltico
Grupo A, del estreptococo beta hemoltico grupo B.
- Prueba de la catalasa, para evidenciar la presencia de esta enzima sobre el perxido de
hidrgeno.
- Prueba de Optochin, para evidenciar la sensibilidad del S. pneumoniae al
Optochin del y la resistencia del S. viridans

II. MATERIALES Y EQUIPOS:

Porta objetos
Reactivo cristal violeta
Reactivo Lugol
Alcohol o acetona
Safranina
Placas con agar sangre
Placas con agar manitol salado
Cultivo de: Staphylococcus aureus
Al examinar una muestra con un microscopio, la calidad de imagen es evaluada por las
siguientes caractersticas: brillo, enfoque, contraste y resolucin. Brillo: define la
intensidad de luz u oscuridad en una imagen. La luminosidad se relaciona con el sistema
iluminacin y puede ser alterado cambiando la tensin de la lmpara (restato) y
ajustndose el condensador y las aberturas del diafragma o el agujero perforado con la
aguja. La luminosidad tambin se relaciona con la apertura numrica de la lente cuanto
mayor es la abertura, ms brillo ofrecer la imagen-. Foco: la imagen puede ser borrosa
o ntida. El foco se relaciona con la longitud focal y puede ser manejado con los botones
de enfoque. El espesor de la lmina de vidrio en la muestra tambin puede afectar a una
imagen focal buena, siendo demasiado gruesa para la lente. Por tanto, con un espesor
correcto se puede mejorar esta caracterstica. Resolucin: se refiere a la distancia
mnima entre dos puntos en la imagen a partir de la cual ellos pasan a ser vistos como
un nico punto. La resolucin se relaciona con la apertura numrica de la lente (cuanto
mayor es la apertura numrica, mejor ser la resolucin) y la longitud de onda de luz
que pasa a travs de las entes (cuanto ms corto sea la longitud, mejor resolucin).
Contraste: este valor indica la diferencia en luminosidad entre reas adyacentes del
espcimen.
III. PROCEDIMIENTO:

1. Aplicar una gota de agua destilada en la lmina porta objetos. Luego con el asa de
kolle esterilizado previamente se extrae una colonia y expande en la gota de agua,
luego secar en el mechero en cortes laterales.

2. Se cubre el frotis con cristal violera por 1 min y posteriormente se lava.

3. Se cubre con lugol por 1 min y posteriormente se lava.

4. Luego se decolora con alcohol acetona

 5. Finalmente se cubre con la solucin zafranina por 30 seg.

6. Se seca el porta objeto y se observa en el microscopio.

FUNDAMENTOS:

GRAM POSITIVA STAPHYLOCOCCUS

En microbiologa, se denominan bacterias gram positivas, o bacterias Gram-positivas,
aquellas bacterias que se tien de azul oscuro o violeta por la tincin de Gram.
Esta caracterstica qumica est ntimamente ligada a la estructura de la envoltura
celular, por lo que refleja un tipo natural de organizacin bacteriana. Son uno de los
principales grupos de bacterias, y cuando se tratan como taxn se utiliza tambin el
nombre de Posibacteria.
La envoltura celular de las bacterias grampositivas comprende la membrana
citoplasmtica y una pared celular compuesta por una gruesa capa depeptidoglucano,
que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmtica mediante
molculas de cido lipoteicoico. La capa depeptidoglicano confiere una gran resistencia
a estas bacterias y es la responsable de retener el tinte durante la tincin de Gram. A
diferencia de las bacterias grampositivas, las gramnegativas presentan una segunda
membrana lipdica externa a la pared celular.
Incluyen especies tanto mviles (va flagelos) como inmviles con forma
de bacilo (Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Lactobacillus, Listeria)
o coco(Staphylococcus, Streptococcus); con gruesas paredes celulares o sin ellas
(Mycoplasma). Algunas especies son fotosintticas, pero la mayora son hetertrofas.
Muchas de estas bacterias forman endosporas en condiciones
desfavorables.4 Realmente, no todas las bacterias del grupo son gram positivas (no se
tien por la aplicacin de ese mtodo), pero se incluyen aqu por su similitud molecular
con otras bacterias gram positivas.

Bacterias grampositivas Bacillus anthracis (bastones prpuras) en una muestra de fluido

cerebroespinal. Las otras clulas son leucocitos.
La clula bacteriana est rodeada por una envoltura que, observada al microscopio
electrnico, se presenta como una capa gruesa y homognea, denominada pared celular.
Luego en seccin (corte) se observa una estructura semejante a dos lneas paralelas
separando una capa menos densa; esto corresponde a la membrana plasmtica. Entre
la membrana plasmtica y la pared celular se encuentra el periplasma o espacio
periplasmtico. En el interior de la membrana plasmtica se encuentra el citoplasma que
est constituido por una disolucin acuosa, el citosol, en el cual se
encuentran ribosomas y otros agregados de macromolculas, y en el centro se ubica la
zona menos densa llamada nucleoide, que contiene una madeja de hebras difcil de
resolver (distinguir) y cuyo principal componente es el ADN.

El gnero Staphylococcus est formado por cocos Gram positivos, con un dimetro de
0.5 a 1.5 m, agrupados como clulas nicas, en pares, ttradas, cadenas cortas o
formando racimos de uvas.
GRAM NEGATIVA SALMONELLA
En microbiologa, se denominan bacterias gramnegativas aquellas que no se tien
de azul oscuro o de violeta por la tincin de Gram, y lo hacen de un color rosado tenue:
de ah el nombre de "gramnegativas" o tambin "Gram-negativas".
Esta caracterstica est ntimamente ligada a la estructura didrmica dada por
la envoltura celular, pues presenta doble membrana celular (una externa y la otra
citoplasmtica), lo que refleja un tipo natural de organizacin bacteriana. Son uno de los
principales supergrupos debacterias, y cuando se tratan como taxn se utiliza tambin el
nombre de Negibacteria o Didermata. Las restantes son las bacterias grampositivas.
Las bacterias gramnegativas presentan dos membranas lipdicas entre las que se localiza
una fina pared celular de peptidoglicano, mientras que las bacterias grampositivas
presentan slo una membrana lipdica y la pared de peptidoglicano es mucho ms
gruesa. Al ser la pared fina, no retiene el colorante durante la tincin de Gram.
Muchas especies de bacterias gramnegativas causan enfermedades.
Algunos cocos gramnegativos causan la gonorrea (Neisseria gonorrhoeae),
la meningitis (Neisseria meningitidis) y sntomas respiratorios (Moraxella catarrhalis),
entre otros.
Los bacilos gramnegativos incluyen un gran nmero de especies. Algunos de ellos
causan principalmente enfermedades respiratorias (Haemophilus influenzae, Klebsiella
pneumoniae , Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa), enfermedades
urinarias (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia
marcescens) y enfermedades gastrointestinales (Helicobacter pylori, Salmonella
enteritidis, Salmonella typhi). Otros estn asociadas a infecciones
nosocomiales (Acinetobacter baumanii).
Estructura
La envoltura celular de las bacterias gramnegativas est compuesta por una membrana
citoplasmtica (membrana interna), una pared celular delgada depeptidoglicano, que
rodea a la anterior, y una membrana externa que recubre la pared celular de estas
bacterias.4 Entre la membrana citoplasmtica interna y la membrana externa se localiza
el espacio periplsmico, relleno de una sustancia denominada periplasma, la cual
contiene enzimas importantes para la nutricin en estas bacterias. Retienen la safranina.
La membrana externa contiene diversas protenas; entre ellas, las porinas o canales
protecos que permiten el paso de ciertas sustancias. Tambin presenta unas estructuras
llamadas lipopolisacridos (LPS), formadas por tres regiones: el polisacrido O
(antgeno O), una estructura polisacrida central (KDO) y el lpido A (endotoxina).
Las bacterias gramnegativas pueden presentar una capa S que se apoya directamente
sobre la membrana externa y no sobre la pared de peptidoglicano, como sucede en las
grampositivas. Si presentan flagelos, estos tienen cuatro anillos de apoyo en lugar de los
dos de las bacterias grampositivas porque tienen dos membranas. No presentan cidos
teicoicos ni cidos lipoteicoicos, tpicos de las bacterias grampositivas. Las
lipoprotenas se unen al ncleo de polisacridos, mientras que en las bacterias
grampositivas estos no presentan lipoprotenas. La mayora no forma endosporas
(Coxiella burnetti, que produce estructuras similares a las endosporas, es una notable
excepcin).

IV. CUESTIONARIO:

1. Qu factores condicionan la patogenicidad del S. aureus en comparacin

con otras especies de estafilococos?

Los factores de patogenicidad con que cuenta el S. aureus. Se pueden dividir en

tres grupos:

a) Componentes de la pared celular: La pared celular est compuesta por una

gruesa capa de peptidoglicano. El polmero polisacrido bsico se halla tambin en
muchos otros microorganismos, mientras la cadena de unin cruzada de
pentaglicina parece ser especfica de S. aureus. Tiene como funcin mantener la
rigidez de la pared bacteriana y su resistencia osmtica. En la patogenia
coadyuvara al desencadenamiento de la inflamacin por activacin del
complemento, es capaz de atraer leucocitos polimorfonucleares (PMN), estimula la
produccin de anticuerpos opsonizantes y tiene actividad similar a las endotoxinas
de Gram negativos. El otro componente mayor de la pared son los cidos teicoicos,
que constituyen alrededor del 40% del peso de la pared. Estos cidos son polmeros
de glicerol o ribitol fosfato, azcares y algunas veces, D-alanina. Estn unidos en
forma covalente al peptidoglicano. Cuando estn unidos a la membrana
citoplasmtica se les llama cidos lipoteicoicos. S. aureus posee
predominantemente cidos de ribitol fosfato, mientras que en los estafilococos
coagulasa negativos estos son de glicerol fosfato. La presencia de cpsula es
variable pero es importante a nivel patognico, ya que tiene propiedades
antifagocticas. Las cepas de S. aureus que poseen cpsula son ms virulentas en
modelos animales. No es claro que la cpsula de S. aureus juegue un papel
importante en la adherencia. Lo que si se conoce es que la adherencia de este
germen a la vlvulas cardacas y cuerpos extraos esta mediada en parte, por
receptores de fibronectina en su superficie. La fibronectina es una glicoprotena
importante en varias funciones de adherencia. Las cepas de S. aureus, que muestran
grandes cantidades de receptores para la fibronectina, parecen ser ms invasivas y
ms hbiles para adherirse. Adems S. aureus puede presentar en su superficie
receptores para el colgeno. La pared celular de S. aureus posee una protena
caracterstica llamada protena A. Esta tiene la habilidad de unirse a la porcin Fc
de las molculas de inmunoglobulina G (IgG), y por tanto funciona como factor de
virulencia, ya que interfiere con la opsonizacin y la ingestin de los
microorganismos por los PMN, activando el complemento y dando lugar a
reacciones de hipersensibilidad inmediata y tarda. Esta protena es inmunognica y
se hallan anticuerpos contra ella en sujetos con infecciones graves por S. aureus.

b) Enzimas:
Catalasa: podra funcionar inactivando algunos sistemas de ingestin de los PMN.
Coagulasas: tanto la coagulasa libre como el llamado clumping factor actan
cubriendo a la clula de fibrina y por tanto hacindola ms resistente a la
opsonizacin y fagocitosis.
Estafiloquinasas: degradan la fibrina y contribuyen a la invasin de tejidos
vecinos.
Hialuronidasa: hidroliza la matriz intracelular de mucopolisacridos de los tejidos
y por tanto contribuye a la diseminacin a tejidos adyacentes.
Lipasas: las cepas de S. aureus productoras de forunculosis crnica son potentes
productoras de lipasas que ayudan al microorganismo a diseminarse por los tejidos
cutneo y subcutneo.
Fosfolipasa C: esta enzima est asociada con cepas recuperadas de pacientes con
distrs respiratorio del adulto y coagulacin intravascular diseminada (eventos que
ocurren durante la sepsis). Aparentemente los tejidos afectados por esta enzima se
vuelven ms susceptibles al dao y destruccin por componentes bioactivos del
complemento y sus productos durante su activacin.
S. aureus produce adems, toda una serie de enzimas como las DNAsas, proteasas
y fosfatasas que colaboran en el proceso infeccioso y en la produccin de lesiones.

c) Toxinas: S. aureus puede producir toxinas de accin general como las

hemolticas (, , y ) y la leucocidina, y tambin toxinas especializadas como las
exfoliatinas, toxina del shock txico y enterotoxinas. Las hemolisinas son
importantes toxinas citolticas sobre una variedad de clulas.
hemolisina o toxina: tiene efecto letal sobre una variedad de membranas
celulares eucariotas, incluyendo la de PMN humanos, as como tambin la de
eritrocitos de diferentes especies animales. Es dermonecrtica si se inyecta en
forma subcutnea y es letal para animales si se administra en forma intravenosa. Es
responsable de la zona de hemlisis observada alrededor de las colonias de S.
aureus.
hemolisina: es una esfingomielinasa activa sobre diferentes clulas: leucocitos,
eritrocitos, fibroblastos.
y hemolisinas: se encuentran en algunas cepas de S. aureus y lisan una
variedad de clulas diferentes.
Leucocidina: es una exotoxina con efecto txico directo sobre las membranas de
los PMN humanos, causando degranulacin del citoplasma, hinchamiento celular y
lisis. El modo de accin de esta toxina comprende la formacin de poros que
alteran la permeabilidad celular para el potasio y otros cationes. Una inyeccin de
esta toxina en modelos animales produce una disminucin severa del nmero de
leucocitos.
Exfoliatinas o toxinas epidermolticas: son producidas por algunas cepas de S.
aureus y consisten en dos protenas, bioqumica e inmunolgicamente diferentes,
pero con funciones biolgicas similares. La exfoliatina A es un producto de genes
cromosmicos, termoestable y es inactivada por el EDTA, mientras la exfoliatina B
es de origen plasmdico, es inactivada por el calor y estable frente al EDTA. Ambas
tienen actividad proteoltica, actan como superantgenos y disuelven la matriz
mucopolisacrida de la epidermis, resultando en la separacin intraepitelial de las
uniones en el estrato granuloso. Las cepas productoras de una o ambas protenas
son responsables del sndrome de piel escaldada (ver ms adelante).
Enterotoxinas: se trata de molculas termoestables responsables de la
intoxicacin alimentaria producida por algunas cepas S. aureus. El modo de accin
de estas toxinas no es an conocido pero se sabe que aumentan el peristaltismo.
Toxina del shock txico (TSST-1): Es tambin denominada como enterotoxina F.
Est implicada en la patogenia del sndrome del shock txico. Aunque su rol es
poco claro tiene una gran cantidad de actividades biolgicas. En modelos animales
potencia la actividad letal de pequeas cantidades de endotoxina.

Con respecto a la patogenicidad, el S. epidermidis es capaz de producir

macromolculas de superficie y extracelulares, que inician y luego aumentan la
adhesin bacteriana a la superficie plstica de cuerpos extraos. La adherencia
inicial de S. epidermidis parece estar mediada por una adhesina polisacrida
llamada PS/A y otras protenas de superficie. La PS/A se trata de un polmero de
galactosa-arabinosa de alto peso molecular. Los anticuerpos dirigidos contra PS/A
bloquean la adherencia de S. epidermidis. Luego de la adherencia inicial, hay otra
fase llamada de adherencia intracelular que es mediada por un polisacrido llamado
PIA y una protena extracelular. Esto permite la formacin de varias capas de
clulas bacterianas adheridas entre s que forman el llamado slime o biofilm. Este
slime sirve para proteger a los microorganismos de los agentes antimicrobianos y
de las clulas fagocticas. En general, es necesaria la remocin del cuerpo extrao
para lograr la cura de la infeccin. El slime parece tener otras actividades
biolgicas, dentro de las cuales se cuentan la inhibicin de la proliferacin de
linfocitos T y un efecto adverso sobre la opsonizacin y fagocitosis.

El Staphylococcus saprophyticus presenta caractersticas similares a S. epidermidis

pero es resistente a la novobiocina y la composicin de los cidos teicoicos es de
fosfato de ribitol. Se encuentra ampliamente distribuido siendo causante de hasta el
 20% de las infecciones urinarias extrahospitalarias en mujeres jvenes, causan
afecciones del tracto urinario bajo sin alteraciones estructurales. No presenta
problemas de resistencia antibitica.

2. Qu enfermedades produce el S. epidermidis y el S. saprophyticus?

El Staphylococcus epidermidis

Es un microorganismo muy resistente, que consiste en cocos Gram positivos no

mviles que crece en colonias de aproximadamente 1.2 milmetros de dimetro y no
hemolticas en agar sangre.
Se clasifica catalasa positiva, coagulasa negativo y anaerobio facultativo que puede
crecer mediante la respiracin aerbica o por fermentacin.
Es positivo para la produccin de ureasa, y se puede utilizar la glucosa, sacarosa y
lactosa para formar productos cidos.
En presencia de lactosa, tambin produce gas. Es sensible a la Novobiocina,
proporcionando una prueba importante para distinguirlo del Staphylococcus
saprophyticus, que es pero Novobiocina resistentes.

Virulencia:

La capacidad de formar biofilms en los dispositivos de plstico es un importante

factor de virulencia de Estafilococo epidermidis. Una causa probable es que se une a
las protenas de superficie sangre y protenas de matriz extracelular.
La cpsula del organismo, conocida como polisacrido de adhesin intercelular
(PIA), se compone de polisacrido sulfatado. Esto permite que otras bacterias que se
unen a la biopelcula ya existente, creando una biopelcula multicapa. Tales
biopelculas disminuyen la actividad metablica de las bacterias dentro de ellas. Esta
disminucin del metabolismo, en combinacin con el deterioro de la difusin de los
antibiticos, hace que sea difcil para los antibiticos para combatir con eficacia este
tipo de infeccin.

Enfermedades:

El Staphylococcus epidermidis causa biopelculas que crecen en los dispositivos de

plstico que se colocan dentro del cuerpo. Esto ocurre ms comnmente en los
catteres intravenosos y prtesis mdicas. La infeccin tambin puede ocurrir en
pacientes sometidos a dilisis o a cualquier persona con un dispositivo plstico
implantado que puede haber sido contaminado. Otra enfermedad que causa es la
endocarditis en pacientes con vlvulas cardacas.

El Staphylococcus saprophyticus:

Es un patgeno que puede causar desde una enfermedad leve o llegar a complicarse
en infecciones ms graves acompaados por una bactermia.
Se ha encontrado en algunas mujeres colonizadas por el s. saprophyticus durante su
perodo menstrual; esto puede asociarse a su estado hormonal o algn otro factor
 que sea regulado por el ciclo menstrual facilitando as la invasin del
microorganismo.
Algunas cepas tienen la habilidad de producir (ESS) sustancia extracelular slime que
les sirve para adherirse al uroepitelio, causando as la infeccin de vas urinarias.

No solo en las infecciones del tracto urinario se ha encontrado al S. saprophyticus,

tambin en algunos casos como: Infeccin de una ciruga por catarata, Endocarditis
e Infecciones neonatales.

3. Es recomendable en un paciente que presenta un cuadro de

faringoamigdalitis, hacerse un examen de secrecin farngea a fin de descartar
la presencia de Streptococcus pyogenes.

Si es necesario porque la faringoamigdalitis aguda es un proceso inflamatorio de la

mucosa y estructuras subyacentes de la faringe, su diagnstico de presuncin se
establece clnicamente, y el definitivo se realiza mediante cultivo del exudado
farngeo, aunque una alternativa son las pruebas rpidas de deteccin del antgeno
del estreptococo del grupo A en muestras farngeas.
Entre las de etiologa bacteriana, la infeccin por estreptococo beta hemoltico
del grupo A (16%) o streptococcus pyogenes es la causa ms frecuente, seguidas
de otros streptococcus del grupo C y G.

V. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Mandel D. Waldvogel F. Staphylococcus aureus. Bennet Principles and Practice

of Infectious diseases. Ed WB Saunders. 2000.

Prieto J y Gomez-Lus ML. Gnero Staphylococcus. Microbiologa Mdica. Ed

Doyma 1996. Pg. 179-191.