GENERALIDADES

1. Ttulo:

Efecto antiproliferativo del extracto de la Arracacia xanthorrhiza en cultivo de lneas celulares

H460 y MCF-7.

2. Personal Investigador
- Autores
Azaa Velez, Omar
Morales Flores, Ana Stephany
Moreno Henostroza, Diego Javier
Mota Asencios, Sharon Katherine
Napn Angulo, Carlos Miguel Alexander
Neyra Muoz, Nathaly Andrea
Ortega Espinoza, Elizabeth Alexandra
Torres Mario, Josu
Vsquez Ochoa, Pedro Pablo

- Profesora Tutora.

Dra. Mery Maximiliana Romero Rojas

- Alumno(s) Asesor(es).

Cristiam Johnatan Yamunaqu

- Colaboradores.

Dra. Doris Huerta Canales

PhD. Abraham Jaime Vaisberg Wolach

3. Departamento y seccin a la que pertenece el Proyecto.

Departamento de Patologa - Seccin de Patologa Experimental

4. Localidad e Institucin donde se desarrollar el proyecto.

Laboratorio de la Facultad de Biologa y Virologa de Cayetano - Hospital Nacional

Cayetano Heredia
 5. Duracin del proyecto: 3 meses
6. Fechas de inicio y trmino del proyecto

6.1 Inicio: 31 de julio del 2015

6.2 Termino: 8 de noviembre del 2015

7. Recursos disponibles (recursos que ya se poseen y no es necesario que vayan al

presupuesto)
7.1 Personal:
- Dra. Mery Maximiliana Romero Rojas
- Dra. Doris Huerta Canales (Departamento de Ciencias Dinmicas de San Fernando)
- PhD. Abraham Jaime Vaisberg Wolach (Director de la Facultad de Biologa y Virologa

de Cayetano)
- Dr. Jorge Luis Arroyo Acevedo (Coordinador del Laboratorio de Farmacologa)
7.2 Material y equipo:

Celulas VERO

Incubador celular

Maquina de destilacion

Estufa

Tubos para el cultivo

Campana de flujo laminar

7.3 Locales, Laboratorios

- Laboratorio de la Facultad de Biologa y Virologa de Cayetano

- Laboratorio de la Facultad de Ciencia Biolgicas de Universidad Nacional de San Marcos

- Laboratorio de Ciencias Dinmicas Departamento de Bioqumica

8. Presupuesto
8.1 Bienes:

Bienes Costo
Lneas celulares de plumn y de mama 600 soles
Raz de la Arracacha (3 Kg) 20 soles
Macetas para la arracacha 40 soles
Productos de aseo 30 soles
Total 690 soles
8.2 Servicios

Servicios Costo
Alquiler del Laboratorio 100 soles
Pago de trabajo de horas extras al cuidador de los bioterios 80 soles
Costo de envo de la Arracacha 40 soles
Total 220 soles

Costos de bienes + servicios = 690 + 220= 910 soles

INTRODUCCIN

Nuestras plantas nativas se consideran como una fuente de una invaluable riqueza curativa. La

Arracacia Xanthorrhiza, tambin conocida en nuestro medio como arracacha es una pequea

planta perteneciente a la familia Umbelifera, gnero Arracacia. Su lugar de origen se desconoce

siendo Amrica del Sur el lugar ms probable de su aparicin. En la actualidad son cuatro los

pases que dotan de una amplia produccin como Brasil, principalmente, Ecuador, Colombia y

Venezuela; en tanto en el Per el departamento que cuenta con ms produccin es Cajamarca.

La arracacha es considerada como una de las nicas umbelferas que ha podido ser muy bien

domesticado, es esencialmente un alimento rico en almidn y su utilizacin est ntimamente

relacionada con su contenido en almidn elevado. La arracacha puede, sin embargo, ser

recomendada por la presencia de otros nutrientes como b-caroteno, cido ascrbico y calcio, pero

en cantidades pequeas.

No se cuenta con una informacin detallada de esta planta nativa, pero las pocas investigaciones

nos revela que genticamente cuenta con 44 cromosomas; Parece haber poca variacin morfolgica

en el acervo gentico cultivado de arracacha, donde claramente, la raz de almacenamiento es la

parte ms variable de la planta; estas son las tres formas generalmente reconocidos:

. Amarilla: Esta arracacha produce races amarillas de muy buen sabor y el follaje es verde.

. Blanca: Produce races blancas y presenta follaje verde.

. Morada: El follaje es de color carmn y las races son amarillas.

Por muchos aos, las acciones citotxicas de las drogas quimioteraputicas fueron atribuidas

solamente a su capacidad de inducir la muerte genotxica; sin embargo, se han acumulado

evidencias que estos agentes ejercen sus efectos citotxicos principalmente induciendo apoptosis

en clulas del tumor; la debilitacin de la apoptosis est relacionada con la inmortalidad de la

clula y la carcinognesis.

Actualmente se dispone de una gama de drogas quimioteraputicas que inducen la apoptosis en las

clulas neoplsicas; pero debido a la necesidad de seguir encontrando alternativas para el

tratamiento del cncer, se ha buscado a travs de los datos etnomdicos, plantas medicinales que

puedan tener alguna actividad antitumoral, para identificar posteriormente sus sustancias activas.

En el presente proyecto se utilizara la Arracacia Xanthorrhiza, donde resaltaremos su contenido en

carotenos para un posible efecto antiproliferativo, ya que estos carotenoides podran influir en el

cese de los efectos negativos de los radicales libres, principales productores de la proliferacin

cancerosa de las clulas.

Por lo tanto, el objetivo de la presente investigacin es determinar la actividad anti proliferativa del

extracto de Arracacia Xanthorrhiza, (arracacha) en cultivos de lneas celulares cancerosas MCF-7:

clulas cancerosas de glndula mamaria y H-460: clulas cancerosas de pulmn.

Tambin resaltar el uso de lneas celulares humanas como un medio de investigacin viable, ya que

se puede preservar las propiedades fisiolgicas, bioqumicas y genticas de las clulas humanas.
OBJETIVO

Objetivo general

Determinar el efecto antiproliferativo del extracto de la Arracacia xanthorrhiza en cultivo

de lneas celulares H460 y MCF-7 cuantificando el nmero de clulas.

Objetivo secundario

Identificar los factores del extracto de la Arracacia xanthorrhiza que intervienen con un

efecto antiploriferativo .
Estandarizar la tcnica de cultivos celulares.
Determinar el principio activo de la raz en lneas celulares

HIPTESIS

Existe un efecto antiploriferativo del extracto de la Arracacia xanthorrhiza en cultivo de lneas

celulares H460 y MCF-7, y cuyos componentes tienen un papel prometedor en el tratamiento de

muchos tipos de cncer.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

1. Problema
1.1. Enunciado del problema cientfico
Es posible la contencin de las clulas cancergenas mediante los componentes de una

planta, esa es la interrogante que presentamos en este proyecto. Algunos estudios reafirman

que las propiedades presentes en los componentes de nuestra raz posibilitan la detencin

del crecimiento acelerado en clulas cancergenas por mecanismos an no esclarecidos del

todo, no obstante no se presenta dato alguno de la capacidad de ejercer este efecto por parte

de la Arracacia Xanthorrhiza (planta descrita ms adelante, con un gran nivel de

componentes en su composicin) tal y como se plante con otras plantas presentes en este

pas, como por ejemplo: la Annona muricata, la Annona cherimola o la Physalis

peruviana. Cabe resaltar, que los mecanismos que actan en la accin de las plantas antes

mencionadas, pueden diferir mucho de lo que se espera encontrar en este proyecto.

1.2. Definicin y delimitacin del problema

1.2.1.Conocimientos previos, antecedentes y origen del problema
En los ltimos aos, la investigacin ha demostrado que la vitaminas y retinoides, naturales o

sintticos encontrados en la Arracacha tienen un papel prometedor en la prevencin y

tratamiento de muchos tipos de cncer. Cabe resaltar su accin en un amplio espectro de

actividades biolgicas, tales como la embriognesis, el crecimiento, la diferenciacin, la

proliferacin y la apoptosis celular. Se han realizado diversos estudios en la aplicacin de esta

vitamina a lneas celulares, es as como Lotan (1995) demostr que estos compuestos, en

experimentos in vitro e in vivo, pueden influir en el crecimiento de clulas malignas de

diversas formas: produciendo la detencin del crecimiento, promoviendo la apoptosis y la re

diferenciacin de una variedad de lneas celulares. Recientemente, Williams et al. (2009)

observ que el metabolismo del retinol se encontraba deteriorado en clulas de cncer de

ovario. En lo que se refiere a cncer de mama, Roman et al. (1992) demostr que el cido

retinoico inhibe la carcinognesis mamaria en roedores e inhibe la proliferacin de clulas de

cncer de mama en humanos. Sin embargo, para obtener resultados positivos, se tuvo que

administrar dosis de estrgenos. El mecanismo por el cul se da este proceso an es

desconocido.
Como podemos apreciar, se han realizado estudios que demuestran los efectos que producen la

administracin de vitamina A en lneas celulares y roedores, sin embargo las vas por el cual

estos compuestos logran dichos efectos anticancergenos son an poco conocidos. Se cree que

los mecanismos por los que la vitamina A, los retinoides y b-carotenos pueden inhibir el

crecimiento canceroso estn relacionadas con mayores niveles de sealizacin, como por

ejemplo la inhibicin de la quinasa C o la reduccin de la expresin del oncogn H-Ras, Van

Zandjwijk (2000).
Con respecto al cncer de pulmn, Comstock et al. (2001) compararon los niveles de vitamina

A en la sangre de personas que subsecuentemente desarrollaron cncer de pulmn y de otras

que no lo hicieron, solo se hall un efecto significativo del retinol en la reduccin del cncer de

pulmn. Sin embargo, estudios del Ensayo de la Eficiencia del Beta caroteno y el Retinol

sugiere que se debera evitar la suplementacin con vitamina A en personas con alto riesgo de

pulmn. Esto probablemente al entorno oxidativo presente en los pulmones, creando productos

inusuales derivados de los carotenoides, involucrados en el desarrollo del cncer. Actualmente,

parece poco probable que una ingesta superior de vitamina A reduzca el riesgo de cncer de

pulmn, aunque los efectos del retinol pueden ser distintos en los fumadores y no fumadores.
Determinados estos antecedentes en lneas celulares, podemos ingresar en el conocimiento con

respecto a la Arracacia Xanthorrhiza. Pertenece al gnero Arracacia, que comprende

aproximadamente 30 especies distribuidas desde Mxico hasta Bolivia, entre los 600 y 3600

msnm. En nuestro pas se identificaron 6 especies, siendo la especie relevante en este proyecto

la Arracacia xanthorrhiza Bancroft. Esta especie es la nica umbelfera domesticada en los

Andes, sus orgenes estaran localizados en Colombia. Se especula que su domesticacin se dio

por influencia de la cultura Nazca, expandindose a lo largo y ancho del Per. Actualmente, el

lugar con mayor produccin de Arracacia xanthorrhiza en el Per es el departamento de

Cajamarca. Sin embargo, esta planta no es muy difundida a pesar de su gran valor nutritivo y

gran accesibilidad econmica. El componente que pone en cuestin a la arracacha como

posible agente anti proliferativo es su gran cantidad de vitamina A. Sin embargo, este no es el

nico componente que resalta en su composicin qumica, ya que podemos observar una

elevadsima proporcin de almidn, adems de la presencia de compuestos importantes como

por ejemplo la vitamina B3, el cido ascrbico y el calcio, aunque estos ltimos en menores

cantidades.
2. Tabla1. Composicin qumica de la raz de Arracacia xanthorrhiza

Composicin Promedio (g) Variacin (g)

Agua 74 64.12-81.3
Slidos totales 26 16.83-34.1
Hidratos de carbono 24.94 19.25-29.8
Protenas 0.96 0.60-1.85
Lpidos 0.26 0.19-0.35
Fibras 0.85 0.6-1.24
Almidn 23.51 16.91-26.4
Azcar 1.66 0.65-1.98
Caloras (cal) 104 96.00-126.
VITAMINAS
cido ascrbico 23 18.26-28.4
Vitamina A 1759.87 254.75-6878
Vitamina B3 3.45 1.00-4.50
Vitamina B6 0.03 0.01-0.07
MINERALES
Calcio 65.25 45.10-127.
Hierro 9.51 3.60-15.4
Fsforo 55 32.50-158.
Potasio 2.4 1.86-3.04
Magnesio 64.12 55.00-97.6

3. Fuente: Pereira, 1995

3.1.1.Caractersticas y significado del problema

El efecto anti proliferativo de la vitamina A y retinoides en lneas celulares, no est

claro del todo, sin embargo podemos aplicar este conocimiento a la realidad que

afrontamos en nuestro pas. El cncer constituye un problema de salud pblica a nivel

mundial, en la regin de las Amricas y en nuestro pas, por su alta mortalidad como

por la discapacidad que produce.

En el Per el cncer de mama se presenta como el segundo de mayor prevalencia en

las mujeres con un total de 11 340 casos registrados en el periodo 2006-2011, solo

detrs del cncer de cuello uterino con 16 374 casos en el mismo periodo. Adems el

cncer de pulmn se presenta tambin, como el stimo de mayor prevalencia con un

total de 5044 casos registrados en el periodo 2006 2011. La distribucin del cncer

en los departamentos de la costa, sigue un patrn casi homogneo, siendo los

principales exponentes el cncer de mama, seguido por el cncer de estmago y el

cncer de cuello uterino. En la sierra, hay cierta heterogeneidad, asociado quiz a los

niveles socioeconmicos que presenta la poblacin en los diferentes departamentos;

vara desde el cncer de crvix, en Cuzco, Cajamarca o Arequipa, hasta el cncer de

estmago en los departamentos como Huancavelica, Ayacucho o Apurmac.

Entonces, podemos aplicar los componentes qumicos presentes en esta planta y su

gran accesibilidad como una medida propuesta para la prevencin y posible

tratamiento del cncer en general, enfocndonos en el cncer de mama y cncer de

pulmn.

Tabla 2. Distribucin de casos de cncer segn localizacin topogrfica y sexo. Per,

2006 -2011

Localizacin Masculino Femenino TOTAL %

Crvix 0 16374 16374 14.9
Estmago 6356 5861 12217 11.1
Mama 69 11271 11340 10.3
Piel 3297 3945 7242 6.6
Prstata 6359 0 6359 5.8
Sistema hematopoytico 3060 2501 5561 5.1
Pulmn 2669 2375 5044 4.6
Colon 1637 2034 3671 3.3
Ganglios linfticos 1872 1491 3363 3.1
Hgado 1536 1446 2982 2.7
Tiroides 524 2428 2952 2.7
Ovario 0 2182 2182 2.0
Pncreas 968 1075 2043 1.9
Encfalo 1046 948 1994 1.8
Rin 1117 781 1898 1.7
Otros 11566 13126 24692 22.5
 TOTAL 42076 67838 109914 100.0

Fuente: Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiolgica

3.1.2.Delimitacin del problema

La aplicacin de la Arracacia Xanthorrhiza con el enfoque de anti proliferacin en

lneas celulares cancergenas otorga la capacidad de plantear varios problemas,

siendo el principal conocer si este efecto es notoriamente relevante, adems es

necesario saber si los qumicos que contiene esta especie influyen sobre clulas

normales, ya que no es de mucha relevancia contar con un frmaco que pueda daar

indiscriminadamente. Secundariamente, se plantea interrogante del mecanismo por el

cual la administracin de la vitamina A o sus derivados afecta a la clula

cancergena.
Cabe resaltar que al ser este proyecto en lneas celulares, se niegan efectos

fisiolgicos que suceden normalmente en un animal o ser humano, es por esto que se

da la posibilidad de extender este conocimiento para otorgar una base cientfica sobre

la cual trabajar en un futuro no muy lejano.

MATERIALES

Como se mencion en la presentacin, para el desarrollo del trabajo de investigacin emplearemos

principalmente dos lneas celulares sobre las cuales probaremos los posibles efectos

antiproliferativos de la Arracacia xanthorriza. Estas lneas celulares son el Carcinoma de pulmn

NCI-H460 y el Carcinoma de mama MCF-7. Se detallarn las caractersticas ms relevantes para el

proyecto de estas lneas celulares.

NCI H460.
Como caracterstica morfolgica se encuentra clasificado dentro de los tejidos epiteliales.

Esta lnea celular representa una muestra de carcinoma de pulmn.

Posee un nivel de bioseguridad 1, esta clasificacin de bioseguridad est dada segn el

Manual de Lineamientos para el Servicio de Salud Pblica de Estados Unidos. Esta clula,

NCI-H460, fue aislada por A. F. Gazdar del fluido pleural de un paciente con cncer de

pulmn en 1982.
Las clulas expresan la protena supresora de tumores p53 en niveles comparados con una

clula pulmonar normal. No se muestran cambios significativos en la estructura del ADN.

Las clulas se tien positivamente para queratina y vimentina, mas no para la protena de

neurofilamento.
MCF 7.
Es una lnea celular de carcinoma de mama aislada en 1970 de una mujer caucsica de 69

aos de edad llamada Frances Mallon (fallecida en 1970). MCF es el resultado de las

siglas de la Fundacin para el Cncer de Michigan (de sus siglas en ingls).

Antes del asilamiento de MCF-7 no era posible para los investigadores de cncer obtener

lneas celulares de mama que fueran capaces de vivir ms que unos pocos meses.
El MCF-7 es un tumor primario, es un carcinoma invasivo de la zona ductal mamaria.

Poseen receptores para estrgeno y progesterona. Muestra respuesta proliferativa ante las

presencia de estrgeno. En muestras experimentales con ratones, el efecto carcinognico

es positivo pero solo con suplemento estrognico. Encontramos estas clulas en epitelio

luminal. El factor de necrosis tumoral alfa inhibe el crecimiento de MCF-7. El tratamiento

con anti-estrognicos puede modular la secrecin de protenas de crecimiento similar a la

insulina.
Clulas VERO.
 Las Clulas VERO son lneas celulares usadas como grupo control en cultivos celulares.

Las clulas VERO fueron aisladas de clulas epiteliales de rin extradas del mono verde

africano (Cholorecebus sp.), estas son continuas y aneuploides. El anlisis del genoma

indica que las Lneas celulares VERO derivan de una hembra Chlorocebus sabaeus. El

linaje fue desarrollado el 27 de marzo de 1962 por Yasumura y Kawakita.

Toda la secuencia genmica de las lneas celulares VERO fue determinada por unos

investigadores japoneses en 2014. El cromosoma 12 de las Clulas VERO sufre una

delecin homocigota causando la prdida del grupo de genes tipo interfern I y de los

inhibidores kinasa dependientes de ciclina CDKN2A y CDKN2B en el genoma

Las Clulas VERO son usadas con mltiples propsitos incluyendo:
- Screening para la toxina de Escherichia coli, llamada primero Toxina VERO
- Como clula husped para crecimiento viral; por ejemplo el testeo para la presencia del

virus de la Rabia o en el crecimiento de los stocks virales

- Como clula husped para parsitos eucariotas, especialmente Trypanosomas

MTODOS

Tipo de estudio: Proyecto de investigacin es de tipo experimental, cuantitativo, cualitativo,

prospectivo y transversal.

Periodo y lugar donde se realizara la investigacin: el tiempo calculado para el bioensayo es de

2 semanas, la investigacin se llevara a cabo en tres instalaciones: Laboratorio de Ciencias

biolgicas de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM), el Laboratorio de

Investigacin y Desarrollo de la Universidad Peruana Cayetano Heredia (UPCH) y en el Bioterio

del grupo N 12 de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos

(UNMSM).

Poblacin y muestra: Se trabajaran con 3 poblaciones distintas: Clulas VERO, Clulas de

Adenocarcinoma pulmonar humano (H 460) y clulas de adenocarcinoma de mama humano (MCF-

7), la muestra es toda la poblacin de las lneas celulares de los cultivos que se prepararan, la

unidad de investigacin es cada clula perteneciente al cultivo de clulas VERO, al cultivo de la

lnea celular H 460 (Adenocarcinoma pulmonar de humano) y al cultivo de la lnea celular MCF-7

(adenocarcinoma de mama).

Seleccin de la variable: las variables en estudio son 3:

1-Actividad anti proliferativa del extracto de Arracacia Xanthorrhiza, de tipo cuantitativa, medida

a travs del indicador CI50 (growing inhibition 50).

2-Respuesta al extracto de Arracacia Xanthorrhiza de las distintas lneas celulares utilizadas, de

tipo cualitativa.

3-Dosis con actividad anti proliferativa ms efectiva del extracto de Arracacia Xanthorrhiza, tipo

cuantitativa.

Procedimiento

1- Conseguir los 3 tipos de lneas celulares: Clulas VERO, Clulas de Adenocarcinoma pulmonar

humano (H 460) y clulas de adenocarcinoma de mama humano (MCF-7)

2- Conseguir la raz de Arracacia Xanthorrhiza

3- Preparacin del extracto de la raz de Arracacia Xanthorrhiza, planta perteneciente a la familia

Umbelifera, gnero Arracacia, para el tratamiento de las 3 distintas lneas celulares, de la siguiente

manera:

.PASO 1: Se licua la raz de Arracacia Xanthorrhiza con agua fra

.PASO 2: se filtrara el licuado utilizando papel filtro y un matraz

.PASO 3: El filtrado se pondr en un plato tendido y llevarlo a la estufa a 40 C

4- Hacer el cultivo de las 3 lneas celulares, el cual se realizara en un periodo de 48 a 72 horas, el

medio de cultivo a eleccin debe ser ptimo para la proliferacin celular, ser suplementado con

suero fetal bovino y gentamicina. Las tres lneas sern mantenidas a una temperatura de 37 C, en

un ambiente hmedo con 95% de oxigeno y 5% de CO2.8

5- Ensayo de la actividad anti proliferativa: Se utilizaran dos multiplacas, una control con pozos

para las tres lneas celulares y otra experimental, con una cantidad de pozos iguales para cada lnea

celular, en cada pozo de ambas placas se coloc la misma cantidad de medio de cultivo. Se llevara

a incubar a 37 C en una atmsfera hmeda con 5% de CO2 y 95% de aire por 24 h. Los pozos de

la multiplaca experimental sern tratados en partes iguales con 5 fluoruracilo, con el extracto de

races de Arracacia Xanthorrhiza a distintas diluciones y la ltima parte se utilizara para control,

ambas placas se incubaran a 37 C en una atmsfera hmeda de 5% de CO2 y 95% de oxigeno.

6- Medir la actividad anti proliferativa que genera el extracto de Arracacia Xanthorrhiza en las

lneas celulares y la que genera el 5 fluoracilo mediante marcador CI50, con un hemocitometro

para su posterior comparacin.

FLUJOGRAMA
 PROYECTO DE
No

Creacin del Proyecto

Reevaluacin
Asesora y orientacin

Etapa de crisis del

proyecto
Estamos

Men de etapas Reevaluacin

Extracto Arracacha
Organizacin para el
proyecto Si

Discusin de resultados
Desempeo del
proyecto

Evaluacin efecto Discusin de

resultados

Herramientas y materiales Lineas Celulares

Publicacin

Publicacin

BIBLIOGRAFA

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